ESTANDARIZACIÓN DE UN PROTOCÓLO DE CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE Mycobacterium tuberculosis A PARTIR DE MUESTRAS DE ESPUTO DE PACIENTES CON

DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS DE LA POBLACIÓN INDÍGENA WIWAS Y KOGUIS DE LA SIERRA NEVADA DE SANTA MARTA

JORGE FUENTES RIVEIRA

SANDY ROMERO MOLINA

DIRECTOR

ANDERSON RAMIREZ AYALA

LIC. EN BIOLOGÍA

MAGISTER EN GENETICA HUMANA

ASESORA

MARIA CECILIA YANETH GIOVANETTY

BACTERIOLOGA

MAGISTER EN CIENCIAS BASICAS

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO

VALLEDUPAR-CESAR

2013

ESTANDARIZACIÓN DE UN PROTOCÓLO DE CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE Mycobacterium tuberculosis A PARTIR DE MUESTRAS DE ESPUTO DE PACIENTES CON

DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS DE LA POBLACIÓN INDÍGENA WIWAS Y KOGUIS DE LA SIERRA NEVADA DE SANTA MARTA

JORGE FUENTES RIVEIRA

SANDY ROMERO MOLINA

DIRECTOR

ANDERSON RAMIREZ AYALA

LIC. EN BIOLOGÍA

MAGISTER EN GENETICA HUMANA

ASESORA

MARIA CECILIA YANETH GIOVANETTY

BACTERIOLOGA

MAGISTER EN CIENCIAS BASICAS

DOCENTE

TANNIA DAVID VENEGAS

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO

VALLEDUPAR-CESAR

2013

1. PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA

1.1 FORMULACIÓN

Durante toda su historia, la especie humana ha sido periódicamente atacada por diferentes agentes biológicos que han puesto en peligro su propia existencia. Uno de estos microorganismos es el Mycobacterium tuberculosis, causante de la enfermedad infecciosa denominada tuberculosis; la cual se transmite de persona a persona por inhalación de aerosoles contaminados por el microorganismo, que ha sido eliminado por los individuos enfermos al toser, hablar o estornudar. (Fernández, H; et al. 2009).

Investigaciones realizadas indican que desde el año 2003 fallecen anualmente aproximadamente 2 millones de personas a causa de esta enfermedad, fundamentalmente en países en vías de desarrollo, para este mismo año, de acuerdo a estimaciones de la OMS, hubo 502.605 casos prevalentes, 370.107 casos nuevos de tuberculosis en todas las formas (Pulmonar y Extrapulmonar) y 53.803 muertes; con tasa de incidencia estimada para tuberculosis en todas las formas (Pulmonar y Extrapulmonar) de 43 por 100.000 habitantes, con variaciones de 323 para Haití y menos de 5 por 100.000 habitantes, para Estados Unidos. Diecisiete países presentaron tasas de incidencia estimada de TBC todas las formas superiores al promedio de la Región Latinoamericana, concentrando el 82% de los casos nuevos estimados y en el 43% de la población. Finalmente en España, se produjeron en 2004, 25 casos de tuberculosis por cada 100.000 habitantes (es decir una incidencia de 25/100.000). (Plan regional De tuberculosis, 2006).

Se ha estimado que la tercera parte de la población mundial, en su mayoría pertenecientes a los países del tercer mundo se encuentra infectada por esta bacteria. Sin embargo, solamente entre el 5-10% de esta población desarrolla la enfermedad en su forma activa, mostrando síntomas clínicos en los primeros 2 años (TBC primaria) o más tarde (reactivación) (Santiago et al., 2005; Al-Attiyah et al., 2006).

La TBC es considerada en la actualidad por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como emergencia mundial, la cual ha reportado la existencia de 8 millones de nuevos casos, con una mortalidad estimada de 3 millones de personas por año. Esta entidad estimó que para el año 2007 que en el mundo se presentaron 9,27 millones de casos nuevos de TB, es decir, 139 casos por 100.000 habitantes, mostrando un incremento en el número de casos con relación a los presentados en el año 2006 (9,24 millones de casos nuevos). Regiones como Asia (55% de los casos) y África (31% de los casos) registran la mayor concentración de casos. India (2,0 millones casos), China (1,3 millones casos). (Jiménez et al., 2001; Castro et al, 2005).

Así mismo, en el reporte publicado en el 2008 por esta misma organización, África, fue el continente que mostro mayor tasa de incidencia mientras que en las Américas, el índice de mortalidad fue de 5 casos por cada 100 000 habitantes, siendo Brasil, Haití, y Perú los países con más alto índices de fallecidos. En Cuba, la tasa registrada en el 2007 fue de 6.7 x 100 000 habitantes, la mortalidad en los últimos 7 años no ha tenido variaciones significativas y se ha mantenido por debajo de 1 x 100 000 habitantes. (Organización Mundial de la Salud; 2008).

En Colombia se reportan anualmente más de 11.000 casos nuevos de tuberculosis, lo que indica que aún sigue siendo un serio problema de salud pública. Durante el año 2008 se notificaron 11.342 casos nuevos, para una incidencia de 25,6 casos por 100.000 habitantes, de los cuales 6.815 (60,08%) ocurrieron en hombres y 4.527 en mujeres (39,91%); en cuanto a la TB infantil, se identificaron 719 casos (6,3%) los cuales ocurrieron en población menor de 15 años, para una incidencia de 5,47 casos por 100.000 menores de 15 años. (Luque, R; et al; 2009).

A pesar de los avances tecnológicos, el mejoramiento de la calidad de vida y el mayor acceso a los servicios de salud, la Tuberculosis continúa siendo un gran problema de salud pública a nivel global, con cerca de 9 millones de casos nuevos y más de un millón y medio de muertos cada año. Cabe resaltar que para el año 2007 en Colombia la incidencia de esta enfermedad en todas sus formas fue de aproximadamente 35 casos por 100.000 habitantes; y en el año 2006 se reportaron 11.122 casos de tuberculosis, de los cuales 10.696 fueron nuevos, para una tasa de incidencia de 24 por 100.000 habitantes. (Luque, R; et al; 2009).

La incidencia de esta patología en el departamento del Cesar en los últimos años presentó cifras que oscilaron entre 28.3 casos por 100.000 habitantes; en 1999 paso a 23 por 100.000 habitantes, en el 2000 ocasionado por el incremento en los casos reportados por las comunidades indígenas del departamento y en el año 2005 con una incidencia mayor de 37.1 casos por 100.000 Habitantes, (Organización Panamericana de la Salud, 2007).

1.2 JUSTIFICACIÓN

Hace aproximadamente dos décadas, la irrupción y el posterior desarrollo de las técnicas de biología molecular en el mundo de la microbiología clínica han supuesto un gran avance en el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Uno de los campos más notables de aplicación han sido las infecciones por micobacterias; destaca la tuberculosis (TB) que es, con mucho, una de las enfermedades infecciosas más importantes que asolan a la humanidad. (Alcaide, F; 2009).

Contextualizando un póco acerca de la importancia del diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis, es importante mencionar que tradicionalmente, el diagnostico microbiológico de la TB se ha fundamentado en la baciloscopia, el cultivo y la identificación fenotípica. Si bien el método más rápido, sencillo, económico y disponible es la baciloscopia, su escasa sensibilidad (del 45 al 80% de los cultivos positivos) ha limitado su utilidad, especialmente en las zonas geográficas de menor incidencia de la enfermedad y en las formas extrapulmonares (paucibacilares) de esta. Además, hay que tener en cuenta que un porcentaje nada despreciable (17%) de la transmisión tuberculosa se debe a pacientes con baciloscopia negativa y cultivo positivo. Hoy en día el cultivo continúa siendo el método de referencia por su sensibilidad y por permitir acceder a estudios posteriores con el aislado micobacteriano (identificación, sensibilidad y tipificación epidemiológica). Sin embargo, la lentitud de crecimiento del bacilo tuberculoso representa el mayor inconveniente para un diagnóstico rápido de la enfermedad. (Alcaide, F; 2009).

A pesar de que es cierto que el cultivo ha tenido un desarrollo espectacular mediante los nuevos medios y sistemas más o menos automatizados para la detección de Mycobacterium tuberculosis; para la ejecución de estos sistemas de cultivo, aún se requieren varias semanas para alcanzarla confirmación microbiológica definitiva, y más aún con los procedimientos de identificación fenotípicos. Por todo esto, en los últimos años se han desarrollado nuevos métodos para el diagnóstico rápido de la TB activa, y los moleculares o genotípicos son la mejor alternativa. (Oyola; A; et al; 2012).

De igual forma, es de vital importancia mencionar que uno de los aspectos más relevantes y controvertidos sobre la aportación de la biología molecular en el diagnóstico de la TB es la detección directa de Mycobacterium tuberculosis de la muestra clínica. Es indudable que el diagnóstico rápido (de 24 a 48 horas) de la TB activa representa uno de los mayores retos en el control de la enfermedad, ya que posibilita una intervención epidemiológica (aislamiento y estudio de contactos) y tratamiento precoz, que incrementa las posibilidades de interrupción de la transmisión infecciosa. (García, G; et al; 2010).

En los últimos 15 años se han desarrollado muchas técnicas moleculares (comerciales y caseras), si bien todas se fundamentan en la amplificación de secuencias genéticas (ADN o ARN) especıficas del complejo Mycobacterium tuberculosis y su posterior detección, lo que no implica necesariamente la viabilidad de la micobacteria. A pesar del ingente número de trabajos publicados hasta la fecha, no hay evidencia científica sólida, unánime y concluyente sobre el tema. Pese a todo esto, cabe resaltar que los métodos moleculares son capaces de detectarla presencia de Mycobacterium tuberculosis en el 80 al 90% de los pacientes con sospecha clínica de tuberculosis pulmonar, varias semanas antes que el cultivo convirtiéndose esto en una ventaja de gran importancia en comparación con el diagnostico tradicional. (Barrera, L; 2007).

En resumen, si bien las técnicas de biología molecular no pueden hoy por hoy sustituir completamente a la metodología tradicional en el diagnóstico de la TB, son un pilar fundamental en el diagnóstico rápido de esta. La gran variedad de métodos disponibles y en constante evolución, así como los diferentes grados de aplicación, ha conllevado la instauración progresiva e imprescindible de esta tecnología, en la mayoría de los laboratorios de microbiología clínica de los países desarrollados. (Esparcia, O; et al; 2012).

De acuerdo a lo antes mencionado, con este proyecto se pretende estandarizar un protocólo de caracterización molecular de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras de esputo provenientes de pacientes con sospecha clínica de tuberculosis; debido a que el aislamiento en cultivo del microorganismo es lento parámetro que atrasa el diagnóstico oportuno de la tuberculosis, así mismo se hace necesario realizar el presente estudio porque hasta la fecha en la región son pocas las investigaciones basados en diagnóstico molecular de la patología como tal .

2. OBJETIVOS

2.1. GENERAL

Estandarizar un protocólo de caracterización molecular de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras de esputo de pacientes con diagnostico de tuberculosis de la población indígena Wiwas y Koguis de la sierra nevada de Santa Marta

2.2. ESPECIFICOS

Realizar la extracción de ADN de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras de esputo provenientes de pacientes con diagnostico de tuberculosis, para su posterior amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa.

A. Obtención de muestras a partir del laboratorio de salud publica departamental.

B. Cultivo de las muestras C. Extracción de ADN por medio del kit comercial wisar genomics de

promega

Cuantificar la concentración de ADN extraído de las muestras de esputo analizadas, con el fin de que se garantice una mejor amplificación del Gen de interés

A. Realizar un corrido electroforético en gel de Agarosa 6% para evidenciar y cuantificar el ADN extraído de las muestras.

Amplificar el Gen IS6110 presente en las muestras de esputo mediante la técnica de Reacción en cadena de la Polimerasa con el fin de que se identifiquen los pacientes positivos para Mycobacterium tuberculosis

B. Probar tiempos y temperaturas en el procedimiento de extracción de ADN.

C. Probar las concentraciones y las cantidades de las enzimas que participan en el proceso.

D. Realizar electroforesis en gel de agarosa para verificar que el fragmento amplificado corresponda al marcador de peso |molecular.

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3. MATERIALES Y METODOS

3.1 CLASIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

Estudio de tipo descriptivo

3.2 POBLACIÓN DE ESTUDIO Y MUESTRA

Debido a que es un estudio en el cual se pretende estandarizar un protocolo de caracterización molecular del Mycobacterium tuberculosis se trabajará con 30 muestras de esputo (15 de pacientes wiwas y 15 de pacientes koguis) proveniente de pacientes con diagnostico de tuberculosis pulmonar, dichas muestras serán suministradas por el laboratorio de salud pública departamental.

3.3 DISEÑO METODOLÓGICO

Este proyecto de investigación se dividirá en tres etapas:

PRIMERA ETAPA: OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS

El trabajo incluirá 30 muestras correspondientes a pacientes con diagnostico de tuberculosis pulmonar pertenecientes a la población indígena Wiwas y Koguis en la sierra nevada de Santa Marta; de cada uno de ellos se obtendrá igual número de muestras clínicas correspondientes a esputo (1 muestra por pacientes); las cuales serán obtenidas a través del laboratorio de la secretaria de salud departamental.

En lo correspondiente al manejo de las muestras tras su obtención cabe aclarar que estas deben venir en frascos tapa rosca en material de polipropileno, previamente rotuladas con su respectivo código de identificación del paciente, su transporte será en cavas de icopor con pilas de hielo manteniendo la cadena de frio para garantizar así su conservación hasta llegar al lugar de destino que será el laboratorio de investigación de Genética y Biología molecular de la Universidad de Santander sede Valledupar; dichas muestras serán procesadas de forma inmediata tras su llegada.

SEGUNDA ETAPA: PROCESAMIENTO DE MUESTRAS, EXTRACCIÓN DE ADN, PURIFICACIÓN DE ADN Y AMPLIFICACIÓN DE LA SECUENCIA IS6110

Para concentrar y neutralizar las muestras, se agregara un volumen igual de Hidróxido de Sodio (NaOH) al 4%, se mezclara en vórtex y, posteriormente se centrifugara durante 15 min a 3,500 rpm. El sobrenadante se descartara y al precipitado se le agregara 20 ml de agua destilada estéril, mezclando en vórtex y se centrifugara a 3,500 rpm durante 15 min. Se repite este paso hasta que el botón de células se observe limpio, se diluirá el botón en 750 ul de solución amortiguadora TE pH 8.0 (Tris HCl 100mM y EDTA 1mM).

Para obtener el ADN de la muestra, el botón del paso anterior se inactivara por ebullición durante 20 minutos. Luego, se adicionaran 50 μl de lisozima, 10 mg/ml (SIGMA) y se incubara a 37 °C durante 2 horas; posteriormente, se adicionara 70 μl de SDS 10% y 10 μl de proteinasa K de 10 mg/ml y se incubara a 65 °C por 10 minutos; y posteriormente, se agregara 100 μl de NaCl 5M y CTABNaCl para incubar a 65 °C por 10 minutos. Se confirmara la concentración y pureza del ADN obtenido mediante espectrofotometría.

La reacción de amplificación se llevara a cabo en un volumen final de 25 ul usando 100 ng de ADN genómico, 1.5 U de enzima Taq Polimerasa y 160 uM de cada iniciador, cuya secuencia es: TB1: CCTGTCCGGGACCACCCGCGGCAA y TB2: GGATCCTGCGAGCGTAGGCGTCGG, que generan un producto de 200 pares de bases (pb) de la secuencia de inserción IS6110 del Mycobacterium tuberculosis, bajo las condiciones siguientes: desnaturalización inicial de 95°C durante 5 min, seguido por 40 ciclos a 95 °C durante 1 min, 60°C durante 1 min, y 72°C durante 1 min. Los fragmentos amplificados se separaran mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% y teñidos con nitrato de plata.

Cada ensayo de amplificación incluirá un control positivo (ADN de la cepa referencia de M. tuberculosis y un control negativo (mezcla de reacción y agua). Para descartar falsos negativos, se repetirá el ensayo añadiéndole al tubo de reacción con la muestra problema 50ng de ADN de la cepa referencia. Los especímenes se consideraran positivos cuando se observe en el gel un fragmento de 200 pb y negativos al no encontrar éste resultado.

TERCERA ETAPA: PRESENTACION DEL PROTOCOLO DE CARACTERIZACION MOLECIULAR DE Mycobacterium tuberculosis

Tras obtener los resultados de los procedimientos realizados y descritos en la segunda etapa de la presente investigación, se procederá a la elaboración del protocólo de caracterización molecular del microrganismo causante de la tuberculosis pulmonar; dicho protocolo se basara en cada uno de los pasos que que se llevaron a cabo al momento de la obtención de las muestras y su procesamiento que va desde la extracción, purificación de ADN y amplificación de la secuencia del gen IS6110.

3.4 VARIABLES DE ANALISIS

Tiempo de duración del procedimiento, concentración y cantidad de los reactivos,

temperaturas utilizadas.

3.5 SISTEMA DE HIPOTESIS

Debido a que la presente investigación es de carácter descriptivo más no experimental se ha establecido que no aplica sistema de hipótesis.