Curva de crecimiento de Escherichia coli:

cuantificación de microorganismos

EQUIPO 1

Crecimiento de poblaciones

Crecimiento: aumento en el número de células microbianas de una población. Incremento de masa celular.

Velocidad de crecimiento: cambio en el número de células o en la masa celular por unidad de tiempo

Generación: intervalo para la formación de dos células a partir de una

Tiempo de generación: tiempo transcurrido para que esto ocurra

Curva de crecimientoTípica de un sistema cerrado ó cultivo en

medio no renovado ó cultivo monofásico:

Fase de latencia (Fase lag) Fase en la que el crecimiento se da tras un

periodo de tiempo Puede ser breve o larga Si se inocula en el mismo medio y

condiciones de cultivo, no hay retraso y el crecimiento exponencial inicia rápido

Si el inóculo se toma de un cultivo viejo (fase estacionaria) o las células han sido dañadas hay retraso

También ocurre cuando se transfiere un cultivo de un medio rico a uno mas pobre

Fase exponencial

Consecuencia de que cada célula se divide para formar dos

Las células están en el estado fisiológico más sano

La mayoría de los mo unicelulares tienen este crecimiento

Las velocidades son muy variables y están influenciadas por condiciones ambientales y características genéticas del mo

Fase estacionaria

En un sistema de cultivo cerrado por ejemplo tubo o matraz, el crecimiento exponencial no puede ser indefinido ya que:

1.- Un nutriente esencial del medio se usa y llega a ser un factor limitante del crecimiento

2.- Se acumulan en el medio productos de desecho No hay aumento ni descenso neto en el número

de células Funciones celulares continúan Crecimiento críptico: algunas células crecen y

otras mueren equilibrándose

Fase de muerte

Si la incubación continúa Menos células vivas y

metabólicamente activas Más células que mueren Hay lisis celular real La velocidad de muerte es

exponencial pero mucho más lenta que la de crecimiento

Métodos de cuantificación de microorganismos

El crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el número de células, en la cantidad de algún componente de las

mismas o en el peso total seco de las célulasDIRECTOS Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter)

Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula).

Cámaras de recuento

Recuento de células totales: Contando una muestra con el microscopio en muestras secas o líquidas.

Ventajas: -Método rápido

Desventajas:-No distingue células vivas de

muertas-Células pequeñas no se ven-La precisión es difícil-Se requiere microscopio de

contraste de fases cuando la muestra no se tiñe

- No adecuado para baja densidad celular

Recuento de células viables

Métodos de cuantificación de microorganismosINDIRECTOS

Turbidez (Turbidimetría) Método rápido y útil para obtener estimaciones

del número de células Se debe a que las células dispersan la luz que

atraviesa la suspensión Se mide con fotómetro o espectrofotómetro Estos miden la luz no dispersada Las lecturas se expresan en unidades

fotométricas (fotómetro) o de densidad óptica para el espectrofotómetro

Se obtiene una curva estándar donde se puede observar que las UDO son proporcionales al número de células

Se debe preparar para cada microorganismo a estudiar una curva estándar

Se pueden hacer sin destruir o modificar la muestra

Se usan mucho para seguir la velocidad de crecimiento

La misma muestra puede medirse repetidamente

Escherichia Coli

Bacilo Gram negativo Anaerobio facultativo Móvil por flagelos

perítricos No forma esporas Capaz de fermentar

glucosa y lactosa Bacteria muy utilizada

en experimentos de genética y biotecnología molecular.

Curva de crecimiento de E. coli

Fuentes de información

Jesús Ramírez Santos,* Gabriel Contreras Ferrat,** M. Carmen Gómez Eichelmann. “Revista Lationoamericana de Microbiología”. Vol. 47, No. 3-4 July - September. 2005, October - December. 2005 pp. 92 -101 www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2005/mi05-3_4f.pdf

Ciclo celular y crecimiento. “Microbiología” Universidad de Granada. http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm

Mandigan, Martinko, Parker, 2004. Brock Microbiologia. 10ª Ed. Pearson, Madird, España.

Procedimiento

Práctica # 6

15 Tubos de rosca 5 Pipetas de 1 mL 5 Pipetas de 10 mL 1Cilindro para esterilizar pipetas 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL 1 Parrilla Agitadores magnéticos 1 Vaso de precipitados 1000 mL 1 probeta de 100 mL Balanza analítica Gasa Algodón Papel de estrazaREACTIVO

Caldo nutritivo Agua destilada

Celdas para espectrofotómetro Espectrofotómetro Microscopio óptico Portaobjetos Cámara de Neubauer Cubreobjetos 2 Mecheros Fisher 1 tubo “t” de vidrio

Sesión prácticaSesión extra clase

4

Sesión extra clase

250 mL de Caldo nutritivo

• 10 mL del medio en un tubo con tapón de rosca (15 tubos)

• 50 mL del medio en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con tapón de algodón

g caldo en 250 mL de agua destilada

g X 4 = En 1000 mL

15 X 4 =60

4

1

2 Esterilizar

Autoclave a 15 lb/plg2, durante 15 minutos.

Pipetas Tubos con tapón de rosca Matraz Erlenmeyer de 125 mL

Pipetas limpias con tapón de algodón y en el cilindroParcialmente cerrados Con tapón de algodón

3Inocular con Escherichia coli el 2 matraz Erlenmeyer (A y B) un día anterior a la sesiónpráctica (19 de mayo de 2008, a las 17:00 hrs)e incubar a 37ºC.

4 Inocular con el cultivo del matraz A a otro matraz con caldo nutritivo e incubara 37ºC 20 de mayo a las 11:00 hrs

Con asada de un cultivo puro

Se agregó cierta cantidad del matraz

A

medir densidad óptica de cada tubo y realizar conteo de células5

Sesión práctica

Fecha de inoculación

Hora de inoculación

Tubo o Matraz Minutos de incubación Hora de checar

Equipo encargado de checar

19 mayo 17:00 2 matraces: A y B 1380 16:00 1

20 mayo 11:00 Del matraz A: 1 matraz

270 15:30 1

13:00 Del matraz A: 1 matraz

240 X 17:00 1

14:00 Del matraz A: 2 tubos 210 17:30 4

15:30 Del matraz B: 14 tubosEq 2: 4 tubosEq 3: 6 tubosEq 4: 4 tubos

0 No se checa 2Esterilizar

30 X 16:00 360 16:30 490 17:00 2120 17:30 3150 18:00 4180 18:30 3

Matraz (11:00) 420 18:00 1

Matraz (13:00) 330 18:30 4

Matraz(11:00)

480 6:30 3

Calibrar espectrofotómetro utilizando como blanco medio estéril.

En una celdilla limpia agregar cierta cantidad de la muestra (tratando de mantener limpia la celdilla).

Poner en el espectrofotómetro y leer su densidad óptica.

Bajo condiciones de asepsia colocar en el área hundida de la cámara de Neubauer una gota de los cultivos (muestras series 1 y 2 según sea el caso) y extenderla rápidamente.

Colocar el cubreobjetos y observar con los objetivos de 40X y 100X

Contar las células en cuadros individuales.

Densidad Óptica Conteo de Células

Cuadro 1= 5Cuadro 2= 6Cuadro 3 = 5Cuadro 4= 5Cuadro 5=Cuadro 6=Cuadro 7=Cuadro 8=Cuadro 9=Cuadro 10=

Cálculo del número de microorganismos pormililitro o gramo de la muestra original

7

tiempo Absorbancia

0 0

30 0.024

30 0.017

60 0.025

60 0.027

90 0.016

90 0.018

120 0.018

120 0.021

150 0.017

150 0.02

180 0.022

180 0.015

210 0.033

210 0.026

270 0.083

270 0.078

420 0.13

420 0.14

480 0.14

480 0.149

1380 0.236

tiempo Ln0 0

30 -3.7297014530 -4.0745419360 -3.6888794560 -3.6119184190 -4.1351665690 -4.01738352

120 -4.01738352120 -3.86323284150 -4.07454193150 -3.91202301180 -3.81671283180 -4.19970508210 -3.41124772210 -3.64965874270 -2.48891467270 -2.55104645420 -2.04022083420 -1.96611286480 -1.96611286480 -1.90380897

1380 -1.443923471380 -1.44816976

tiempo conteo de células

0 0.00000001

30 2.35E+05

60 5.00E+04

120 3.96E+05

150 7.92E+04

210 8.92E+04

270 4.28E+05

420 3.36E+05

480 7.20E+06

1380 1.02E+07

tiempo segundos) Ln

150 11.2797316

210 11.3986363

270 12.9668785

420 12.7248664

480 15.7895916

1380 16.1378983