Microsoft Word - PCR bis

INTRODUCCINEl diagnstico de las enfermedades infecciosas se realiza mediante la deteccin directa e indirecta de los agentes infecciosos. Mediante los mtodos directos se detectan las partculas de los agentes infecciosos y/o sus componentes, tales como los cidos nucleicos, las protenas estructurales y no estructurales, los enzimas, etc. Los mtodos indirectos ponen de manifiesto los anticuerpos inducidos por las infecciones.Los mtodos ms comunes de deteccin directa son: el aislamiento o el cultivo in vitro, la microscopa electrnica, la inmunofluorescencia, la inmunohistoqumica, el enzimoinmunoensayo (ELISA para antgenos), la hibridacin de cidos nucleicos (NAH), las micromatrices y macromatrices y las diversas tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos, tales como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o los mtodos de amplificacin isotrmica, como por ejemplo la amplificacin basada en la secuencia del cido nucleico (NSABA), la amplificacin isotrmica mediada por bucles (LAMP). Tambin se denominan mtodos de diagnstico molecular, puesto que los ensayos de NAH, de macro y micromatrices y los diversos ensayos de amplificacin tienen como objetivo las molculas de cidos nucleicos.Los mtodos indirectos ms comunes de deteccin del agente infeccioso son las pruebas serolgicas tales como: la neutralizacin vrica, la deteccin de anticuerpos mediante el ELISA y las pruebas de inhibicin de la hemoaglutinacin,a las que se han incorporado otras ms novedosas, tales como el mtodo de los biosensores, la bioluminometra, el mtodo de la fluorescencia polarizada, los ensayos de quimioluminiscencia, etc. En general, los laboratorios de diagnstico aplican simultneamente los dos mtodos para garantizar un diagnstico seguro.Las experiencias de las dos ltimas dcadas indican que las tcnicas de la PCR finalmente sustituirn a muchos de los mtodos directos clsicos de deteccin de agentes infecciosos. Est claro que la PCR est reemplazando el aislamiento de virus o el cultivo de bacterias para la deteccin de agentes que son difciles o imposibles de cultivar. Hay varias razones para esta tendencia, teniendo en cuenta que el aislamiento de los virus requiere: i) la presencia de los microorganismos que se replican (virus o bacterias); ii) cultivos celulares caros y el mantenimiento de las instalaciones; iii) hasta varias semanas para completar el diagnstico en algunas ocasiones; y iv) una pericia especial, que se est perdiendo o disminuyendo hoy en muchos laboratorios. Aunque los ensayos de la PCR inicialmente eran caros y engorrosos, hoy en da son herramientas relativamente baratas, seguras y fciles de utilizar en los laboratorios de diagnstico (2, 4, 6, 7, 11, 13). Generalmente, la sensibilidad y la especificidad de la PCR son mayores que los procedimientos ELISA de captura del antgeno.La introduccin de varios mtodos de la PCR en tiempo real, de robots para la extraccin del cido nucleico y de estaciones de trabajo automatizadas ha dado como resultado hoy en da a un gran volumen de trabajo y a ensayos muy fiables, rpidos y slidos para el diagnstico molecular.

Principios de la tcnica de PCRLa reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) implica que en el ensayo hay una reaccin de amplificacin basada en enzimas. El trmino "reaccin en cadena" se refiere a varios ciclos de copiado de un tramo especfico de ADN, en este caso a partir del genoma del agente infeccioso. La regin que hay que amplificar est definida por dos (o ms) secuencias de nucletidos cortos denominados sitios de los cebadores, que flanquean a la secuencia diana. Los cebadores, oligonucletidos cortos que son complementarios a los sitios de los cebadores, se unen a las hebras de ADN para ser copiadas. Utilizando una polimerasa que no se desnaturalice durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la secuencia diana uniendo los nucletidos libres a los cebadores. Repitiendo el rgimen de ciclos de calentamiento de 20 a 40 veces, la cantidad de ADN diana copiado que se obtiene aumenta de forma exponencial, produciendo suficiente para operaciones posteriores, tales como la deteccin, la clonacin y la secuenciacin. La sensibilidad de diagnstico de la PCR es muy alta, porque se producen varios millones de copias de la diana seleccionada. La especificidad de la reaccin puede ser tambin muy alta, ya que est determinada por las secuencias especficas de nucletidos de la diana seleccionada, as como por el diseo del cebador. Los cebadores pueden disearse para detectar secuencias especficas de nucletidos en los genomas de los agentes infecciosos diana seleccionados o pueden disearse para ser complementarios de regiones ms conservadas, permitiendo de este modo la deteccin de miembros dentro de una familia o gnero del agente infeccioso. Se ha publicado una sinopsis ms detallada de las tcnicas moleculares (17).

Amplificacin del ADNSi el genoma del agente infeccioso es de ADN, la amplificacin se realiza directamente, con o sin purificacin previa del ADN diana. En muchos casos el empleo de ADN extrado y purificado del material que se va a utilizar en la prueba, dar como resultado un aumento en la sensibilidad analtica y diagnstica.

Amplificacin del ARN (PCR de trascripcin inversa)Los genomas de muchos agentes infecciosos contienen cido ribonucleico (ARN) que no se puede amplificar directamente mediante la PCR. Para la amplificacin por PCR se necesita un ADN diana monocatenario, y ste no est disponible en los virus de ARN. El problema puede resolverse por la adicin de una etapa antes de comenzar la PCR. Utilizando la transcriptasa inversa, el ARN se puede transcribir a ADN complementario (ADNc), que es ADN de doble cadena y, por tanto, se puede usar en el ensayo de la PCR (el procedimiento se denomina PCR de trascripcin inversa: RT-PCR). Tradicionalmente, la reaccin de trascripcin inversa se realiza en un tubo aparte y el ADNc producido se transfiere despus a un tubo nuevo para la reaccin de la PCR. Sin embargo, ya se dispone de polimerasas de ADN termoestables con actividad transcriptasa inversa y tampones especficos en los cuales las polimerasas RT y ADN estn activas. Ambas permiten una reaccin RT-PCR que tiene lugar en el mismo tubo en secuencia directa sin manipulacin adicional y con menos probabilidad de seguir contaminando. En la mayora de los casos ser necesario extraer y purificar el ARN antes de la trascripcin inversa.

Deteccin del amplmero por la PCREl producto PCR o amplmero puede detectarse utilizando varios procedimientos. El ms comn incluye la deteccin no especfica del producto de la PCR, basada en una medida amplmera utilizando electroforesis en gel de agarosa y tiendo el ADN con un tinte intercalado no especfico, como el bromuro de etidio (ahora es posible reemplazar este ltimo con tintes no cancergenos, por ejemplo GelRed, o el reconocimiento especfico de la secuencia diana amplificada utilizando una transferencia de ADN por Southern blot seguido de hibridacin con sondas de oligonucletidos complementarias de la secuencia diana. Las sondas de hibridacin pueden ser, enzima, marcado como quimioluminiscente o radionucletido para permitir la deteccin de la secuencia diana especfica.

Ms adelante se dan algunos ejemplos de mtodos de la PCR utilizados actualmente.PCR convencionalEn la "PCR convencional" (o simplemente PCR) se utiliza un par de cebadores oligonucletidos para amplificar una parte pequea del genoma del agente infeccioso. La sensibilidad analtica es relativamente alta con un nmero mnimo de 100 a 1000 copias de ADN diana detectable. La especificidad analtica puede ser alta, dependiendo de la seleccin de la diana, del cebador designado, y de la optimizacin de la prueba. La sensibilidad y especificidad analticas se pueden mejorar mediante la aplicacin de la PCR anidada (vase ms adelante el punto 3). La especificidad y la sensibilidad se pueden mejorar posteriormente utilizando el mtodo

Southern blot seguido de las sondas de hibridacin, pero esto lleva mucho tiempo y requiere el manejo en el laboratorio de ADN amplificado, y la interpretacin de los resultados puede ser tcnicamente subjetiva. Esta deteccin de los mtodos, basada en la complejidad y los gastos, no es una prctica comn hoy en da en los laboratorios de diagnstico.PCR anidadaEn los ensayos de la PCR anidada se utilizan dos ciclos de amplificacin con cuatro cebadores, denominados cebadores externos e internos. En general, los ensayos de la PCR anidada proporcionan una sensibilidad y especificidad analticas superiores si se comparan con las pruebas de la PCR convencionales. Sin embargo existe un alto riesgo de contaminacin cruzada dado que los productos de la primera tanda de amplificacin se utilizan a menudo como molde inicial para la segunda tanda, dando como resultado la transferencia de material entre los diferentes tubos de PCR. La PCR anidada ha sido ampliamente reemplazada por los protocolos de la PCR en tiempo real, los cuales son igualmente sensibles, pero tienen un riesgo de contaminacin mucho menor. La sensibilidad analtica es tpicamente