UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR

INVESTIGACINENTERAPIASESPECFICASDEMUTACINENENFERMEDADESMETABLICAS

HEREDITARIAS.RESPUESTAACOFACTORESYTERAPIA

ANTISENTIDO.

Cristina Aguado Esteban

TESIS DOCTORAL

Madrid, 2008

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR

INVESTIGACINENTERAPIASESPECFICASDEMUTACINENENFERMEDADESMETABLICAS

HEREDITARIAS.RESPUESTAACOFACTORESYTERAPIA

ANTISENTIDO.

Directora de Tesis:

Dra. Lourdes Ruiz Desviat

Memoria presentada por la licenciada Cristina Aguado Esteban para optar al grado de Doctor en Ciencias

El presente trabajo ha sido realizado en ellaboratorio de la Prof. Magdalena Ugarte,Catedrtica del Departamento de BiologaMolecular,enelCentrodeBiologaMolecularSeveroOchoadelaUniversidadAutnomadeMadrid,yduranteunaestanciabreveenellaboratoriode laProf. RumaBanerjee, en elCentro Redox de Biologa,Departamento deBioqumica, en la Universidad deNebraska,EEUU,con laayudadeunabecapredoctoralconcedida por elministerio de Educacin yCiencia.

AGRADECIMIENTOS

EnprimerlugarquieroagradeceraDioslavidaylagentetangenialquehapuestoenmicaminoduranteestoscincoaos.Graciasporlosbuenosymalosmomentos,porquenuncamehesentidosola,poreseamortangrandequememuestrasiempre.

GraciasalaProfesoraMagdalenaUgartepordarmelagranoportunidadderealizarla tesis doctoral en su laboratorio. Por su gran ejemplo profesional y humano. Porpresentarmeavariosdesusnios.

Graciasacadaunadelaspersonasdellaboratorio201210/204porquemehesentidomuyqueridaymuycuidadayporquedecadaunoheaprendidomucho,porpoderhacerlatesisjuntoaellos:

ALourdespor sermidirectorade tesis,porhaberescuchado siempremis teoras,porque eso ha hecho queme ilusione estemundo. Por transmitirmemucha confianza ytranquilidad,porcorregirmey regaarmeen losmomentosadecuados,por tenersiempreuna solucin,por acertar siempre los resultados,por ser como eres; inteligente,prctica,clarayfuerte.

ABelnporser laprimerapersonadel laboratoriocon laquehabl,por la fuerza,seguridadeinteligenciaquetransmite.Alasdosporsuejemplocomoinvestigadoras,poresacapacidaddeintegrartantostemascientficosalavez,portrabajardeformatancomplementaria.

ARosaporsertanbuenagente,unadelasmejoresqueconozco,porlosmildetallesquehatenidoconmigo,pordefendermesiempre,porescucharmeaqueldaalastresdelamaana,porsertanbuenaamiga.

AAscenporquefuelaprimerapersonaconlaquecompartpoyata,portodoloquemehaenseado,porsupaciencia,porquetieneunasolucinparacualquierproblema,porsusbuenosconsejos.

AFapor losviajesenel tren,porser tanelegante trabajando,porqueeres lanicapersonaquemehavistomediollorar,porlaszapatillasdeestarporcasa,porestaratentaaloquemepasaba,porescucharmesiempre.AlastresAscen,FayRosaporlaseguridadyuninquetransmitsenellaboratorio.

AAnaRincnporloscincoaoscompartiendotesis,porsermiONGpersonal,porsoportarmienanogrun,poresunseor....,porelintentodelibro,poralgnqueotrosecreto.

AAnaVegaporsusinceridadyfranquezasiempre,porquerersiempreentenderloquehaces,porelviajeaBarcelona,portuhumoryporintentarensearmeabailar.

A Patricia porqueme parece que te conozco desde hacemuchoms tiempo, poraquelmecaesmuybiendespusdelacenadeNavidad,porcompartirtussentimientos,porlaconfianzaquemetransmites.

AAnaJorgeporsertantrabajadorayluchadora.A Celia y a Begoa por contestar siempre mis preguntas, por transmitirme lo

maravillosoqueeseldiagnsticodelasenfermedadesmetablicas.A Carmen por ser ejemplo de fuerza, por ensearme tanto, por todas las

conversacionesenelcuartodecultivo,porpreocupartetantoporlagente..APilarporserunadelasmejorasprofesorasquetuveenlacarrerayportodossus

buenosconsejos.AMargaporhacermesiempreunhuecoenelaparato,porexplicarmetantascosas.

A Palo por dejarme cotillear en los picos de los aminocidos y por tantasconversaciones.AFerporsertandispuestoyamable.

ARocoaliasIrene,por la tranquilidadque transmite,poraguantarmisbromas,porpreguntarmeyfiartedemi.

AIreneyelnioporquefueronmisavanzados,portodaslashistoriasquehevividoconellos,pordejarseensear,porlapacienciaconmislargasexplicaciones,porlosbollitosdesupuebloRubn,porlashistoriasconsuhermano,porllevartanbienlodelairequeledio.Irene,porserunejemploenempeoypacienciahastaconseguirunexperimento.

A los dos informticos Julio y Gonzalo, por su paciencia con mis estropiciosinformticos y por su gran humor, por las discusiones de religin, por los partiditos albaloncestoyporlascaasenlosdardos.

ASonia,aMAyangelmisbecariospredecesoresporlucharcadaunoasumaneraporconseguirvuestrossueosSoniaporlasbromasenlosprimerostiempos,poracogermeen tucasa trasunacomidadeNavidad,por tusmilconsejos,por losviajesenel tren,porllamarmecuandoestabaenNebraska.AMarangelesporloscinesporsudulzurayporsu sinceridad. A Pey por ensearme con tanta precisin, por ser un enamorado de sutrabajo.

AIsaacporlospartidosdebaloncesto,porlaspartidasdedardos,porqueaunqueenmuchascosaspensamosdiferentesiempremehasescuchado,portusbromas.

APedroportodaslasconversacionesenellaboratorioyfueradeel,porlosteatroscompartidos, lascaasyporquesiempreheaprendidocuandohehabladocontigo,por tuhumor.

AGema,Mara,Charo,Yolanda,Nuria,MaraJessportantasconversacionesenelladodediagnstico,por losexperimentosquemehabisenseado,porvuestrapacienciacuandomedejabacosasenvuestrolado.

AlaRichiporsusonrisaperenne,porcontestarsiempremispreguntasyporsertancercana.

A las biosecre (Ana, Isa, Eva y Julia) por tener siempre una sonrisa aunque noscolramosen la impresoracon lassecuenciasya la Julienespecial,porsuhumor,porsucapacidadteatral,porcomerconnosotrasalastres,porpresentarmeaunamigocomn,porpreocupartepormi.AMaja, Abel y Lorena porque aunque habis estado poco conmigo habis hechomuyagradableeldaadaenellaboratorio.Graciasa lagentede losdiversos laboratoriosyde losdistintos serviciosdelCBM cuyaayudahasidoimportanteparaestatesis. OSVOYAECHARMUCHODEMENOSNo se puede hacer una tesis sin una familia y unos amigos que te apoyen, quieran yacompaenduranteloscincoaosqueduraestecamino.

Porsupuestoyenprimerlugargraciasamispadres,amipadreporsuejemplodetrabajo,honradezyhumor,amimadreporsuejemplodeatencin,detallismoydulzura.Alosdosgraciasporlaconfianzaquesiemprehabistenidoenmi,porapoyarmesiempredurante la carrera ydurante estos cinco aosdedoctorado, pero sobre todo gracias porquererme tantoysiempre,porquenocreoquememerezcaunospadres tanbuenos.Amihermana, por su ejemplo de entrega total, por su fuerza y decisin, por que cada dadescubro lagran suertede tenerla,depoderhablar con ella,deque est en esepequeo

convento rezandopor todos.Ami hermanopor ser tan trabajador ypor tener tan buencorazn.

ARaquelporlos24aosdeamistad,porlostresaosdecompartirpiso,porabrirtucoraznsiempre,portufuerzadevoluntad,porquehemoscompartidomucho

Amiscompisdepisodelltimoaoymedio,porlasconversacionesdelsaln,porlalibertaddeestacasa,aMaraporlospaseosdelosltimostiempos,poresediscoquemegrabasteyquenuncadejardeescuchar,aAnaMerinoporlosintentosdemagdalenasyeltriunfodelbizcocho,portantasconversacionesespirituales,porsertanalegreyvivaz,aAnaBarqueroporsuhumor,porpreocupartepormiaaltashorasdelamadrugada,aBeaporsertangenerosa,pordarsinpreguntar,ojalatodoelmundopudieratenerunascompaerasdepisotangenialescomoellas.

A los chavales de Fundamipf sobre todoQuique, Irene (Lala) y Laurita porqueconocerlesesunadelasmejorescosasquemehapasadoenlavidaydelasquemsmehacambiado,porquesihehecholatesisenestelaboratorioesgraciasaencontrarmeconellos.

AlgrupodeSan Jorge,a loschavales,por la felicidadque transmits,por todas lassonrisas, besos y abrazos que me habis regalo durante estos dos aos, por loscampamentos,porelclubde losmartesy lascelebracionesde losdomingos.Graciasa lospadres y a todos losmonitores con los que he aprendido a cuidar y disfrutar de estoschavalestanespeciales.

AmisamigosdeSegoviapor losmsde10aosque llevamos juntos,porquecadavezquevuelvoaSegoviaescomosinuncamehubieraido.

Alagentedelokosporhacermedisfrutarencadaviajeyencadapartido.Ami comunidaddeMirto con la que he crecido espiritual y humanamente estos

aos,aPablo,Marisa,Gabriella,MaraJos,MaraKika,Jorge,Vanesa,Abraham,Noem,MaraCasado,Carmen,Quique,Javi,David,Pepa.Enfin,muchasgraciasatodos.

A mis padres:HilarioyPilar

SUMMARY In this work, we have investigated specific mutation therapies in metabolicgeneticdiseases,specificallywehaveanalyzedthemechanismsunderlyingcofactorandcoenzyme responsiveness in phenylketonuria (PKU), propionic acidemia (PA),methylcrotonylglycinuria (MCG) and methylmalonic aciemia (MMA) and splicingtherapiesinPA. WehaveidentifiedthemutationspresentinSpanishPKUpatientswhorespondto BH4 and we have selected some mutations associated to responsiveness forexpression analysis.We have analyzed in total 14missensemutations using differentprokaryote,eukaryoteandcellfreesystems.Fivemutationswereexpressed invitro inE.coli as MBPPAH fusion proteins, we have determined PAH steadystate kineticproperties in order to detect possible defects in BH4 affinity. The majority of themutations affected kinetic and regulatory properties. Only one mutation showedslightly reduced affinity for the cofactorunder steadystate conditions.Wehave alsomeasured the degradation rates of 11mutant PAH proteins expressed in a cellfreesystem,usingpulsechaseanalysisandpresenceorabsenceofBH4anddeterminedtheamountofthreeofthemutantproteinsaftertransfectioninHep3BasFLAGPAHfusionproteinsinpresenceofdifferentlevelsofBH4.TheresultsshowthathighconcentrationsofBH4 protectsomemutantproteinsagainstdegradationandresult inan increase inthesteadystateamountsofprotein inhepatomacells.Inthehepatomacellularmodel,BH4levelsdontaffecttheexpressionofthePAHgene.

InMMAcblB typewehave selected twomutationspreviouslyassociatedwithresponsiveness