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CONTROL
BIOLÓGICO
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CONTROL BIOLÓGICO DE LA BROCA DEL CAFÉ Hypothenemus hampei FERR.
(COLEOPTERA:CUCURLIONIDAE) CON EL HONGO ENTOMOPATÓGENO
Metarhizium anisopliae (METCH.) SOROKIN (MONILIALES:MONILIACEAE) EN
HUIXTLA, CHIAPAS
Víctor Manuel Díaz-Vicente, José Nelson Pérez-Quintanilla, Ricardo Magallanes-Cedeño, Erika Patricia Pinson-
Rincón, Martha Elena de Coss-Flores y Mario Ernesto Cabrera-Alvarado. Universidad Autónoma de Chiapas
Facultad de Ciencias Agrícolas. Carretera Costera Entronque Estación Huehuetán, Huehuetán, Chiapas.
RESUMEN. Se evaluó el efecto de diferentes dosis del hongo Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin para el control de
Hypothenemus hampei Ferr. en el Ejido Barrio Brasil, municipio de Huixtla, Chiapas. Se utilizó un diseño experimental en una
distribución en bloques al azar con seis tratamientos y cinco repeticiones. Se midieron cuatro variables: porcentaje de infestación,
mortalidad y abandono de la broca y el porcentaje de incidencia del hongo M. anisopliae. La mayor infestación, menor mortalidad
y menor abandono de la broca fue para el tratamiento testigo sin aplicación con 8.30%, 0.00% y 9.28%, respectivamente. Y la
menor infestación, mayor mortalidad y abandono fue para el tratamiento de mayor dosis (1.00 kg ha-1 a una concentración de
2.3X10 conidios por ml) de M. anisopliae con 1.86%, 22.66% y 34.40% respectivamente. La incidencia de M. anisopliae fue
mayor en el tratamiento de mayor dosis con 28.10% y el testigo sin aplicación fue de 0.00%.
Palabras clave: Coleoptera, concentración, dosis, mortalidad, incidencia.
ABSTRACT. It was evaluated the effect of different doses of the fungus Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin for control of
Hypothenemus hampei Ferr. in Ejido Barrio Brasil, Huixtla, Chiapas. Experimental design in a distribution in random blocks with
six treatments and five repetitions was used. Four variables were measured: percentage of infestation, mortality and abandonment
of the coffee berry borer and the percentage of incidence of the fungus M. anisopliae. The largest infestation, lower mortality and
lower abandonment of the borer were for the control without application with 8.30%, 0.00% and 9.28% respectively. And the
lower infestation, largest mortality and abandonment was for the higher dose treatment (1.00 kg ha-1 at a concentration of 2.3X10
conidia per ml) of M. anisopliae with 1.86%, 22.66% and 34.40% respectively. The incidence of M. anisopliae was higher in the
higher dose treatment with 28.10% and the control without the application was 0.00%.
Key Word: Coleoptera, concentration, dose, mortality, incidence.
Introducción
El cultivo del café se ubica entre los Trópicos de Cáncer y Capricornio, se cultiva en todo
el mundo a excepción de Europa. Las mayores producciones de café provienen de Brasil,
Colombia, Centro América, México. Puerto Rico, Jamaica, Camerún, Costa de Marfil, Vietnam,
Indonesia, Java, India, Sumatra, Australia y Hawai, entre otros (Álvarez, 2006). La broca del
grano de café Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera:Curculionidae Scolytinae) es la
principal plaga en todos los países productores de café, la hembra perfora los frutos y oviposita
en el endospermo, los cuales eclosionan y dan origen a las larvas que se alimentan del grano y
causan grandes pérdidas económicas (Mathieu et al., 1999; y Damon, 2000). La reproducción de
H. hampei presenta una alta endogamia, en la que la broca colonizadora da lugar a una progenie
de muchas hembras, y pocos machos. Los machos no vuelan y permanecen en el fruto y las
hembras copulan con sus hermanos lo cual ocurre antes de salir de los frutos para ir a colonizar
nuevos frutos de café. Este aspecto es acentuado por el mecanismo de la haplodiploidía funcional
en el cual tanto las hembras como los machos son diploides, pero estos últimos fallan en expresar
y transmitir los cromosomas paternos (Brun et al. 1995). Recientemente, se ha propuesto un
mecanismo para explicar el comportamiento reproductivo de la broca que tiene que ver con la
determinación sexual, en el que predominan las hembras sobre los machos. Ninguno de los siete
cromosomas presentes en su forma haploide en la broca han sido ligados a la determinación
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sexual, se sugiere que probacterias del género Wolbachia, encontrada recientemente como un
endosimbionte en la broca, es la causante de la determinación sexual (Vega et al., 2002), de la
misma forma como ha sido descrita en otras especies de insectos (Benavides, 2005).
Materiales y Método
El presente trabajo se realizó en el Ejido Barrio Brasil, ubicado en el municipio de Huixtla
Chiapas a 940 metros sobre el nivel del mar. El clima AC m, semicálido con lluvias en verano
(García 1981).
Se utilizó un diseño experimental con una distribución en bloque al azar, con seis
tratamientos y cinco repeticiones, los tratamientos evaluados fueron diferentes dosis del hongo
M. anisopliae a una concentración de 2.3X10
conidios por ml (Cuaro1)
Cuadro 1. Tratamientos en el control biológico de la broca del
café Hypothenemus hampei Ferr. con el hongo
entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.)
Sorokin en Huixtla, Chiapas.
Tratamiento Dosis
A 0.2 kg ha-1
B 0.4 kg ha-1
C 0.6 kg ha-1
D 0.8 kg ha-1
E 1.0 kg ha-1
F Testigo Sin Aplicación.
Se midieron cuatro variables: porcentaje de infestación, se contaron los frutos sanos e
infestados por la broca, porcentaje de mortalidad, se disectaron los frutos brocados para observar
si el insecto estaba vivo o muerto, porcentaje de abandono, se disectaron los frutos con la
finalidad de observar presencia o ausencia de la broca y el porcentaje de incidencia del hongo M.
anisopliae, donde se observó la emergencia del micelio del hongo sobre el cuerpo de la plaga.
Los datos de las variables a medir fueron transformados a arc sen √porcentaje antes de realizar el
análisis de varianza, donde se observaron diferencias significativas entre tratamientos, se utilizó
la prueba de Tukey con un α = a 0.0 (Reyes, 1980).
Resultados y Discusión
En el cuadro 2 se observa que existe una diferencia altamente significativa entre los
tratamientos. Posteriormente se realizó la comparación de medias (Cuadro 3), en donde el
tratamiento que presentó mayor infestación por broca fue el testigo sin aplicación (8.30%),
seguido del tratamiento de menor dosis (0.2 kg ha-1
) con 6.56%. Estos dos tratamientos son
estadísticamente iguales. Tratamiento B, C, D y E a dosis de 0.4, 0.6 0.8 y 1.0 kg ha-1
con una
infestación de 3.20%, 2.80% 2.02% y 1.86%, respectivamente, fueron estadísticamente iguales y
todos por abajo del umbral económico para esta plaga que es de 5.00%. Lo que puede presentar
otra alternativa de control de la broca.
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Cuadro 2. Análisis de varianza del porcentaje de infestación de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr. con el
hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin en Huixtla, Chiapas.
Fuentes de
Variación GL SC CM F cal.
F tablas
0.05 0.01
Tratamientos 5 314.215820 63.843163 18.3100** 2.71 4.10
Bloques 4 34.958984 8.739746 2.5476 2.87 4.43
Error 20 68.610596 3.430553
Total 29 417.785400
** Altamente significativa
Cuadro 3. Comparación de medias del porcentaje de infestación de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr. con
el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin en Huixtla, Chiapas.
Tratamientos Porcentaje Observado*
Campo Transformado
F Testigo Sin Aplicación 8.30 16.27 a
A 0.2 kg ha-1
6.56 14.81 a
B .0.4 kg ha-1
3.20 10.24 b
C 0.6 kg ha-1
2.80 9.60 b
D 0.8 kg ha-1
2.02 8.15 b
E 1.0 kg ha-1
1.86 7.83 b
* Promedio con la misma letra son estadísticamente iguales según prueba de Tukey a un α = 0.0 de probabilidad.
Porcentaje de mortalidad. En los cuadros 4 y 5 se observan el análisis de varianza
(diferencia altamente significativa entre los tratamientos) y la comparación de medias se puede
notar que el tratamiento de la dosis más alta (tratamiento E 1.0 kg ha-1
) fue el que presentó mayor
mortalidad de la broca de café (22.66%) y la dosis más baja, tratamiento A 0.2 Kg ha-1
causó
10.46% de mortalidad y el tratamiento F testigo sin aplicación presentó 00.00% de mortalidad.
Cuadro 4. Análisis de varianza del porcentaje de mortalidad de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr.on el
hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.) Sororokin en Huixtla, Chiapas.
Fuentes de
Variación GL SC CM F cal.
F tablas
0.05 0.01
Tratamientos 5 2,484.805664 496.961121 394.7165** 2.71 4.10
Bloques 4 4.839844 1.209961 0.9610 2.87 4.43
Error 20 25.180664 1.259033
Total 29 2,514.826172
** Altamente significativa
Cuadro 5. Comparación de medias del porcentaje de mortalidad de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr.con
el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin en Huixtla, Chiapas.
Tratamientos Porcentaje Observado*
Campo Transformado
E 1.0 kg ha-1
22.66 28.39 a
D 0.8 kg ha-1
17.06 24.37 b
C 0.6 kg ha-1
14.68 22.52 bc
B .0.4 kg ha-1
13.60 21.63 c
A 0.2 kg ha-1 10.46 10.85 d
F Testigo Sin Aplicación 0.00 00.00 e
* Promedio con la misma letra son estadísticamente iguales según prueba de Tukey a un α = 0.0 de
probabilidad
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Porcentaje de abandono. En los Cuadros 6 y 7 se observan el análisis de varianza
(diferencia altamente significativa entre los tratamientos) y la comparación de medias se puede
notar que el tratamiento de la dosis más alta (tratamiento E 1.0 kg ha-1
) fue el que presentó mayor
abandono de la broca de café (34.30%) y la dosis más baja, tratamiento A 0.2 Kg ha-1
causó
18.86% de mortalidad y el tratamiento F testigo sin aplicación presentó 9.28% de abandono, esto
concuerda con lo reportado por Díaz et al., (2009) quienes señalan que cuando se aplicó el hongo
Beauveria bassiana para el control de Hypothenemus hampei observaron un abandono de la
broca en forma natural menor de 10.00%.
Cuadro 6. Análisis de varianza del porcentaje de abandono de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr.con el
hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin en Huixtla, Chiapas.
Fuentes de
Variación GL SC CM F cal.
F tablas
0.05 0.01
Tratamientos 5 835.625000 167.125000 39.2892** 2.71 4.10
Bloques 4 12.878906 3.219727 0.7569 2.87 4.43
Error 20 85.074219 4.253711
Total 29 933.578125
** Altamente significativa
Cuadro 7. Comparación de medias del porcentaje de abandono de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr.con
el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin en Huixtla, Chiapas.
Tratamientos Porcentaje Observado*
Campo Transformado
E 1.0 kg ha-1
34.30 35.84 a
D 0.8 kg ha-1
24.58 27.92 b
C 0.6 kg ha-1
21.36 27.52 b
B .0.4 kg ha-1
20.36 26.80 b
A 0.2 kg ha-1 18.86 25.72 b
F Testigo Sin Aplicación 9.28 17.71 c
* Promedio con la misma letra son estadísticamente iguales según prueba de Tukey a un α = 0.0 de probabilidad
En los cuadros 8 y 9 se observan el análisis de varianza (diferencia altamente significativa
entre los tratamientos) y la comparación de medias y se puede notar que el tratamiento de la dosis
más alta (tratamiento E 1.0 kg ha-1
) fue el que presentó mayor incidencia del hongo M. anisopliae
(28.10%) y la dosis más baja, tratamiento A 0.2 Kg ha-1
causó 17.58% de incidencia del hongo
entomopatógeno y el tratamiento F testigo sin aplicación presentó 00.00% de incidencia.
Cuadro 8.Análisis de varianza del porcentaje de incidencia del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae
(Metch.) Sorokin en en Huixtla, Chiapas.
** Altamente significativa
Fuentes de
Variación GL SC CM F cal.
F tablas
0.05 0.01
Tratamientos 5 2,503.624023 500.724792 706.9381** 2.71 4.10
Bloques 4 10.149414 2.537354 3.5821 2.87 4.43
Error 20 14.166016 0.708301
Total 29 2,527.939453
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Cuadro 9. Comparación de medias del porcentaje de incidencia del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae
(Metch.) Sorokin en Huixtla, Chiapas.
Tratamientos Porcentaje Observado*
Campo Transformado
E 1.0 kg ha-1
22.22 28.10 a
D 0.8 kg ha-1
18.00 25.10 b
C 0.6 kg ha-1
14.86 22.86 c
B .0.4 kg ha-1
11.24 19.56 d
A 0.2 kg ha-1 9.16 17.58 e
F Testigo Sin Aplicación 00.00 00.00 f
* Promedio con la misma letra son estadísticamente iguales según prueba de Tukey a un α = 0.0 de probabilidad
Conclusiones
El menor porcentaje de infestación de la broca se observó en el tratamiento de mayor
dosis 1.0 kg ha-1
con 1.86% y el que presentó mayor infestación fue el tratamiento testigo sin
aplicación con 8.30%.
La mayor mortalidad de la broca se presentó en el tratamiento de mayor dosis 1.0 kg ha-1
con 22.66% y el que de menor mortalidad fue el tratamiento testigo sin aplicación con 0.00%.
El mayor porcentaje de abandono de la broca se presentó en el tratamiento de mayor dosis
1.0 kg ha-1
con 34.30% y el menor abandono en el tratamiento testigo sin aplicación con 9.28%.
El mayor porcentaje del hongo M. anisopliae se observó en el tratamiento de mayor dosis 1.0 kg
ha-1
con 28.10%.
Literatura Citada
Álvarez, C. 2006. Distribución geográficas zonas. http://www.federacioncafe.com/Público/El
Cafe/Zonas. asp#>. Revisado el 11 de abril de 2007.
Benavides, P. 2005. Distribución global de la broca del café: la versión molecular. En: Memorias
XXXII Congreso de la Sociedad Colombiana de Entomología (Socolen). Ibagué, 27-29 de
julio. p. 7-11
Brun, L. O.; Stuart, J.; Gaudichon, V.; Aronstein, K.; Ffrench-Constant, R. H. 1995. Functional
haplodiploidy: a mechanism for the spread of insecticide resistance in an important
international insect pest. Proceedings National Academy of Sciences, U. S. A. 92: 9861-
9865.
Damon, A. 2000. A review of the biology and control of the coffee berry borer, Hypothenemus
hampei (Coleoptera:Scolytidae). Bulletin of Entomological Research 90: 453-465.
Díaz, V.V.V.M., J. N. Pérez Q. E.P. Pinson R. R. Magallanes C. M.E. De Coss F. y M.E. Cabrera
A. 2009. Mezcla de un tensoactivo aniónico con Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. para el
control de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr. en Cacahoatán, Chiapas, México.
Entomología Mexicana Vol. 8 pp. 477-481.
García, de M. E. 1981. Modificaciones al Sistema de Clasificación de Koppen. Edit. UNAM.
México. p. 9, 47, 90.
http://www.federacioncafe.com/Público/El
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206
Mathieu, F., O. Brun, B. Frerot, D. Duckling and C. Framton. 1999. Progression in field
infestation is linked with tramping of coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Col.
Scolytidae). J. Appl. Ent. 123: 535-540.
Reyes, C.P. 1980. Diseños de Experimentos Aplicados. 2ª. Edición Editorial Trillas, México,
D.F. 348 p.
Vega, F.; Benavides, P.; Stuart, J. J.; O neil, S. 2002. Wolbachia infection in the coffee berry
borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera:Scolytidae). Annals Entomological
Society of America 95 (3): 374-378.
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ASPECTOS DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA DE Anticarsia gemmatalis
(HÜBNER) (LEPIDÓPTERA: NOCTUIDAE), RELACIONADOS CON EL CONTROL
BIOLÓGICO DEL NUCLEOPOLIEDROVIRUS DE Anticarsia gemmatalis (AgNPV)
Joel Ávila-Valdez. INIFAP, Campo Experimental Las Huastecas, Apartado Postal 31, 89610, Altamira, Tam.
[email protected] RESUMEN. Anticarsia gemmatalis (Hübner), es la principal especie defoliadora del cultivo de soya en México y se controla
biológicamente con el nucleopoliedrovirus de Anticarsia gemmatalis (AgNPV), el cual es utilizado en 15000 hectáreas en
promedio en México. Debido a la importancia de este caso de control biológico en México, esta revisión tiene como objetivo
abordar los principales aspectos de la biología y los mecanismos de defensa del insecto relacionados con el control de AgNPV.
Palabras Claves: Soya, Anticarsia gemmatalis, control biológico, nucleopoliedrovirus.
ABSTRACT. The veltbean Caterpillar Anticarsia gemmatalis (Hubner), is the main soybean crop pest in Mexico and has a
biological control with A. gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgNPV), used in 15,000 hectareas in Mexico. Considering the
importance of this case of biological control in Mexico, this review was aimed to address the main aspects of the biology and
defense mechanisms of this insect, as well as its biocontrol by AgNPV.
Key words: Soybean, Anticarsia gemmatalis, biological control, nucleopolyhedrosis.
Introducción Anticarsia gemmatalis (Hübner), es la especie defoliadora más importante del cultivo de
la soya en México (Maldonado et al 1991) y sus poblaciones han sido reguladas biológicamente
con el nucleopoliedrovirus de A. gemmatalis (AgNPV), desde el año 2000 en la región del sur de
Tamaulipas, en una superficie que actualmente fluctúa alrededor de 15 mil hectáreas (Ávila y
Rodríguez del Bosque, 2011). Este virus es muy específico y tiene la capacidad de burlar los
mecanismos de defensa en sus poblaciones (Moscardi, 1998). Considerando la importancia de
este caso de control biológico en México, el objetivo del trabajo fue realizar una revisión
bibliográfica sobre los mecanismos de defensa de A. gemmatalis (Hübner), relacionados con el
control biológico que se aplica con el nucleopoliedrovirus de A. gemmatalis.
Materiales y Método Se realizó una revisión bibliográfica sobre el tema y se elaboró una síntesis del
conocimiento recopilado, poniendo énfasis en la información de los riesgos de posible resistencia
de A. gemmatalis al uso continuo y masivo de AgNPV en condiciones de campo.
Resultados
La familia Baculoviridae está conformada por dos géneros de nucleopoliedrovirus (NPV),
que producen estructuras poliédricas (0.5-15 micrómetros) formadas por la proteína poliedrina y
los granulovirus (GV) que presentan cuerpos de oclusión menores (0.5 micrómetros) formados
por granulina. Los baculovirus producen dos tipos de virus fenotípicamente distintos, los virus
extracelulares y los virus derivados de los cuerpos de inclusión (Souza et al., 2002). Los virus
extracelulares se producen en la fase inicial de infección y se diseminan célula a célula dentro del
insecto. La otra forma de virus se produce en la fase tardía de la infección y resulta de la oclusión
de viriones en cuerpos proteínicos de inclusión (CPI); esta forma es llamada de cuerpo de
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inclusión del poliedro y es responsable de la diseminación del virus entre los insectos en el
ambiente (Ribeiro y Pinedo, 2001; Souza et. al., 2002).
La infección de A. gemmatalis se produce al alimentarse del follaje contaminado con CPI.
El pH alcalino del intestino medio solubiliza los CPI liberando los viriones que son formados por
un nucleocapsideo envuelto, cuyas membranas se funden con las membranas de las
microbellosidades de las células epiteliales del intestino. Los nucleocapsideos migran al
citoplasma de la célula y penetran a través de los poros nucleares; en el núcleo liberan DNA viral
y ocurre la transcripción de los genes del virus y la replicación de su genoma. En esta fase son
sintetizados nucleocapsideos en el núcleo de la célula (Funk et. al., 1997; Castro et. al., 1999).
Los nucleocapsideos salen del núcleo y migran a la base de la célula, atraviesan la
membrana basal y se distribuyen en la hemolinfa y el sistema traqueal del insecto, provocando
infecciones secundarias en otros tejidos. En las células infectadas se forman más virus que son
diseminados célula a célula. En estados avanzados de infección es cuando ocurre la oclusión de
los viriones, los cuales revientan las membranas celulares y liberan gran cantidad de CPI en la
hemolinfa del insecto, (Funk et. al., 1997; Castro et. al., 1999). Durante el proceso de infección,
la larva de A. gemmatalis se debilita y pierde su capacidad motora de alimentación y busca la
parte superior de la planta donde muere en un periodo de cinco a ocho días; después de dos días
de muerta, el cuerpo se revienta y libera gran cantidad de virus en el follaje, sirviendo de inóculo
de la enfermedad (Moscardi y Souza, 2002).
Mecanismos de defensa. La cutícula y el exoesqueleto de los insectos presentan
componentes antimicrobianos que impiden la penetración de microorganismos a la hemocele y
constituyen la primera línea de defensa a los patógenos (Bulet et. al., 1999), internamente la
membrana peritrófica que recubre las células epiteliales del tubo digestivo, también son un
mecanismo de defensa a los patógenos que penetran por vía oral (Silva, 2002).
En el hemocele del insecto se desencadena una defensa hemocitaria, que es la respuesta
inmunológica del insecto a la invasión de patógenos (Bulet et. al., 1999). La defensa
inmunológica puede ser subdividida en dos componentes: un componente humoral y otro celular,
representado por los hemocitos (Niere et. al., 1999). La defensa humoral se realiza
principalmente por la acción de péptidos antimicrobianos en un complejo enzimático que regula
la coagulación y la melanización de la hemolinfa (Lavine y Strand, 2002). Los insectos no
presentan inmunoglobulinas específicas pues no tienen memoria inmunológica, no existen
evidencias de especificidad molecular de anticuerpos en el sistema inmunológico de los insectos,
ya que una respuesta inmunológica adquirida requiere de varios días y semanas para
desarrollarse, lo que sería desventajoso para el insecto que tiene un ciclo de vida relativamente
corto, comparado con los vertebrados (Niere et. al., 1999; Silva, 2002).
La respuesta celular de los insectos se debe a la actividad de los hemocitos en la
hemolinfa, los cuales reaccionan para eliminar al invasor o limitar su desarrollo (Alves y Pereira
1998). Los hemocitos se mueven pasivamente en el hemocele y al contacto con partículas
extrañas, reconocen y eventualmente destruyen a los patógenos. Los procesos celulares de
defensa comprenden fagocitosis, formación de nódulos, encapsulamiento, coagulación de la
hemolinfa y cicatrización (Meyer-Fernández et. al., 2000). La fagocitosis es considerada la
respuesta celular primaria de defensa de muchos insectos y consiste en el proceso por el cual los
hemocitos actuando individualmente forman pseudópodos y engloban las partículas extrañas
contenida en la hemolinfa (Lavine y Strand, 2002). Si la concentración de patógenos en la
hemolinfa es muy grande, los hemocitos se agregan y forman nódulos a fin de inmovilizar a los
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invasores o sacarlos de circulación (Silva, 2002). Cuando el cuerpo extraño es muy grande para
ser fagocitado, ocurre el fenómeno de encapsulamiento, que es la aglomeración de un conjunto de
células que forman una cápsula alrededor del invasor (Pech y Strand, 1995).
La coagulación de la hemolinfa es un fenómeno frecuente observado después de una
herida en el exoesqueleto del insecto, para prevenir la pérdida de hemolinfa. También es una
barrera mecánica que impide la penetración de patógenos oportunistas. Desempeña un papel
complejo en las reacciones de defensa de los insectos y se le ha observado participando en el
proceso de encapsulamiento (Rowley y Ratcliffe, 1981). En un cuadro infeccioso, existe
variación en el número y proporción de los diversos tipos de hemocitos presentes en la
hemolinfa. En respuesta a la presencia de patógenos, estas variaciones se manifiestan en una
producción elevada de algunos tipos celulares y en la inmovilización de hemocitos en nódulos y
cápsulas alrededor del patógeno. Estas reacciones de defensa celular, son influenciadas por
parámetros genéticos y fisiológicos del hospedante y el patógeno; el número de respuestas
inmunológicas depende del número y los tipos de hemocitos involucrados en el mecanismo
(Russo et. al., 2001).
Los tipos de hemocitos pueden ser caracterizados morfológicamente por las diferencias
del tamaño y forma de la célula; por el tipo, tamaño y número de sus inclusiones, así como por su
apariencia general y coloración del citoplasma. También pueden ser clasificados por sus
diferencias en comportamiento, su capacidad de dividirse, rapidez de vacuolización de sus
inclusiones, su fragilidad, su abundancia relativa en periodos específicos en la vida del insecto y
su participación en los procesos de defensa (Jones, 1979). Se reconocen cinco tipos de hemocitos
que están presentes en la mayoría de los insectos: prohemocitos, plasmatocitos, granulocitos,
esferulocitos y oenocitoides (Gupta, 1979; Clark et. al, 1997). Los plasmatocitos son células
polimórficas, generalmente presentan pseudópodos y participan en los procesos de fagocitosis y
encapsulamiento. Los granulocitos son variables en tamaño y forma, pero generalmente son
células redondas u ovales y su función es de reconocimiento de cuerpos extraños y comprenden
más del 50% de los hemocitos (Silva 2002; Lavine y Strand, 2002).
Los prohemocitos son pequeños, redondos o elípticos con un pequeña cantidad de
citoplasma periférico y son considerados células formadoras de hemocitos; no participan
directamente en los procesos de defensa y son responsables de la multiplicación post embrionaria
de los hemocitos representan alrededor del 10% de los hemocitos (Lavine y Strand, 2002;
Yamashita e Iwabuchi, 2001). Los esferulocitos son esférulas grandes ovales o redondas con
núcleo pequeño y participan en la histólisis, que ocurre en ocasión de la muda, transportando
determinadas substancias como las hormonas, o participando en la síntesis de proteínas en la
hemolinfa que ayudan a la destrucción de bacterias; representan el 20% de los hemocitos (Gupta,
1979; Ratclife et. al., 1985; Tanada y Kaya, 1993; Chapman, 1998).
Los oenocitoides son los mayores hemocitos encontrados y tienen citoplasma abundante,
denso y homogéneo, núcleo pequeño y participan en la producción de fenoloxidasa, una enzima
multifuncional que participa en la defensa inmunológica, como en la cicatrización de lesiones y
esclerotización de la cutícula (Lavine y Strand 2002; Silva 2002).
El lepidoptero A. gemmatalis, tiene cinco tipos de hemocitos los cuales son:
plasmatocitos, granulocitos, prohemocitos, esferulocitos y oenocitoides, además de células
vermiformes y células esfoliativas (Andrade et. al., 2003). Las células vermiformes son de
aspecto fusiforme y no emiten pseudópodos (Andrade et. al., 2003). Las células esfoliativas, son
células grandes y son más bien un tipo de hemocito distinto a los demás, aunque existe escasa
-
210
información sobre ellas, sin embargo, constan evidencias que ambos tipos participan en los
procesos inmunológicos del insecto junto con los hemocitos plenamente reconocidos (Faraldo,
2000).
Discusión y Conclusiones
A. gemmatalis, ha sido controlada en Brasil desde la década de los ochenta con el virus
AgNPV y la superficie actual rebasa los 2.5 millones de hectáreas aplicadas (Sosa-Gómez, 2010,
comunicación personal). En todo este periodo, no se ha encontrado ninguna evidencia de
resistencia del insecto al virus. En México, Ávila y Rodríguez del Bosque (2011), consignan los
mismos resultados, aunque con solo diez años de aplicación, corroborando lo que registraron
Fuxa y Ritcher (1993), quienes consignan que en condiciones de campo no se han encontrado
indicios de resistencia de A. gemmatalis al virus AgNPV, sólo en condiciones de labotatorio y
bajo una fuerte presión de selección. La presencia de siete tipos de hemocitos en A. gemmatalis,
presupone una férrea actividad inmunológica del insecto para evitar la acción del AgNPV,
después de varios años de estar sometidos a presión de selección. La ausencia o retardo de la
resistencia puede deberse a la migración de adultos de las áreas no expuestas a las áreas tratadas
con el virus (Moscardi y Sosa-Gómez, 1992). También se debe a la gran especificidad del
AgNPV (Moscardi, 1998), que es una característica deseable en la mayoría de los
entomopatógenos utilizados en el control biológico de plagas (Ribeiro y Pinedo, 2001). Esto
permite concluir que se puede seguir utilizando el AgNPV por mucho tiempo e incrementar la
superficie aplicada actualmente en México, con todo el beneficio económico y ecológico que
resulta de su uso en el cultivo de soya.
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IM:L.G
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212
TOXICIDAD DE TRES CEPAS NATIVAS DE Bacillus thuringiensis EN LARVAS DE
Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE)
Juan Reyes Delgado-Gamboa
1, Rafael Pérez-Pacheco
1, Jaime Ruíz-Vega
1, Carlos Alejandro Granados-Echegoyén
1,
Jorge Eugenio Ibarra-Rendón2, Verónica González-Negrete
3.
1Centro Interdisciplinario de Investigación para el
Desarrollo Integral Regional Unidad Oaxaca. IPN. Calle Hornos 1003. Santa Cruz Xoxocotlán. C.P. 71230. Oaxaca.
México. [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]. 2Departamento de Biotecnología y Bioquímica, Centro de Investigación y Estudios Avanzados, Unidad Irapuato,
36500, Irapuato, Guanajuato, México. [email protected]. 3Universidad de Guanajuato, Campus Irapuato-
Salamanca División de Ciencias de la Vida. Ex Hacienda El Copal km. 9 carretera Irapuato-León; C.P. 36500;
Irapuato, Guanajuato. [email protected].
RESUMEN. Los mosquitos son vectores de agentes causales de enfermedades como paludismo y dengue. Una alternativa al uso
de insecticidas químicos es el empleo de agentes biológicos, principalmente insecticidas microbianos. En el presente trabajo se
evaluó la toxicidad de tres cepas de B. thuringiensis endémicas de Oaxaca, México, contra Aedes aegypti. Su efecto se cuantificó
mediante bioensayos. Se realizó un diseño completamente al azar, utilizando como unidad experimental vasos plásticos con 100
ml de agua desclorada y 20 larvas del cuarto instar temprano A. aegypti. Se utilizó el complejo espora-cristal, evaluando de 6 a 8
dosis., se realizaron 5 repeticiones con un testigo cada una. La mortalidad se determinó a las 24 h bajo condiciones de 70% de
humedad relativa y temperatura media de 28±2°C. Se obtuvieron dos cepas altamente tóxicas a A. aegypti, cuyas CL50 fueron
10.82 y 13.2 ng/ml, respectivamente, similares a la Bti control (CL50 de 9.43 ng/ml) usada como estándar.
Palabras clave: Bacillus thuringiensis, toxicidad, bioensayo, resistencia, espora-cristal.
ABSTRACT. Mosquitoes are vectors of causal agents of diseases such as malaria and dengue. An alternative to chemical
insecticides is the use of biological agents, mainly microbial insecticides. In the present study was designed the toxicity of three
native B. thuringiensis strains of Oaxaca, Mexico, against Aedes aegypti. The effect was quantified by bioassay. Performed a
randomized design, using as an experimental unit with 100 ml plastic cups dechlorinated water and 20 early in fourth instar Aedes
aegypti. Using the spore-crystal complex, six to eight doses were evaluated, five replicates were performed and each with one
included one blank treatment. Mortality was determined after 24 hours under conditions of 70% relative humidity and mean
temperature of 28±2°C. Two highly toxic strains against of Aedes aegypti, were obtained which presented an LC50 of 10.82 and
13.20 ng/ml respectively, similar to the blank Bti (9.43 ng/ml).
Keys words: Bacillus thuringiensis, toxicity, bioassay, isolates, spore-crystal.
Introducción
Los mosquitos constituyen un grupo de insectos de gran importancia desde el punto de
vista médico epidemiológico, debido a que muchas de sus especies además de provocar molestias
al hombre y a los animales, son vectores de agentes causales de enfermedades como paludismo
(malaria) y dengue (Samanidou-Voyadjoglou et al., 2007).
El dengue es la enfermedad viral más importante transmitida por mosquitos en las áreas
tropicales y subtropicales del mundo, donde vive una tercera parte de la población humana
(Guzman y Kouri, 2002).
El uso de insecticidas químicos de alta acción residual y toxicidad a amplio espectro de
organismos han ocasionado serios problemas de contaminación y resistencia de los organismos
plaga (Van Frankenhuyzen, 1993).
Como una alternativa al uso de insecticidas químicos para el control de mosquitos es
necesario el empleo de diversos agentes biológicos (Rodríguez et al., 2001) incluyendo
principalmente insecticidas microbianos (Wirth et al., 2005).
Bacillus thuringiensis Berliner es la bacteria entomopatógena más conocida, estudiada y
utilizada como agente de control microbiano. Más del 90% del mercado de bioinsecticidas
mailto:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]
-
213
incluye productos a base de esta bacteria (Glare y O Callaghan 2000). Los principales productos
están basados en los serovares kurstaki, israelensis, aizawai, morrisoni, alesti, galleriae,
darmstadiensis, dendrolimus y sotto (Glare y O‟Callaghan, 2000).
Desde el descubrimiento e identificación de B. thuringiensis, el interés en esta bacteria ha
sido cada vez mayor, en el intento de encontrar nuevas toxinas con actividad biológica diferente
(Khyami-Horani et al., 2003). Se estima que actualmente existen más de 100,000 aislados
distribuidos en colecciones de todo el mundo (Hammond, 2007).
Hasta 1976 se conocía que B. thuringiensis sólo era tóxico contra larvas de lepidópteros,
sin embargo, Goldberg y Margalit (1977), aislaron una cepa en el desierto del Negev (Israel).
Este aislado representaba un nuevo serotipo (H-14) y se le denominó B. thuringiensis svar.
israelensis (de Barjac, 1978).
Bti muestra una elevada actividad insecticida sobre larvas de dípteros, en particular de
mosquitos (Culicidae) y jejenes (Simuliidae); entre los mosquitos, es activo sobre los tres géneros
más importantes: Aedes, Anopheles y Culex, en orden de susceptibilidad (Ibarra et al., 2003).
Los productos-Bt basados en esta subespecie han logrado un gran éxito y son el principal
insecticida microbiano utilizado en el control de vectores de enfermedades, especialmente en
países en desarrollo. Existen diversos formulados comerciales, los más utilizados son
VectoBac®, Bactimos® y Teknac® (Federici et al., 2005). Aunque el espectro insecticida de Bti
abarca principalmente especies de dípteros, algunos insectos de otros órdenes, como lepidópteros
y coleópteros, también han mostrado cierto grado de susceptibilidad.
El éxito experimentado con la cepa Bti estimuló en todo el mundo el desarrollo de
programas de búsqueda de nuevas bacterias y cepas de B. thuringiensis con propiedades
mosquitocidas. Hasta la fecha, se han descubierto numerosos aislados activos, aunque su
efectividad nunca ha superado la de Bti (Federici et al., 2005).
El objetivo de este trabajo fue evaluar la toxicidad de tres cepas nativas de Oaxaca de B.
thuringiensis contra Aedes aegypti (L.).
Materiales y Método
Aislamiento de cepas. Las cepas S4(17), S18(60) y S19(65) forman parte del
aislamiento, selección y caracterización de cepas nativas de Bacillus thuringiensis, en el que se
procesaron 71 muestras de suelo, estiércoles y telarañas. Las muestras fueron tamizadas en malla
#40. Posteriormente se incorporó 1 g de muestra en tubos de ensayo con 10 ml de agua destilada
estéril. Los tubos fueron sometidos a pasteurización mediante baño María a 65°C durante 30 min
y enfriados inmediatamente después en hielo. De la suspensión se extrajeron alícuotas de 10 µl,
con el que serían plaqueadas cajas Petri con agar nutritivo. Estas se incubaron a 28°C durante 24
h, lo cual permitió el desarrollo de colonias aisladas, que fueron seleccionadas por la apariencia
propia de B. thuringiensis: forma irregular y aplanada, márgenes recortados irregularmente,
aspecto farinoso y opaco. Estas colonias se inocularon en pequeñas gotas de agar nutritivo (a
manera de microcultivos), las cuales fueron incubadas a 28°C durante 48 h en bolsas de plástico
(para evitar desecación), hasta obtener la esporulación de la cepa. Las telarañas se colocaron
directamente en tubos Eppendorf, se les adicionó 1 ml de agua destilada estéril con sol. Tween 80
al 0.02 %. Posteriormente se procedió de la misma manera que con las muestras de suelo.
La identificación de las colonias cristalíferas se efectuó al miscroscopio óptico de
contraste de fases (1000 X). Aquellas cepas que mostraron la formación de cristales (cuerpos
parasporales típicos de B. thuringiensis) fueron resembradas y cultivadas bajo las mismas
-
214
condiciones durante 4-5 días, hasta obtener autolisis. Posteriormente, cada cepa completamente
autolizada fue suspendida en 1000 µl de agua destilada estéril dentro de pequeños viales, donde
se introdujeron tiras estériles de papel filtro para absorver la suspensión bacteriana y se
sometieron a congelación y liofilización para después almacenarse a -20°C.
Bioensayo Preparación del Complejo Espora-Cristal. Para la selección toxicológica de las cepas
aisladas, se realizó una serie de bioensayos con larvas de A. aegypti, díptero de susceptibilidad
conocida a B. thuringiensis svar. israelensis. Se obtuvieron polvos liofilizados del complejo
espora-cristal, con la finalidad de contar con un peso seco constante para cada bioensayo de cada
una de las cepas. Las cepas cristalíferas se sembraron en matraces de 500 ml con leche
peptonizada y se incubaron a 28°C a 250 rpm (Revoluciones por minuto). Después de la autolisis
(5 días), se suspendió el cultivo de los matraces en 10 ml de agua destilada estéril y se sometió a
tres centrifugaciones sucesivas con la finalidad de eliminar las posibles exotoxinas excretadas, así
como los desechos celulares. El precipitado obtenido se congeló y liofilizó. El polvo seco
obtenido se utilizó para los bioensayos.
Pruebas de Toxicidad. La metodología del bioensayo fue diseñada con la finalidad de
determinar la concentración que provoca un 50% de mortalidad en la población (CL50), y así
determinar el grado de actividad del agente microbiano. Dichas pruebas toxicológicas se llevaron
a cabo sobre larvas del cuarto instar temprano de A. aegypti, alimentadas con levadura en polvo,
bajo condiciones de insectario (28± 2ºC, 70 ± 5% de humedad relativa y fotoperiodo de 16:8 h
luz: oscuridad). El bioensayo se preparó utilizando vasos plásticos con 100 ml de agua desclorada y 20
larvas.
En un primer nivel de selección se probaron todas las cepas, poniendo una cantidad
indeterminada del complejo espora-cristal. Sólo las cepas que provocaron una mortalidad de
100% se sometieron a una segunda etapa de selección, partiendo de una solución madre de 10
mg del complejo espora cristal por ml, donde se probaron niveles de concentración entre 5.04 y
61.25 ng/ml.
Se realizó un diseño completamente al azar, utilizando como unidad experimental vasos
plásticos con 100 ml de agua desclorada y 20 larvas del cuarto instar temprano. Se realizaron 5
repeticiones con un control positivo empleando Bti.
Las cepas S4(17), S18(60) y S19(65) mostraron gran actividad insecticida, por lo que se
les probó en diversos bioensayos de 6 y 8 niveles de concentración. El nivel de toxicidad fue
comparado con la CL50 obtenida para la cepa estándar de B. thuringiensis israelensis (de Barjac,
1978), producida y probada bajo las condiciones antes mencionadas.
La mortalidad se determinó a las 24 h, considerando larva muerta a aquélla que al ser
hundida en el agua, no regresa a la superficie con sus movimientos normales característicos o
bien no presentan movimiento alguno. Posteriormente se realizó un análisis Próbit para
determinar la concentración letal media (CL50).
Resultados y Discusión
En el cuadro 1 se presenta el efecto tóxico causado por la cepa control Bti, en el cual se
observa que con una concentración de 30 y 21 ng/ml se registraron los más altos niveles de
-
215
mortalidad que fueron de 100 y 80% respectivamente, el cálculo de la CL50 con un valor de
9.426 ng/ml, así como la CL95 con un valor de 27.806 ng/ml.
Cuadro 1. Porcentaje de mortalidad, CL50 y CL95 del complejo espora-cristal de la cepa control Bti en larvas del
cuarto instar de A. aegypti.
En el cuadro 2 se presenta el efecto tóxico causado por la cepa S4(17), en el cual se
observa que con una concentración de 61.25 ng/ml se registró la mortalidad más alta que fue de
92.5%, una CL50 con un valor de 26.91 ng/ml y una CL95 de 131.641 ng/ml.
Cuadro 2. Porcentaje de mortalidad, CL50 y CL95 del complejo espora-cristal de la cepa S4(17) en larvas del cuarto
instar de A. aegypti.
En el cuadro 3 se presenta el efecto tóxico causado por la cepa S18(60), en el cual se
observa que con una concentración de 30 ng/ml se registró la mortalidad más alta que fue de
95.92%, una CL50 con un valor de 13.196 ng/ml y una CL95 de 35.466 641 ng/ml.
Cuadro 3. Porcentaje de mortalidad, CL50 y CL95 del complejo espora-cristal de la cepa S18(60) en larvas del cuarto
instar de A. aegypti.
Tratamiento Concentración
(ng/ml)
Mortalidad
%
CL50
(ng/m)
CL95
(ng/m)
1 30 95.92
2 21 69.7
3 14.7 59 13.19 35.466
4 10.29 35.71
5 7.20 14.58
6 5.04 14.58
Control 0 0
Tratamiento Concentración
(ng/ml)
Mortalidad
% CL50 (ng/ml) CL95 (ng/ml)
1 30 100
2 21 80
3 14.7 74.58
4 10.29 62.07 9.426 27.80
5 7.20 37.5
6 5.04 13.33
Control 0 0
Tratamiento Concentración
(ng/ml)
Mortalidad
%
CL50
(ng/ml)
CL95
(ng/ml)
1 61.25 92.5
2 42.875 70
3 30.0125 46.84
4 21.0087 30 26.91 131.641
5 14.7061 18.75
6 10.2942 12.82
7 7.2060 13.75
8 5.0442 11.67
Control 0 0
-
216
En el cuadro 4 se presenta el efecto tóxico causado por la cepa S19(65), en el cual se
observa que con una concentración de 30 ng/ml se registró la mortalidad más alta que fue de
97.5%, una CL50 con un valor de 10.823 ng/ml y una CL95 de 29.324 ng/ml.
Cuadro 4. Porcentaje de mortalidad, CL50 y CL95 del complejo espora-cristal de la cepa S19(65) en larvas del cuarto
instar de A. aegypti.
Se observa que las CL50 de las cepas S18(60) y S19(65) con un valor de 13.2 y 10.82
ng/ml respectivamente, son similares a la CL50 de la cepa Bti (control) con un valor de 9.43
ng/ml. En las mismas cepas las CL95 tuvieron el mismo comportamiento, por lo tanto estos
resultados nos indican que las cepas S18(60) y S19(65) tienen alto potencial mosquitocida,
siendo similar a la cepa Bti (control) usada como estándar y con mejor potencial a la cepa Bti
analizada por Wirth et al., (2004), quienes reportan una CL50 de 22.3 ng/ml para el complejo
espora cristal. De igual manera Federici et al., (2003), reporta un rango de concentración letal 50
(CL50) de 10-13 ng/ml sobre larvas de cuarto estadio de muchas especies de mosquitos.
Conclusiones Se obtuvieron dos cepas altamente tóxicas a A. aegypti, cuyas CL50 fueron 10.82 y 13.2
ng/ml respectivamente similares a la Bti control (CL50 de 9.43 ng/ml) usada como estándar. Este
trabajo abre una nueva vía para el control biológico de A. aegypti, el cual es un vector de
importancia médica-veterinaria, para el cual se está implementando una estrategia de control que
combina diversos métodos, entre los cuales se podría integrar la vía que explora esta
investigación, ya que B. thuringiensis por su elevada actividad larvicida, especificidad e
inocuidad sobre organismos no blanco, complejo de tóxinas, la hace una alternativa de gran
potencial en el control de insectos vectores de enfermedades.
El contar con cepas nativas permite conservar o alterar lo menos posible la biodiversidad
existente, en lugar de usar especies exóticas aisladas de nichos ecológicos diferentes. Más aún, el
uso de especies nativas es frecuentemente más eficaz que el correspondiente a especies exóticas,
cuando los especímenes han sido aplicados en igualdad de circunstancias.
Es importante continuar con la caracterización biológica de cepas nativas de B.
thuringiensis para disponer de mayores alternativas de control biológico de insectos plaga y
vectores de agentes causales de enfermedades.
Tratamiento Concentración
(ng/ml)
Mortalidad
%
CL50
(ng/ml)
CL95
(ng/m)
1 30 97.5
2 21 87.5
3 14.7 65
4 10.29 44.3 10.823 29.324
5 7.20 23.08
6 5.04 14.29
Control 0 0
-
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Pathology 88. 154-162.
-
218
PRODUCCIÓN DE PROTEASAS EXTRACELULARES DE Gliocladium virens Y SU
RELACIÓN CON LA ACTIVIDAD ENTOMOPATÓGENA CONTRA Anopheles
albimanus
Guillermo Carrión-Vázquez
1, Germán Pérez-García
2 y María Guadalupe Vázquez-Martínez
1.
1Centro Regional de
Investigación en Salud Pública (CRISP). Instituto Nacional de Salud Pública. 4ª Norte y 19 Poniente s/n, Colonia
Centro C.P. 30700. Tapachula, Chiapas, México. 2Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de
Chiapas. Tapachula, Chiapas, México. [email protected]
RESUMEN. La cepa nativa del sureste de Chiapas Gliocladium virens demostró su potencial entomopatógeno sobre larvas de
mosquitos Anopheles albimanus en bioensayos de laboratorio. Con el propósito de estimar el potencial de esta cepa nativa para su
uso en campo para el control de los mosquitos vectores de paludismo, en este estudio se evaluó el efecto de la temperatura sobre
la producción de proteasas en G. virens y su relación con la actividad entomopatógena. Se encontró que el hongo G. virens
presenta una relación directa entre la producción de enzimas proteolíticas y su patogenicidad. Gliocladium virens produjo la
mayor cantidad de enzimas a 29ºC, que es la temperatura que caracteriza a los hábitats larvales de An. albimanus. La producción
de proteasas extracelulares y la alta entomopatogenicidad de G. virens, convierten a este hongo en un excelente candidato para
usarlo en estrategias de control del mosquito Anopheles albimanus.
Palabras Clave: hongos entomopatógenos, mosquitos, enzimas, control biológico.
ABSTRACT. The native strain of the South-East of Chiapas Gliocladium virens showed its entomopathogenic potential on
mosquito larvae Anopheles albimanus in laboratory bioassays. In order to estimate the potential of this native strain for use on the
field for the mosquito control, this study evaluated the effect of temperature on the production of proteases in G. virens and its
relationship to the entomopathogenic activity. We found that the fungus G. virens presents a direct relationship between the
production of proteolytic enzymes and their pathogenicity. Gliocladium virens produced the major amount of enzymes at 29°C,
which is the temperature that characterizes the larval habitats of Anopheles albimanus. The production of extracellular proteases
and the high entomopathogenicity of G. virens, make this fungus an excellent candidate to use it in the Anopheles albimanus
mosquito control strategies.
Key words: entomopathogenic fungi, mosquitoes, enzymes, biological control.
Introducción
El control del paludismo en México se lleva a cabo mediante el uso de insecticidas
químicos contra el mosquito vector y de medicamentos antipalúdicos contra el parásito (WHO,
2008). Recientemente han aumentado los casos de resistencia a insecticidas (Penilla et al., 2007;
Dzul et al., 2007) que complican el control de esta enfermedad, por lo que es necesario buscar
alternativas al control químico. Una buena alternativa es el control biológico mediante el uso de
hongos entomopatógenos, los cuales son patógenos naturales de varios insectos, actúan por
contacto, tienen capacidad de autodiseminación, y por lo tanto, gran potencial para ser empleados
como biocontroladores (Cañedo y Ames, 2004; Vázquez-Martínez et al. 2008a).
Tanada y Kaya (1993) describieron que los hongos presentan distintos mecanismos para
atacar a los mosquitos y pueden ser separados en tres fases: a) Adhesión y germinación de la
espora en la cutícula del insecto, b) Penetración dentro del hemocele, y c) Desarrollo del hongo
que resulta en la muerte del insecto.
Los hongos entomopatógenos penetran el exoesqueleto de los insectos mediante un
proceso mecánico acompañado de la acción enzimática, de proteasas, quitinasas y lipasas. En el
proceso de infección del insecto participan principalmente las proteasas extracelulares (Cañedo y
Ames, 2004).
mailto:[email protected]
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219
La cepa nativa del sureste de Chiapas Gliocladium virens demostró su potencial
entomopatógeno sobre mosquitos Anopheles albimanus (Vázquez-Martínez et al. 2008b) en
bioensayos de laboratorio, causando mortalidades del 100% a las 96 hs de exposición a 4.6x107
conidias/ml. Con el propósito de estimar el potencial de esta cepa nativa para su uso en campo
para el control de los mosquitos vectores de paludismo, en este estudio se evaluó el efecto de la
temperatura sobre la producción de proteasas en G. virens y su relación con la actividad
entomopatógena.
Materiales y Método
Material biológico. La cepa de G. virens pertenece al cepario del Laboratorio de
Patógenos y Vectores del CRISP, a cargo de la Dra. Guadalupe Vázquez Martínez y las cepas de
referencia M. anisopliae cepa 33, fue donada por el Dr. Jorge E. Ibarra Rendón del
CINVESTAV, Irapuato y la otra cepa de M. anisopliae fue donada por la UNAM.
Cultivo. De un cultivo madre (stock) se resembraron los hongos en cajas petri con Agar
Dextrosa Sabouraud (ADS) usando la técnica del papel celofán (Dennis y Webster, 1971). Los
conidios se cosecharon en agua tridestilada estéril y se hicieron diluciones hasta una
concentración final de 104 conidias/ml. Este inóculo se resembró en matraces Erlenmeyer con
medio de cultivo líquido de soya.
Tratamientos. Los hongos se crecieron en medio líquido de soya, a diferentes
temperaturas: 20, 23, 26, 29 y 32°C, y fueron expuestos a un fotoperiodo de 12:12 horas
luz:oscuridad. La producción de enzimas proteolíticas de cada tratamiento se evaluó a las 24, 48,
72, 96 y 120 horas, por medio de las técnicas de la azocaseína y de la elastina cromogénica.
Todos los tratamientos fueron realizados en una cámara ambiental y se manejaron tres
repeticiones para cada tratamiento.
Evaluación enzimática. Para evaluar la producción de enzimas se tomaron muestras de
1.5 ml de los diferentes cultivos, por triplicado, a las 24, 48, 72, 96 y 120 h y se depositaron en
tubos Eppendorff de 2 ml. Los tubos se centrifugaron a 10 000 rpm durante 15 min y los
sobrenadantes (enzimas) fueron colectados. La actividad proteolítica fue evaluada a través de dos
técnicas.
Método de la azocaseína (Castellanos-Moguel 2002). En un tubo Eppendorff de 1.5 ml,
se colocaron 250 μl de sustrato y 150 μl de enzima y se incubaron a 25ºC por 1 h. Posteriormente
se agregó 1.1 ml de ácido Tricloroacético (TCA) al 10%, se mezcló y dejó en reposo durante 15
min para luego centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min. En tubos de vidrio de 12 x 75 mm se
recuperó 1.2 ml de sobrenadante y se adicionaron 1.4 ml de hidróxido de sodio 1.0 M; se mezcló
para el desarrollo del color y después se realizó la lectura a la absorbancia de 440 nm. Se preparó
para cada muestra un tubo testigo de la misma manera pero al sustrato se le agregó el TCA al
10% antes que la enzima. Se usó como blanco el buffer de fosfatos. La actividad proteolítica se
expresó en unidades de proteasa (UP), siendo una unidad la cantidad de enzima que origina un
cambio en la absorbancia de 0.01 a 440 nm, bajo las condiciones experimentales usadas.
Método de la elastina cromogénica. De una suspensión de elastina rojo congo (1.5
mg/ml) en buffer Tris-HCl 0.05 M, pH 8.0, se tomaron 4 ml y se mezclaron con 1 ml de enzima
agitando vigorosamente por 10 seg. Se incubó a 30ºC durante 30 min sin agitación y luego se
centrifugó a 10 000 rpm durante 15 min. Se filtró el sobrenadante y se leyó a una absorbancia de
450 nm. Se preparó de la misma forma para cada muestra un tubo testigo con 4 ml del buffer sin
el sustrato y 1 ml de enzima, incubando a 30ºC por 30 min sin agitación. Se usó como blanco el
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220
buffer Tris-HCl 0.05 M, pH 8.0 sin el sustrato. La actividad enzimática sobre la elastina fue
determinada en unidades de enzima (UE), siendo una unidad la cantidad de enzima necesaria para
originar un cambio en la absorbancia de 0.01 a 450 nm, bajo las condiciones experimentales
usadas.
Bioensayos. Los hongos G. virens y M. anisopliae se cultivaron bajo las condiciones de
temperatura que obtuvieron la mayor y la menor producción de enzimas proteolíticas. Se
obtuvieron las conidias y se suspendieron en Tween 80 al 0.0001% a una concentración de 108
conidias/ml del hongo. Los bioensayos se realizaron en una cámara ambiental, colocando 100 ml
de la suspensión de conidias con 25 larvas de A. albimanus de 3er estadio en recipientes
desechables de plástico. Las observaciones se hicieron cada 24 h durante 5 días. En todos los
bioensayos se incluyó un grupo testigo de larvas, colocadas en una solución de Tween al
0.0001% pero sin conidias. Los bioensayos tanto para los tratamientos como para los grupos
testigos se realizaron por triplicado.
Resultados y Discusión
Determinación de la producción de proteasas: Técnica de la azocaseína.
El hongo G. virens mostró la mayor producción de proteasas a 29ºC a partir de las 48 h de
incubación (39.2 UP/ml), con un pico máximo a las 72 h (47.36 UP/ml). Con el tratamiento a
32ºC, G. virens no produjo proteasas (Cuadro 1). Por lo que, la temperatura de incubación afectó
la producción de proteasas de este hongo.
Cuadro 1. Producción de proteasas (UP/ml) de G. virens a diferentes temperaturas y tiempos de incubación.
Temperatura
(ºC)
Tiempo de incubación ( h )
24
(UP/ml)
48
(UP/ml)
72
(UP/ml)
96
(UP/ml)
120
(UP/ml)
20 0 3.93 4.43 2.53 0.86
23 0.1 6.16 25.75 2.36 11.93
26 0.1 1.7 4.36 2.13 8.18
29 0.23 39.2 47.36 29.1 19.13
32 0 0 0 0 0
El hongo M. anisopliae produjo gran cantidad de proteasas a dos diferentes temperaturas
de incubación: 23 y 29ºC (Cuadro 2). La mayor cantidad de proteasas a 23ºC fue a partir de las
48 h de incubación (37.03 UP/ml), alcanzando la producción máxima a las 72 h (56.56 UP/ml). A
la temperatura de 32ºC, M. anisopliae no produjo proteasas.
Cuadro 2. Producción de proteasas (UP/ml) de M. anisopliae a diferentes temperaturas y tiempos de incubación.
Temperatura
( ºC)
Tiempo de incubación ( h )
24
(UP/ml)
48
(UP/ml)
72
(UP/ml)
96
(UP/ml)
120
(UP/ml)
20 0 2.43 8.53 3.03 2.83
23 0.3 37.03 56.56 44.8 19.56
26 0.16 8.3 2.03 8.36 5.13
29 0.23 53.9 32.03 1.73 18.7
32 0 0 0 0 0
-
221
Determinación de la producción de Elastasa: Técnica de la elastina rojo congo.
Se demostró que G. virens tuvo la mayor producción de enzima a 29ºC, logrando la mayor
cantidad (3.96 UE/ml) a las 48 h (Cuadro 3). La menor producción de elastasa se observó a la
temperatura de 23ºC.
Cuadro 3. Producción de elastasa (UE/ml) de G. virens a diferentes temperaturas y tiempos de incubación.
Temperatura
( ºC)
Tiempo de incubación ( h )
24
(UE/ml)
48
(UE/ml)
72
(UE/ml)
96
(UE/ml)
120
(UE/ml)
20 0 2.53 3.63 0.5 0.06
23 0.1 1.63 0.66 0.73 0.13
26 0.06 2.4 0.10 0.43 0.16
29 0.26 3.96 0.83 2.1 0.10
32 0.33 2.83 0.37 0.36 0.16
Cuando se cultivó M. anisopliae, se observó la mayor producción de elastasa a 23ºC
alcanzando un máximo a las 72 h (3.90 UE/ml). También hubo una producción considerable a 20
y 29ºC a las 48 h de incubación y la menor producción de elastasa fue a 32ºC (Cuadro 4).
Cuadro 4. Producción de elastasa (UE/ml) de M. anisopliae a diferentes temperaturas y tiempos de incubación.
Temperatura
( ºC)
Tiempo de incubación ( h )
24
(UE/ml)
48
(UE/ml)
72
(UE/ml)
96
(UE/ml)
120
(UE/ml)
20 1.9 2.63 1.03 1.4 0.23
23 0.3 1.63 3.90 1.36 0.06
26 0.16 4.16 0.03 1.26 0.02
29 0.23 3.7 1 1.53 0.04
32 0 2.76 0.53 3.45 0.06
En la producción de elastasa G. virens produjo mayor cantidad que M. anisopliae. La
temperatura de 29ºC y el tiempo de incubación de 48 h en la producción de elastasa de G. virens
coinciden con las condiciones para la producción de proteasas.
Bioensayos. Los resultados mostraron que en la cepa nativa de G. virens sí existe una
relación entre la producción enzimática y la patogenicidad, ya que las mortalidades larvarias
causadas por este hongo, con los cultivos crecidos a la temperatura de mayor producción de
enzimas (29°C), fueron del 100% a las 72 h del bioensayo (Cuadro 5). Esta relación no se
observó en la cepa de M. anisopliae, la cual mostró un porcentaje de mortalidad de 44% a las 120
h con los cultivos de mayor y menor producción de proteasas. Esto podría indicar que la
patogenicidad de este hongo depende más del proceso mecánico que del enzimático.
La temperatura es el principal factor de variabilidad en la producción de enzimas en un
hongo (Nirula, 1957) seguida de la exposición a la luz (Quesada y Vey, 2004), lo cual fue
constatado en este estudio. La cepa nativa de G. virens fue aislada en la planicie costera de
Chiapas, donde las temperaturas oscilan de 22ºC por la noche hasta 36ºC en el día, con una
temperatura promedio de 29ºC (Vázquez-Martínez et al. 2002).
-
222
Cuadro 5. Mortalidad larvaria (%) de Anopheles albimanus expuestas a G. virens y M. anisopliae cultivados bajo las
temperaturas en que produjeron la mayor y menor cantidad de enzimas.
Hongos Temperatura
Producción de
enzimas
Mortalidad diaria Mortalidad
(%)
Proteasas Elastasas 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
M.
anisopliae
20°C --- Mayor 0 2 4 6 9 36
23°C Mayor --- 0 2 5 8 11 44
32°C Menor Menor 1 3 5 8 11 44
G. virens
23°C --- Menor 0 3 5 7 10 40
29°C Mayor Mayor 5 16 25 100
32°C Menor --- 1 3 5 8 13 52
Al comparar la producción de proteasas se observa que G. virens produjo la mayor
cantidad de proteasas a 29ºC desde las 48 h de incubación, mientras que M. anisopliae logró la
mayor producción de proteasas desde las 48 h de incubación, pero a 23ºC. La cepa de M.
anisopliae, donada por el CINVESTAV Irapuato, fue aislada de cultivos en el estado de
Guanajuato, con temperaturas promedio inferiores a las presentes en el estado de Chiapas. Por lo
anterior, M. anisopliae no es una buena opción para usarse en estrategias de control de larvas de
A. albimanus ya que tendría la desventaja de que su mayor producción de proteasas es a una
temperatura diferente a la presente en los criaderos de mosquitos, mientras que G. virens logró su
mayor producción a la temperatura promedio de 29ºC, que es la que caracteriza a los hábitats
larvales de este mosquito.
La producción de proteasas extracelulares y la gran patogenicidad de G. virens, convierten
a este hongo en un excelente candidato para el control del mosquito vector del paludismo A.
albimanus.
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, que financió este estudio a través del
Proyecto No. 87102. A la Q.F.B. Olga R. Gálvez Coutiño por su asistencia en laboratorio y a la
Téc. Octavia Pérez Medina por su apoyo en insectario.
Literatura Citada
Cañedo, V. y T. Ames. 2004. Manual de laboratorio para el manejo de hongos entomopatógenos.
Centro Internacional de la Papa (CIP). Lima, Perú. 62 pp.
Castellanos-Moguel, M. J. 2002. Relación entre los niveles de proteasa y quitinasa en aislados de
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-
224
EFECTO DE LA SALINIDAD EN LA CAPACIDAD INFECTIVA DEL NEMATODO
PARÁSITO Romanomermis iyengari WELCH (NEMATODA:MERMITHIDAE) EN
LARVAS DE MOSQUITOS Culex quinquefasciatus SAY (DÍPTERA: CULICIDAE)
Ninfa Ruiz-Santiago y Rafael Pérez-Pacheco.
Instituto Politécnico Nacional (CIIDIR-IPN-Oaxaca), Calle Hornos N
o
1003, Col. Indeco Xoxocotlán, Oaxaca, México. C.P. 68000. [email protected] ,
RESUMEN. Las especies de nematodos parásitos del género Romanomermis (Mermithidae) son una alternativa efectiva,
específica y sostenible para el control biológico de mosquitos. Sin embargo el uso práctico y extensivo de los nemátodo está
limitado y requieren especial cuidado en la capacidad reproductiva, viabilidad e infectividad de los preparasíticos ya que estos son
la etapa parasítica del nematodo y es limitada por factores ambientales como la Temperatura, Salinidad y pH. Es por ello que se
evaluó el efecto de la salinidad en la capacidad parasítica del nematodo Romanomermis iyengari. Los niveles de parasitismo e
infestación se vieron disminuidos respecto a las concentraciones altas de salinidad. La salinidad es un factor de estrés de los
estados infectivos del nematodo R. iyengari afectando su capacidad infectiva y disminuyendo su potencial de control biológico de
larvas de mosquitos.
Palabras clave: nematodos, Romanomermis iyengari, salinidad.
ABSTRACT. The species of parasitic nematodes of the genus Romanomermis (Mermithidae) are an effective alternative,
targeted and sustainable alternative for biological control of mosquitoes. However the practical and extensive use of the nematode
is limited and they require special care in reproductive capacity, viability and infectivity of the preparasíticos these are the
parasitic nematode stage and is limited by environmental factors such as temperature, salinity and pH. For this reason that
assessed the effect of salinity on the parasitic ability of nematode R. iyengari. Levels of parasitism and infestation were
diminished to high concentrations of salinity. Salinity is a factor of stress of infective state of the nematode R. iyengari affecting
their infective ability and decreasing the potential for biological control of mosquito larvae.
Key words: Romanomermis iyengari, salinity, nematode.
Introducción
Los mosquitos son importantes en el sector salud por ser vectores de enfermedades como
la malaria y dengue, además de los problemas de molestia que ocasionan por sus picaduras,
principalmente por los criaderos naturales que están cerca a establecimientos humanos. La
utilización de insecticidas químicos ha sido el principal recurso en campañas para el control de
mosquitos. Sin embargo, el uso excesivo de estos productos químicos ha ocasionado serios
efectos nocivos sobre el ambiente, fauna y personas expuestas, tales como: contaminación del
suelo, aire y agua, muerte de organismos no nocivos, alteración de ecosistemas, resistencia a
insecticidas, intoxicación de personas y además alto costos económicos (Pérez-Pacheco et al.,
2005).
El uso de nematodos parásitos es una alternativa de alto potencial para el control
biológico de larvas de mosquitos (Paily y Balaraman, 2000). Estos organismos son parásitos
obligados, los cuales deben cumplir parte de su ciclo vital en el interior de una larva de mosquito,
las ventajas principales que presentan estos organismos es su capacidad de sobrevivencia en los
cuerpos de agua después de su emergencia del hospedero (reciclar biológicamente),especificidad
de parasitismo en larvas de mosquitos, provocan parasitismo letal para el hospedero y son
completamente inocuos para la fauna acompañante. Romanomermis iyengari Welch 1964 es uno
de los que presenta mayor potencial para reducir las densidades larvarias de mosquitos en
reservorios naturales (Pérez-Pacheco et al., 2005). Su ciclo de vida consta de cinco fases: huevo,
preparasítico, parásito y postparasítico. La fase preparasítica producto de la eclosión de los
-
225
huevos es corta, de 48 a 72 horas y de gran actividad en búsqueda del hospedero. La presencia de
condiciones ambientales extremas como la salinidad, temperatura y pH de los cuerpos de agua en
donde se aplican afecta su uso práctico y extensivo de control (Pérez et al., 1999) impidiendo
que logren su máximo potencial como agentes de control biológico. En la presente investigación
los estados infectivos de R iyengari fueron sometieron a diferentes concentraciones de salinidad
con el objetivo de determinar su efecto en el porcentaje de parasitismo e infestación del
nematodo.
Materiales y Método
Para evaluar el efecto de la salinidad en la capacidad infectiva de R. iyengari se utilizaron
nematodos preparasíticos de R. iyengari y larvas de II ínstar de Culex quinquefasciatus ambas
especies producidas en la “Planta de producción masiva de nematodos parásitos de larvas de
mosquitos” ubicada en el CIIDIR-IPN-Oaxaca.
Se diseño un experimento completamente al azar con once tratamientos de las siguientes
concentraciones de NaCl: 0.00M testigo (agua desionizada que no contiene sales), 0.2M
(200mg/L), 0.4M (400mg/L), 0.6M (600mg/L), 0.8M (800mg/L), 1M (1000mg/L), 1.2M
(1200mg/L), 1.4M (1400mg/L), 1.6M (1600mg/L), 1.8M (1800mg/L) y 2M (2000mg/L) con
cuatro repeticiones cada tratamiento. Cada unidad experimental consistió en una bandeja de
polietileno de 21x13.5x5.5 cm en la cual se depositaron 200 mL de solución salina de cada una
de las diferentes concentraciones evaluadas, posteriormente se colocaron 100 larvas de mosquito
C. quinquefasciatus en II ínstar y se contabilizaron para aplicar 1000 nematodos preparasíticos
(dosis=10:1 diez nematodos por larva de mosquito) de R. iyengari a través del método de
dilución volumétrica propuesto por Petersen y Willis (1972).
Después de 24 hrs de cada una de las unidades experimentales de los diferentes
tratamientos se tomó una muestra de 20 larvas que fueron depositadas de forma individual en
platos de cultivo de tejidos de 24 pocillos en los cuales previamente se agregaron 6 mL de agua
desionizada. Cuando las larvas colocadas en los pocillos alcanzaron el IV ínstar y comenzaron a
emerger los nematodos (juveniles 4), con ayuda de agujas entomológicas y un microscopio
estereoscópico se cuantifico el número de larvas o pupas con y sin nematodos, así como el
número de nematodos en las larvas parasitadas y su sexo, para posteriormente determinar el
Porcentaje de Parasitismo (PP) y Medias de Infestación (MI, número promedio de nematodos
parasitando una larva).
A los datos de porcentaje de parasitismo y medias de infestación, se les aplicó un análisis
de varianza con Statistical Analysis System (SAS, 2004) y se compararon las medias mediante
una prueba de Tukey (α =0.0 ) para determinar el efecto de la salinidad NaCl en la capacidad
parasítica del nematodo R. iyengari sobre larvas de mosquito C. quinquefasciatus.
Resultados
En el cuadro 1, se muestra el efecto de las diferentes salinidades evaluadas sobre el
porcentaje de parasitismo y media de infestación del nematodo R. iyengari en larvas de mosquito
C. quinquefasciatus.
La salinidad influyó negativamente en el PP (P
-
226
Tukey P
-
227
en el cuerpo de los nematodos en altas concentraciones de sal probablemente disminuye su
motilidad y en consecuencia, la infectividad. El desequilibrio de iones en los nematodos
infectivos y en consecuencia los trastornos metabólicos interfirieren con la capacidad infectiva de
los preparasíticos (Brown y Platzer, 1978).
Conclusión
Fue considerable la acción de salinidades altas sobre la acción infectiva del nematodo R.
iyengari, observándose una reducción drástica en el PP. Esto sugiere que los nematodos
preparasíticos se vio afectada por salinidades altas de NaCl reduciendo su capacidad de
parasitismo.
El rango óptimo de infectividad de R. iyengari fue entre 200 mg L-1
a 1 000 mg L-1
en
donde registró promedios de parasitismo de 100 a 62.6% y en promedio de 7.2 a 2.0 nematodos
por larva parasitada de C. quinquefasciatus.
La tolerancia e infectividad de los preparasíticos de R. iyengari a estas salinidades,
representa una ventaja importante que les permitió una ventaja importante respecto al resto.
Literatura Citada
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EL CONSUMO DE LARVAS DE Galleria mellonella (LEPIDOPTERA: PYRALIDAE)
FUENTE DE NUTRIENTES EN DOS ESTADOS DE SU METAMORFOSIS OPCIÓN AL
COMBATE DE ESTA PLAGA
Virginia Melo Ruiz, Héctor Daniel Jiménez Aguirre, Nidia Vargas Martínez, Tomas Quirino Barreda. Universidad
Autonomía Metropolitana Unidad Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Col. Villaquietud, Delegación Coyoacán,
C.P. 04960. D.F. México. [email protected].
RESUMEN. Galleria mellonella insecto considerado como plaga para las colmenas, provoca perdidas económicas significativas
en la apicultura mexicana y de otras naciones. El objeto de esta investigación fue analizar el contenido de macronutrientes y
minerales a larvas y pupas del organismo, para difundir los beneficios de su consumo a la población y contrarrestar la plaga. En
Tenancingo, Estado de México se colectaron en 2011 larvas y pupas en un apiario, para realizar análisis proximal de nutrientes.
Los resultados obtenidos para 1) larvas y 2) pupas: proteínas 1) 42.54%, 2) 40.50%; lípidos 1) 44.70%, 2) 10.86%; minerales 1)
2.93%, 2) 4.39%; carbohidratos solubles 1) 9.83%, 2) 44.25%. Ambos estados contienen cantidades considerables de proteína, las
larvas poseen alto contenido de lípidos pero en las pupas disminuye, son una buena fuente de macronutrientes y calorías por tanto
pueden considerarse como un alimento más para consumo humano y así como combate de esta plaga.
Palabras clave: apicultura, plaga, macronutrientes, nutrición.
ABSTRACT. Galleria mellonella insect consider as a plague reduce worldwide incomes of Mexican apiaries due to low down
the wax production. The aim of this study was to assess the macronutrients and minerals of the larvae and pupae metamorphosis
stage of wax moth and inform population the benefits of their consumption to human health as well as to void apiary damage of
the moth. Convenience sampling at 2011 was performed at an apiary of Tenancingo, Mexico State, to assess larvae and pupae
macronutrients and minerals of larvae s and pupas. Data from 1) larvae and 2) pupae were: proteins 1) 2. , 2) 0. 0 ; lipids
1) 44.70%, 2) 10.86%; minerals 1) 2.93%, 2) 4.39%; soluble carbohydrates 1) 9.83%, 2) 44.25%. Proteins are high in both
metamorphosis stages, however lipids were higher in larvae than pupae, nevertheless insects are a good source of nutrients
therefore they can become a part of daily diet to improve human health and at the same time low down damage of the grub
plague.
Key words: apiculture, plague, macronutrient, nutrition.
Introducción
La apicultura en México es de importancia económica desde tiempo de la civilización
Maya, la cual practicaba esta actividad, y en época de la colon