COMPARACIÓN DE LAS TECNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE ... · COMPARACIÓN DE LAS TECNICAS DE...

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COMPARACIÓN DE LAS TECNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE

ANTICUERPOS EN PACIENTES CON REFRACTARIEDAD

PLAQUETARIA DE TIPO INMUNITARIO EN COLOMBIA

GINNA ALEXANDRA URREGO MONTOYA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BACTERIOLOGÍA

BOGOTÁ

2009

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TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR EL TITULO DE BACTERIOLOGA

Directora

DOCTORA LUCIA DEL PILAR CORTES

Medica transfusional

_______________________

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BACTERIOLOGÍA

BOGOTÁ

2009

3

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos pos sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan

ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el

anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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APROBADO

Dra. Lucía del Pilar Cortés, Médica Transfusional Directora Dra. Lorena Rodríguez, Bacterióloga Banco de Sangre cruz Roja colombiana Jurado Dra. Consuelo García, Bacterióloga de Banco de Sangre Jurado

5





APROBADO

INGRID SCHULER Ph. D Decana Académica – Facultad de Ciencias LUZ AMPARO MALDONADO FONSECA M. Ed. Directora Carrera de Bacteriología

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DEDICATORIA

A Dios todo poderoso y creador, quien ha iluminado mi camino. Gracias por

permitirme culminar mi trabajo de grado y carrera en este mundo, así se

encuentren personas queridas a tu lado y por darme valor y fortaleza para

alcanzar esta meta.

A mi familia porque siempre han estado a mi lado dándome un apoyo para

que no decaiga en los malos momentos, pueda cumplir mis sueños y por su

solidaridad y real estimulo para emprender y culminar el camino que me trajo

a esta meta.

A Sandra madre, expresión de apoyo, quien cedió muchos momentos de su

pertenencia, convirtiéndose en la más hermosa luz que incentivo mi triunfo y

quien a pesar de su particular manera de ser, me siento orgullosa de tenerte

a mi lado ya que me has dado un gran apoyo en el día a día de mi profesión.

A flor abuela y patricia tía, quienes me han visto en todos los momentos de

mi vida, dándome un apoyo incondicional, una fuerza y fortaleza por medio

de una palabra o ayuda para que el día de hoy pueda tener esta alegría en

nuestras vidas.

En especial a Edgar Manuel padre, en ausencia física, vivo en espíritu, para

que donde quiera que estés veas realizado este humilde triunfo realizado y te

sientas orgulloso de que todo tu esfuerzo para sacarme adelante tuvo

buenos frutos.

A Juan Sebastián hermano, con la confianza de que mi meta les sirva de

estimulo y motivación en sus propios caminos.

A mis amigas, compañeras de profesión en especial a María Fernanda

quienes disfrutaran este éxito, como ha sido tradición entre nosotros y

propósito que teníamos en nuestras vidas para formas un camino de triunfos.

7

Igualmente a todos muchas gracias por su comprensión durante toda esta

experiencia y desde luego por el apoyo y fortaleza para no decaer en los

malos momentos y así lograr tener este sueño realizado.

8

AGRADECIMIENTOS

Doy gracias a Dios por este triunfo, darme la capacidad y oportunidad

de estar donde me encuentro, por haberme permitido ser fruto del

amor de dos seres maravillosos: Edgar Manuel y Sandra, padres

ejemplares de quienes obtuve valores y creencias sobre mi persona,

que hoy les doy a conocer todos los esfuerzos que han hecho por

sacarme adelante, al verme realizar mis sueños y obtener mi título

profesional. A ustedes dedico mi éxito.

A la Dra. Lucia de Pilar Cortes que con su profesionalismo me orientó

en la adquisición de los conocimientos necesarios para la elaboración

de este trabajo de grado y desde luego por todo ese tiempo y

dedicación que me brindo para realizar este trabajo lo más pronto

posible y de la mejor forma.

A la vida por los dones espirituales y materiales recibidos que me han

permitido hacer realidad este sueño, que hoy se convierte en meta.

A mis padres, hermano, familia y amiga por el apoyo y comprensión

para lograrlo y por ser la razón y el esfuerzo de mis metas.

A los evaluadores personas por haber colaborado con sus

comentarios

Muchas gracias.

9

TABLA DE CONTENIDO

PÁG.

1. INTRODUCCIÓN 1 - 3

2. MARCO TEÓRICO 4 - 25

2.1 CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DE LAS 4 - 11

PLAQUETAS

2.1.1 zona periférica o pared celular

2.1.1.1 Capa exterior o glucocáliz 5

2.1.1.2 Membrana celular 6 - 7

2.1.1.3 Citoesqueleto 7

2.1.1.4 Área submembranosa 7

2.1.2 zona de sol- gel o hialoplasma

2.1.2.1 Haz marginal de microtúlos 7

2.1.2.2 Microfilamentos 8

2.1.3 zona de organelos

2.1.3.1 Mitocondrias 8

2.1.3.2 Lisosomas 8

2.1.3.3 Gránulos 8 - 9

2.1.3.3.1 Gránulos densos 8 - 9

2.1.3.3.2 Gránulos alfa 9

2.1.3.4 Masas de glucógeno (citoplasma) 10

2.1.3.5 Aparato de Golgi 10

2.1.4 Sistema tubular denso 10

2.1.5 sistema canalicular abierto 10 - 11

2.2 REFRACTARIEDAD PLAQUETARIA 11 - 14

10

2.2.1 Definición 11

2.2.2 Causas 12 - 13

2.2.3 antecedentes 13 - 14

2.2.4 porcentaje de refractariedad plaquetaria de 14

causa inmune

2.3 Aloinmunización 14 - 15

2.3.1 Mecanismo de aloinmunización plaquetaria 16

2.3.2 Aloinmunización HLA primaria 16

2.3.3 Aloinmunización HLA secundaria 16

2.4 Técnicas para la identificación de anticuerpos en 16 - 45

Refractariedad plaquetaria

2.4.1 MAIPA 16 - 19

2.4.1.1 Fundamento 16

2.4.1.2 Detección 16

2.4.1.3 Equipos necesarios para 17

montar una técnicas de MAIPA

2.4.1.4 Metodología 17 - 19

2.4.1.5 Interpretación de resultados 19

2.4.1.6 Desventajas 19

2.4.1.7 Control de calidad 19

2.4.2 Adherencia de células rojas a una fase 19 - 26

Sólida (SPRCA)

2.4.2.1 Fundamento 19 - 20



Montar la técnica


2.4.2.5 Interpretación de resultados 23 - 24

2.4.2.6 desventajas 24

2.4.2.7 Control de calidad 25 - 26

11

2.4.3 Prueba de linfocitotoxicidad(LCT) 27 - 28



2.4.3.3 Equipos necesarios para 27 - 28

montar una técnica de

linfocitotoxicidad

2.4.3.4 Metodología 28




2.4.4 Ensayo inmunoabsorbente conjugado a una

enzima (ELISA) inmunoensayos 29 - 32

2.4.4.1 Fundamento 29 - 30



montar una técnica de ELISA

2.4.4.4 Metodología 31




2.4.5 Prueba inmunofluorescente especifico para

plaquetas (PSIFT) 32 - 36

2.4.5.1 Fundamento 32 - 33



montar una inmunofluorescencia




2.4.5.7 Control de calidad 35 - 36

12

2.4.6 Ensayo de aglutinación de látex. 36 - 39




montar una aglutinación de látex





2.4.7 Citometría de flujo 37 - 45

2.7.7.1 Fundamento 37 - 39


2.7.7.3 equipos necesarios para 40

montar la citometría de flujo


2.7.7.4 Interpretación de resultados 41 - 43

2.7.7.5 desventajas 43 - 44


3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 47 - 48

3.1 formulación del problema 47

3.2 preguntas planteadas 47

3.3 justificación 47 - 48

4. OBJETIVOS 49

4.1 Específico 49

4.2 General 49

5. METODOLOGÍA 50 - 52

5.1 tipo de investigación 50

13

5.2 selección de los artículos 50

5.3 definición de criterios para la inclusión y

exclusión de los artículos 50 - 51

5.3.1 criterios de inclusión 50

5.3.1.1 tipos de artículos 50

5.3.1.2 tipos de estudio designado para 51

La investigación

5.3.1.3 Año de publicación 51

De artículos

5.3.2 criterios de exclusión 51

5.4 estrategia de búsqueda para la identificación 51 - 52

De los artículos

5.5 selección de los artículos por más de un observador 52

5.6 discusión de artículos 52 - 53

5.7 recopilación de la información 53

5.8 elaboración y escritura de documento 53

6. RESULTADOS 54 - 62

7. CONCLUSIONES 63 - 66

8. RECOMENDACIONES 67

9. REFERENCIAS 68 - 71

10. ANEXOS 72

14

LISTA DE TABLAS Y FIGURAS

Tabla 1. Causas de la Refractariedad Plaquetaria Pág 13

Tabla 2. Porcentajes de Refractariedad plaquetaria

de causa inmune, según revisión bibliográfica Pág 14

Tabla 3. Ventajas y desventajas de las técnicas Pág 60-62

De identificación de anticuerpos

Figura 1. Estructura morfológica de la plaqueta Pág 11

Figura 2. Aloinmunización plaquetaria Pág 15

Figura 3. Representación esquemática de la

Técnica de MAIPA (inmovilización específica

De los antígenos plaquetarios con anticuerpos monoclonales). Pág 18

Figura 4. Reacción inmunológica en placa. Pág 20

Figura 5. Sistema en fase sólida para la

Detección de anticuerpos IgG contra plaquetas. Pág 23

Figura 6. Interpretación de resultados de la fase sólida. Pág 24

Cuadro 1.Estructura plaquetaria Pág 5

Cuadro 2. Resumen de refractariedad plaquetaria Pág 45-46

15

LISTA DE ANEXOS

· Anexo 1. Artículo clinical and blood bank factors in the management of

platelet refractoriness and alloimmunization.

· Anexo 2 Artículo guidelines for the management of platelet transfusion

refractoriness.

· Anexo 3 Artículo is flow cytometry accurate enough to screen

Platelet autoantibodies?

· Anexo 4 Artículo evaluación del desarrollo de la refractariedad

plaquetaria en pacientes con neoplasias de origen hematológico,

transfundidos con concentrados de plaquetas obtenidos por el método

cb-bc en presencia y ausencia de filtros desleucocitarios.

· Anexo 5 Artículo platelet-specific antibodies in HLA-immunized

patients receiving chronic platelet support.

· Anexo 6 Articulo Platelet Transfusion therapy.

· Anexo 7 Artículo características estructurales y funcionales de las

plaquetas.

· Anexo 8 Artículo platelet alloantibodies in transfused patients.

· Anexo 9 Articulo reacciones postransfusionales.

16

· Anexo 10 Articulo transfusión de concentrados de Plaquetas, plasma

y componentes Plasmáticos, y granulocitos.

· Anexo 11 Artículo platelet antibody: review of detection Methods

17

GLOSARIO

1. AGLUTINACIÓN: Es la reacción Ag-Ac que puede ser detectada y

cuantificada por la formación del aglutinado celular o bacteriano.

2. ALOANTICUERPO: Es un anticuerpo producido por un individuo

que reacciona con aloantígenos de otros individuos de la misma

especie.

3. ALOINMUNIZACIÓN: Desarrollo de anticuerpos anti-HLA de

Clase I o anticuerpos HPA o ambos.

4. ANTICUERPO: También conocidos como inmunoglobulinas que

son glicoproteínas del tipo gammaglobulina.

5. ANTILEUCOCITARIO: Anticuerpos dirigidos contra los leucocitos.

6. ANTIPLAQUETARIO: Anticuerpos dirigidos contra las plaquetas

.

7. AUTOANTICUERPO: Anticuerpo dirigido contra moléculas del

propio organismo.

8. CONTROL DE CALIDAD: Estrategia para asegurar el

mejoramiento continuo de las técnicas que se van a realizar y que

se encuentran realizando bajos los estándares mínimos para la

obtención de resultados fiables.

9. EFICACIA: Capacidad de alcanzar los resultados de calidad

previstos, independientemente de los medios que se utilicen, de

18

acuerdo con las metas y objetivos propuestos, y con los

estándares de calidad definidos. La eficacia hace referencia a

nuestra capacidad para lograr lo que nos proponemos.

10. EFICIENCIA: Capacidad de lograr un efecto determinado

optimizando los recursos disponibles, relación entre los recursos

utilizados en un proyecto y los logros conseguidos con el mismo.

Se entiende que la eficiencia se da cuando se utilizan menos

recursos para lograr un mismo objetivo.

11. ELISA: Detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase

sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente

producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante,

puede ser medido espectrofotométricamente.

12. ESPECIFICIDAD: Es la probabilidad de clasificar correctamente a

un individuo sano, es decir, la probabilidad de que para un sujeto

sano se obtenga un resultado negativo. En otras palabras, se

puede definir la especificidad como la capacidad para detectar a

los sanos.

13. EXACTITUD: Se refiere a que tan cerca del valor real se

encuentra el valor medido. En términos estadístico, la exactitud

está relacionada con el sesgo de una estimación. Cuanto menor

es el sesgo más exacto es una estimación.

14. HLA: (antígenos leucocitarios humanos) Es un conjunto de

genes implicados en el reconocimiento inmunológico y en la

señalización entre células del sistema inmunitario.

19

15. INMUNOFLUORESCECIA: Es una técnica de laboratorio

empleada para identificar anticuerpos o antígenos específicos, con

ayuda de un fluorocromo encargado de marcar el componente que

se necesita.

16. LINFOCITOTOXICIDAD: Importante para la detección de los

anticuerpos dirigidos contra los antígenos HLA presentes tanto en

leucocitos como en plaquetas.

17. MICROPLACA: Placa en la que se realiza el proceso de detección

de antígenos y anticuerpos con la formación de un pells en el

fondo del pozo.

18. MONOCLONAL: Se define como un grupo de células producidas

a partir de una única célula en la que sucede un proceso de

replicación celular.

19. PLAQUETA: Son fragmentos de células anucleadas, de unos

3μm de diámetro, que se encuentran en la sangre y que se forman

a partir de un tipo celular denominado megacariocito.

20. POLITRANSFUNSIÓN: Paciente al que se le ha suministrado

constantemente varias unidades de hemocomponentes.

21. PRECISIÓN: Se refiere a la variación del conjunto de valores

obtenidos de mediciones repetidas de una magnitud. Cuanto

menor es la dispersión mayor la precisión.

20

22. REFRACTARIEDAD PLAQUETARIA: Fallo en el incremento del

número de plaquetas después de dos transfusiones seguidas con

concentrados plaquetarios de excelente calidad, AB0 compatibles

y en ausencia de fiebre, infección, hemorragia, esplenomegalia o

CID.(9)

23. SENSIBILIDAD: Es la probabilidad de clasificar correctamente a

un individuo enfermo, es decir, la probabilidad de que para un

sujeto enfermo se obtenga en la prueba un resultado positivo. La

sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar la

enfermedad.

24. TECNICA: Es un procedimiento o conjunto de estos, (reglas,

normas o protocolos), que tienen como objetivo obtener un

resultado determinado y deseado.

25. TRANSFUSIÓN: Proceso por el cual se administra a un paciente

un hemocomponente en las mejores condiciones con

características similares evitando reacciones transfusionales.

26. TROMBOCITOPENIA: Trastorno cuya característica es la

escasez o disminución de plaquetas.

21

RESUMEN

Este trabajo trata acerca de las técnicas usadas para la detección de

anticuerpos en un paciente que presenta refractariedad plaquetaria de tipo

inmune sabiendo la definición, causas y etiología por los cuales es

ocasionada, teniendo como base los antecedentes y porcentaje en el cual

sucede la refractariedad plaquetaria en pacientes politransfundidos y

mostrando los siguientes aspectos de las técnicas de laboratorio como son:

Maipa, Inmunofluorescencia, Citometría de flujo, Linfocitotoxicidad,

Adherencia de Células Rojas a Fase Solida, Elisa y Aglutinación en Látex

teniendo en cuenta el fundamento, sitio de acción, materiales, metodología a

seguir, resultados y control de calidad que se debe de seguir para obtener

óptimos resultados para así saber la eficiencia y eficacia de cada una de

ellas y de esta manera se podrá escoger la técnica que puede acomodarse a

las condiciones de la población colombiana de acuerdo con las necesidades

del paciente, la situación financiera y el método más exacto y preciso para

diagnosticar al paciente dándole un resultado fiable y útiles para su

tratamiento a nivel medico.

PALABRAS CLAVES: aloinmunización, refractariedad, plaqueta,

politransfundido.

22

ABSTRACT

This paper discusses the techniques used for detecting antibodies in patients

with immune platelet refractoriness.

We carried out a literature search of the principal laboratory techniques and

we describe the definition, site of action, materials, methodology, results, and

quality control that must be followed to obtain optimum results. Also, we

explain the sensitivity and specificity of each technique.

In this way, this work will give you the skills to choose the best technique that

can be adapt to the Colombian conditions, the patient's needs, the financial

position and the most accurate and precise method to diagnose the pathology

and give the most suitable treatment to the patient.

KEY WORDS: alloimmunization, refractory state, platelet, politransfundido.

1

1. INTRODUCCIÓN

Las plaquetas son células, de aproximadamente 3μm de diámetro, que se

encuentran en la sangre y que se forman a partir de un tipo celular

denominado megacariocito. Tienen una vida media de 7 a 10 días y son de

gran importancia en la coagulación sanguínea por su capacidad para

agregarse unas con otras en respuesta a diversos estímulos, al haber un

aumento en el numero se pueden formar trombos. De igual forma al haber

una disminución de este tipo de células sanguíneas es necesario soporte

transfusional de plaquetas como tratamiento y / o prevención de hemorragias

en pacientes con una disminución del número o función de las plaquetas. La

transfusión profiláctica de plaquetas es utilizada en pacientes con

enfermedades malignas con tratamiento de quimioterapia o radiación que

induce trombocitopenia. Las transfusiones terapéuticas de plaquetas se

utilizan en el período postoperatorio tras la cirugía de bypass del corazón y la

disfunción plaquetaria en trombocitopenia asociada con coagulopatía

(coagulación intravascular diseminada “CID”). (10)

Cuando un paciente necesita más de dos transfusiones de

hemocomponentes, se dice que es un paciente politransfundido. En este tipo

de pacientes, es importante tener en cuenta el riesgo de presentar

refractariedad plaquetaria. Aproximadamente el 50% de los pacientes

politransfundidos se vuelven refractarios a los concentrados plaquetarios,

limitando la efectividad clínica de esta terapia. La refractariedad plaquetaria

es un fallo en el incremento del número de plaquetas después de dos

transfusiones seguidas con concentrados plaquetarios de excelente calidad,

AB0 compatibles, frescas (recolección menor de 72 horas) y en ausencia de

fiebre, infección, hemorragia, esplenomegalia o coagulación intravascular

diseminada (CID).(9)

2

Una de las causas por las cuales se origina la refractariedad plaquetaria es

inmunológica la cual se asocia con una rápida destrucción de las plaquetas,

sangrado activo y disminución de la cantidad después de 1 hora de la

transfusión del concentrado plaquetario (9), puede deberse a aloanticuerpos

dirigidos contra aloantígenos plaquetarios, o en su mayoría por anticuerpos

anti-leucocitarios en especial por aloinmunización de tipo HLA clase I. Esta

causa inmunológica, debe sospecharse en los casos de refractariedad sin

causa clínica que la justifique, por lo cual es más frecuente en mujeres

multíparas y politransfundidos, estimándose que en el 20% al 50% de los

pacientes politransfundidos pueden detectarse aloanticuerpos contra

antígenos HLA y/o anticuerpos antiplaquetarios específicos. Por otra parte,

los autoanticuerpos que causan refractariedad plaquetaria se encuentran

generalmente en pacientes con púrpura trombocitopenia inmune (PTI) y en

algunos pacientes con trasplante de médula ósea. (9)

Otra causa de refractariedad plaquetaria es la no inmunológica que es más

frecuente, se encuentra asociada con sepsis, esplenomegalia, antibióticos,

sangrado en mucosas, etc. Esta causa esta asociada con la ausencia de

anticuerpos antiplaquetarios y disminución en el rendimiento plaquetario a la

hora de transfundidos. (9)

Conociendo cuales son los motivos, razones y circunstancias por las cuales

se ocasiona la refractariedad plaquetaria en pacientes politransfundidos, se

pueden usar técnicas para la identificación de anticuerpos como:

· Inmovilización específica de los antígenos plaquetarios con

anticuerpos monoclonales(MAIPA)

· Adherencia de células rojas a una fase sólida (SPRCA)

· Prueba de linfocitotoxicidad (LCT)

3

· Ensayo inmunoabsorbente conjugado a una enzima (ELISA),

inmunoensayos

· Prueba inmunofluorescente especifico para plaquetas (PSIFT)

· Ensayo de aglutinación de látex.

· Citometría de flujo

En esta revisión se realizará un análisis de las técnicas para

determinar cuál es más eficiente, factible para la realización y estar al

alcance de todos los servicios transfusionales, pero sobre todo

aplicable a las condiciones del paciente que presenta refractariedad

plaquetaria de tipo inmune.

4

2 MARCO TEÓRICO

2.1 CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DE LAS PLAQUETAS

Las plaquetas son discos de forma elipsoidal que como todas las

demás células sanguíneas provienen de una célula hematopoyética

Stem que da lugar a la línea megacariocítica. En 1906, Wright

demostró que estas partículas se formaban en la médula ósea por la

fragmentación del citoplasma de una célula poliploide, el

megacariocito (células muy grandes). Su recuento normal en la sangre

es de 150 - 350 x 103 plaquetas/mm3 y la función principal es la

prevención y detención de la pérdida de sangre del torrente

circulatorio. Se calcula que en un individuo normal, 42 x 109

plaquetas/L/día aproximadamente se renuevan de la circulación, con

un tiempo promedio de supervivencia de 7-10 días, siendo el bazo el

sitio donde se destruyen.

Las plaquetas son muy sensibles a diferentes estímulos y frente a una

lesión endotelial reaccionan rápidamente, adhiriéndose al

subendotelio; aquí participan receptores a nivel de membrana de las

plaquetas y una serie de sustancias llamadas genéricamente

adhesinas. Los receptores plaquetarios están constituidos por las

glicoproteínas llamadas integrinas y son los sitios de unión de las

proteínas adhesivas. Muchas de las funciones de las plaquetas

(adhesión, agregación, asociación con otros elementos celulares) se

realizan principalmente por la actividad funcional de las integrinas, las

cuales favorecen la unión de las plaquetas al endotelio vascular (a

través de las proteínas adhesivas). Las integrinas están moduladas

5

por concentraciones milimolares de calcio. En la actualidad se están

realizando esfuerzos en la caracterización de nuevos receptores

adhesivos plaquetarios relacionados con las integrinas, puesto que

esta nueva información facilitará la incorporación de medidas

terapéuticas específicas en la enfermedad vascular. En el cuadro 1 y

figura 1 se observa la estructura que presenta la plaqueta por zonas

teniendo en cuenta los organelos.

Cuadro 1. Estructura plaquetaria

2.1.1 ZONA PERIFÉRICA O PARED CELULAR

2.1.1.1 CAPA EXTERIOR O GLUCOCÁLIZ

w Está en contacto con el plasma circulante.

w Contiene ATP-asa contráctil.

w Es la estructura por la que se adhieren las plaquetas.

w Tiene avidez por proteínas externas.

6

2.1.1.2 MEMBRANA CELULAR

w Es trilaminar:

o Proteína contráctil que participa en la retracción del coágulo

(trombostetina).

o Acido araquidónico (precursor de prostaglandinas).

o Factor plaquetario.

w Mantiene la integridad celular de la plaqueta.

w Constituye una bicapa lipoproteica con glicoproteínas que

funcionan como receptores de los agonistas fisiológicos de las

plaquetas (ADP, TXA2, trombina), proteínas adhesivas

(fibrinógeno, fibronectina, laminina, trombospondina, vitronectina,

factor de von Willebrand [vWF]) y para ligandos fibrosos como el

colágeno, además, posee enzimas importantes para el

funcionamiento celular y fosfolípidos. Es responsable de la

interacción de la célula con el medio circundante a través de

receptores entre las que figuran las integrinas las cuales se

caracterizan por enlazarse a proteínas que tienen la secuencia

arginina-glicina-aspartato (RGD): fibrinógeno, fibronectina,

vitronectina, vWF, colágeno.

w La GPIIb/IIIa ocupa una gran proporción de la superficie

plaquetaria (15 % de la proteína total de la membrana y 3 % de la

célula). Se encuentra principalmente en la membrana plaquetaria

(1–3x104 moléculas /plaqueta). La región extracelular posee los

dominios de identificación de la trombina y el vWF. Las diferentes

porciones de este complejo tienen una función: la región

extracelular facilita el acceso al subendotelio y la interacción con

trombina y vWF; la región intracitoplasmática une los dominios

funcionales extraplaquetarios con el citoesqueleto de actina; la

7

región transmembrana actúa como anclaje de la glicoproteína en la

membrana plaquetaria.

2.1.1.3 ÁREA SUBMEMBRANOSA

w Es la parte interna de la zona periférica.

w Es filamentosa.

w Mantiene la forma discoidal de la plaqueta y participa en la

estabilización de los tentáculos de los trombocitos.

2.1.2 ZONA DE SOL – GEL O HIALOPLASMA

w Es un gel visco elástico que contiene filamentos de actina

entrecruzados, conectados a la GPIb por proteínas enlazantes de

actina. Tiene como funciones:

a) la regulación de las propiedades de la membrana, tales como sus

contornos y estabilidad, junto a los microtúbulos propicia el

mantenimiento de la forma de la plaqueta en reposo

b) mediación de la distribución lateral de las glicoproteínas receptoras

en la membrana

c) constituye una barrera para la exocitosis.

Su alteración puede llevar a la fragmentación del citoplasma formando

micropartículas.

2.1.2.1 HAZ MARGINAL DE MICROTÚBULOS

w Anillo situado debajo de la pared celular.

w Compuesto de subfilamentos.

w Es un citoesqueleto que mantiene la forma de disco de la plaqueta.

w Se pierde cuando se activan los trombocitos.

8

2.1.2.2 MICROFILAMENTOS

w Están formados por proteínas contráctiles como la actina, la miosina,

la actomiosina (trombostetina).

w Los filamentos de actina enrejados, conectados con el citoesqueleto

submembranoso y miosina se encuentra en forma no polimérica en la

célula en reposo.

w Intervienen en los cambios de forma de la plaqueta y en la secreción

de sustancias.

2.1.3 ZONA DE ORGANELAS

2.1.3.1 MITOCONDRIAS

w Son poco abundantes.

w Contribuyen al depósito de ATP y de calcio.

w las mitocondrias, capacitan a los gránulos en la oxidación de ácidos

grasos proveyéndolas de metabolismo aeróbico;

2.1.3.2 LISOSOMAS

w Contienen enzimas hidrolíticas que intervienen en la lisis celular.

2.1.3.3 GRÁNULOS

Varios tipos de gránulos se observan en el citoplasma plaquetario:

2.1.3.3.1 GRÁNULOS DENSOS

w los cuerpos densos que son reservorios de serotonina, nucleótidos

adenílicos metabólicamente no utilizables por la plaqueta e iones

calcio.

w Son escasos.

9

w Encierran metales y otras sustancias.

w Tienen una función secretora.

w Se caracterizan por su alta densidad electrónica que le confieren el

elevado contenido en calcio (50 % del total, en una concentración 2

mol/L) y fósforo inorgánico

2.1.3.3.2 GRÁNULOS ALFA ESPECÍFICOS

w los gránulos alfa con halos periféricos de baja densidad; estos son

heterogéneos y algunos contienen enzimas lisosómicas mientras

otros son ricos en tromboglobulina, factor plaquetario 4 (FP-4),

fibrinógeno, vWF, FVa, trombospondina, factor mitogénico y otras

proteínas de la coagulación. La ausencia de estos gránulos provoca el

síndrome de la plaqueta gris.

w Son numerosos.

w Sintetizados por el Aparato de Golgi.

w Proteínas específicas que se liberan cuando se activan las plaquetas.

w Son organelos esféricos de 140 a 400 nm en diámetro, ricos en

macromoléculas con una porción de alta densidad en electrones.

w Constituyen un 15 % del volumen total de las células. Sus membranas

contienen GPIIb/IIIa, pequeñas cantidades de GPIb, GPIX y P

selectina.

w Tienen una importante participación en el funcionamiento celular, al

propiciar la interacción entre plaquetas, de ahí que la cantidad de

gránulos alfa (como promedio 35-40) determina el valor funcional de

la célula. También participan en la interacción con otras células a

través de la liberación de su contenido.

10

2.1.3.4 MASAS DE GLUCÓGENO (citoplasma)

w Son grupos de esta sustancia.

w Contienen partículas de glucógeno diseminadas o aglomeradas que

constituyen la fuente energética de la célula en forma similar a las

células musculares.

w Contiene ribosomas en muy pocas cantidades, fundamentalmente en

las células jóvenes, lo que concuerda con la casi nula actividad de

síntesis proteica.

w Soporta, además, los microtúbulos que aparecen en forma de

circunferencia, ubicados de manera concéntrica y que mantienen la

forma discoide de la célula y garantizan su resistencia a la

deformación.

2.1.4 SISTEMAS MEMBRANOSOS

2.1.4.1 APARATO DE GOLGI

w Se encuentran en algunas plaquetas.

w Contribuyen a la síntesis de sustancias.

2.1.4.2 SISTEMA TUBULAR DENSO

w Es una serie irregular de canales bajo el haz marginal de microtúbulos.

w Interviene en la fabricación de elementos fibrosos.

2.1.4.3 SISTEMA CANALICULAR ABIERTO

w Son Invaginaciones de la membrana celular formando un sistema de

tortuosos canales que comunican el interior de la plaqueta con el

plasma.

w Asociado al sistema tubular denso.

w Facilita la secreción y aumenta la superficie de la plaqueta.

11

w Está formado por canales ramificados, se conecta a la membrana

externa y posee características similares a ella en cuanto a su

composición. A través de este sistema se transportan las GPIIb/IIIa y

la GP1b hacia los gránulos.

Fig.1 Estructura morfológica de una plaqueta

2.2 REFRACTARIEDAD PLAQUETARIA

2.2.1 DEFINICION

La refractariedad plaquetaria es un fallo en el incremento del

número de plaquetas después de dos transfusiones de

concentrados plaquetarios seguidas, de calidad comprobada, AB0

compatibles, frescas (recolectadas antes de 72 horas) y en

ausencia de fiebre, infección, hemorragia, esplenomegalia o CID.

(9)

12

2.2.2 CAUSAS

La refractariedad plaquetaria es provocada por una destrucción de

las plaquetas que puede ser de causa inmune o no inmune. La

adecuada respuesta a la transfusión de plaquetas en el paciente

puede ser medida cuando se observa que el sangrado se detiene y

por el incremento del conteo de plaquetas en una muestra pos-

transfusional. El incremento en el conteo de plaquetas después de

la transfusión, se mide entre 60 y 90 minutos de terminada la

terapia. Esta medida suele expresarse como el incremento del

conteo corregido (ICC) y se puede calcular mediante las siguientes

ecuaciones (4):

ICC (En 1 hora) = (Conteo plaquetas pos-transfusión – Conteo plaquetas pre-transfusión) x AC*

Número de unidades transfundidas

ICC (En 1 hora) = Conteo plaquetas pos-transfusión –Conteo plaquetas pre-transfusión) x AC*

Número de plaquetas transfundidas (En múltiplos de 1011)

* AC= Área o superficie corporal (m2).

Cuando se utiliza la primera ecuación se obtiene un ICC entre

4000 y 5000/uL y cuando se aplica la segunda ecuación entre

7000 y 10000/uL, lo que nos indica que ha habido una adecuada

respuesta a la transfusión plaquetaria. (13)

En pacientes con refractariedad plaquetaria, después de descartar

las causas no inmunes, se debe considerar las causas inmunes

investigando la identificación de anticuerpos HLA del donador, por

que la incompatibilidad HLA de las plaquetas en la transfusión es

frecuentemente, el cual puede ser evitado realizando un estudio

13

previo de compatibilidad plaquetaria, dando así una mejor

respuesta a la transfusión.

Las causas de refractariedad plaquetaria: inmunes y no inmunes

están relacionadas en la tabla 1 (3,23):

Tabla 1. Causas de la Refractariedad Plaquetaria

NO INMUNE INMUNE

CID Anticuerpos HLA

Sepsis Anticuerpos contra plaquetas

Uso de fármacos (anfotericina) Complejos inmunes circulantes

Viremia Anticuerpos leucocitarios

Fiebre Autoanticuerpos (PTI)

Radioterapia, quimioterapia Drogas dependientes de anticuerpos

plaquetarios.

Vasculitis(daño endotelial) Incompatibilidad de grupo sanguíneo

ABO

Esplenomegalia

Fuente: YanYun Wu. Cáncer: principios y prácticas de oncología, 7ed. capítulo 52. 2005

2.2.3 ANTECEDENTES

En el año de 1999 se realizó un estudio multicentrico con

530 pacientes que presentaban leucemia mieloide aguda

como enfermedad de base, estos pacientes fueron tenidos

en cuenta para identificar las causas de refractariedad

plaquetaria, en este estudio se determinó como primera

instancia que la causa inmunitaria sin presentación de

anticuerpos HLA se encontraba con una incidencia de 45%

(estudios TRAMP) y otros de los pacientes presentaba

14

refractariedad plaquetaria resultantes de aloinmunización

con una incidencia de 29%. En la segunda instancia se

determinó otra causa de la refractariedad plaquetaria,

siendo esta la no inmune que ha demostrado ser motivo de

fracaso en la transfusión de al menos el 80% de los

pacientes.

2.2.3.1 PORCENTAJE DE REFRACTARIEDAD PLAQUETARIA DE

CAUSA INMUNE.

En la siguiente tabla, se relacionan diferentes porcentajes de refractariedad

plaquetaria por causa inmune encontrados por diferentes autores.

Tabla 2. Porcentajes de Refractariedad plaquetaria de causa inmune, según la revisión bibliográfica.

PORCENTAJE AUTORES

20-30% Nemo,GJ and McCurdy PR Transfusion 1991;31:584

30-70% Friedberg RC et al. Blood 1993; 81:3428

30% TRAP Study Group NEJM 1997; 337:1861

Fuente: Artículos de revistas incluidas en la revisión bibliográfica.

2.3 ALOINMUNIZACIÓN

Se define como el desarrollo de anticuerpos anti-HLA de Clase I

o anticuerpos HPA o ambos. La Refractariedad plaquetaria es

no obtener respuesta satisfactoria a las transfusiones de

plaquetas. (3)

Se desconoce el mecanismo preciso de aloinmunización

plaquetaria, debido a que las plaquetas expresan solo

antígenos HLA clase I.

15

La expresión de antígenos HLA de clase I y II en las células

presentadoras de antígenos funcionales del componente

sanguíneo transfundido, puede ser el causante del inicio de una

respuesta inmune en el receptor. Es así como se ha postulado

que las células presentadoras de antígenos presentan péptidos

antigénicos en conjunción con antígenos HLA clase II del

donante a linfocitos T CD4 (TH2) del receptor, para inducir la

producción de citoquinas y así estimular a los linfocitos B para

producir aloanticuerpos. Los péptidos HLA clase I también

pueden ser reconocidos por los linfocitos T CD8 (TH1), iniciando

así una respuesta inmune citotóxica. Por ello, esta respuesta

inmune mediada por linfocitos T requiere de la interacción entre

las células presentadoras de antígenos del donante y linfocitos

T CD4 y linfocitos T CD8 del receptor.

2.3.1 MECANISMO DE ALOINMUNIZACIÓN PLAQUETARIA

En la figura 2 se observa el mecanismo de aloinmunización

plaquetaria entre el donante y receptor de las plaquetas

dependiendo del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA).

Figura 2. Aloinmunización plaquetaria.

16

2.3.2 ALOINMUNIZACIÓN HLA PRIMARIA

La aloinmunización parece ser iniciada por las células que

expresan tanto antígenos HLA de clase I y clase II como

linfocitos y células presentadoras de antígenos. Las

plaquetas sólo expresan antígenos HLA de clase I. (3)

2.3.3 ALOINMUNIZACIÓN HLA SECUNDARIA

No requiere la presencia de antígenos HLA de clase II y

puede ocurrir en pacientes que han estado embarazadas o

han sido previamente transfundidos. (3)

2.4 TECNICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS EN

REFRACTARIEDAD PLAQUETARIA

2.4.1 Inmovilización Específica de los Antígenos

Plaquetarios con Anticuerpos Monoclonales (MAIPA)

2.4.1.1 Fundamento: Técnica considerada como el

patrón de oro de referencia en inmunología

plaquetaria. Esta técnica es más sensible y

permite definir simultáneamente la especificidad

del anticuerpo detectado y la Glicoproteína en la

cual se localiza el antígeno así como,

determinar si las inmunoglobulinas están

dirigidas contra antígenos HLA u otros

específicos de plaquetas.(8,16)

2.4.1.2 Detecta : Anticuerpos HLA

17

2.4.1.3 Equipos y reactivos necesarios para técnica

MAIPA

· Pipetas para servir las muestras y los reactivos.

· Baño serológico 37°C.

· Agitador de placas

· Lavador automático

· Centrífuga

· Microplaca

· Pipeta Multicanal

· Lector de Elisa

· Enzima

· Conjugado

· Sustrato

· Solución stopper

2.4.1.4 Metodología:

La caracterización de los anticuerpos que

reaccionan con las plaquetas se realiza con

MAIPA, con algunas pequeñas modificaciones

como se demuestra en la figura 3:

18

Figura 3. Representación esquemática de la técnica de MAIPA.

1. En la primera fase se incuban las plaquetas control de forma

secuencial, con el suero que se va a estudiar y con anticuerpos

(Ac) monoclonales específicos para las distintas glicoproteínas

(GP) de la membrana plaquetaria.

2. Las plaquetas sensibilizadas se lavan y se solubilizan.

3. El sobrenadante obtenido de las plaquetas solubilizadas se

depositan en una microplaca recubierta con anti-IgG de ratón;

los posibles anticuerpos antiplaquetarios presentes en el suero

estarán ligados al complejo inmovilizado de la GP con el Ac

monoclonal correspondiente. Estos se unirán, a través del

anticuerpo monoclonal, al fragmento Fc de la antiglobulina de

ratón fijada al pocillo de la microplaca

19

4. Podrán detectarse mediante ELISA, por adición de anti-IgG

humana marcada con enzimas como Fosfatasa alcalina y

Peroxidasa y el sustrato de color correspondiente. (8,16)

2.4.1.5 Interpretación de resultados: dado por la

presencia o ausencia del pellets en el fondo de

la microplaca. La presencia de anticuerpos

HLA-II no interfiere en el resultado y el empleo

de varios anticuerpos monoclonales permite la

identificación de diversas especificidades

presentes en un mismo suero, sin necesidad de

realizar adsorciones diferenciales. (8,16)

2.4.1.6 Desventaja: El principal inconveniente radica en

la necesidad de utilizar un amplio panel de

anticuerpos monoclonales dirigidos contra todas

las GP cuando se estudian sueros

desconocidos. (kiefel et al, 1987)

2.4.1.7 Control de calidad: Si el anticuerpo monoclonal

reconoce el mismo epítope que el anticuerpo

plaquetario se pueden obtener falsos resultados

negativos (kiefel et al, 1987)

2.4.2 ADHERENCIA DE CÉLULAS ROJAS A UNA FASE

SÓLIDA (SPRCA)

2.4.2.1 Fundamento: Se basa en la reacción de los

antígeno/anticuerpo.

Una monocapa de plaquetas de donante es

inmovilizada mediante centrifugación en la

superficie de los pocillos de microplaca

20

recubiertos con anticuerpo monoclonal de ratón

plaquetario específico. El suero del paciente y

LISS (Solución de Baja Fuerza Iónica) son

incubados en los pocillos apropiados,

permitiendo que los anticuerpos del suero se

unan a la monocapa inmovilizada de plaquetas.

Después de la incubación, los componentes de

suero que no se han unido se eliminan

mediante lavado. Los anticuerpos unidos a las

plaquetas son detectados añadiendo IgG anti-

humano monoclonal de ratón y eritrocitos

sensibilizados con IgG humano (células rojas

indicadoras MASPAT) y la subsiguiente

centrifugación de la microplaca. En caso de una

reacción positiva, el IgG anti-humano y las

células rojas indicadoras MASPAT se unen a

los anticuerpos IgG en la monocapa de

plaquetas. (8,16)

El proceso que se observa en la placa se

esquematiza en la figura 4.

Figura 4. Reacción inmunológica en placa.

21

2.4.2.2 Detecta: anticuerpos antiplaquetarios, rastreo de

anticuerpos leucocitarios. Se usa también como

pruebas de compatibilidad plaquetaria, pruebas

de tipificación antigénica y permite cuantificar

IgG asociada a plaquetas.


de adherencia de células rojas a una fase

sólida (SPRCA)

· Pipeta multicanal apropiada para 50, 100 y 150 μl

· Microplaca

· Puntas desechables.

· Pipetas de transferencia desechables de

PLÁSTICO (pipetas de Pasteur o chupas

plásticas).

· Incubadora 37°C

· Lector automático

· Centrífuga de microplaca.

· Suspensión 0,3% de células rojas indicadoras

MASPAT de eritrocitos sensibilizados en un medio

conservante.

· Solución Liss

· Salina tamponada con fosfato (PBS).

· Reactivo anti-IgG


Ø El método consiste en obtener un concentrado plaquetario o

plasma rico en plaquetas mediante el centrifugado lento 400

rpm. de muestras recogidas con EDTA, para luego utilizarlas

como fuente directa o indirecta de la investigación.

22

Ø Permitir que todos los reactivos alcancen la temperatura

ambiente (18-25°C).

1. Extraer la microplaca

2. Añadir Plasmas Rico en Plaquetas en o concentrados

plaquetarios del donante a los pocillos (suero de paciente,

control positivo y control negativo).

3. Centrifugar la microplaca para inmovilizar las plaquetas

en la superficie de los pocillos.

4. Trasvasar y eliminar las plaquetas que no se han unido

lavando los pocillos de la microplaca manualmente con

PBS.

5. Añadir LISS a cada pocillo.

6. Añadir control positivo o control negativo a los pocillos

apropiados.

7. Añadir suero del paciente a los pocillos restantes con

monoplacas de plaquetas de donante.

8. Centrifugar.

9. Incubar la microplaca a 37°C

10. Lavar los pocillos de la microplaca manualmente con

PBS

11. Añadir reactivo anti-IgG a cada pocillo inmediatamente

después del lavado.

12. Añadir CÉLULAS ROJAS INDICADORAS MASPAT a

cada pocillo. Agitar suavemente.

13. Centrifugar la microplaca

14. Las reacciones pueden examinarse ahora

macroscópicamente o usando un lector automático, como se

muestra en la figura 5. (8,16)

23

Figura 5. Sistema en fase sólida para la detección de

anticuerpos IgG contra plaquetas.

2.4.2.5 Interpretación de Resultado: Momentos más

tarde la inclusión de un suero antiglobulínico

IgG hará de puente específico entre el

anticuerpo IgG presente (muestra) y la

inmunoglobulina sensibilizada de los hematíes

cohorte, quienes proporcionan el revelado de la

reacción. Las reacciones positivas se

caracterizan por la adherencia de las células

rojas indicadoras a toda la superficie de los

pocillos, mientras que las reacciones negativas

producen pellets discretos de células rojas

indicadoras en el centro del pocillo. En el

resultado como lo ilustra la imagen, se observa

la formación de un punto o manto si la reacción

es negativa o positiva respectivamente.

24

Una reacción positiva o positiva débil (los

eritrocitos forman una capa en el fondo del

pocillo) indica la presencia de anticuerpos

plaquetarios y/o HLA específicos en el suero.

Una reacción negativa (los eritrocitos forman un

botón en el fondo del pocillo) indica la ausencia

de anticuerpos plaquetarios y/o HLA específicos

en el suero, como se encuentra esquematizado

en la figura 6. (8,16)

Figura 6. Interpretación de resultados de la fase sólida.

2.4.2.6 Desventaja: Un recubrimiento menos óptimo de

los pocillos resultará en un funcionamiento

inadecuado del test, reduciendo tanto la

25

sensibilidad como la fuerza de las reacciones en

los resultados finales del test. (8,16)

2.4.2.7 Control de calidad: Se recomienda realizar el

control positivo y negativo MASPAT para cada

donante. Si se requiere un autocontrol del

paciente, el suero del paciente debe ser

analizado frente a las plaquetas del paciente

mismo derivadas de una muestra de sangre con

EDTA. El control negativo MASPAT debe

realizarse para determinar los anticuerpos

unidos a las plaquetas del donante. El control

positivo verifica si se ha obtenido una

monocapa de plaquetas adecuada del donante.

Los resultados falsos positivos o negativos

pueden ser originados por contaminación del

material de análisis o por diferir del método

recomendado. Los resultados falsos positivos

pueden darse si las plaquetas del

donante/paciente son ABO incompatibles con el

suero analizado, si los anticuerpos IgG están

unidos a las plaquetas del donante o si la

concentración de plaquetas es demasiado baja

(<0,5 x 108/ml). Los resultados falsos negativos

pueden darse con un control positivo MASPAT

si las plaquetas usadas no contienen los

antígenos HPA-1a y HPA-3a. El lavado

insuficiente antes de añadir el reactivo MASPAT

anti-IgG y/o las células rojas indicadoras

MASPAT puede producir reacciones falsas

negativas. Si la velocidad y el tiempo de

26

centrifugación no ha sido optimizados, puede

darse una adherencia deficiente de plaquetas a

la microplaca. La centrifugación insuficiente de

la microplaca después de añadir las células

rojas indicadoras MASPAT puede producir

resultados falsos positivos en todos los análisis

(incluido el control negativo). Las reacciones

falsas positivas pueden deberse al fracaso de

resuspender correctamente las células rojas

indicadoras MASPAT.

La centrifugación excesiva de la microplaca

después de añadir las células rojas indicadoras

MASPAT puede producir resultados falsos

negativos en todos los análisis (incluido el

control positivo). En todos los casos es

importante utilizar controles que no dejen dudas

al respecto de la buena obtención del

concentrado (PRP), sobre todo si lo que

evaluamos es una muestra proveniente de una

trombocitopenia por ejemplo en casos de

trombocitopenia autoinmune materna. La

monocapa deberá ser protegida por lavados

manuales con el fin de que no se den espacios

que permitan el alojamiento de micropartículas

inesperadas, dando lugar a reacciones

falsas.(8,16)

27

2.4.3 Prueba de linfocitotoxicidad (LCT)

2.4.3.1 Fundamento: Se basa en la lesión de membrana

producida por el complemento cuando

reacciona con complejos antígeno - anticuerpo

sobre las superficies celulares. Esta reacción

tiene lugar en dos tiempos. En una primera

incubación, se hace reaccionar el anticuerpo

con los linfocitos y posteriormente se añade el

complemento. Si los linfocitos son portadores

del antígeno reconocido por el antisuero, tendrá

lugar la lesión celular, citólisis, que se

visualizará mediante los cambios producidos en

la célula, ya sea directamente en microscopio

de contraste de fase o con ayuda de un

colorante vital (eosina). Gracias a la ruptura de

la membrana celular mediada por el

complemento, penetra la eosina en el interior de

las células y las hace aparecer como sombras

oscuras. Si en éstas no ha tenido lugar ninguna

reacción antígeno-anticuerpo, la vitalidad de los

linfocitos diagnosticados permanece inalterada

por el complemento añadido y en la imagen de

contraste de fase se ofrecen de color

claro.(8,12)

2.4.3.2 Detecta: anticuerpos HLA (anti leucocitarios)

2.4.3.3 Equipos y reactivos necesarios para técnica de

linfocitotoxicidad (LCT)

· Incubadora a 37°C

· Microscopio de contraste de fase

28

· Azul de tripano o eosina

2.4.3.4 Metodología

Se incuban los linfocitos con anticuerpo y complemento y

con un líquido de tinción (azul de tripano o eosina) si los

linfocitos poseen el antígeno correspondiente al

anticuerpo, se fija el complemento, queda lesionada la

membrana celular y el líquido de tinción penetra en la

célula y la tiñe de azul(o de rojo), entonces se cuenta el

porcentaje de células teñidas. Es esencial utilizar una

suspensión pura de linfocitos, ya que los anticuerpos HLA

no son citotóxicos para los granulocitos, debido

posiblemente a que en estas células existe muy pocos

lugares antigénicos(Thorsby,1969)

2.4.3.5 Interpretación de Resultados: La técnica

utilizada para evaluar Acs anti HLA fue la de

linfocitotoxicidad que se basa en una mezcla de

leucocitos (linfocitos en su mayoría), como fue

de Ags HLA. Se detecta es la variación del color

en las células de azul por la presencia de lesión

de la membrana celular de los linfocitos.(8,12)

2.4.3.6 Desventaja: Las plaquetas pueden ser destruidas

por anticuerpos HLA no citotóxicos, que no se

detectan en test de linfocitotoxicidad

2.4.3.7 Control de calidad: Podrían obtenerse resultados

falsamente negativos en la técnica por no

contar con antígenos de baja incidencia en esa

mezcla; también falsos positivos por reacción

cruzada con antígenos HLA.(8,12)

29

2.4.4 Ensayo inmunoabsorbente conjugado a una enzima

(ELISA) inmunoensayos

2.4.4.1 Fundamento: Se basa en la detección de un

antígeno inmovilizado sobre una fase sólida

mediante anticuerpos que directa o

indirectamente producen una reacción cuyo

producto, por ejemplo un colorante, puede ser

medido espectrofotométricamente. Este

principio tiene muchas de las propiedades de un

inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple

en su realización, emplea reactivos económicos

y consigue, mediante el uso de la fase sólida,

de una separación fácil entre la fracción

retenida y la fracción libre. La prueba de ELISA

se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, uno

de los cuales debe ser de reactividad conocida.

El color se genera por la interacción de un

sustrato cromogénico y una enzima que ha sido

acoplada al anticuerpo detector. Si debe

medirse el anticuerpo, se coloca el antígeno en

la fase sólida, como una capa de captura.

Después de la reacción del antígeno con el

suero del paciente, la capa de detección puede

ser un reactivo anti-inmunoglobulina clase

específica (IgM o IgG) para detectar respuesta

de anticuerpos clase específicos. En 1977 fue

descrita por primera vez la utilización de

antiglobulina marcada con peroxidasa para

30

detectar anticuerpos antiplaquetarios. Las

plaquetas control, previamente sensibilizados

con el suero problema, se incuban, en

microplacas, con la antiglobulina marcada.

Posteriormente, se les añade el sustrato

necesario para inducir la reacción de color, que

se cuantifica mediante análisis

espectrofotométrico.(8,16)

2.4.4.2 Detecta: anticuerpos HLA y anticuerpos

antiplaquetarios


ELISA

· Pipetas para servir las muestras y los reactivos

· Baño serológico

· Agitador de placas

· Lavador automático

· Placa de Elisa

· Pipeta Multicanal

· Lector de Elisa

· Opcionalmente un procesador automatizado de

placas de Elisa

· Enzima

· Conjugado

· Sustrato

· Solución stopper

· Solución lavadora

31


1. Tapizado del pocillo con el antígeno o

anticuerpo

2. Adición de la muestra problema con la

mezcla de antígenos o anticuerpos

3. Unión del antígeno o anticuerpo específico

al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo.

4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso

de anticuerpo o antígeno no unido

5. Adición del anticuerpo secundario marcado

con la enzima

6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno

o anticuerpo

7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso

de enzima no unida

8. Adición del sustrato

9. Unión del sustrato a la enzima

10. Desarrollo del color(8,16)

2.4.4.5 Interpretación de resultados: Se mide por la

intensidad del color por la reacción antígeno

anticuerpo con la ayuda de un cromógeno

marcado con una enzima para medirse en un

lector de ELISA

2.4.4.6 Desventaja: La principal desventaja estriba en la

facilidad que tienen las IgG séricas para

adherirse al plástico de las microplacas, lo cual

puede ser causa de falsos resultados

positivos.(8,16)

32

2.4.4.7 Control de calidad: Tener un personal capacitado

para el manejo del equipo, que las placas se

encuentren en buen estado y que sea el kit que

se necesite acorde con las necesidades del

consumidor, equipos bien calibrados y fechas

de vencimiento activas.(8,16)

2.4.5 Prueba inmunofluorescente especifico para plaquetas

(PIFT)

2.4.5.1 Fundamento: Consiste en evidenciar la presencia

de los aloanticuerpos del suero problema fijados

a la membrana de las plaquetas control

mediante una antiglobulina humana

fluorescente. El tratamiento previo a las

plaquetas con PFA (paraformaldehido)

disminuye la fijación inespecífica de agregados

de IgG o IC y facilita la expulsión de la Ig

intraplaquetaria, evitándose así la fluorescencia

inespecífica (Von Dem Borne et al, 1979). Es

una técnica sencilla, que consiste en evidenciar

la presencia de anticuerpos en la membrana de

las plaquetas del paciente, es una técnica que

consta de una parte directa mediante una

antiglobulina humana fluorescente que según la

necesidad puede o no eluirse para detectar si el

Ig es autoanticuerpo o aloanticuerpo y detecta

la presencia de Ig fijada a la membrana

33

plaquetaria del paciente y de una prueba

indirecta que estudia la reactividad del suero del

paciente(anticuerpo libre) y la del eluido sobre

plaquetas normales.(8,16)

2.4.5.2 Detecta: Anticuerpos antiplaquetarios y anti

leucocitarios (anti-HLA)


inmunofluorescencia especifico para

plaquetas (PIFT)

· Incubadora a 37°C

· Lavador

· Microscopio de fluorescencia o citometría de flujo

· Incubadora oscura

· Centrifuga

· Paraformaldehido

· Solución lisante

· Solución PBS

· Fluorocromo

· Inmunoglobulina humana

· Anticuerpo monoclonal


Las plaquetas tratadas con PFA

(paraformaldehido) se incuban con el suero y

una vez lavadas se les añade antiglobulina

humana marcada con isotiocianato de

fluoresceína. Finalmente se procede a la lectura

34

de los resultados en un microscopio de

fluorescencia o por citometría de flujo. (8,16)

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA POR

CITOMETRIA DE FLUJO

Técnica usada para detectar Ag presentes en la

superficie celular de la serie blanca por medio

de AcMo marcados con un fluorocromo. Las

células son primeramente marcadas con los Ac

Mo conjugados con fluorocromos,

posteriormente la serie roja es lisada.

1) Poner en cada tubo un volumen de muestra

que contenga 1x106células.

2) Poner el anticuerpo monoclonal (la cantidad

dependerá de la casa comercial que lo sirva

debido a la concentración y el fluorocromo

utilizado).

3) Agitar e incubar durante 10-15 min a

temperatura ambiente en oscuridad.

4) Añadir solución lisante comercial

(dietilenglicol y formaldehido).

5) Agitar e incubar durante 5-7 min a

temperatura ambiente y en oscuridad.

6) Centrifugar a 300rpm. Durante 5 minutos a

temperatura ambiente.

7) Decantar el sobrenadante.

8) Resuspender el botón celular.

9) Añadir PBS.

10) Centrifugar a 300 rpm durante 5 minutos a

temperatura ambiente.

11) Decantar el sobrenadante.

35

12) Resuspender el botón celular.

13) Añadir PBS.

14) Leer en el citómetro.

(www.citometriadeflujo.com)

2.4.5.5 Interpretación de Resultados: Para obtener un

resultado positivo se necesita un mínimo de

unas 1000 moléculas de Ig fijadas por plaqueta.

Esta técnica permite la identificación de IgG,

IgM, IgA mediante antiglobulinas

monoespecíficas. La lectura por microscopia

ofrece también la posibilidad de detectar

fragmentos plaquetarios portadores de

fluorescencia no específica y de evaluar el

patrón de fluorescencia obtenido. Se aceptan

como positivos los estudios en los que la

prueba directa y el eluido son positivos.(8, 16)

2.4.5.6 Desventaja: Las desventajas son su baja

sensibilidad, que las reacciones no son

permanentes y que es necesario fotografiar las

reacciones positivas para documentar los

casos. Además, requiere microscopio de

fluorescencia, que es un instrumento de relativo

alto costo. Así como una ventaja de la IF es que

son una técnica rápida, reproducible, permite

tinciones dobles e incluso se aplica en

microscopia confocal.

2.4.5.7 Control de calidad: Se debe tener el equipo

adecuado para la incubación de las plaquetas,

debidamente calibrado para poder evidenciar la

36

presencia de aloanticuerpos presentes en la

membrana, además el fluorocromo debe ser

vigente para que la antiglobulina identifique

esos aloanticuerpos.

2.4.6 Ensayo de aglutinación de látex.

2.4.6.1 Fundamento: Técnica que hace visibles los

complejos Ag-Ac por la aglutinación que

producen los anticuerpos cuando el Ag forma

parte o se ha unido artificialmente a la superficie

de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos,

partículas de látex, etc. Las partículas de látex

se cubren ya sea con un antígeno (para

identificar un anticuerpo específico) o un

anticuerpo definido (para identificar

antígenos).(8,16)

2.4.6.2 Detecta: Anticuerpos antiplaquetarios y

anticuerpos anti leucocitarios.


aglutinación de látex

· Centrifuga

· Mezclador

· Pipeta

· Microscopio

· Látex con el antígeno o anticuerpo que se necesita


1. Se toma una muestra de sangre en tubo seco

2. Se centrifuga se saca el suero

37

3. Se coge una gota de suero y se mezcla con el

látex que contenga el antígeno o el anticuerpo

que se necesita.

4. Se observa la aglutinación (8,16)

2.4.6.5 Interpretación de Resultados: Por tanto,

aglutinación (+) indica ausencia de la sustancia

a estudiar, y aglutinación (-) indica presencia de

la misma(8,16)

2.4.6.6 Desventaja: La poca cantidad de antígeno o

anticuerpo que puede reaccionar para formar la

aglutinación ocasionando la poca visibilidad de

la reacción.

2.4.6.7 Control de calidad: Cuidado con la placa de

aglutinación que se vaya a usar de que no

tenga fechas de vencimiento viejas y que la

placa contenga el látex con el antígeno o

anticuerpo que se desee estudiar. No se

presenten problemas con la muestra y esté bien

centrifugada con el tiempo y las revoluciones a

las que se necesiten.(8,16)

2.4.7 Citometría de flujo

2.4.7.1 Fundamento: La citometría de Flujo (CMF) es una

técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo

fundamento se basa en hacer pasar una

suspensión de partículas (generalmente células)

alineadas y de una en una por delante de un

haz de láser focalizado. El impacto de cada

38

célula con el rayo de luz produce señales que

corresponden a diferentes parámetros de la

célula y que son recogidos por distintos

detectores. Estos convierten dichas señales en

señales electrónicas que posteriormente serán

digitalizadas para permitir la medida simultánea

de varios parámetros en una misma célula.

Estos parámetros son:

- Parámetros relacionados con características

intrínsecas de la célula, como su tamaño y la

complejidad de su núcleo y citoplasma.

- Parámetros relacionados con características

antigénicas de cada célula (inmunofenotipo).

Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una

célula por medio de sus características

antigénicas y/o por sus características

morfológicas de tamaño y complejidad

(www.citometriadeflujo.com). En la medida en

que transcurre el tiempo se ha ido simplificando

cada vez más el manejo de los citómetros de

flujo. Este hecho se une a la obtención de datos

en forma objetiva y reproducible que permiten

un juicio diagnóstico con un mayor grado de

certeza llevando a una mejor caracterización de

una entidad clínica dada cuando se

correlacionan con otros parámetros del

laboratorio.(8,15)

La citometría de flujo es una técnica que

permite la medida simultánea de múltiples

características físicas de una población celular

39

que se hace sobre el análisis rutinario de 500 a

10000 células en una corriente fluida en

movimiento.

El citómetro en sí es un sistema bien acoplado

que se compone de un sistema fluido, óptico y

electrónico que recoge la información generada

por la interacción celular con un haz de luz

enfocado, basándose en la capacidad de la

célula para dispersar la luz incidente y emitir

fluorescencia, mediante una serie de lentes

colocados en la zona de detección se recoge la

luz dispersada y es dirigida hacia detectores

especiales que producen una señal eléctrica

proporcional a la luz que reciben, estas señales

son amplificadas y pasadas a la computadora

para su conversión a una forma digital, los datos

de cada partícula o evento son recolectadas y

sus características o parámetros proporcionan

información estadística sobre las diversas sub-

poblaciones celulares presentes en una

muestra. Mediante la citometría de flujo se

pueden detectar cinco parámetros, dos que

corresponden a la dispersión de la luz (FSC Y

SSC) y los restantes corresponden a las

emisiones fluorescentes (FL1; FL2 y FL3). Estos

parámetros se pueden medir simultáneamente

sobre cada célula individual y aún más

mediante un procedimiento especial se pueden

separar u obtener sub-poblaciones celulares a

partir de poblaciones heterogéneas(8,15,16)

40

2.4.7.2 Detecta: Anticuerpos anti leucocitarios (anti-HLA)

y anticuerpos antiplaquetarios.


citometría de flujo

· Equipo citómetro de flujo

· Tubos

· Agitador

· Centrifuga

· Pipeta Pasteur

· Incubadora oscura

· Lavador de células

· Fluorocromo

· Anticuerpos monoclonales

· Solución PBS


Es el análisis de las características de las células

mediante inspección al microscopio, o midiendo de

manera automatizada las propiedades particulares de las

células.

1- Se toma una muestra de sangre periférica

2- Se procesa la muestra dependiendo de las

necesidades del estudio utilizando un fluorocromo

específico que ayuda a la diferenciación celular. Lo

que el paciente presente y lo que se quiera estudiar,

programando el equipo y sabiendo leer los gráficos de

resultados(8,15,16)

3- Técnica usada para la detección de Ag presentes en

la superficie celular de los hematíes y plaquetas por

41

medio de AcMo conjugados con fluorocromos. Las

células son primeramente marcadas con los AcMo y

después de unos lavados son adquiridas en el

citómetro en escala logarítmica y velocidad baja.

1) Poner en cada tubo muestra del paciente.

2) Añadir los anticuerpos monoclonales.

3) Agitar e incubar durante 10-15 minutos a

temperatura ambiente y oscuridad.

4) Añadir PBS

5) Centrifugar a 300 rpm. Durante 5 min.

6) Quitar el sobrenadante con pipeta Pasteur.

7) Resuspender el botón.

8) Añadir PBS.

9) Leer en el citómetro colocando los

detectores/amplificadores de SSC/FSC en escala

logarítmica (para serie blanca se utilizan en escala

lineal) y adquirir en velocidad

baja.(www.citometriadeflujo.com).citometriadeflujo.com)

2.4.7.5 Interpretación de Resultados: la citometría de

flujo es una tecnología compleja que nos

permite analizar una población celular

proporcionándonos una amplia variedad de

parámetros que van desde el simple tamaño

celular hasta medidas de densidad de epítopes

o mecanismos de fluidos de membrana

obteniéndose un excelente muestreo estadístico

de los parámetros evaluados en células

individuales. Estos pueden ser correlacionados

y mostrados en una amplia variedad de

formatos multidimensionales.

42

Cuando este análisis revela sub-poblaciones

celulares de interés es posible seleccionarlos o

separarlos en cámaras separadas y ser usadas

para cultivos.

Las señales producidas por la interacción de

las células con el haz de luz son de dos tipos:

-Señales de dispersión.

- Señales de fluorescencia.

Señales de dispersión: La dispersión resulta

de la interacción de la luz con una partícula que

produce un cambio de dirección (no de la

longitud de onda) en todas las direcciones del

espacio. Las características morfológicas que

determinan la dispersión de la luz son

fundamental-mente el tamaño celular, la

membrana, el núcleo y el material granular del

interior de la célula, llamado complejidad. En los

Citómetros de Flujo se miden dos fracciones de

dispersión:

-La luz dispersada en ángulo cónico pequeño

(0-10º) que casi coincide con la dirección de la

luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter).

Es una medida proporcional al tamaño de la

partícula que produce la dispersión.

-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC

(Side Scatter). Es proporcional a la complejidad

de la estructura interna de la partícula.

(www.citometriadeflujo.com)

43

Señales de Fluorescencia: Un fluorocromo es

una molécula química que absorbe luz a una

determinada longitud de onda (energía) y emite

a una longitud superior (menor energía). El

espectro de absorción o excitación es el rango

sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el

espectro de emisión es el rango sobre el que un

fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo

interacciona con la luz de excitación procedente

del láser emite energía radiante. Debido a que

parte de la energía se utiliza para la absorción,

la luz emitida es de menor energía que la luz de

excitación, es decir la longitud de onda emitida

es mayor. La diferencia entre la longitud de

onda de absorción y emisión se denomina

Stokes Shiff. Los citómetros de flujo permiten

detectar señales de fluorescencia procedentes

de complejos antígeno-anticuerpo marcados

con un fluorocromo y situados en una célula,

siendo la cantidad de señal de fluorescencia

emitida igual a la proporción de la cantidad de

componentes fluorescentes de la partícula.

(www.citometriadeflujo.com) (8, 15,16)

2.4.7.6 Desventaja: Debido a la necesidad de utilizar una

suspensión de partículas (células, núcleos,

cromosomas, etc.), para ser leídos de una, hace

que se pierda información sobre la arquitectura

de los tejidos que componen las células o de las

propias células, así como la interacción entre

44

estas y el medio que las rodea (patrones

nodulares o difusos de los linfomas).

Por esta razón se pueden decir que Frente a

este inconveniente la CMF presenta múltiples

ventajas frente al microscopio de fluorescencia

y las técnicas citoquímicas, como:

- Posibilidad de empleo de múltiples marcajes

frente a un solo marcaje de la citoquímica y la

microscopia de fluorescencia.

- Posibilidad de analizar un elevado número de

partículas en un corto período de tiempo (5000

partículas/segundo).

- Posibilidad de cuantificar la intensidad

antigénica por medio de los canales medios de

fluorescencia.

- Mayor sensibilidad y objetividad que le

permiten detectar enfermedad mínima residual y

caracterizar poblaciones celulares poco

abundantes en condiciones normales como los

Basófilos.

- Posibilidad de analizar poblaciones celulares y

epítopes celulares.

- Permite almacenar informáticamente la

información del análisis para poderla utilizar en

cualquier momento y reanalizar análisis hechos

con anterioridad.

- Posibilidad de cuantificar las moléculas

antigénicas presentes en un grupo celular.

(www.citometriadeflujo.com)(8, 15,16)

45

2.4.7.7 Control de calidad: Realizar los controles

positivos y negativos de las muestras, que el

citómetro se encuentre bien calibrado y los

fluorocromos en buen estado alejados de la luz

que puede ser un componente degradador y

observar las fechas de vencimiento de los

reactivos para evitar resultados falsos para los

pacientes.

Refractariedad

plaquetaria.

Anticuerpos HLA, Anticuerpos contra plaquetas, Complejos inmunes circulantes, Anticuerpos leucocitarios, Autoanticuerpos (PTI), Drogas dependientes de anticuerpos plaquetarios, ABO

Inmune

No inmune

Causas

CID, Sepsis, Uso de fármacos (anfotericina), Viremia, Fiebre, Radioterapia, quimioterapia, Vasculitis (daño endotelial), Esplenomegalia, Incompatibilidad de grupo sanguíneo ABO.

Fallo en el incremento del número de plaquetas después de dos transfusiones seguidas, con Concentrados Plaquetarios de calidad comprobada, AB0 compatibles y en ausencia de fiebre, infección, hemorragia, esplenomegalia o CID.

Definición

46

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47

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

3.1 Formulación del Problema: Existen diferentes técnicas para identificar

la refractariedad plaquetaria de causa inmunitaria, en pacientes

politransfundidos con plaquetas. Teniendo en cuenta que la incidencia de

refractariedad plaquetaria de causa inmune por HLA es del 80% y por HPA

es del 20% se debe determinar una técnica que detecte el anticuerpo que

ocasiona la refractariedad plaquetaria, la cual debe ser precisa, concreta,

fácil para la realización del personal que la utilice y de mayor asequibilidad

económica.

3.2 preguntas de investigación:

- ¿cuál es la mejor técnica para distinguir entre causas inmunes y no

inmunes, causa de refractariedad plaquetaria?

- ¿cuál es la mejor técnica para detectar anticuerpos HLA importantes

¿qué técnica/s de podrían recomendarse?

- ¿qué esfuerzos estarían justificados para encontrar causa inmunológica,

(anticuerpos específicos de plaquetas, anti HLA), en pacientes con

necesidad de soporte transfusional y refractariedad plaquetaria, en caso de

que el test de agrupación sea negativo?

3.3 Justificación: Este análisis de las técnicas es importante puesto que

proporciona un apoyo diagnóstico para el manejo transfusional adecuado de

los pacientes que presentan refractariedad plaquetaria. Podría ser aplicado

en los servicios transfusionales de Colombia ya que la transfusión de

plaquetas sería más eficaz, disminuyendo las reacciones

postransfusionales.

48

El propósito de esta investigación, es recopilar e integrar información para

toma de decisiones en la elección de ayudas diagnosticas en pacientes con

refractariedad plaquetaria de origen inmune y mejorar el soporte

transfusional con el uso de plaquetas mejor seleccionadas para así cumplir

con el fin último de los servicios transfusionales.

Un adecuado manejo de las transfusiones plaquetarias disminuye la

frecuencia de transfusión de plaquetas y la refractariedad plaquetaria

adicional a la disminución del riesgo de otras reacciones transfusionales.

49

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

· Hacer un levantamiento bibliográfico que permita analizar y comparar

las técnicas de detección de anticuerpos en pacientes

politransfundidos que presentan refractariedad plaquetaria de causa

inmune.

4.2 Objetivos Específicos

· Documentar los principios de las técnicas por las cuales se realiza la

detección de anticuerpos en pacientes con refractariedad plaquetaria.

· Describir las técnicas de identificación de refractariedad plaquetaria.

· Identificar cual es la técnica más eficiente por la cual se puede

detectar los anticuerpos que causan la refractariedad plaquetaria

inmune.

· Comparar las diferentes técnicas de identificación de anticuerpos en

pacientes politransfundidos con refractariedad plaquetaria.

50

5. METODOLOGÍA

5.1 Tipo de investigación: La investigación es de tipo documental, se

recopilará información acerca de la refractariedad plaquetaria y diferentes

técnicas de identificación de anticuerpos plaquetarios

5.2 Selección de los artículos: Levantamiento bibliográfico de guías, libros

y artículos publicados, acerca de pacientes politransfundidos que sufran de

refractariedad plaquetaria de tipo inmune y necesiten de una técnica de

detección de anticuerpos para poder ser diagnosticada, tales artículos serán

leídos en su totalidad, para tenerlos en cuenta como referencias o bases

bibliográficas.

5.3 DEFINICIÓN DE CRITERIOS PARA LA INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN DE

LOS ARTICULOS

5.3.1 CRITERIOS DE INCLUSIÓN

Los artículos serán escogidos con base al planteamiento propuesto en el

trabajo, de las técnicas de identificación de anticuerpos en pacientes con

refractariedad plaquetaria de tipo inmunitario.

5.3.1.1 Tipos de artículos

Se incluirán artículos que tengan relación con la refractariedad plaquetaria,

donde se hable específicamente sobre las técnicas de identificación de

anticuerpos de causa inmune en pacientes politransfundidos, relacionados

con su fundamento, metodología y control de calidad.

51

5.3.1.2 Tipo de estudio designado para la investigación

Se tendrán en cuenta artículos de tipo experimentales y observacionales que

describan la refractariedad plaquetaria y las técnicas de identificación de

anticuerpos.

5.3.1.3 Año de publicación de artículos

La revisión de artículos e información bibliográfica se realizará desde el año

1995 hasta la fecha.

5.3.2 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN

· Estudios que evalúen la refractariedad plaquetaria en Purpura

trombocitopénica y CID.

· Artículos que solo nombren y no describan las técnicas de identificación de

anticuerpos de causa inmune en refractariedad plaquetaria.

· Artículos en idiomas diferentes al inglés o español.

· Resumen de artículos o comentarios de revistas no reconocidas, en la

investigación.

5.4 ESTRATEGIA DE BÚSQUEDA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LOS

ARTÍCULOS

Para la búsqueda de los artículos se utilizarán bases de datos de PUBMED,

SCIENCE DIRECT, HINARI (Health InterNetwork Access to Research

Initiative), ELSEIVER, SCIELO. También se realizará búsqueda de libros que

proporcionen información sobre el tema.

La revisión de artículos e información bibliográfica se realizará en idioma

inglés y español.

52

Como estrategia de búsqueda se utilizarán una combinación de términos

relacionados con refractariedad plaquetaria en especial las técnicas de

identificación de anticuerpos.

Las palabras que se utilizarán para la búsqueda son:

· Refractariedad plaquetaria

· Técnicas identificación de anticuerpos plaquetarios

· Técnicas de identificación de anticuerpos de refractariedad plaquetaria

· MAIPA

· Adherencia de células rojas a una fase sólida (SPRCA)

· Prueba de linfocitotoxicidad (LCT)

· Ensayo inmunoabsorbente conjugado a una enzima (ELISA),

inmunoensayos

· Prueba inmunofluorescente especifico para plaquetas (PSIFT)

· Ensayo de aglutinación de látex.

· Citometría de flujo

5.5 SELECCIÓN DE LOS ARTICULOS POR MAS DE UN OBSERVADOR

La selección de los artículos se realizará por la estudiante y la doctora a

cargo aplicando los criterios de inclusión y exclusión anteriormente

mencionados.

5.6 DISCUSIÓN DE ARTICULOS

Para la discusión de artículos en caso en el que haya un desacuerdo entre

las personas directamente involucradas en el proyecto el paso a seguir es la

realización de una discusión y solución de dudas de acuerdo a los criterios

53

de exclusión e inclusión mencionados con anterioridad y aun mas importante

por el tema que se está trabajando en este momento.

5.7 RECOPILACIÓN DE LA INFORMACIÓN

La recopilación de la información se realizará con ayuda de la búsqueda de

artículos. Los datos que se tienen en cuenta para la recopilación son: autor,

año de la publicación, revista de la que proviene el artículo, área geográfica

donde se realizó el estudio, los datos serán incluidos en un formato de

recolección.

5.8 ELABORACIÓN Y ESCRITURA DE DOCUMENTO

La elaboración del documento se realizará en base de 10 artículos, 10 libros

y 3 guías utilizados en la búsqueda de información.

El contenido del trabajo, se describe a continuación:

1. Definición de refractariedad

2. Causas de refractariedad plaquetaria

3. Etiología de la refractariedad plaquetaria

4. Antecedentes de la refractariedad plaquetaria

5. Porcentaje de refractariedad plaquetaria de tipo inmune

6. Aloinmunización y mecanismos de aloinmunización

7. Técnicas de identificación de anticuerpos de refractariedad plaquetaria.

54

RESULTADOS

Se analizaron 50 artículos de los cuales se tomaron 11 artículos que eran los

que cumplían con las normas de inclusión de artículos así como contaban

con temas pertinentes y consecuentes con la refractariedad plaquetaria, los

cuales se tomaron como base para sacar las siguientes conclusiones:

Se logró documentar y describir las diferentes técnicas de identificación de

anticuerpos en pacientes que presentan refractariedad plaquetaria.

A partir de información obtenida de las técnicas para la identificación de

anticuerpos en pacientes con refractariedad plaquetaria, se resumen las

siguientes características específicas cada una de ellas, para hacer una

elección de una técnica recuerdo a las condiciones para el paciente de la

siguiente manera:

1. MAIPA: Técnica muy buena y efectiva ya que es considerada

como el patrón de oro de la detección plaquetaria, es una

modificación de la técnica de Elisa es manejada con anticuerpos

monoclonales en un principio y posteriormente es procesada y

leída como una Elisa; Es una técnica más sensible que permite

definir, simultáneamente, la especificidad del anticuerpo detectado

ya que sabe diferenciar entre un anticuerpo HLA y un anticuerpo

antiplaquetario. Su principal inconveniente es que los anticuerpos

monoclonales pueden reconocer epítopes parecidos o conocidos

produciendo falsas reacciones.

2. CITOMETRIA DE FLUJO: Es una técnica que se ha ido

simplificando cada vez más con el manejo de los citómetros de

flujo hecho que se une a la obtención de datos en forma objetiva y

55

reproducible que permiten un juicio diagnóstico con un mayor

grado de certeza llevando a una mejor caracterización de una

entidad clínica cuando se correlacionan con otros parámetros del

laboratorio lo cual no quiere decir que es muy sensible para la

detección de anticuerpos, pero si es una técnica muy específica

para detectar los anticuerpos lo cual es una ventaja para dar un

diagnostico al paciente.

3. INMUNUNOFLUORESCENCIA: Es una técnica sencilla, pero no

muy específica ya que puede detectar anticuerpos HLA y

antiplaquetarios ocasionando problemas en su determinación. Es

poco sensible porque permite la detección de los anticuerpos

presentes en pacientes con refractariedad plaquetaria y su baja

sensibilidad, demostrado con reacciones no permanentes en

donde es necesario fotografiar las reacciones positivas para

documentar los casos. Además, requiere microscopio de

fluorescencia, que es un instrumento de relativo alto costo. Así

como una ventaja de la IF es que son una técnica rápida,

reproducible, permite tinciones dobles e incluso se aplica en

microscopia confocal.

4. AGLUTINACIÓN EN LÁTEX: Técnica inespecífica ya que puede

encontrarse influenciada por muchos factores externos que alteran

los resultados y reportan falsos positivos. De igual forma puede

detectar anticuerpos con epítopes similares ya que no se cuenta

con la suficiente especificidad, así como es la técnica de menor

sensibilidad ya que no permite muchas variaciones entre los

instrumentos y las muestras utilizadas al igual que la variación

entre anticuerpos HLA y antiplaquetarios.

56

5. ELISA: Es una técnica inespecífica ya que detecta anticuerpos

HLA y anticuerpos antiplaquetarios por lo cual no es de muy buen

diagnostico a menos que se complemente por otras técnicas, sin

embargo se puede decir que es la técnica de más sensibilidad

puesto que tienen la probabilidad de clasificar correctamente a un

individuo enfermo, es decir, la probabilidad de que para un sujeto

enfermo se obtenga en la prueba un resultado positivo. Este

principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo

ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea

reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase

sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la

fracción libre, por lo cual puede traer cosas muy bueno pero con

falta de especificidad.

6. LINFOTOXICIDAD: Técnica de baja sensibilidad y especificidad ya

que las plaquetas pueden ser destruidas por anticuerpos HLA no

citotóxicos, que no se detectan en test de linfocitotoxicidad, tiene

problemas ya que no identifica muy fácilmente los anticuerpos HLA

ya que pueden ser confundidos con otros componentes de los

anticuerpos.

7. ADHERENCIA DE CELULAS ROJAS A UNA FASE SÓLIDA:

Técnica especializada anticuerpos antiplaquetarios. Técnica que

permite el recubrimiento menos óptimo de los pocillos resultando el

mal funcionamiento del test, reduciendo tanto la sensibilidad como

la fuerza de las reacciones en los resultados finales del test.

57

Con base en lo analizado de cada una de las técnicas podemos

mostrar las diferencias:

- Los estudios que comparan la técnica de MAIPA

con el test de linfocitotoxicidad concluyen que el

MAIPA es superior.

- La técnica de MAIPA es la combinación de

anticuerpos Monoclonales y Elisa por lo cual se

puede decir que el MAIPA se encuentra superior

con el Elisa.

- La técnica de inmunofluorescencia corre el riesgo

de ser poco sensible para la detección de

anticuerpos proceso que no ocurre con Citometría

de flujo, Elisa y MAIPA.

- En cuanto a la especificidad la aglutinación en

látex, adherencia de células rojas a fase solida,

linfocitotoxicidad y Elisa son muy baja para la

detección de anticuerpos en pacientes con

refractariedad plaquetaria, lo cual no sucede en

las técnicas de MAIPA, inmunofluorescencia,

citometría de flujo ya que por el contrario son

técnicas de altas especificidades para lograr

detectar el anticuerpo antiplaquetario o HLA.

- La aglutinación en látex es la técnica que puede

ser empleada con mayor rapidez para la detección

de anticuerpos antiplaquetarios pero corriendo

58

con el riesgo de dar resultados con un margen de

error alto.

De acuerdo a la revisión de las técnicas para la identificación de

anticuerpos en pacientes con refractariedad plaquetaria de tipo

inmune, se puede concluir que no hay una técnica especifica y única

que pueda hacer el estudio completo, ya que para la detección de

anticuerpos es necesario la utilización e integración de varias técnicas

para un completo diagnostico de la refractariedad. Es necesario hacer

un test de agrupación en el que se pueden seleccionar las técnicas

como combinación de las técnicas de MAIPA, inmunofluorescencia y

ELISA que forman el complemento necesario para corroborar y

verificar un resultado que se quiera reporta.

La citometría de flujo es una técnica eficiente en la búsqueda de

refractariedad plaquetaria de causa inmune y puede ser de mucha

utilidad en el diagnóstico clínico, la citometría de flujo nos muestra la

utilidad de usar marcadores celulares para la identificación de

anticuerpos, es una técnica muy sensible y especifica con la que

podemos llegar a reportar con seguridad un resultado al paciente y

con ello ayudar al profesional a tener un resultado mas confiable y de

utilidad clínica sin olvidar que debe estar apoyada por técnicas como

el MAIPA, inmunofluorescencia y ELISA

Según investigaciones realizadas en 3 estudios de la revista

Transfusion del mes de junio de 2001(de Sanz y cols., Kurz y cols. y

Kiefel y cols.) concuerdan entre ellos y refrendan estudios previamente

publicados respecto a que:

- La refractariedad plaquetaria aloinmune es principalmente

causada por anticuerpos antiHLA.

59

- Los anticuerpos HLA ocurren con más frecuencia en mujeres con

embarazos previos.

- Los anticuerpos antiplaquetarios específicos (anti-HPA) son raros

como anticuerpos aislados (0- 2%) en ausencia de aloinmunización

HLA.

- Las plaquetas pueden ser destruidas por anticuerpos HLA no

citotóxicos, que no se detectan en test de linfocitotoxicidad.

- Los dos estudios que comparan la técnica de MAIPA con el test de

linfocitotoxicidad concluyen que el MAIPA es superior.

Hay desacuerdo entre los estudios en cuanto a:

- La presencia de anticuerpos específicos de plaquetas en

pacientes con aloinmunización HLA.

- La incidencia de anticuerpos antiplaquetarios específicos, que

oscila entre el 2 y 20%. Algunos expertos relacionan la diferencia en la

frecuencia de inmunización específica frente a antígenos plaquetarios

con diferencias genéticas en los alelos de la respuesta inmune. La

Dra. Brand opina que probablemente más que pensar en una causa

genética deberíamos tener en cuenta otros factores como: la selección

de pacientes estudiados, los donantes usados en los ensayos y las

diferencias técnicas, a la hora de explicar las discrepancias en los

estudios.

60

TABLA 3. Ventajas y desventajas de las técnicas de identificación de

anticuerpos.

TECNICA DETECTA VENTAJAS DESVENTAJAS

MAIPA Anti leucocitarios

Anti-HLA

Técnica más sensible que

permite definir,

simultáneamente, la

especificidad del anticuerpo

detectado y la Glicoproteína

en la cual se localiza el

antígeno así como,

determinar si las

inmunoglobulinas están

dirigidas contra antígenos

HLA u otros específicos de

plaquetas.

El principal inconveniente

radica en la necesidad de

utilizar un amplio panel de

anticuerpos monoclonales

dirigidos contra todas las GP

cuando se estudian sueros

desconocidos. (kiefel et al,

1987)

LINFOCITOTOXICIDAD Anti

leucocitarios

Anti-HLA

Se puede observar la

reacción a simple vista por

el cambio de color. Técnica

especial para detectar

anticuerpos anti-HLA,

basado en la mezcla de

leucocitos especialmente

linfocitos.

Las plaquetas pueden ser

destruidas por anticuerpos

HLA no citotóxicos, que no

se detectan en test de

linfocitotoxicidad

AGLUTINACIÓN EN

LATEX

Anti plaquetarios

Anti leucocitarios

Anti-HLA

Técnica muy rápida y fácil

de realizar por los reactivos

e implementos de fácil y ágil

uso.

La poca cantidad de

antígeno o anticuerpo que

puede reaccionar para

formar la aglutinación

ocasionando la poca

visibilidad de la reacción.

ELISA Anti

plaquetarios

Anti

leucocitarios

Anti-HLA

Principio tiene muchas de

las propiedades de un

inmunoensayo ideal: es

versátil, robusto, simple en

su realización, emplea

reactivos económicos.

Permite obtener resultados

cuantitativos, la técnica no

es compleja y, por tanto,

puede ser realizada por

personal relativamente

La principal desventaja

estriba en la facilidad que

tienen las IgG séricas para

adherirse al plástico de las

microplacas, lo cual puede

ser causa de falsos

resultados positivos.

61

inexperto, se puede

automatizar, y puede

utilizarse como método de

"screening" con un número

limitado de diluciones

séricas. Además, permite

conocer la respuesta

inmunológica de las

diferentes clases de Ig.

CITOMETRIA DE FLUJO Anti

plaquetarios

Anti

leucocitarios

Anti-HLA

Frente a este inconveniente

la CMF presenta múltiples

ventajas frente al

microscopio de

fluorescencia y las técnicas

citoquímicas, como:

- Posibilidad de empleo de

múltiples marcajes frente a

un solo marcaje de la

citoquímica y la microscopia

de fluorescencia.

- Posibilidad de analizar un

elevado número de

partículas en un corto

período de tiempo (5000

partículas/segundo).

- Posibilidad de cuantificar la

intensidad antigénica por

medio de los canales

medios de fluorescencia.

- Mayor sensibilidad y

objetividad que le permiten

detectar enfermedad mínima

residual y caracterizar

poblaciones celulares poco

abundantes en condiciones

normales como los

Basófilos.

- Posibilidad de analizar

poblaciones celulares y

epítopes celulares. - Permite

almacenar informáticamente

la información del análisis

para poderla utilizar en

cualquier momento y

Debido a la necesidad de

utilizar una suspensión de

partículas (células, núcleos,

cromosomas, etc.), para ser

leídos de una, hace que se

pierda información sobre la

arquitectura de los tejidos

que componen las células o

de las propias células, así

como la interacción entre

estas y el medio que las

rodea (patrones nodulares o

difusos de los linfomas).

62

reanalizar análisis hechos

con anterioridad.

- Posibilidad de cuantificar

las moléculas antigénicas

presentes en un grupo

celular.

INMUNOFLUORESCEN

CIA

Anti

plaquetarios

Anti

leucocitarios

Anti-HLA

Una ventaja de la IF es ser

una técnica rápida,

reproducible, permite

tinciones dobles e incluso se

aplica en microscopia

confocal.

Las desventajas son su baja

sensibilidad, que las

reacciones no son

permanentes y que es

necesario fotografiar las

reacciones positivas para

documentar los casos.

Además, requiere

microscopio de

fluorescencia, que es un

instrumento de relativo alto

costo.

ADHERENCIA DE CELULAS ROJAS A UNA FASE SÓLIDA

Anti plaquetarios

Específica, rápida y al

alcance de todos los

servicios transfusionales

Un recubrimiento menos

óptimo de los pocillos

resultará en un

funcionamiento inadecuado

del test, reduciendo tanto la

sensibilidad como la fuerza

de las reacciones en los

resultados finales del test.

Fuente: revisión bibliográfica

63

CONCLUSIONES

Generalmente, los pacientes politransfundidos tienen refractariedad

plaquetaria, afecta a ambos sexos, con ligero predominio en mujeres

ya que se encuentran sensibilizadas al ser multíparas; en general, se

relacionan con bajos niveles de plaquetas en la sangre que no son

recuperados y no aumentan los niveles por los hemocomponentes

(plaquetas) transfundidos.

Los pacientes politransfundidos con plaquetas que presentan

refractariedad plaquetaria se encuentran en un 50% de los casos de

los pacientes totales, de los cuales un 40% equivalen a casos de

pacientes con refractariedad plaquetaria de tipo no inmune y un 10%

equivaldrían a pacientes con refractariedad plaquetaria de tipo

inmune.

El compromiso de la disminución de las plaquetas, asociado a

hemorragias en el contexto de la refractariedad plaquetaria es

frecuente; aun más cuando son de tipo inmunológico, características

que plantean el diagnostico diferencial de la refractariedad plaquetaria

de tipo inmune y no inmune. El diagnostico se establece por los

hallazgos inmunológicos que demuestran la afectación por

politransfusiones e incompatibilidad de HLA con ausencia de

sintomatología como fiebre, infección, hemorragia, esplenomegalia o

CID característicos del diagnostico diferencial. Podríamos decir que la

refractariedad plaquetaria es una falla en el incremento del número de

las plaquetas después de dos transfusiones seguidas con

concentrados plaquetarios de excelente calidad, AB0 compatibles,

frescas (recolectadas menor a 72 horas) y en ausencia de fiebre,

64

infección, hemorragia, esplenomegalia o CID que se caracteriza por

causar anticuerpos HLA y antiplaquetarios

El primer aspecto que queremos resaltar del presente estudio está

relacionado con los pacientes que presentan refractariedad

plaquetaria de tipo inmune, partiendo de la evaluación de la

refractariedad plaquetaria de tipo inmune en pacientes

politransfundidos como este acontecimiento se ha incrementado

gradualmente en la investigación clínica en los últimos años,

especialmente en investigaciones sobre técnicas de identificación de

anticuerpos, lo que ha permitido priorizar problemas, mitigar el riesgo

en los pacientes, identificar preferencias y monitorear cambios en el

tiempo, al igual que respuestas a su utilización.

En el caso de los pacientes politransfundidos se han evaluado de

maneras muy diversas, esto se ve reflejado en múltiples aspectos que

llevan a ser el factor principal de desarrollo de la refractariedad

plaquetaria. Adicionalmente, la calidad metodológica de los estudios

en general, presenta múltiples diferencias, en las técnicas de

anticuerpos de pacientes que presentan refractariedad plaquetaria de

tipo inmune y la poca información experimental o teórica de este tema

hace que sea un tema muy complicado de abarcar, En mi opinión se

necesita un gran estudio que compare varias técnicas, realizadas de

forma repetida por suficientes técnicos como para probar la

repetitividad y fiabilidad de las mismas, así como la variabilidad entre

los participantes.

Las técnicas de detección de anticuerpos en la investigación es

bastante reciente, y su evaluación es débil en un tipo de intervención

donde este desenlace es la razón de ser del desarrollo de esta

65

aproximación terapéutica; debería ser uno de los resultados

reportados con mayor precisión y rigurosidad metodológica por los

investigadores, situación que no se ve reflejada en las publicaciones

que hemos revisado.

En los últimos años, afortunadamente, la transfusión de componentes

leucorreducidos y el uso de quimioterapia intensiva, se han asociado

a una reducción de las tasas de refractariedad inmunológica, a la vez

que, al menos en algunos lugares privilegiados, se mejoraba y

aumentaba la compatibilidad de HLA de los donantes y, con ello, la

disponibilidad de plaquetas HLA compatibles para pacientes

seleccionados. Actualmente, la refractariedad de plaquetas se debe,

en la mayor parte de los casos, a factores clínicos y es, en general,

controlable para evitar la hemorragia grave, pero los casos de

hemorragia incontrolable en enfermos aloinmunizados sin donantes

compatibles persisten, y por tanto persiste el reto de detectar de forma

fiable los aloanticuerpos.

Tras analizar los problemas asociados al test de linfocitotoxicidad, el

ensayo MAIPA, y los test de casas comerciales disponibles, concluye

que afrontar la refractariedad a transfusión de plaquetas es

desalentador porque sigue siendo un problema sin resolver. Aunque

una de las técnicas con mejor pronostico clínico podría ser la

citometría de flujo ya que nos ayuda a detectar los anticuerpos

presentes en pacientes que presentan refractariedad plaquetaria de

tipo inmune en especial los anticuerpos HLA y antiplaquetarios.

Mientras dispongamos de pocos resultados, de forma segura para

afrontar la refractariedad plaquetaria en transfusiones en las que se

presente una reacción positiva se debe de seguir realizando un test

66

de agrupación (linfocitotoxicidad, inmunofluorescencia, ó Elisa) para

transfundir plaquetas HLA compatibles. También está justificado el

uso de plaquetas HLA compatibles con test de agrupación de baja

sensibilidad negativo, en caso de que la refractariedad a la transfusión

se asocie a hemorragia.

Probablemente se debe recomendar el estudio de anticuerpos

antiplaquetarios específicos en casos de refractariedad plaquetaria en

pacientes en donde la transfusión de plaquetas sea HLA compatibles.

67

6. RECOMENDACIÓN

Se recomienda que a la hora de escoger una técnica para identificar

anticuerpos en un paciente que presente refractariedad plaquetaria se

tenga en cuenta el costo, sensibilidad, especificidad, precisión y

exactitud así como la reproducibilidad que tenga la técnica ya que

siempre se debe de pensar es en el bienestar del paciente que es

transfundido.

El presente trabajo se encuentra dirigido a personal profesional de los

servicios transfusionales de Colombia y personal que se encuentre

interesado con la transfusión de plaquetas.

Siendo la refractariedad plaquetaria una reacción cada vez más

frecuente, se hace necesaria la identificación de las técnicas que nos

detecten los anticuerpos que pueden estar ocasionando la

refractariedad plaquetaria para que el paciente tenga un mejor

pronóstico y pueda recibir su tratamiento adecuado.

68

7. REFERENCIAS

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10. ANEXOS

1993 81: 3428-3434

RC Friedberg, SF Donnelly, JC Boyd, LS Gray and PD Mintz

refractoriness and alloimmunizationClinical and blood bank factors in the management of platelet

http://bloodjournal.hematologylibrary.org/misc/rights.dtl#repub_requestsInformation about reproducing this article in parts or in its entirety may be found online at:

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. reservedHematology; all rightsCopyright 2007 by The American Society of

Suite 200, Washington DC 20036.semimonthly by the American Society of Hematology, 1900 M St, NW, Blood (print ISSN 0006-4971, online ISSN 1528-0020), is published

For personal use only. by on May 3, 2009. www.bloodjournal.orgFrom

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Clinical and Blood Bank Factors in the Management of Platelet Refractoriness and Alloimmunization

By Richard C. Friedberg, Sarah F. Donnelly, James C. Boyd, Lloyd S . Gray, and Paul D. Mintz

Numerous independent and interdependent factors are involved in the posttransfusion platelet response. Factors such as AB0 match and platelet age are related to circumstances potentially under the control of the blood bank physician and therefore may permit circumvention by an active transfusion service. On the other hand, factors such as fever or sepsis may be unavoidable, being related more to the individual patient or clinical condition. To evaluate which factors could be circumvented, we prospectively followed the 1 -hour corrected count increments (CCls) for 962 single-donor apheresis platelet transfusions to 71 refractory hematologic oncology inpatients, with concomitant recording of implicated factors. Stepwise regression analysis allowed for determination of which concurrent and confounding clinical-, patient-, and blood bank-related factors significantly affected the CCls. Although many implicated factors proved to be independently associated

HE CAPABILITY OF providing adequate platelet T transfusion support to thrombocytopenic patients has allowed remarkable advances in the treatment of hematologic malignancies. However, under certain circumstances, transfused platelets fail to circulate beyond the initial posttransfusion redistribution phase. Such rapid disappearance oftransfused platelets is most frequently seen with immune- mediated clearance (eg, alloimmunization) or in clinical conditions manifesting active platelet sequestration (eg, splenomegaly).' Inadequate posttransfusion survival of pooled random-donor platelets has also been associated with numerous clinical-, patient-, and blood bank-related factors. I-' Recently, transfusion practice has shifted to a greater reliance on single-donor apheresis products instead of pools of random-donor platelet concentrates to minimize both disease risk and allergic reactions. Traditional transfusion practice considered a shift to single-donor products only after the patient no longer received adequate posttransfusion increments.* This refractoriness is an eventual occurrence in 30% to 70% of multiply transfused patients, and can be secondary to either alloimmunization or various clinical factors.'.'-'' In an attempt to provide platelets for refractory patients, single-donor platelets would be matched

From the Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham, AL; and the Departments of Pathology and Internal Medicine, University of Virginia Health Sciences Center, Char- lottesville, VA.

Submitted September 2, 1992; accepted January 29, 1993. Address reprint requests to Richard C. Friedberg, MD, PhD. De-

partment of Pathology, P230-B West Pavilion, University of Ala- bama at Birmingham, 618 S 18th St, Birmingham, A L 35233- 7331.

The publication costs of this article were defayed in part bv page charge payment. This article must therefore be hereby marked "advertisement" in accordance with 18 U.S.C. section I734 solely to indicate this fact. 0 I993 by The American Society of Hematology. 0006-49 7 1/93/81 12-0035$3.00/O

with an increased or decreased CCI, we found that no single variable consistently explained the CCI variation across the patient population. Each patient appeared sensitive to one or a few particular factors, but because of marked intraindividual variation, it was not possible to identify a priori which factors were important for a given patient. The single exception was a solid-phase red blood cell adherence assay used to cross-match platelets, but only for alloimmunized patients. We also evaluated the utility of re- questing HLA-matched platelets from the local suppliers and maintained a clear distinction between platelets sim- ply ordered as HLA matched and actually HLA-identical platelets. Accounting for the confounding clinical-, patient-, and blood bank-related factors, the cross-match assay was a better predictor of an adequate CCI than ordering platelets as HLA matched. 0 1993 by The American Society of Hematology.

to the HLA class I phenotype of the intended recipient to circumvent circulating HLA-directed alloantibodies resulting from previous exposure to foreign HLA antigens.',''

The shift to a greater and earlier reliance on single-donor apheresis platelet products has important implications for the management of thrombocytopenic patients. Studies of the clinical, patient, and blood bank factors implicated in refractoriness typically have used pooled random-donor platelets. Of the factors analyzed, alloimmunization is the most sensitive to the origin and type of platelet product. A pool of random-donor platelet units is more antigenically diverse and contains a greater variety of contaminating highly immunogenic, HLA-dense leukocytes; therefore, pooled random donor units theoretically may lead to broader alloimmunization in susceptible individual^.^^'^ Discontinuation of pooled random-donor units has been associated with loss of alloimmunization.'~'' In contrast, a single-donor apheresis platelet product is antigenically more concentrated and homogeneous than a pool of random-donor platelet units, and thus is more prone to an all- or-none transfusion outcome in a patient with platelet- directed antibodies (ie, an alloimmunized patient).

The aim of this study was to identify those factors involved in refractoriness to single-donor apheresis platelet transfusions by recording implicated concurrent and confounding clinical, patient, and blood bank factors available at the time of platelet transfusion to inpatients with documented refractoriness. We sought not only to identify those factors that could explain refractoriness but specifically to discern those factors in particular that the transfusion team could actively circumvent to provide the optimum platelet product. The capability of selecting platelet products a priori with an increased circulation and functional life span would have significant hemostatic and therapeutic advantages for these refractory pa t ien t~ . '~

MATERIALS AND METHODS

Patients. Between July 1990 and December 199 1, all hematologic oncology inpatients at the University of Virginia Health

3428 Blood, Vol 8 1 , No 12 (June 15), 1993: pp 3428-3434




PLATELET REFRACTORY FACTORS 3429

Sciences Center were followed prospectively for development of refractoriness to platelet transfusions. Those patients with demonstrated refractoriness requiring two or more platelet doses per day were evaluated thereafter for clinical-, blood bank-, and patient-related factors thought to influence the platelet increment following platelet transfusion. For the purposes of this study, refractoriness was defined as repeated inadequate I -hour posttransfusion increments on successive days. Once identified as refractory, patients were evaluated for platelet alloimmunization twice weekly using a solid-phase red blood cell adherence assay (SPRCA, Capture-P or Modified Capture-P Kits; Immucor Inc, Norcross, GA). Those patients with evidence of alloimmunization were thereafter given cross-match-compatible platelets when available regardless of AB0 mismatch. If no cross-match-compatible platelets were available for alloimmunized patients, platelets were issued according to plasma compatibility, ie, avoiding transfusion of incompatible foreign isohemagglutinins. If no plasma-compatible units were available, platelets were selected to avoid transfusion of incompatible high-titer isohemagglutinins. Aliquots ofthe product were later evaluated for cross-match compatibility. Nonalloimmunized patients were issued platelets according to parallel criteria.

Platelet increments (CCls). The 1 -hour posttransfusion corrected count increment (CCI) was used to reflect the usefulness of the platelet transfusion by estimating the number of donor platelets surviving the initial redistribution phase after transfusion, nor- malizing for dosage and volume effects. The formula is:

(Posttransfusion - Pretransfusion Platelet Count) X (Body Surface Area)

No. of Platelets Transfused CCI =

where the platelet counts are per microliter, body surface area is in square meters, and the number of platelets transfused is the number multiplied by IO". Units for the CCI are (platelets X mZ)/(pL X IO"); hereafter implied for the sake of clarity. A CCI of greater than 7,500 is generally considered to be an adequate posttransfusion response. Patient platelet counts were determined on a Technicon H-1 analyzer (Technicon Inc, 'Tarrytown, NY). No data were recorded if ( I ) the entire platelet dose was not given, (2) a clinically significant transfusion reaction occurred (other than febrile nonhemolytic reactions), (3) the platelets were washed or volume reduced, (4) posttransfusion platelet counts were not drawn within 90 minutes, or ( 5 ) the number of platelets transfused was not known. These restrictions affected less than 5% of all otherwise evaluable transfusions.

Platelets. Single-donor apheresis platelets were obtained from volunteer donors. Collections were on site at the University of Vir- ginia Health Sciences Center Blood Bank, or obtained from the local blood supplier (Mid-Atlantic [Tidewater] Region ofthe Ameri- can Red Cross [July 1990 to April 199 I ] or Virginia Blood Services [April 1991 to December 19911). Random-donor platelet pools were transfused only when appropriate single-donor apheresis products were not available. ABO-identical platelets were provided when possible; if not, then maintenance of plasma compatibility was preferred. Group 0 platelets with high-titer (> 1 :200 at immediate spin) isohemagglutinins were not transfused to non-group 0 patients. When risk of cytomegalovirus (CMV) infection was a concern, CMV-seronegative products were issued. Most (90.7%) of the platelet products were leukocyte reduced (72.1% with either a Pall PL-50 [Pall Biomedical Products Corp, Glencove, NY] or Sepacell PL-5 [Baxter Healthcare Corp, Fenwal Division, Deerfield, IL] third-generation leukoreduction filter and 18.6% with the Cutter Leukotrap system). No patient was switched to or from leukoreduced units after the onset of refractoriness. Platelets were counted on day 0 at the collection center and thereafter stored at 22°C under constant horizontal agitation. Platelet HLA type and cross-reactive groups (CREGs) were recorded when available.'s When requested

by the clinician, "HLA-matched" platelets were ordered through the local blood supplier.

Platelet cross-matching. Cross-matching of donor platelets and patient plasma was performed with a solid-phase red blood cell adherence (SPRCA) assay using Capture-P or Modified Capture-P kits (Immucor Inc, Norcross, GA) according to the manufacturer's directions. Platelets chosen for screening were typically ( I ) those already in inventory and less than 2 days old or (2) stored samples from local donors scheduled for donation. Pooled random-donor platelets were not cross-matched. Patient blood samples were collected into yellow-top (ACD-A) vacutainer tubes, and the platelet- poor plasma isolated by centrifugation at 1,OOOg. Citrate was chosen as the anticoagulant to minimize heparin- and EDTA-mediated platelet effects as well as to avoid assay artifacts of partial clotting. Platelets selected for screening were bound to pretreated microplate round-bottomed wells by centrifugation at 200g. Excess platelets were then washed away with phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.2). Patient plasma, in parallel with positive and negative controls, was added to the microplate wells in the presence of low ionic strength enhancement medium. Antibodies directed against antigens on the immobilized (ie, well-bound) platelets adsorbed during the subsequent 30-minute incubation at 37°C. Excess plasma, un- bound antibody, and enhancement medium were then washed away with PBS. Finally, indicator red blood cells (those with bound antihuman IgG) were added to the wells and the plate centrifuged at I ,000g. The presence of platelet-directed IgG antibodies in patient plasma was evident as a diffuse carpet of indicator red blood cells over the surface of the rounded well bottom. Conversely, the absence of platelet-directed IgG antibodies in patient plasma was evident as a red blood cell button at the bottom of the well. As performed, the test is sensitive to human IgG class antibodies only, but it does not discriminate HLA-directed from platelet-specific antibodies. Naturally occurring and transfusion-stimulated AB0 isohemagglutinins were neutralized when necessary with soluble A and B substance (NeutrAB; Baxter Healthcare Co, Dade Division, Miami, FL). Because the procedure for identifying alloimmunization also defined cross-match status, alloimmunized patients were issued platelets identified as cross-match compatible, cross-match incompatible, or cross-match untested. In comparison, nonalloimmunized patients were given platelets identified only as either cross- match compatible or cross-match untested because, by definition, there could be no cross-match incompatibility.

Data were collected on patient factors that were thought to influence platelet transfusion responses: alloimmunization, bone marrow (BM) transplantation within the previous year, gender, circulating intravenous immunoglobulin, and transfusion number (Table I ). Alloimmunization was defined as repeatable demonstration of non-neutralizable platelet-directed antibodies against at least 2 of I O or more randomly chosen single- donor apheresis platelet products. No patient developed platelet- directed antibodies after the onset of refractoriness. Intravenous immunoglobulin was considered to be circulating ifthe most recent dose was within the previous month. Transfusion number was defined as the total number of platelet transfusions received by the

Patientfactors evaluated.

Table 1. Patient Factors Evaluated

Blood Bank Patient Factor Clinical

AB0 match Alloimmunization Fever Bone marrow transplant Sepsis Platelet storage time Gender Splenomegaly SPRCA cross-match Circulating lVlg Clinical bleeding HLA-match grade Transfusion no. RBC use No. of HLA mismatches

DIC No. of CREG mismatches Neutropenia




3430 FRIEDBERG ET AL

patient up to and including the transfusion in question. Because patients were evaluated only on development of refractoriness, all patients had received previous red blood cell and platelet transfusions by the time of evaluation. No patient had received any granulocyte transfusions. To control for individual variation, the patient’s name was included in all statistical analyses as a patient factor.

Data were collected daily on seven clinical factors thought to influence platelet transfusion responses: fever, sepsis, splenomegaly, bleeding defined clinically, bleeding defined by transfusion frequency, disseminated intravascular coagulation (DIC), and neutropenia (Table I). Fever was defined as an oral temperature greater than 38°C at any point between initiation of the transfusion and the posttransfusion platelet count. Sepsis was defined as a positive blood culture within 3 days preceding transfusion. Splenomegaly was defined as a palpable spleen. Bleeding was defined in two different ways: (1 ) as overt external bleeding from any source (clinical bleeding) and (2) as low (11) or high (22) red blood cells used as determined by the total number of red blood cell units transfused the day before, day of, and day after platelet transfusion (red blood cell use). DIC was defined as an elevated D-dimer titer and fibrin degradation product (FDP) levels concomitant with a prolonged activated partial thromboplastin time (aPTT). Neutro- penia was defined as an absolute neutrophil count of less than 1 X 109/L. The presence or absence of each of these factors was determined and recorded daily. The effects of disease progression and hospital course were determined by including the number ofevalu- able previous platelet transfusions received by each patient.

Data were collected on blood bank factors thought to influence platelet transfusion responses: AB0 match, platelet storage duration, SPRCA cross-match result, and HLA match grade (Table I ) . A B 0 types of the patient and platelet product were recorded and grouped according to the AB0 mismatch (major, minor, both, or none). The degree of HLA mismatch was evaluated two different ways. First, by the HLA match grade (A: four of four match; BIU: three HLA matches but one HLA antigen unknown; B 1 X: one HLA mismatch but cross-reactive; B2X: two HLA mismatches but both cross-reactive; B2U: two HLA matches, two HLA antigens unknown; B2UX: one HLA mismatch but cross-reactive, one HLA antigen unknown; C all others). For the purposes ofcalculations, A, B IU, and B2U matches comprised one group, all BX matches a second group, and all C matches a third group. Second, the number of foreign HLA antigens and foreign cross-reactive group (CREG) antigens in the transfused product were also recorded when available.

The statistical significance of the influence of various factors (clinical-, blood bank-, and patient-related) on interpatient variation in the platelet increments was first evaluated by analysis of variance (ANOVA) using a repeated measures, main- effects model. Marked interindividual variation precluded determination of relative contributions due to factors that did not change during the period of evaluation for an individual patient. The general linear model (GLM) program of the SAS package (SAS Insti- tute, Cary, NC) was used for these ANOVA studies. Because the platelet increment appeared to have such a strong individual basis in each patient, further studies were performed using a stepwise regression model to analyze the platelet increment data for each patient. Significant (P < .05) explanatory variables were tallied for each patient in whom a regression model was found that explained a significant (P < .05) portion of the variation in platelet increment. The stepwise regression (REG) procedure of the SAS package with the MINR forward selection scheme was used for these studies.16

RESULTS

A total of 962 single-donor platelet transfusions to 71 patients were evaluated in this study. Because selection of

Clinical factors evaluated.

Blood bank factors evaluated.

Statistical methods.

platelets depended in part on the patient’s alloimmunization status, patients were grouped into two categories based on that status for the purpose of data analysis. Of these, 36 patients with 695 transfusions ( 1 8 of 23 alloimmunized patients with 368 of 399 transfusions and 18 of 48 nonalloimmunized patients with 327 of 563 transfusions) had sufficient data for an individual regression model (P < .05). For all patients and all transfusions, the median CCI was 5,000, range 0 to 33,400, mean 6,210, with a n S D of 5,620, an SE of 18 1 ; 50.2% of transfusions had a CCI of less than 5,000 and 37.5% greater than 7,500 (Table 2). A profile ofpatients and diseases is given in Table 3.

For all factors evaluated, stepwise regression analysis allowed for determination of the correlation of each individual factor with the posttransfusion platelet increment (Ta- bles 4 and 5). The regression model evaluated the factors for a significant independent role in the posttransfusion increments of a particular patient if data were available both in the presence and absence of that factor. Significant factors are denoted as either positive (POS) or negative (NEG) effectors. A positive effector was significantly associated with a greater posttransfusion platelet increment. Conversely, a negative effector for a given patient was significantly associated with a lesser posttransfusion platelet increment. Fac- tors that were evaluable but were found to be not significant are denoted as “ns.” Factors that were not evaluable for a given patient are left blank.

Of the patient factors evaluated (Tables 4 and 5), only circulating intravenous immunoglobulin (IVlg) changed within a n individual patient and therefore could allow intraindividual stepwise regression analysis. IVIg did not become an independent predictor of posttransfusion response for any of the six patients (four alloimmunized) not initially receiving IVIg but who were treated with IVIg later on during the course of this study. Although BM transplant recipients, nonalloimmunized females, and alloimmunized IVIg recipients generally had greater posttransfusion increments, these differences are not statistically significant because individual variation could account for the demonstrated differences. In contrast, 13 patients were sensitive to the total number of preceding platelet transfusions; eight negatively and five positively.

Of all the clinical factors evaluated (Ta- bles 4 and 5), fever, bleeding, neutropenia, DIC, and sepsis were each identified in at least one patient as a significant independent predictor of posttransfusion platelet increments. Splenomegaly was the only clinical factor not to be independently identified as a significant predictor because in no patient did the condition wax or wane to allow for intraindividual analysis. Fever, bleeding, and neutropenia were usually, but not always, associated with lesser posttransfusion increments. Although fever was a negative effector for four patients, three other patients generally had greater posttransfusion increments while febrile (ie, positive effector). Bleeding defined clinically was a significant predictor for seven individuals; in five of these as a negative effector. In contrast, bleeding defined by red blood cell use within the 3-day period centered on the platelet transfusion was a significant effector in four patients. In n o patient were both definitions of bleeding significant. Neutropenia was a

Patient factors.

Clinicalfactors.




PLATELET REFRACTORY FACTORS 3431

Table 2. All Patients

Alloimmunized Gender Bone Marrow Transplant lVlg

Yes No Female Male Yes No Yes No

No. of transfusions 399 563 495 457 412 550 40 1 56 1 Median CCI 5,000 5.000 5,300 5,000 6,000 4,350 5,600 4,800 Mean CCI 6,330 6,130 6,450 5,960 7,010 5,6 10 6,550 5,970

SEM 302 224 268 242 269 242 269 244

significant predictor in six patients; in five of these as a negative effector. Although DIC (two patients) and sepsis (three patients) were identified as significant independent predictors in fewer patients, these factors were always associated with lesser increments (negative effector).

Of the blood bank factors evaluated (Tables 4 through 6), the SPRCA cross-match, ABO-match, and platelet storage duration independently influenced the posttransfusion increments in at least one patient each. The HLA match grade, number of foreign HLA antigens, and number of foreign CREG antigens did not independently influence the posttransfusion increments for any patients; that is, the variability in posttransfusion increments was not further explained by the extent of HLA similarity. As performed, the SPRCA cross-match assay allowed one technol- ogist to screen 10 to 50 single-donor apheresis platelet units before transfusion. Throughout hospitalization, patients typically remained compatible with the same donors. In 10 of the 11 alloimmunized patients for whom the SPRCA cross-match was an independent predictor of posttransfusion increment, cross-match-compatible platelets routinely led to greater increments than did either cross-match-incompatible or cross-match-untested platelets. For these patients, increments from cross-match-incompatible platelets were indistinguishable from those following cross-match- untested platelets (data not shown). On the other hand, the

Blood bank factors.

Table 3. Patient Diagnoses

Diagnosis No. of Patients No. of Transfusions

Leukemia Chronic myelogenous Chronic lymphocytic Acute myelogenous Acute lymphocytic

Non-Hodgkin’s Hodgkin’s

Solid tumors Breast carcinoma Lung carcinoma Neuroblastoma Ovarian carcinoma

Myelodysplastic syndrome Fanconi‘s anemia Aplastic anemia Myelofibrosis Waldenstram’s disease

Lymphoma

Other

9 3

25 7

11 2

196 22

408 91

91 24

13 3

14 3

45 27 19 2 4

Totals 71 962

SPRCA cross-match was not an independent predictor for five other alloimmunized patients. Of the seven ABO-sensitive patients, five generally had greater increments with ABO-identical platelets; one with major ABO-mismatched and one with minor ABO-mismatched platelets. Twenty- two other patients were not apparently sensitive to the AB0 match. Ten patients appeared sensitive to the age of the platelet products; for seven of those patients, increasing storage time was a negative effector in the transfusion outcome.

Seven ofthe alloimmunized patients received a total of 44 single-donor apheresis platelets that were ordered as HLA matched (hereafter referred to as HLA ordered, which, con- trary to widespread belief, does not necessarily imply “HLA matched” or “HLA identical”) from the blood supplier (Ta- ble 7). These same patients also received 158 other single- donor apheresis platelets from general inventory (ie, routinely ordered). All HLA-ordered single-donor apheresis units were cross-matched whenever possible, just as with other single-donor apheresis platelets. Consistent with the above findings regarding the utility of the SPRCA cross- match, cross-match-compatible HLA-ordered platelets provided posttransfusion responses similar to those of routinely ordered cross-match-compatible platelets. In contrast, cross-match-incompatible or cross-match-untested HLA-ordered platelets provided poor posttransfusion increments similar to analogous routinely ordered platelets. Of note is that 39% ( 1 5 of 38) of platelets ordered as HLA matched were incompatible by SPRCA cross-match and that none of those I5 transfusions resulted in an adequate increment (median CCI = 0). Ofthe six HLA-ordered platelets not evaluated by SPRCA cross-match, only one yielded an adequate posttransfusion increment (median CCI = 2,750). In contrast, almost halfofthe 23 HLA-ordered platelets that were cross-match compatible resulted in adequate increments (median CCI = 6,500).

DISCUSSION

Because all patients were shown to be refractory to platelet transfusions, criteria thought to be responsible for the refractoriness were followed and evaluated for significant independent effects on posttransfusion increments. Only those factors that waxed and waned in a given patient could be evaluated for their role in refractoriness. The goal of this study was to identify clinical, patient, and blood bank factors that are significant predictors of posttransfusion platelet increments, and in particular to identify those factors that could be readily circumvented. To identify these factors, all transfusions were evaluated in terms of the 1-hour CCI. Theoretically, viable platelets should survive the initial





Table 4. Alloimmunized Patients

Patient Factors Regression Clinical Factors Blood Bank Factors

Patient Marrow Transfusion Overall Clinical Neutro- RBC Cross- AB0 Storage No. Gender Diagnosis Transplant No. N PValue Fever Bleeding penia DIC Sepsis Use Match Match Time

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18

F M F F F F F F F M F F F F M F F F

AML CML MDS AML AML CML AML CML AML Neurobl AML Breast Ovarian Fanconi's MDS Breast AML HL

No POS No NEG Yes POS No NS No POS Yes NS No NS No NS No NS Yes NEG Yes NS Yes NS No NS Yes NS No NS Yes NS No NS Yes NS

45 0.0001 NEG 21 0.0001 NS 24 0.0001 NS 12 0.0001 NS 44 0.0003 NEG 10 0.0003 POS 23 0.0007 NS 40 0.0080 NS 14 0.0094 NS 14 0.0108 NS 22 0.0111 POS

5 0.0120 NEG 3 0.0127

23 0.0143 NS 16 0.0173 NS

7 0.0297 NS 26 0.0333 19 0.0385

NS NS POS NS NS NEG NEG NS

NS POS

NS NEG

NS NS NS

NS NS NS

NEG

NEG

NS

NS NS

NS NS NS NS

NS NS NS

NEG NS NS NS

NS NS NS NS NS

NEG NS NS NEG NS NEG

POS POS POS POS POS NEG POS POS NS NS POS NS NS POS POS NS

NS NS NS NS NS NS NS NS POS NS NS NS NS POS NS NS

NEG NS NS NS NS POS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NEG NEG NS

Effects of various factors on posttransfusion platelet increments for alloimmunized patients: blank, not evaluable (insufficient data); NS, not significantly associated with increment; NEG. negative effector, significantly associated with a diminished increment; POS, positive effector, significantly associated with an increased increment.

Abbreviations: AML. acute myelogenous leukemia; CML, chronic myelogenous leukemia; MDS. myelodysplastic syndrome; Neurobl, neuroblastoma; Breast, breast carcinoma; Ovarian, ovarian carcinoma; Fanconi's, Fanconi's anemia; HL, Hodgkin's lymphoma.

posttransfusion hour and the more platelets that survive the initial hour after transfusion, the more platelets are available to assist in hemostasis.

gender, and circulating lVIg did not emerge as independent predictors of posttransfusion increment. In contrast, fever, bleeding, neutropenia, sepsis, and transfusion number each

Patient factors such as recent BM transplantation, emerged as an independent predictor in at least one patient,

Table 5. Nonalloimmunized Patients

Patient Factors Regression Clinical Factors Blood Bank Factors

Patient Marrow Transfusion Overall Clinical Neutro- RBC Cross- AB0 Storage No. Gender Diagnosis Transplant No. N PValue Fever Bleeding penia DIC Sepsis Use Match Match Time

19 M ALL No NS 31 0.0005 NS NS NEG NS NS NS NS 20 F AML No NEG 10 0.0028 NS NEG NS POS NS 21 M AML No NEG 28 0.0034 NS NS NS NS NS POS NS 22 F CML Yes POS 16 0.0043 POS NS NS NS NS NS 23 M NHL No NEG 31 0.0057 NEG NS NS 24 M AML No NS 7 0.0062 NS NEG NS NS NS 25 M AML No POS 15 0.0095 NS NS NS NEG NEG NS NEG NS 26 M AML No NS 3 0.0140 NS POS 27 F NHL No NS 10 0.0149 NS NEG NS NS POS NS 28 M NHL No NEG 8 0.0176 NS NS POS 29 F AML No NS 22 0.0225 NEG NEG 30 M CML Yes NS 28 0.0266 NEG NS NS NS NS NS 31 M NHL Yes NS 5 0.0334 NS NEG 32 F CML Yes NS 10 0.0353 NS NS NEG NS NS 33 M CLL No NS 13 0.0363 NS NS NEG NEG 3 4 M CML No NEG 7 0.0401 NS NS NS NS 35 M CLL No NS 4 0.0447 NS POS NS NS NS 36 M AML Yes NEG 8 0 0.0489 NS NS NEG NS NS NEG

Effects of various factors on posttransfusion platelet increments for nonalloimmunized patients: blank, not evaluable (insufficient data); NS, not significantly associated with increment; NEG. negative effector, significantly associated with a diminished increment; POS, positive effector, significantly associated an increased increment.

Abbreviations: ALL, acute lymphocytic leukemia; AML, acute myelogenous leukemia; CML, chronic myelogenous leukemia; NHL, non-Hodgkin's lymphoma; CLL, chronic lymphocytic leukemia.




PLATELET REFRACTORY FACTORS

Table 6. CCI and HLA Grade

A and BU BX C

3433

HLA matched. These findings agree with the data of O’Con- ne11 et al, who showed that platelet cross-matching can suc- cessfully select donors that would not have been selected on the basis of HLA type.” These results are likely the consequence of many factors. First of all, for platelet orders, HLA matched is not the same as HLA identical. Platelets ordered as HLA matched are typically the closest match obtainable within the constraints of time and donor availability. Sec- ond, achieving a greater number of HLA matches is probably not as important as avoiding those particular mismatches against which the recipient has already been sensitized. ’* Unlike AB0 isohemagglutinins, HLA-directed antibodies are not “naturally occurring.” Patients with HLA-directed antibodies as the mediator of platelet alloimmunization typically have antibodies directed against specific and/or cross-reacting HLA epitopes. Avoiding those particular epitopes would bypass the mediators of alloimmunization in a particular recipient more efficiently than matching for all self-antigens. Indeed, at least 20% (grade A matches) to 40% (BU matches) of HLA-matched platelet units fail to provide adequate posttransfusion increments.” Finally, the SPRCA cross-match assay as performed is sensitive to all IgG antibodies that adsorb onto target platelets by the Fab moiety.

Other techniques have been used to cross-match platelets by identifying HLA-directed antibodies, including the platelet immunofluorescence test (PIFT), platelet enzyme-linked immunosorbent assay (P-ELISA), platelet radioimmunoas- say (P-RIA), immunobead assay, and platelet radioactive antiglobulin test (RAGT).’8,2G24 These methods are generally more labor intensive, require special handling, and may not identify antibodies directed against antigens other than HLA class I. In addition, most of the effectiveness studies were performed with pooled random donor platelets and did not account for clinical and patient variables. The SPRCA cross-match method does not inherently discriminate HLA directed from platelet-specific antibodies, both of which may mediate platelet alloimmuni~ation.~*”~~~ In contrast to commercial lymphocytotoxic antibody panels, the SPRCA assay does not require antibodies to fix rabbit complement and to recognize serologically related (though perhaps distinct) antigens on third-party neoplastic lymphocytes. Moreover, this method allows for a direct test of the unique combination of patient plasma and specific donor platelets for antibody-antigen interaction.

A recent multisite clinical study compared HLA-matching with prospective cross-matching in the selection of platelets for refractory patients.26 A paired set of one HLA- matched and one cross-match-compatible single-donor

Mean 7.400 7.700 6,400 Median 6,500 8,000 5.400 CCI c 5,000 38.3% 37.5% 47.3% CCI 2 7,500 48.9% 50.0% 38.5% No. Patients 9 15 41 No. Transfusions 47 48 455

often but not always as a negative effector. These findings are in general agreement with those of others.’ However, the variation from person to person was such that it was not possible to predict a priori which factors would be significant for a given patient. Curiously, frequently cited negative factors such as fever and sepsis were not always negative or even independent effectors. Perhaps the underlying reason for the fever or sepsis is more important to the posttransfusion platelet increment than the fever itself. We found no single variable that appeared to explain the variation in the platelet increments across patients. In fact, when included as a factor in a regression model encompassing all patients, the patient name was identified as most significant of all factors. Evidently, no single clinically evident factor is a reliable predictor of posttransfusion increment in an unfa- miliar patient; each individual patient is sensitive to specific clinical factors that cannot necessarily be identified beforehand.

The blood bank factors significantly affecting posttransfusion increments with individual patients were the SPRCA cross-match, AB0 compatibility, and platelet storage duration. The HLA-match grade and the number of HLA and CREG mismatches did not independently affect the CCI in any of these multiply transfused patients. Most alloimmunized patients for whom effectors could be identified were sensitive to cross-match results. By definition, nonalloimmunized patients could not receive cross-match-incompatible platelets, and therefore the cross-match could not be used as a predictor in the patient population without cross- match-demonstrable antiplatelet antibodies. Some patients were markedly sensitive to the AB0 match, whereas others were sensitive to the storage time. Owing to the design of the study, we were unable to evaluate the negative effects of repeated AB0 mismatch as reported by others4 Similarly, we cannot comment on the role, if any, ofleukoreduction in modulating the onset of alloimmunization. With the singu- lar exception of the SPRCA cross-match for most alloimmunized patients, determination of which patients are sensitive to which blood bank factors cannot be accomplished a priori. As with the clinical factors, individual patient variation accounts for the majority of the posttransfusion platelet increment.

No additional benefit beyond that provided by the SPRCA cross-match was apparent from the use of platelets ordered from the blood supplier as HLA matched. All patients who received HLA-ordered platelets also received routinely ordered platelets. The cross-match results had a greater bearing on the posttransfusion increments than whether the platelets were routinely ordered or requested as

Table 7. Patients Receiving Platelets Ordered as HLA Matched

SPRCA Cross-Match

Orders as HLA Compatible matched Incompatible

Not done

Incompatible Not done

Routine Compatible

No. Transfusions

23 15 6 87 36 35

Median CCI

6,500 0

2,750 7,600 950 0

CCI k7.500 (%)

48 0 17 52 0 3





platelet dose were selected for 73 refractory patients without confounding concurrent nonimmune factors. Cross-matching was performed by one of four different procedures. This group found grade A and BU HLA matches to be optimum, with cross-match-compatible platelets acceptable; either was superior to any other grade of HLA match or selective mismatching of HLA or CREG types. Curiously, they noted substantial variation in the second response among the 35 patients with repeated sets of platelet transfusions (only 50% to 57% concordance). Our data are in general agreement, although our greater number of transfusions allowed for inclusion of confounding clinical and patient variables and subsequent mathematical analysis of which clinical factors are indeed repeatedly significant and which blood bank factors can be circumvented.

With a greater number of transfusions to more patients, our data extend the results of previous cross-match studies to account for single-donor apheresis platelets as well as confounding variations in clinical and patient f a ~ t o r s . ' ~ ~ ' ~ , ~ ~ Based on the results from this study, taking into account the various clinical, patient, and blood bank factors that can affect posttransfusion increments, most patients are susceptible to one or more particular factors affecting posttransfusion platelet increments that cannot necessarily be identified beforehand. Moreover, many well-known factors associated with diminished posttransfusion increments are not necessarily purely negative or positive effectors. How- ever, for patients with cross-match-demonstrable antiplatelet antibodies, the SPRCA cross-match assay does appear to select for a particular single-donor apheresis platelet product likely to yield an increased posttransfusion increment.

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I M M U N O H E M A T O L O G Y

Is flow cytometry accurate enough to screenplatelet autoantibodies?

Nathalie Hézard, Gérard Simon, Catherine Macé, Vincent Jallu, Cécile Kaplan, and Philippe Nguyen

BACKGROUND: The diagnosis of immune thrombocy-topenic purpura (ITP) is a diagnosis of exclusion, asstated by international guidelines. Nevertheless, theassessment of platelet (PLT) antibodies has beenreported as helpful for the diagnosis and the follow-upof ITP patients. PLT antibodies are detected by highlyspecialized assays, such as monoclonal antibody–specific immobilization of PLT antigen (MAIPA) test.Flow cytometry for PLT-associated immunoglobulin G(PAIgG) detection has been described more recently.This study was meant to evaluate the utility of flowcytometry to screen accurately patients needing furtherMAIPA testing.STUDY DESIGN AND METHODS: PAIgG, PAIgM, andPAIgA were determined in 107 consecutive patients andin 147 healthy controls in parallel. MAIPA testing wasperformed in all patients. The accuracy of flow cytom-etry was assessed with a receiver operating character-istics (ROC) curve analysis versus MAIPA.RESULTS: MAIPA assay found PLT-specific IgG in 27patients (25%). The ROC curve analysis showed thatno false-negative result in flow cytometry was obtainedfor a mean fluorescence intensity (MFI) cutoff of 0.2.With this cutoff, PAIgG were positive in 61 patients(57%). In this series, MAIPA was unnecessary in42 percent of patients (corresponding to true-negativeresults). When MAIPA was positive, PAIgM valuesranged from 0.1 to 1.0, and PAIgA from 0.1 to 2.CONCLUSION: Flow cytometry for PAIgG assessmentmay be used to accurately decide whether or notMAIPA must be subsequently performed. In this series,MAIPA was unnecessary in 42 percent of patients.Moreover, PAIgM results suggested that its determina-tion combined with PAIgG may be of interest in ITPinvestigation.

Immune thrombocytopenic purpura (ITP) is anacquired disorder, in which accelerated platelet(PLT) consumption is due to PLT autoantibodies.ITP is classified as “primary” or “idiopathic” when

occurring without any underlying disease or consideredas “secondary” when associated with various dysimmunedisorders, such as systemic lupus erythematosus or lym-phoproliferative diseases. According to the AmericanSociety of Hematology (ASH) guidelines, “the diagnosis isbased principally on the history, physical examination,complete blood count, and examination of the peripheralsmear, which should exclude other causes of thrombocy-topenia” and not on the detection of PLT autoantibodies.1

More recent publications suggest that laboratory testscould be incorporated in current guidelines.2,3 Two differ-ent types of techniques are currently used: the detectionof PLT-associated immunoglobulins (PAIg) and the detec-tion and characterization of specific PLT antibodies. Thedetection of PAIg cannot differentiate between antibodiesspecifically raised against PLT glycoproteins and non–PLT-specific antibodies. In the past few years, the use of flowcytometry to screen PAIg has been assessed with conflict-ing reports.4-8 These studies compared flow cytometrywith the clinical probability of ITP diagnosis. In thiscontext, we evaluated the performance of flow cytometryto screen PAIgG. For this, the flow cytometric assaywas compared with monoclonal antibody–specific immo-bilization of PLT antigen (MAIPA) in 107 consecutive

ABBREVIATIONS: ITP = immune thrombocytopenic purpura;

MAIPA = monoclonal antibody–specific immobilization of

platelet antigen; PAIg = platelet-associated immunoglobulins;

ROC = receiver operating characteristics.

From the Laboratoire d’Hématologie, CHU Robert Debré,

Reims; and the Institut National de Transfusion Sanguine, Paris,

France.

Address reprint requests to: Pr Philippe Nguyen, MD, PhD,

Laboratoire d’Hématologie, CHU Robert Debré, 51092 Reims

Cédex, France; e-mail: [email protected].

Received for publication July 16, 2007; revision received

September 4, 2007, and accepted September 5, 2007.

doi: 10.1111/j.1537-2995.2007.01556.x.

TRANSFUSION 2008;48:513-518.

Volume 48, March 2008 TRANSFUSION 513

mailto:[email protected]

patients. The performance of flow cytometry was analyzedwith a receiver operating characteristics (ROC) curve. Touse flow cytometry as a screening test, we calculated thecutoff allowing a 100 percent sensitivity.


PatientsWe investigated 107 consecutive adults (47 males, 60females) from January 2003 to January 2007. They werereferred by senior hematologists of an academic hospital.According to the current guidelines, patients had primaryITP (n = 73), secondary ITP (n = 14, including lymphopro-liferative disorders, antiphospholipid syndromes, sys-temic lupus erythematosus, hemorrhagic rectocolitis,rheumatoid polyarthritis, one Felty syndrome), or unex-plained isolated thrombocytopenia (n = 20, correspond-ing to miscellaneous diseases, i.e., hepatitis virusinfection, liver cirrhosis, hyperthyrosis, Biermer disease,myelodysplastic syndrome, myeloproliferative syndrome,Marfan syndrome). We obtained informed consent fromall patients, and the study met all institutional ethicsrequirements. Baseline characteristics of patients are pre-sented in Table 1.

MAIPATen milliliters of whole blood was collected into ethylene-diaminetetraacetate (EDTA). The identification of PLTantigen–specific antibodies was performed in one refer-ence laboratory (Institut National de Transfusion Sanguine[INTS], Paris, France), with the gold standard assayMAIPA.9-11 Monoclonal antibodies were Gi9 (Immunotech,Marseille, France), P11-64 and P12-46 (Dr Kaplan, INTS,Paris, France), and GR-P (Dr Garrido, Granada, Spain),respectively, raised against GPIa, GPIIbIIIa, and GPIbIX.The secondary antibody was a goat peroxidase–conjugatedanti-human IgG Fcg fragment specific (Jackson Immu-noResearch Laboratories, Suffolk, UK). Results were inter-preted blindly of the presumed clinical diagnosis.

Flow cytometric assay for PAIg detectionFive milliliters of whole blood was collected on EDTA. Inour laboratory, for any PLT flow cytometric analysis, we

currently run in parallel samples obtained from at leastone healthy volunteer. For this, informed consent wasobtained according to our institutional ethics require-ments. The assay was completed within 2 hours afterwithdrawal in a single laboratory (CHU Reims).

A direct immunofluorescence assay, adapted fromRosenfeld and coworkers5 was used. For this, whole bloodwas centrifuged at 150 ¥ g for 10 minutes to obtain a PLT-rich plasma sample, which was transferred in a polypro-pylene tube. A PLT pellet was obtained by centrifuging thePLT-rich plasma at 2300 ¥ g for 5 minutes and then resus-pended in ammonium oxalate (1%) for red cell lysis. Aftercentrifugation at 1100 ¥ g for 5 minutes to discard super-natant, the pellet was washed twice in phosphate-buffered saline (PBS) containing EDTA (0.009 mol/LNa2EDTA, 0.0264 mol/L Na2HPO4, 0.07 mol/L NaCl) andresuspended at the concentration of 5 ¥ 106 PLTs per mL inPBS-EDTA buffer.

Antibodies were purchased from Tebu (Le Perray enYvelines, France). A volume of 100 mL of PLT suspensionwas incubated in a polypropylene tube coated with 5percent bovine serum albumin for 30 minutes with 10 mLof the appropriate dilution of fluorescein isothiocyanate–conjugated antibodies (the saturating concentration ofeach antibody was previously determined by serial dilu-tion studies): goat F(ab′)2 anti-human IgG (Fcg fragmentspecific) antibody was used at a 1-in-15 dilution, goatF(ab′)2 anti-human IgM (Fcm fragment specific) antibodywas used at a 1-in-10 dilution, and goat F(ab′)2 anti-human IgA (Fca fragment specific) antibody was used ata 1-in-20 dilution. PLT suspension was then washed withPBS-EDTA buffer. Pellet was resuspended in 500 mL ofPBS-EDTA buffer and immediately analyzed on a flowcytometer (EPICS XL, Beckman Coulter, Paris, France).Excitation and emission wavelengths were 488 and525 nm, respectively. PLT population was gated with PLTforward and side scatter characteristics. Acquisition andprocessing data from 10,000 PLTs were performed andanalyzed with computer software (Expo 32, BeckmanCoulter). We analyzed the mean fluorescence intensity(MFI), obtained for the whole PLT population, includingthe events in the first channel.

Statistical analysisThe Shapiro-Wilk test showed that flow cytometric datawere not normally distributed. Results are expressedas median (interquartile range). The diagnostic valueof flow cytometry for PAIgG assessment was evaluatedwith a ROC curve analysis. The ROC curve analysisconsists of constructing a graph that correlates true andfalse-positive rates (sensitivity and 1 minus specificity,respectively) for a series of cutoff points for the assayunder evaluation, versus the reference test. The graph isused to decide the optimum cutoff point according to the

TABLE 1. Characteristics of studied patientsPatients Number

Males/females 47/60Age (years), mean � SD 47 � 22Referring department

Hematology 78Internal medicine 29

Isolated thrombocytopenia (<50 109/L) 28Associated autoimmune disease (>50 109/L) 79

HÉZARD ET AL.

514 TRANSFUSION Volume 48, March 2008

purpose of the assay.12 As we evaluated flow cytometry asa screening test, we looked for the highest sensitivity andnegative predictive value. Indeed, we chose the cutoff ofMFI for which sensitivity and negative predictive valuewere 100 percent, which is the cutoff for which no false-positive result was observed. Both specificity and posi-tive predictive value are also reported.

RESULTS

MAIPAMAIPA analysis was positive in 27 patients (25%), negativein 78 patients (73%), and not determined in 2 cases

TABLE 2. MAIPA results

ResultNumber of patients (%)

(N = 107)

Negative 78 (73)Positive 27 (25)Not determined 2 (2)Anti-GPIIbIIIa 24Anti-GPIbIX 11Anti-GPIaIIa 6Multiple reactivity 9

A

Fig. 1. Representative histograms obtained from a patient presenting with primary ITP (B). A sample from a healthy volunteer is

systematically run in parallel (A). With PLT-rich plasma, the gate of PLTs is drawn in the forward scatter (FS)/side scatter (SS) histo-

gram (top). The mean of fluorescence for each isotype is obtained with a cursor set on the four decades, including the first channel,

corresponding to the whole PLT population.

FLOW CYTOMETRY AND PLT ANTIBODIES


because of a low PLT count (19 ¥ 109 and 11 ¥ 109/L).Details of the IgG specificity are reported in Table 2.MAIPA was positive in 29 percent in “primary” ITP (21/73), in 28 percent in “secondary” ITP (4/14), and in10 percent in the other cases (2/20).

Flow cytometryFluorescence histograms are shown in Fig. 1. In patients,MFI data, expressed as median (25th, 75th percentile),were 0.3 (0.2-0.5) for PAIgG, 0.2 (0.2-0.4) for PAIgM, and0.2 (0.2-0.2) for PAIgA. MFI values ranged from 0.1 to 5.5for PAIgG, 0.1 to 4.2 for PAIgM, and from 0.1 to 2.0 forPAIgA.

In controls, MFI values were 0.2 (0.2-0.2) for eachisotype (PAIgG, PAIgM, and PAIgA) and ranged from 0.1 to0.5 for PAIgG, 0.1 to 1.7 for PAIgM, and 0.1 to 0.5 for PAIgA.The distribution of MFI values is reported in Fig. 2.

Cutoff and performances of flow cytometryWe used an ROC curve to evaluate the utility of flow cyto-metric assay as a screening test for further MAIPA anti-body characterization. The ROC curve was only analyzedfor PAIgG, because the MAIPA test detected specific IgGalone (Fig. 3). The cutoff value allowing 100 percent sen-sitivity and 100 percent predictive negative value wasdetermined. As shown in Fig. 2, the cutoff of MFI was 0.2.

B

Fig. 1. Continued

HÉZARD ET AL.


With this cutoff, the specificity was 58 percent, and thepositive predictive value was 45 percent.

DISCUSSION

Although the ASH guidelines stated in 1996 that PLT-associated IgG assay was unnecessary and inappropriatein both adults and children ITP patients, the British guide-lines considered in 2003 that the investigation of PLTautoantibodies may be of value in adult ITP patients inparticular clinical settings, that is, combination of marrowfailure and ITP or ITP patients refractory to first- and

second-line treatment for whom a third-line treatment isconsidered.1,13 Moreover, several authors also state thatantibody testing is helpful for positive diagnosis (ratherthan to make only a diagnostic of exclusion) and may beused in the follow-up of patients to determine immuneremission or a worsening outcome in ITP.2,3,14 It has alsobeen reported that PLT antibodies are associated with PLTdysfunction in some cases.15 In our daily practice, thedemand on physicians for PLT antibody testing is high.This prompted us to develop a strategy to investigatepatients presenting with a presumed diagnosis of ITP.Because of the frequency of the cases, we evaluated flowcytometry as a first-line assay. Because this technique isfast and easy to handle, it is a good candidate for a screen-ing test. An ROC curve analysis was therefore used toevaluate the negative predictive value of the assay (a 100%sensitivity being a prerequisite in a screening strategy).The ROC curve analysis showed that an MFI cutoff of 0.2permitted no false-positive result with the highest speci-ficity (57%). Our results showed that 42 percent of MAIPAanalysis (= flow cytometric PAIgG true-negative results)could be unnecessary.

Also, several authors previously reported on the inter-est of flow cytometry as a screening test; none of them usedan ROC curve analysis to compare flow cytometry withspecific assays, such as MAIPA or solid-phase modifiedantigen capture enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).4,6,7 In their hands, sensitivity displayed from 60 to90 percent, and specificity from 39 to 77 percent. Anotherstudy compared flow cytometry and MAIPA and found a100 percent negative predictive value for flow cytometry;however, the cutoff to reach this performance was not cal-culated.8 The current opinion is that flow cytometry has apoor performance in ITP. This is mainly based on the factthat the agreement between flow cytometry and specificassays (MAIPA, modified antigen capture ELISA) is poor

with a lack of specificity for flow cytom-etry. Our approach clearly shows thatflow cytometry can be used to screenpatients with low PLT count to makeMAIPA testing unnecessary in case ofnegative screening. The cutoff for nega-tivity is low and this explains the poorspecificity of the test. The approach issafe because no positive cases weremissed. It is also time- and cost-effective,because MAIPA was unnecessary in40 percent of the referred patients. In ourcountry, this appears as a major advan-tage because flow cytometry is currentlyavailable in academic laboratories,whereas MAIPA is restricted to a few ref-erences laboratories.

Our study raises the questionwhether specific IgM and IgA should be

6

5

4

3

2

1

0

MF

I

IgG IgM IgA IgG IgM IgA IgG IgM IgA

Healthy controlsn=147

All patients n=107

Patients withpositive MAIPA

n=27

Fig. 2. Repartition of MFI values of 147 healthy controls and

107 patients. MFI results in healthy controls ranged from 0.1

to 0.5 for PAIgG, 0.1 to 1.7 for PAIgM, and 0.1 to 0.5 for PAIgA.

In patients, values ranged from 0.1 to 5.5 for PAIgG, 0.1 to 4.2

for PAIgM, and 0.1 to 2.0 for PAIgA.

0

20

40

60

80

100A B

0 20 40 60 80 100

100-specificity

sens

itiv

ity

0.2

MAIPA

PAIg

G

+

+

-

-

TPn=27

(25%)

FNn=0

FPn=33

(31%)

TNn=45

(42%)

Fig. 3. ROC curve and contingency table: flow cytometric PAIgG determination

versus MAIPA. For a 100 percent sensitivity, the best specificity (57%) was obtained

for an MFI cutoff of 0.2 (A). True negative (TN) indicates that specific PLT testing by

MAIPA should be unnecessary in 40 percent of patients (B). TP = true-positive value;

FP = false-positive value; FN = false-negative value.

FLOW CYTOMETRY AND PLT ANTIBODIES


systematically searched in specific MAIPA assays. Indeed,we observed high values of PAIgM and/or PAIgA in asso-ciation with PAIgG. In some patients, high levels of PAIgMwere found alone. These findings are in agreement withprevious reported data that highlight the fact that IgM andIgA are frequently associated with IgG or even presentalone for IgM.5,6,16 In a study with an ELISA method forPAIgM, IgM were found alone in 29 percent of cases.16 Inour series, we did not confirm IgM/A specificity by MAIPA.Our strategy should allow us to determine whether IgMand/or IgA directed against PLT antigens (GPIIbIIIa,GPIbIX, GPIaIIa) are involved in the pathogenicity of ITP.

In conclusion, flow cytometry is useful to screenpatients with a suspicion of immune thrombocytopenia,but does not prevent MAIPA testing to establish the diag-nosis. Such a strategy requires each laboratory to evaluateits own flow cytometric cutoff levels according to its ownassay conditions.

ACKNOWLEDGMENT

We are indebted to Dr B. Lartigue for including patients in this

study.

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HÉZARD ET AL.


EVALUACION DEL DESARROLLO DE LA REFRACTARIEDAD PLAQUETARIA

EN PACIENTES CON NEOPLASIAS DE ORIGEN HEMATOLÓGICO,

TRANSFUNDIDOS CON CONCENTRADOS DE PLAQUETAS OBTENIDOS POR

EL METODO CB-BC EN PRESENCIA Y AUSENCIA DE FILTROS

DESLEUCOCITARIOS

Oriana Lombana 1 , Lucía del Pilar Cortés 2, Hugo Diez 1 .

1 Facultad de Ciencias, Pontificia Universidada Javeriana, Bogotá

2 Banco de Sangre, Instituto Nacional de Cancerología, Bogotá.

e-mail: [email protected]

RESUMEN

El desarrollo de refractariedad plaquetaria permanente es un problema en

pacientes politransfundidos con neoplasias de origen hematológico. La reducción

sistemática del contenido de leucocitos en los productos transfundidos, que está

orientada a disminuir la presentación de la misma, puede elevar notablemente los

costos de la terapia transfusional principalmente por la utilización de filtros de

absorción selectiva. Este estudio comparó la presentación de refractariedad en 83

pacientes con neoplasias de origen hematológico que fueron transfundidos con

concentrados obtenidos por el método de extracción de la capa leucoplaquetaria,

con (n=41) o sin (n=42) la utilización de filtros para reducción leucocitaria,

encontrando que no existe diferencia significativa (p = 0.378) en la aparición de

refractariedad en los dos grupos y que el costo de la terapia se aumenta cuatro

veces (p < 0.001), cuando se utilizan filtros.

Palabras claves: Aloinmunización – Neoplasia – Plaquetas – Refractariedad.

ABSTRACT

Development of permanent platelet refractoriness is a major problem in

multitransfused patients with hematologic malignancies. The systematic leukocyte

reduction of blood components transfused, guided to reduce it, may increase the

cost of the transfusional therapy, specially by the application of leukocyte

adsorption filters. We studied the development of platelet refractoriness in 83

patients with hematologic malignancies, that had been transfunded with platelet

concentrates derived from Buffy Coat, with or without the use of leukocyte

depletion filters. No significant difference (p = 0.378) was found between both

groups, for the refractoriness development . Additionally, the cost of the therapy

increased about four times, (p<0.0001) when the filters applied.

Key words: Allo inmunisation – Neoplasie - Platelets – Refractory state.

I. INTRODUCCION.

La medicina transfusional es una especialidad multidisciplinaria cuyo objetivo

primordial es obtener un componente sanguíneo de optima calidad que no cause

reacciones post transfusionales al ser aplicado al paciente (1). La transfusión

sanguínea es una terapia de soporte para aquellos pacientes que presentan

neoplasias malignas de origen hematológico, siendo el concentrado de Plaquetas

el de mayor demanda institucional. Sin embargo, el mayor obstáculo para la

utilización de este componente es el desarrollo de la refractariedad, es decir, la

falta de incremento del recuento plaquetario después de la transfusión ( 2 ).

La refractariedad puede ser debida a causas no inmunológicas e inmunológicas.

Entre las causas no inmunológicas se encuentra esplenomegalia, medicamentos y

sepsis. Entre las causas inmunológicas se encuentra la presencia de

autoanticuerpos o aloanticuerpos dirigidos contra antígenos del Complejo Mayor

de Histocompatibilidad ( CMH; también conocido como HLA en el Hombre),

antígenos leucocitarios, antígenos específicos de plaquetas; La aloinmunización

depende de factores propios del receptor pero esencialmente de la

aloinmunización generada por la transfusión de leucocitos dentro del concentrado

plaquetario ( 2 ). La utilización de donantes HLA compatibles y/o eliminación de los

leucocitos presentes en los concentrados de plaquetas disminuye el riesgo de

aloinmunización y las consecuentes reacciones post transfusionales al producto

sanguíneo, además de mejorar la respuesta del paciente refractario a las

plaquetas normales ( 3, 4 ).

En la actualidad existen múltiples métodos para disminuir la cantidad de leucocitos

contaminantes en la transfusión. Estos métodos incluyen la utilización de filtros

antes de la transfusión y técnicas de fraccionamiento de sangre total orientadas a

disminuir la cantidad de leucocitos dentro del concentrado plaquetario, tales como

la separación de la capa leucoplaquetaria, conocido mundialmente como Buffy

Coat ( BC ).

La filtración es un método aceptado y altamente efectivo en la prevención de

aloinmunización que permite disminuir el recuento de leucocitos hasta en 1x106

leucocitos por unidad de sangre ; sin embargo, su uso eleva sustancialmente el

costo de la terapia transfusional (2, 4, 5, 6, 7 ) y por eso métodos como el de

separación de la capa leucoplaquetaria , en el que se produce una reducción

notable del recuento leucocitario, surge como alternativa más económica y

probablemente igual de efectiva, lo que en nuestro medio significaría un ahorro de

recursos.

Varios trabajos han evaluado el uso de filtros en transfusiones de plaquetas

obtenidas por método de centrifugación sin leucodepleción, encontrando necesario

el uso de filtro ; sin embargo, no existen estudios clínicos que garanticen su

utilización cuando se transfunden concentrados plaquetarios obtenidos por

métodos de leucoreducción ( 13, 15 ). En este trabajo inicialmente se estandarizó

e implementó la técnica para obtención de concentrados plaquetarios por el

método semiautomático que separa la Capa Leucoplaquetaria en el Banco de

Sangre del Instituto Nacional de Cancerología; posteriormente se hizo un estudio

clínico prospectivo aleatorio para determinar la diferencia en la incidencia de

refractariedad plaquetaria, en pacientes con enfermedades onco-hematológicas,

que recibieron varias unidades de plaquetas obtenidas por la técnica

implementada y transfundidas con y sin filtros desleucocitarios.

II. MATERIALES Y METODOS.

Para conocer el grado de refractariedad desarrollado por los pacientes después de

la transfusión de concentrados plaquetarios extraídos mediante metodología CP-

BC(Concentrado plaquetario-Buffy coat) se realizo inicialmente la estandarización

de la técnica para extraer el componente plaquetario y una vez obtenido el

componente se verificó su efectividad en un grupo de 83 pacientes con

diagnostico de neoplasias hematológicas. Los pacientes fueron divididos en dos

grupos; uno (n=41) recibiría transfusiones de plaquetas sin filtro desleucocitario

(SF), y el segundo grupo(n=42) recibiría transfusiones de plaquetas con filtro

desleucocitario(CF). Cada grupo fue valorado a nivel de pre y post – tranfusional

bajo un seguimiento clínico que incluía calculo de incremento plaquetario, % de

recuperación plaquetaria para determinar grado de la refractariedad, y análisis de

costos individuales por transfusión para cada método. De los datos obtenidos se

realizó un análisis paramétrico con un 0,005 en el programa SPSS 9.0 .

GRUPO DE ESTUDIO

Los 83 pacientes del estudio fueron seleccionados de una población conformada

por pacientes con neoplasias de origen hematológico del Instituto Nacional de

Cancerologia y que requerían plaquetas con fin profiláctico o terapéutico por tener

un recuento menor de 20 X 109/L. No se incluyeron pacientes que habían recibido

previamente cualquier producto sanguíneo, presentaban esplenomegalia mayor de

5 cm por debajo del borde costal, habían desarrollado refractariedad plaquetaria

previa por cualquier razón, tenían síndrome febril, Infección clínica diagnosticada,

o Coagulación intravascular diseminada.

Los pacientes que cumplieron los criterios de inclusión fueron ingresados en forma

consecutiva en una base de datos, asignándolos a recibir los concentrados de

plaquetas con o sin filtro desleucocitario de acuerdo con el orden de llegada.

EQUIPO Y METODOS

Concentrados plaquetarios

Los concentrados plaquetarios se obtuvieron mediante la implementación del

método de extracción de la capa leucoplaquetaria (CP-BC) utilizando un sistema

semiautomático de fraccionamiento de sangre total, con el equipo OptipressR - I

(FDR 4548). El sistema se compone de una bolsa cuádruple y un extractor

automático que trabajan en conjunto, y un controlador óptico para separar los

componentes. Durante el procesamiento con el sistema semiautomático, la capa

leucoplaquetaria permanece en la bolsa primaria, mientras que el plasma y los

glóbulos rojos fluyen simultáneamente a través de los puertos superior e inferior

respectivamente, hacia las bolsas satélite.

La unidad de sangre centrifugada se colocó en el sistema semiautomático,

activando el plato de presión. Como el plasma tiene menor viscosidad que los

glóbulos rojos empacados fluye más rápido que los glóbulos rojos y la capa

leucoplaquetaria tiende a moverse hacia arriba. Cuando la capa celular se coloca

frente a la fotocelda ubicada en el plato de presión, las pinzas del dispositivo

frenan el flujo de plasma pobre en plaquetas que estaba siendo transferido a la

bolsa superior, mientras que los eritrocitos son transferidos simultáneamente hacia

la bolsa inferior. La capa leucoplaquetaria que contiene plaquetas y leucocitos se

queda en la bolsa primaria y se centrifugo otra vez. El concentrado plaquetario es

transferido a la bolsa de almacenamiento, mientras que los leucocitos y los

glóbulos rojos residuales permanecen en la bolsa original de la recolección (

Figura 1). La sangre se proceso antes de las 8 horas posteriores a la flebotomía y

los concentrados plaquetarios obtenidos se colocaron en el sistema de agitación

continua a temperatura ambiente, hasta el momento de la transfusión.

Filtro para reducción de leucocitos

Para realizar la transfusión se utilizaron filtros leucoreductores SepacellR PLS-5ª

que se pueden utilizar para una transfusión hasta de 6 concentrados plaquetarios

de donante múltiple o 1 concentrado plaquetario obtenido de donante único, el que

da un rendimiento óptimo de filtración cuando el flujo no excede 20 mL/min.(Figura

1 )

Evaluación pre y post transfusional

Para determinar la eficacia de las transfusiones de plaquetas, se realizó recuento

plaquetario pretransfusional y una hora después de la transfusión. Este

procedimiento se realizó en todas las ocasiones en que el paciente fue

transfundido hasta cuando se detecto la aparición de refractariedad plaquetaria o

se interrumpió la terapia transfusional. La evaluación de la respuesta a la

transfusión de plaquetas se determinó por el incremento corregido ( 17 ).

IC A = Plaquetas post – Plaquetas Pre x SCB (m

2) / Unidad de plaquetas transfundidas.

Donde,

IC A = Incremento corregido

SCB = superficie corporal

SCB = ( (peso en Kg) x 4) +7 ) / peso en Kg + 90

Igualmente se hizo seguimiento clínico estricto durante y en las 4 horas

posteriores a la transfusión, registrando incrementos de la temperatura corporal

mayor a 1º C, calofríos, temblor, urticaria, broncoespasmo o desarrollo de

reacciones alérgicas.

REFRACTARIEDAD

Para evaluar la respuesta a las tranfusiones recibidas se definió refractariedad

como un ICA menor a 5,0 ( 2 ). Este proceso siempre estuvo supervisado por uno

de los investigadores principales y en él, no se permitió la intervención directa del

medico tratante , como previamente se acordó con el servicio de hematología del

Instituto.

III. RESULTADOS.

GRUPO DE ESTUDIO

De los 83 pacientes incluidos, todos reunían los criterios de inclusión para una

patología neoplásica hematológica predominando la Leucemia Linfoide Aguda (

28/42 en el grupo sin filtro y 38/41 en el grupo con Filtro ); en su mayoría mujeres (

26/42 en el grupo sin filtro y 24/41 en el grupo con filtro ) y los concentrados

plaquetarios se usaron principalmente en forma profiláctica ( 21/41 en el grupo sin

filtro, 26/41 en el grupo con filtro ) ( Tabla 1 ).

REFRACTARIEDAD PLAQUETARIA

Al comparar los dos grupos de estudio no se encontró diferencia estadísticamente

significativa en el desarrollo de la refractariedad ( p = 0,378 ).

Los dos grupos presentaron un alto grado de refractariedad ( 28/42 en el grupo sin

filtro y 25/41 en el grupo con Filtro ) ; la refractariedad se presento en tiempos

similares para cada grupo ( 4.75 1,9 Transfusiones en el grupo sin filtro y 5.44

2.40 transfusiones en el grupo con filtro ).

ANÁLISIS DE COSTOS

Se encontró diferencia estadísticamente significativa en los costos originados por

el uso de filtros desleucocitarios ( p 0,001 ) ; $212960 para el grupo sin Filtro y

$783989 para el grupo con filtro ).

IV. DISCUSIÓN

Las transfusiones plaquetarias están indicadas para el tratamiento y/o prevención

de sangrado asociado a trombocitopenia o disfunción plaquetaria en pacientes

estables con conteos menores a 10000 células/uL ; pacientes con conteos

menores a 20000/uL asociado a sangrado menor, fiebre, o esplenomegalia ;

pacientes con conteos menores a 50000/uL con sangrado significativo o

sometidos a procesos quirúrgicos invasivos ; pacientes con anormalidades

funcionales plaquetarias ( 20 ). En este estudio ; en 47/83 pacientes ( 21 sin filtro y

26 con filtro ) se utilizaron los concentrados plaquetarios como medida terapéutica,

y los otros 36 pacientes presentaban alguna clase de sangrado (Tabla 1).

El uso de concentrados plaquetarios tiene como riesgo reacciones post

transfusionales de tipo febril en 1% cuando se transfunde por primera vez y 30%

en politransfundidos. Pacientes politransfundidos pueden desarrollar

aloanticuerpos contra Ags plaquetarios y causar una aloinmunización o

refractariedad inmune plaquetaria. La aloinmunización se debe principalmente a

Acs contra Ags HLA-I del donador, y contra otros Ags menores de la superficie

plaquetaria como el P, I ( 18 ). Este estudió coincide con lo reportado por la

literatura donde conteos plaquetarios realizados una hora después de la

transfusión muestran bajos recuentos y la refractariedad se presenta en pacientes

que han sido transfundidos más de una vez ( 4.77 a 5.44 transfusión ).

El riesgo de aloinmunización es reducido por leucoreducción. Leucoreducción es

el proceso de remover más del 90% de las células blancas de los componentes

celulares de un Banco de Sangre, entre ellos, los concentrados plaquetarios. En

el orden de establecer el nivel de leucoreducción en un componente, la Asociación

Americana de Bancos de Sangre estableció como estándar que el contenido

residual de leucocitos en un componente sanguíneo no debe ser mayor de 5x106

células. El estándar puede lograrse mediante dos métodos básicos: filtración y

procesos de aféresis, siendo el primero el de mayor utilidad para componentes

plaquetarios obtenidos de un pool de donantes, y el segundo para el que se

obtiene de un único donante ( 17 ). La leucoreducción está indicada para prevenir

reacciones febriles, Aloinmunización y reducir el riesgo de transmisión de

infecciones especialmente Citomegalovirus ( 3, 8, 10 ).

La causa más común de aloinmunización por Ags HLA es el embarazo y

transfusión sanguínea. La mayoría de pacientes HLA aloinmunizados no están

asociados con problemas clínicos. Sin embargo, están asociados con dos

complicaciones clínicas mayores : refractariedad plaquetaria y rechazo a

transplante de órganos. Uno de los principales argumentos para justificar la

reducción en el número de leucocitos transfundidos en pacientes que requieren

soporte transfusional plaquetario, ha sido el de disminuir la aparición de

refractariedad plaquetaria, con el objetivo de retardar el momento de aparición y

lograr transfundir el mayor número de veces con un adecuado rendimiento. Este

estudio utilizó la implementación de técnicas de leucoreducción como la extracción

de la capa leucoplaquetaria, y la utilización de filtros para reducción leucocitaria en

el momento de la transfusión ( 21).

Estudios del Grupo Trap.,2001 mostraron que el uso de componentes

leucoreducidos puede reducir la incidencia de aloinmunización y refractariedad (

18 ). Este estudio mostró que el grado de refractariedad en el grupo sin filtro fue

de 66% (28 de 42 casos ) y que disminuyó levemente a un 60% en el grupo con

filtro ( 25 de 41 casos ). Un 6% numéricamente no es un dato estadísticamente

significativo pero clínicamente indica una menor morbilidad en los pacientes ( 17

). Estudios realizados por otros autores ( 10,13,14,15 ) permiten observar un

menor % de refractariedad bastante heterogéneo ( 10 al 50% ) debido al manejo

de diferentes variables dentro del diseño experimental. El alto grado de

refractariedad en un estudio puede tener causas multifactoriales; la prevalencia

en la expresión de moléculas de HLA – A, B en el grupo de estudio hace que los

pacientes presente refractariedad por un período mayor ; El uso de componentes

provenientes de más de un donante aumenta la posibilidad de aloinmunización ;

la perdida de plaquetas durante el proceso de filtración disminuye los recuentos

post transfusionales ; la activación del sistema inmune por factores indirectos

generados por plaquetas genera proceso febriles. Sobre estos dos últimos puntos

existen estudios documentados como los de Kao.,1995 demostrando que el

promedio de plaquetas que se pierden después de la filtración es del 24% para

componentes obtenidos de múltiples donantes y 15% para componentes

obtenidos de un solo donante por aféresis e Igualmente que la frecuencia con la

cual los filtros no retienen de manera eficiente los leucocitos depende de la calidad

del mismo y los porcentajes van del 0,3 al 2.7% ( 20 ) ; Darrelly., 2001 verificó la

incapacidad de los filtros para remover de los sobrenadantes plaquetarios

citoquinas IL-1, IL-6 y TNF las cuales causan reacciones febriles en el huésped.

Al analizar el costo derivado de la utilización de filtros para la reducción

leucocitaria, se encontró que este supera en cuatro veces aproximadamente el

valor de la transfusión plaquetaria sin filtros, dato similar a los estudios de

Kaplan,1997 (8). El análisis de Costo / efectividad de los métodos utilizados debe

ser reevaluado para establecer un mejor manejo en los pacientes, y establecer si

los beneficios clínicos y sociales superan los costos de implementación

tecnológica.

Los resultados obtenidos no permitieron realizar conclusiones sobre el uso o no de

los filtros a nivel de refractariedad.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS

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CARACTERISTICA GRUPO SIN

FILTRO (n=42)

GRUPO CON

FILTRO (n=41)

SEXO

FEMENINO 26 24

MASCULINO 16 17

DIAGNOSTICO

Leucemia Linfoide Aguda 28 38

Leucmia Mieloide Aguda 8 2

Aplasia Medular 1 0

Linfoma Hodgkin 1 1

Linfoma No Hodgkin 1 1

Sarcoma Blastico 1 0

ORDEN DE TRANSFUSION

Terapeutica(Sin sangrado) 21 26

Sangrado leve 12 9

Sangrado moderado 4 4

Sangrado severo 5 2

Tabla 1. Características del grupo de estudio que muestra la distribución por

sexo, diagnostico, y objetivo de la transfusión .

SANZ ET AL.

762 TRANSFUSION Volume 41, June 2001 www.transfusion.org

Failure of HLA-matched platelets to increase theposttransfusion platelet count is a major problemoccurring in 12 to 40 percent of HLA-alloim-munized patients who are receiving chronic plate-

let support.1 Although concomitant factors—such as fever,hypersplenism, or ABO incompatibility—usually accountfor the poor transfusion results, in some patients no obvi-ous reason can be found. This frequently raises the suspi-cion that platelet-specific antibodies can be present. Inves-tigation of such antibodies in the presence of HLAantibodies is difficult from the technical viewpoint. Chemi-cal removal of HLA molecules from the platelet surface,thereby allowing identification of platelet-specific antibod-ies by conventional serologic methods, often fails to achieveits goal and yields dubious or uninterpretable results. Onthe other hand, the MoAb immobilization of platelet anti-gens assay (MAIPA), that is the most appropriate assay inthis setting, is usually available only in reference immuno-hematology laboratories. In addition, there is a high degreeof uncertainty about the magnitude of the problem createdby platelet-specific antibodies. Thus, while for some au-thors platelet-specific antibodies constitute a frequent find-ing in multiply transfused patients, with prevalence ratesranging from 15 percent to 36 percent,2-4 for others, such an-

Platelet-specific antibodies in HLA-immunizedpatients receiving chronic platelet support

Cristina Sanz, Carolina Freire, Inaki Alcorta, Antonio Ordinas, and Arturo Pereira

BACKGROUND : In HLA-alloimmunized patients, the un-expected failure of HLA-matched platelet transfusionsusually raises the suspicion about concomitant platelet-specific antibodies. As the reported frequency of plate-let-specific antibodies in multitransfused patients varieswidely, the aim of this study was to determine the preva-lence of such antibodies in a population of chronicthrombocytopenic patients with HLA antibodies.STUDY DESIGN AND METHODS: From 1985 to 1997,11,777 determinations of HLA antibodies were per-formed in 1330 hematologic patients receiving chronicplatelet support. Fifty-two patients with HLA alloimmu-nization that lasted more than 1 month were selected.The search for platelet-specific antibodies was per-formed by using a monoclonal antibody immobilizationof platelet antigens assay, thus allowing the identificationof platelet-specific antibodies directed against the plate-let glycoproteins (GP) Ib/IX, GPIIb/IIIa, and GPIa/IIa.Specificity of the platelet-specific antibodies was furtherinvestigated by using a solid-phase assay with chloro-quine-treated platelets.RESULTS: Only 2 (3.8%) of the 52 patients had platelet-specific antibodies. One antibody reacted with anepitope of the GPIIb/IIIa that was present in all the panelplatelets, and that probably was an autoantibody. Theother was an anti-HPA-5b.CONCLUSIONS: The prevalence of platelet-specific an-tibodies in patients with HLA alloimmunization is verysmall. The search for concomitant platelet-specific anti-bodies would be indicated only when other causes of re-fractoriness to HLA-matched platelets are ruled out.

ABBREVIATIONS: GP = platelet glycoprotein; LCT = microlym-

phocytotoxicity; MAIPA = monoclonal antibody immobilization

of platelet antigens.

From the Service of Hemotherapy and Hemostasis; and the

Augusto Pi i Sunyer Memorial Institute for Biomedical Research,

Hospital Clínic; and the Service of Hematology, Hospital San

Juan de Dios, Barcelona, Spain.

Address reprint requests to: Cristina Sanz, PhD, MD, Service

of Hemotherapy and Hemostasis, Hospital Clínic, Villarroel 170,

08036 Barcelona, Spain; e-mail: [email protected].

Supported in part by Grant FIS 99/0464 from the Govern-

ment of Spain.

Received for publication August 29, 2000; revision received

November 24, 2000, and accepted December 5, 2000.

TRANSFUSION 2001;41:762-765.


PLATELET-SPECIFIC ANTIBODIES

Volume 41, June 2001 TRANSFUSION 763www.transfusion.org

tibodies are much less frequent, appearing in only 0 to 9percent5-8 of these patients.

The aim of the present study was to investigate theprevalence of platelet-specific antibodies in a large popu-lation of HLA-alloimmunized patients receiving chronicplatelet support because of marrow failure. The MAIPA wasused to reveal platelet-specific antibodies in the presenceof HLA antibodies.

MATERIALS AND METHODSIn the Hospital Clinic, hematologic patients receivingchronic platelet support are routinely screened at weeklyintervals for the presence of HLA antibodies. A standardcomplement-dependent microlymphocytotoxicity (LCT)assay using a panel of 18 to 24 selected donors carrying themost frequent HLA-A and HLA-B specificities is used. Fromthe mid-1980s onward, several aliquots of serum from eachpatient had been routinely stored frozen at –80°C. Thisstudy reviewed the LCT results of 1330 patients who weretested from 1985 to 1997 (11,777 determinations). Patientswere considered to be HLA alloimmunized when their se-rum reacted with more than 40 percent of the panel cellson two or more occasions, and the reactivity lasted for atleast 1 month. After review of the patients’ clinical records,positive results that could be ascribed to antithymocyteglobulin were rejected.

In patients with HLA antibodies, the concomitant pres-ence of platelet-specific antibodies was investigated byMAIPA. From each patient, at least two serum samplesseparated by 1 month or more were tested by MAIPA andLCT. The MAIPA was performed as described by Kiefel et al.9

The following monoclonal antibodies against platelet gly-coproteins (GP) were used: GR-P and FMC-25 againstGPIb/IX (respectively, a gift of Frederico Garrido, MD, PhD,Service of Immunology, Hospital Virgen de las Nieves,Granada, Spain; and purchased from Serotec, Oxford, En-gland), 962 and 672 against GPIIb/IIIa (both provided byRamón Vilella, MD, PhD, Service of Immunology, HospitalClínic, Barcelona, Spain), and Gi9, directed against theCD49b on GPIa/IIa (CLB, Amsterdam, Netherlands). Micro-titer plates were coated with goat anti-mouse IgG, Fc spe-cific, and capture of the immunocomplex was revealed byhorseradish peroxidase-conjugated goat anti-human IgG,Fc specific, antibody (both from Sigma-Aldrich, Madrid,Spain).

Specificity of the platelet-specific antibodies was fur-ther investigated by use of a solid-phase assay (Capture-PReady Screen, Immucor, Norcross, GA). Platelet monolay-ers on the kit plates were treated with chloroquine (20%chloroquine in saline buffered at pH 5, 200 µL per well for2 hours at 22°C, followed by four washes with PBS, pH 7.2).Sera with a high-titer, polyspecific, HLA antibody, withoutconcomitant platelet-specific antibodies, were tested in

parallel as control for an optimal removal of HLA antigensfrom the platelet monolayer surface.

Before 1992, transfused blood components were ob-tained from whole blood by preparation of platelet-richplasma. Since 1992, blood components have been preparedfrom buffy coat, so they were partially WBC-reduced. Theuse of filtered cellular blood components was circum-scribed to selected patients (those with a history of febriletransfusion reactions or recipients of CMV-negative marrowtransplants).

RESULTSFifty-two (3.9%) of the 1330 patients had HLA antibodies.The median age of these patients was 42 (range, 16-71)years; 35 (63.5%) were females. Clinical diagnoses at thetime of the HLA alloimmunization were marrow transplantin 34 patients, acute myeloid leukemia in 10 patients, non-Hodgkin’s lymphoma in 3 patients, myelodysplastic syn-dromes in 2 patients, severe marrow aplasia in 2 patients,and chronic myeloid leukemia in 1 patient. All patients hadbeen transfused repeatedly before HLA antibodies weredetected. In most cases, the HLA antibodies showed a broadspecificity, reacting with all the panel cells. In 7 patients, an-tibodies were directed against HLA-A2. Most patients withHLA antibodies of broad reactivity were refractory to ran-dom-donor platelet transfusions (5 patients no longer re-quired platelet transfusions). Eleven patients had severebleeding complications (cerebral hemorrhage in 10 andmassive gastrointestinal bleeding in one). Five of thesepatients died as a consequence of the hemorrhagic com-plications.

In the MAIPA, only two patients (3.8%) had platelet-specific antibodies. One antibody recognized an unidenti-fied epitope on the GPIIb/IIIa, and reacted with all the panelchloroquine-treated platelets in the solid-phase assay. Thepatient had acute myeloid leukemia and became refractoryto random-donor platelet transfusions and unmatchedsingle-donor platelets. She died of cerebral hemorrhagebefore HLA typing could be performed. The second anti-body was an anti-HPA-5b. The patient was a multiparouswoman with acute myeloid leukemia, and became refrac-tory to random-donor platelets while she was inpostremission chemotherapy. Good posttransfusion recov-eries were obtained by transfusing platelets from HLA-matched donors and two sons who were crossmatchcompatible on a solid-phase assay (Capture P).

DISCUSSION

As shown in the present study, HLA alloimmunization con-tinues to be a major clinical problem that causes significantmorbidity and mortality in those patients who requirechronic platelet support. Difficulties in finding HLA-com-

SANZ ET AL.


patible donors (or the concomitant presence of clinical fac-tors that reduce the posttransfusion recovery of HLA-matched platelets) contribute to an increase in the clinicalimpact of HLA alloimmunization. In addition, even in theabsence of such clinical factors, well-matched platelets arehighly variable in their efficacy to increase the posttrans-fusion platelet count.1 Platelet-specific antibodies may alsoaccount for the poor posttransfusion recoveries, and con-cern about the presence of such antibodies frequentlyarises when HLA-matched platelets fail unexpectedly toincrease the platelet count.

In a previous study, no case of platelet-specific anti-bodies was found among patients who were refractory toplatelet transfusion and had not developed HLA antibod-ies.10 However, patients with HLA antibodies seem to bemore prone to develop platelet-specific antibodies. In fact,transfusion-induced platelet-specific antibodies have beenfound nearly exclusively in HLA-alloimmunized patients,in whom they appear in close temporal relationship withthe HLA antibodies.6,11 Therefore, the present study focuseson a selected population of patients with HLA alloim-munization. To rule out both passively transferred HLAantibodies and vanishing HLA immunizations, only casesin which the lymphocytotoxic antibodies lasted for at least1 month were selected. In order to detect platelet-specificantibodies that might have not appeared at the same timeas HLA antibodies, at least two serum samples collected 1month apart were tested from each patient.

Only two cases of platelet-specific antibodies werefound in a group of 52 HLA-alloimmunized patients whowere seen in a large hematology unit over 12 years. One casewas a panreactive antibody, without a definite specificity,and it probably was a platelet autoantibody; the other casewas an anti-HPA-5b. These results are in accordance withwhat can be expected from the phenotype frequency ofHPA antigens, and also with the low prevalence of HPA im-munization after pregnancy. For instance, because theprevalence of HPA-1a antibodies after pregnancy is 0.1 per-cent,12 the probability of finding at least one such alloim-munization among 52 individuals is only 5 percent. Theresults also agree with the findings of Novotny et al.,13 whofound platelet-specific antibodies in only 2.6 percent of 229multitransfused patients. In contrast, other authors havefound a higher frequency of platelet-specific antibodies.Restricting the review to studies in which MAIPA was used,the prevalence of platelet-specific antibodies in HLA-alloimmunized, multiply transfused patients ranged from5.5 percent to 20 percent.6,7,14 Panreactive and undefinedplatelet antibodies, such as those found in the current study,were not rare among these alloimmunizations, as they ac-counted for 14 of the 23 platelet-specific antibodies foundin three large series.8,13,14 When a definite HPA specificitywas found, the most frequently involved ones were HPA-1band HPA-5b, in contrast with what occurs in neonatal

alloimmune thrombocytopenia, where most cases arecaused by HPA-1a and HPA-5b antibodies.15 The reason forthis discrepancy is not apparent. It is possible that differ-ences in the mechanisms of immune response after bloodtransfusion, in comparison with pregnancy, may accountfor the above discrepancy. Alternatively, as most of theplatelet-specific antibodies associated with HLA alloim-munization described up to now were found in series ofpatients from central Europe, a genetic predispositioncould be entertained. This might explain the observed dif-ferences in both the prevalence and the involved specifici-ties of platelet-specific antibodies. In fact, such a geneticpredisposition has been described for the immune re-sponse against HPA-1a, closely related to HLA-DRw52a,16

and HPA-5b, associated with HLA-DR6.17,18 Furthermore,studies on multiply-transfused patients from the UnitedStates6 and the Netherlands,13 for instance, have found ahigher incidence of HPA-1a antibodies than that reportedfor patients from central Europe.8,14,19 Serum samples fromsome of the patients in the current report had been storedfrozen for a long time, and this might have decreased thereactivity of platelet antibodies. However, HLA antibodiesin these sera reacted in LCT as strongly as they did beforestorage, and some of the control sera with platelet antibod-ies that were run in parallel with the patients’ samples inMAIPA had also been stored frozen for more than 10 years.

In conclusion, the results show that in Spain, platelet-specific antibodies are rare in HLA-alloimmunized patientswho receive chronic platelet support. Consequently, whenHLA-matched platelets fail to increase the platelet count inthese patients, other factors potentially accounting for thepoor transfusion result should be investigated first.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors are indebted to Ana Ribera, MD, PhD and Francisco

Parra, MD, PhD from the Banc de Sang i Teixits del ICS

(Barcelona, Spain) for providing some of the anti-HPA sera that

were used as controls and also for typing the platelets used in

MAIPA.

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Platelet Transfusion Therapy

Sherrill J. Slichter, MDa,b,*aPuget Sound Blood Center, 921 Terry Avenue, Seattle, WA 98104-1256, USAbUniversity of Washington School of Medicine, Seattle, WA, USA

Statistics on blood product usage in the United States are often reportedseveral years after the data are generated. The latest nationwide statisticsfrom the National Blood Data Resource Center are for 1999. Platelet

transfusions totaled approximately 9 million concentrate equivalents; ie, oneapheresis collection was considered equivalent to six pooled random donorplatelet concentrates [1]. Compared with 1997, the total number of plateletunits transfused was unchanged, but single donor apheresis platelet useincreased by 6.7%, while platelets prepared from whole blood (platelet concen-trates) decreased by 10.6%.

A major focus of this article will be on providing guidelines for the appropri-ate use of platelet transfusions to reduce unnecessary transfusions, therebyavoiding transfusion-related risks to the patients as well as the costs of platelettherapy. The costs of platelet therapy for the long-term support of patients whohave hypoproliferative thrombocytopenia are substantial. For example, thecosts of platelet therapy for acute myelogenous leukemia (AML) patientsreceiving chemotherapy ranged between $11,406 and $13,016 [2], and they av-eraged $4,000 for patients having an autologous peripheral blood stem celltransplant versus $11,000 for those having an allogeneic bone marrow trans-plant [3]. Up to 20% of thrombocytopenic patients may become refractory toplatelet transfusions, and this may double the costs of their platelet therapy [4].

PLATELET PRODUCTS AVAILABLE FOR TRANSFUSIONPlatelets are obtained by two different methods; ie, preparing platelet concen-trates from donated units of whole blood, and by platelet apheresis procedures.

Platelet Concentrates from Whole BloodPlatelet concentrates can be isolated from donated units of whole blood usingtwo different methods as outlined in Fig. 1. These are referred to as the platelet-rich plasma method (PRP) [5], and the buffy coat method (BC) [6]. The PRPmethod is used exclusively in the United States, whereas the BC method is the

*Puget Sound Blood Center, 921 Terry Avenue, Seattle, WA 98104-1256. E-mail address:[email protected]

0889-8588/07/$ – see front matter ª 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.doi:10.1016/j.hoc.2007.06.010 hemonc.theclinics.com

Hematol Oncol Clin N Am 21 (2007) 697–729

HEMATOLOGY/ONCOLOGY CLINICSOF NORTH AMERICA

mailto:[email protected]

698 SLICHTER

predominant method of platelet preparation in Europe, and Canada is convert-ing to the BC method. Comparative studies have shown no differences in thequality of these platelet concentrates when they are stored for up to 5 days[7,8]. However, there are several advantages to the BC platelet preparation sys-tem: (1) preparation can be fully automated; (2) platelets can be prepared fromwhole blood up to 24 hours from collection rather than requiring platelet prep-aration within 6 hours of donation as is mandated for PRP platelet concen-trates, which allows blood collected at distant sites to be transported toa processing center and permits platelets to be prepared on a single ratherthan multiple shifts; (3) platelets are routinely prestorage pooled allowing rapidplatelet release from the production facility; (4) residual white blood cell(WBC) count is less than for PRP platelets; (5) pooled platelets are usuallystored in additive solution rather than plasma making more plasma availablefor other purposes; and (6) with storage of platelets beyond the current 5days, platelet viability may be better maintained in BC rather than PRP con-centrates [9,10]. There is emerging evidence that, when platelets are storedbeyond 5 days, the method of platelet collection and the storage media influ-ences posttransfusion platelet viability [11,12]. The hard-spinning of the plate-lets against a red cell layer in the BC method versus against the bottom of the

Whole blood

Hard spin

Remove supernatant PPP

Remove buffy coat

Pool 4-6 buffy coats

Soft spin

Remove and store supernatant pooled BC

platelet concentrates in a storage bag

BC Platelet Concentrate

(European System)

PRP Platelet Concentrate

(U.S. System)

Whole blood

Soft spin

Remove supernatant PRP to a storage bag

Hard spin PRP

Remove most of the supernatant PPP

Re-suspend packed platelets in residual plasma

Retain and store individual platelet concentrates

TWO METHODS OF PREPARING AND STORING

PLATELET CONCENTRATES FROM WHOLE BLOOD

PRP=Platelet-rich plasma.

PPP=Platelet-poor plasma.

Fig. 1. Preparation of platelet concentrates from whole blood. Two methods of preparingplatelet concentrates from whole blood have been described. The main differences are relatedto the centrifugation steps that are used, proceeding from whole blood to a platelet concen-trate. Specific details of the methods are described in [5] for PRP platelet concentrates andin [6] for BC platelet concentrates.

699PLATELET TRANSFUSION THERAPY

bag in the PRP method requiring resuspension of the platelets may compro-mise the long-term storage of PRP platelets compared with BC platelets.

Apheresis PlateletsThe major advantage of apheresis platelets is that enough platelets can be col-lected from a single donor to constitute a transfusion dose. In contrast, toobtain an equivalent number of platelets requires pooling four to six wholeblood-derived platelet concentrates.

The reduction in donor exposures by using apheresis platelets has the poten-tial advantages of reducing transfusion-transmitted infections and the incidenceof platelet alloimmunization. However, the current tests for detecting viraltransmission by transfusion have reduced the infectious risk/donor exposureto very low levels [13]. The bacterial risk associated with platelet transfusionsis high because platelets are stored at 22�C rather than at 4�C as are red cells.Some studies have suggested a reduction in bacterial transmission by transfu-sion with the use of single-donor platelets [14]. However, the American Asso-ciation of Blood Banks (AABB) has recently mandated testing of all plateletproducts for bacteria [15], which should reduce this potential advantage ofsingle-donor platelets versus pooled random-donor platelets.

Concerning prevention of platelet alloimmunization, there is no benefit of us-ing leukoreduced single donor platelets compared with leukoreduced pooledrandom donor platelets [16]. There is a substantial increase in costs for singledonor compared with pooled random donor platelets [17]. In addition, thereare some risks to the donor during platelet apheresis procedures [18]. As thequality of apheresis platelets is similar to pooled random donor platelet concen-trates [19], these two products can be used interchangeably based on availabil-ity and cost considerations [20].

LeukoreductionThere are clear indications forproviding leukoreduced platelet products: (1) reduc-tion of platelet alloimmunization rates [16]; (2) prevention of cytomegalovirus-transmission by transfusion [21]; and (3) reduction in febrile transfusion reactions[22]. In addition, there are studies that suggest that white cells that contaminateplatelet and red cell transfusions may contribute to possible immunomodulatoryeffects of transfusion such as an increased incidence of postoperative infectionsand metastasis formation in cancer patients [23]. However, a great deal of contro-versy still surrounds whether transfusions have immunomodulatory effects [24].

Another controversial issue is universal leukoreduction [25]. In spite of theincreased costs associated with leukoreduction and a loss of up to 25% ofthe platelets [26], many countries, organizations, and individual blood centersand hospitals have instituted universal leukoreduction of the blood supplyrather than limit leukoreduction to only the established indications.

Gamma (c)-IrradiationGamma-irradiation of platelets is indicated to prevent transfusion-related graft-versus-host disease (GVHD), which is uniformly fatal [27]. Gamma-irradiation

700 SLICHTER

with the usual dose of 25 Gy in one study did not effect either posttransfusionplatelet survival or function [28]. However, in a more recent transfusion studyin thrombocytopenic patients, c-irradiation decreased 1-hour posttransfusionincrements by 2800 platelets/lL and showed an increased hazard ratio of1.45 for the development of platelet refractoriness [29]. Furthermore, in unpub-lished observations from the TRAP Trial [16], c-irradiation prolonged the du-ration of HLA alloantibodies in patients who developed these antibodiesduring the course of the transfusion. Therefore, indiscriminate use of c-irradi-ation should be avoided.

Proven situations where c-irradiation should be performed are for patientsreceiving allogeneic stem cell transplants and for patients who are severelyimmunocompromised usually because of their disease or its treatment (eg, pa-tients who have Hodgkins disease or other lymphomas) [27].

Volume ReductionFor some patients who are receiving large volumes of fluids where consider-ation of intravenous line availability is an issue, who are volume overloaded,or for infants/young children where an adult volume may be excessive, volumereduction of platelets before transfusion is a consideration. Fortunately, formost children, volume reduction is often unnecessary [30]. Whenever plateletsare concentrated by centrifugation, there is likely to be some damage to theplatelets, resuspension is often incomplete, and, therefore, this extra processingshould only be done if really necessary for patient care [31].

Extended Stored PlateletsIn 1984, the storage time of platelets was extended from 5 days to 7 days. How-ever, because of increased reports of bacterial transmission by platelet transfu-sion, in 1986 the Food and Drug Administration (FDA) reduced plateletstorage time back to 5 days. Two recent studies have demonstrated the post-transfusion quality of 7- and 8-day stored apheresis platelets using radiolabeledautologous platelet recovery and survival measurements in healthy volunteers[32,33]. Recent studies have documented the quality of platelet concentratesalso stored for 7 days [12], but the FDA has not yet licensed extended storedplatelet concentrates.

As platelets have an in vivo lifespan of only 9 to 10 days—as documented byautologous radiolabeled platelet survival measurements in healthy volunteers[34], there has been concern about how long platelets might be able to be storedin vitro. Fortunately, platelet viability is better maintained in vitro than in vivo[35]. In some circumstances, platelet viability may be better preserved in addi-tive solutions than in plasma, and radiolabeled platelet viability studies inhealthy volunteers [11] as well as transfusion experiments in thrombocytopenicpatients [10] have suggested platelet storage times of at least 13 days may bepossible. As most bacteria grow to confluence by 4 to 5 days [36], extendingplatelet storage times for as long as quality is maintained should not representany increased infectious risk to platelet recipients.


EXPECTED RESPONSE TO TRANSFUSED PLATELETSThere are three parameters that are evaluated after a platelet transfusion todetermine efficacy. How many of the transfused platelets circulate immediatelyafter transfusion, what is the interval to the next transfusion, and have thetransfused platelets either prevented or controlled any active bleeding.

Immediate Posttransfusion Platelet ResponseNormally, about one third of the platelets released from the bone marrow ortransfused are pooled in the spleen [37]. In patients who are asplenic, over90% of the transfused platelets circulate, and, in patients who have hypersplen-ism, platelet recovery is reduced proportional to the size of the spleen. There-fore, to achieve a desired posttransfusion platelet increment, fewer platelets arerequired in asplenic patients compared with those who have hypersplenism.

There are several methods of determining the initial response to a platelettransfusion: (1) determine the posttransfusion platelet count—values drawnwithin 10 to 60 minutes posttransfusion give equivalent results [38]; (2) assessthe platelet increment that is the posttransfusion platelet count minus the pre-transfusion platelet count—the daily morning platelet count is routinely used asthe pretransfusion platelet count regardless of how long after this count isdrawn the platelets are actually transfused; (3) determine the percent recoveryof the transfused platelets (PPR); or (4) calculate the corrected count increment(CCI). The latter two determinations are calculated by the following formulas,and both require knowledge of the number of platelets transfused and an esti-mate of the patient’s blood volume.

PPR ¼ ðPlatelet Increment=lLÞ � ðWeight in Kg� 75mLÞðPlatelet Count of Product=lLÞðVolume of Platelets in mLÞ

� 100

CCI ¼ ðPlatelet Increment=lLÞ � ðBody Surface Area in Square MetersÞNumber of Platelets Transfused

�� 1011

�

Because clinicians usually do not know the number of platelets transfusedand because estimates of blood volume are often unreliable, the platelet incre-ment is considered a more reliable measure of immediate posttransfusion plate-let response than either the PPR or CCI [39].

On average, a platelet concentrate contains 8 � 1010 platelets (FDA requiresa minimum of 5.5 � 1010 platelets/concentrate), and an apheresis collectioncontains an average of 4.2 � 1011 platelets (FDA requires a minimum of3.0 � 1011 platelets/apheresis collection) [40]. The usual dose of pooled plate-lets is four to six concentrates per transfusion. Based on these average values,one platelet concentrate should increase the 1-hour posttransfusion plateletcount by 7000 to 10,000 platelets/lL in a 75-kg man. The usual dose of pooledplatelets or an apheresis collection will produce a CCI of 10,000 to 20,000

702 SLICHTER

(median 15,000). Platelet recoveries in thrombocytopenic patients average60% � 15% [34].

Days to Next TransfusionThe days to next transfusion (ie, the platelet survival time following transfu-sion) is directly related to the patient’s posttransfusion platelet count (Fig. 2)[34]. Platelets are lost from circulation by two mechanisms: (1) senescencewith a maximum platelet life span of 10.5 days; and (2) a fixed fraction of plate-lets amounting to 7100 platelets/lL/day are removed randomly. The latterplatelet loss becomes an ever-increasing proportion of the platelets that areremoved as the platelet count decreases. This fixed platelet loss is consideredto reflect the number of platelets needed on a daily basis to maintain endothe-lial integrity by preventing blood loss at endothelial cell junctures. Of substan-tial interest was the observation that there are progressive decreases in bothplatelet increments at 1 hour and 18 to 24 hours posttransfusion as well asin days to next transfusion with increasing numbers of platelet transfusions(Fig. 3A) [29]. These changes were observed even in the absence of platelet al-loimmunization (Fig. 3B). There appeared to be a logarithmic decrease in plate-let response with the most pronounced effect occurring with the earliesttransfusions. The reasons for these effects are not apparent but may be relatedto endothelial damage as a result of the patient’s induction therapy for AML.

0

2

4

6

8

10

0 100 200 300 400 500

Platelet S

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e (D

ays)

Platelet Count (platelets/ L × 103)

Fig. 2. Relationship between platelet count and platelet survival. Relationship between plate-let count and the survival of autologous (closed symbols) and donor (open symbols) 51Cr-la-beled platelets in normal and thrombocytopenic subjects who have no evidence ofhypersplenism (circles). Complications included splenectomy (squares), splenomegaly (trian-gles), and prior transfusions (diamonds). At platelet counts of <100 � 103/lL, there is a directrelationship between the platelet count and the platelet survival. (Reprinted from Hanson SR,Slichter SJ. Platelet kinetics in patients with bone marrow hypoplasia: evidence for a fixedplatelet requirement. Blood 1985;56:1105–9; with permission. Copyright ª 1985, the Amer-ican Society of Hematology.)


155

0

5

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Platelet Transfusion Number

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D

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Platelet Transfusion Number

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L)

Mean

P

latelet In

crem

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10

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L)

Fig. 3. Relationship between number of platelet transfusions and platelet increments at 1 hourand 18 to 24 hours after transfusion and days-to-next transfusion. (A) The mean 1-hour post-transfusion platelet increments are plotted for the first 25 transfusions given to all study patients.These data represent 6334 transfusions given to 533 patients (closed circles). Similar data forthe 18- to 24-hour posttransfusion platelet increments are shown for 5555 transfusions given to531 patients (open circles). Data for days-to-next transfusion for 5955 transfusions given to530 patients (closed triangles). (B) When the same analyses are plotted for only lymphocyto-toxic antibody-negative patients, the results are similar. One-hour increments for 5484 transfu-sions given to 477 patients (closed circles), 18- to 24-hour increments for 4833 transfusionsgiven to 475 patients (open circles), and days to next transfusion for 5144 transfusions givento 474 patients (closed triangles). Dotted lines are best fit of the data for 1-hour posttransfusionincrements; dashed lines, for 24-hour posttransfusion increments; and solid lines for days-to-next transfusion. (Reprinted from Slichter SJ, Davis K, Enright H, et al. Factors affecting post-transfusion platelet increments, platelet refractoriness, and platelet transfusion intervals inthrombocytopenic patients. Blood 2005;105:4106–14; with permission. Copyright ª2005, the American Society of Hematology.)

704 SLICHTER

HemostasisThe most relevant aspect of platelet transfusion therapy is whether the plateletshave been able to prevent the onset of bleeding in severely thrombocytopenicpatients or control bleeding in patients who have significant blood loss. In thepast, the FDA has licensed platelets for transfusion based on in vitro measure-ments of platelet function, biochemistry, and metabolism along with document-ing adequate posttransfusion platelet recoveries and survivals. However, withsignificant changes in platelet preparation and storage conditions, they arerequiring documentation of hemostasis following transfusion [41]. Hemostasiscan be demonstrated using three different techniques: (1) observational assess-ments of patients’ bleeding status [42]; (2) documenting the relationship betweenbleeding times and platelet count [43,44]; and (3) measuring radiolabeled stoolblood loss [45]. The most common clinical method of documenting hemostasisis by using the World Health Organization (WHO) Bleeding Scale [42].

Clinical assessment of bleedingWHO Grade 0 is no evidence of bleeding; WHO Grade 1 is the mildest formof bleeding characterized by petechia, ecchymosis, mucosal bleeding, or retinalbleeding without visual impairment; WHO Grade 2 is gross bleeding includingmelena, hematemesis, hematuria, or hemoptysis; WHO Grade 3 includes anybleeding that requires a red cell transfusion; and WHO Grade 4 bleedingincludes retinal bleeds with visual impairment, cerebral bleeds associatedwith morbidity, and fatal bleeds. Most clinicians consider platelet transfusionsare indicated to prevent an increase in bleeding for those patients who developWHO bleeding grades of �2, but not for Grade 1 bleeding.

Relationship between bleeding time and platelet countThere is a direct inverse relationship between bleeding time and platelet countat platelet counts between 20,000/lL and 100,000/lL (Fig. 4) [43]. This rela-tionship has been used to document the function of transfused human plateletsboth in patients [43] and in a thrombocytopenic rabbit model [44]. In patients,the bleeding time can be predicted by the equation:

Bleeding Time ðMinutesÞ ¼ 30:5�

Platelet Count� 109=L3:85

!

Stool blood lossAnother method of documenting bleeding is by means of stool blood loss mea-surements. In 20 stable aplastic thrombocytopenic patients on no medicationsand not receiving platelet transfusions, a small blood sample was drawn to per-mit labeling of their red cells with 51Chromium [45]. After re-infusion of theirradiolabeled red cells, a blood sample was drawn daily from the patients, and24-hour stool collections were obtained. Thus, knowing the radioactivity permilliliter of blood on each study day and the amount of radioactivity presentin daily stool collections, it was possible to determine the milliliters of blood


lost per day in the stool. Study duration averaged 8.4 � 3.9 days with a rangeof 4 to 16 days. It was presumed that these stool blood loss studies would pro-vide an assessment of blood loss through the intact vasculature of the gastroin-testinal (GI) track and might also be reflective of the potential for bleedingelsewhere. Fig. 5 shows the relationship between platelet count and stool bloodloss. At platelet counts of >10,000/lL, stool blood loss was no different thanvalues found in normal subjects (ie, <5 mL/day). At platelet counts between5000 and 10,000/lL, stool blood loss was only slightly increased above normal(9 � 7 mL/day). However, at platelet counts of <5000/lL, stool blood loss wasmarkedly elevated in all patients (50 � 20 mL/day).

ADVERSE CLINICAL EVENTS ASSOCIATED WITH PLATELETTRANSFUSIONS AND THEIR PREVENTIONPlatelet transfusions can be associated with numerous adverse events that maybe related to the transfusion of any blood product (eg, volume overload, viraltransmission, transfusion-related acute lung injury, allergic reactions). In thissection, discussion will be focused on two adverse events that are either rela-tively unique to platelet transfusions or are commonly associated with platelettransfusions: (1) bacterial transmission; and (2) nonhemolytic transfusionreactions.

Bacterial Transmission by TransfusionBacterial testingWith the institution of a variety of assays to detect viruses that may be transmittedby transfusion, the major residual infectious risk is bacterial transmission bytransfusion [46]. This risk is particularly relevant for platelet transfusions asthey are stored at room temperature (22�C) rather than at 4�C as are red cells.

0

5

10

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0 10 20 30 40 60

Bleeding Time (Min)

Platelet C

ou

nt (×

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L)

Fig. 4. Inverse relationship of bleeding time to circulating platelet count in patients who havethrombocytopenia on the basis of impaired production when the concentration of platelets isbetween 10,000 and 100,000 per lL. The regression line is shown by the solid line, and95% confidence limits are indicated by the shaded area. (Reprinted from Harker LA, SlichterSJ. The bleeding time as a screening test for evaluating platelet function. N Engl J Med1972;287:155–9; with permission. Copyright ª 1972, Massachusetts Medical Society.)

706 SLICHTER

Bacterial contamination is usually related to inadequate sterilization of the vena-puncture site or asymptomatic bacteremia in the donor. Of the two causes, inad-equate sterilization is much more common. It has been estimated that 1 in 2000 to3000 platelet concentrates are contaminated with bacteria and that 1 in 5000 ofthese transfusions results in sepsis [46]. Efforts to reduce the incidence of bacterialcontamination have involved improvements in skin sterilization techniques [47],diverting the initial 10 mL of blood drawn to remove the skin plug [48] and bac-terial detection [49,50], Bacterial testing of all platelet products has been man-dated in the United States by the AABB [15]. This has substantially increasedthe use of apheresis platelets because the cost of testing an apheresis donation ver-sus testing individual platelet concentrates is significant. This situation will beresolved with the availability of prestorage pooled platelet concentrates so thatplatelet pools can be bacterially tested rather than testing individual platelet con-centrates [51]. The currently available bacterial tests are culture based requiringtime to obtain a positive result. What is needed are bacterial tests that can be rap-idly performed just before platelet release, and these tests are under developmentby several manufacturers.

Pathogen reductionAn alternative to preventing both viral and bacterial transmission by transfu-sion is pathogen reduction. There are currently two procedures being

20

5 10 15 20 25

40

60

80

100

Platelet Count / L × 103

Sto

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L

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L/d

ay)

Fig. 5. Stool blood loss as a measure of thrombocytopenic bleeding. When stool blood loss(expressed as milliliters of blood/day) was determined in 20 aplastic thrombocytopenicpatients (C), blood loss was <5 mL/day at platelet counts of >10,000/lL; at platelet countsbetween 5000/lL and 10,000/lL, blood loss averaged 9 � 7 mL/day; and at platelet countsof <5000/lL, blood loss was markedly elevated at 50 � 20 mL/day. (Adapted from SlichterSJ, Harker LA. Thrombocytopenia: mechanisms and management of defects in platelet produc-tion. Clin Haematol 1978;7:523–9; with permission.)


evaluated, and both are based on adding a compound to platelets—either Amo-tosalen HCl or Riboflavin – followed by exposing the platelets to UV-A lightthat activates these compounds preventing replication of viruses and bacteria[52,53]. One of these procedures has been licensed in Europe [52], but neitherhave been approved by the FDA for use in the United States. In addition, there isevidence that UV-A exposure—using either technique of pathogen reduction—induces damage to the platelets [54,55]. In clinical trials with AmotosalenHCl and UV-A irradiation, both posttransfusion platelet increments and inter-val to next transfusion were reduced compared with nonirradiated platelets.This resulted in the use of about 25% more platelets in patients enrolled inthe treatment arm compared with the control arm [56]. However, the hemo-static efficacy of the treated platelets was comparable to the control platelets[56,57].

Nonhemolytic Transfusion Reactions (NHTR)These reactions are more common following platelet transfusions than otherblood products. These reactions can vary from mild urticaria and fever/chillsto severe anaphylactic shock [58]. They are considered to be caused by whitecells that are present in the platelets and/or cytokines that are released fromwhite cells or platelets during storage [59]. Prevention of NHTR has beendocumented to be decreased by prestorage leukoreduction or plasma removal[22]. However, centrifugation of platelets to remove plasma leads to loss ofplatelets and requires re-suspension of platelets. In addition, the remainingplatelets may have lost viability and/or function because of the additional cen-trifugation [30,31]. Even with these procedures, not all NHTR are preventable.

PREVENTION OF PLATELET ALLOIMMUNIZATIONABO CompatibilityA and B red cell antigens are expressed on platelets, and ABO-incompatibleplatelets have reduced posttransfusion platelet recoveries but normal survivals[60]. ABO-compatible (ie, the donor has no A or B antigens incompatible withthe recipient’s A or B antibodies) allogeneic donor platelets have average plate-let recoveries of 63% the same as autologous platelets, while A, B, or AB plate-lets given to an O recipient have average recoveries of 19%, 57%, and 8%,respectively. It was considered that the lower recoveries of A or AB comparedwith B platelets in O recipients were related to the higher titer of A antibodiescompared with B antibodies in O recipients. These data emphasize the impor-tance of ABO compatibility on initial platelet recoveries.

A study in 1990 demonstrated the importance of ABO compatibility on ratesof platelet refractoriness and alloimmunization (Table 1) [61]. Recipients ofABO mismatched platelets increased their anti-A or -B titers depending onthe incompatibility of the platelets they received. However, recipients ofABO-incompatible platelets also become platelet refractory at a higher ratethan the ABO-compatible recipients (69% versus 8%, respectively, P ¼ .001)because of the concurrent development of anti-HLA and platelet-specific

Table 1Refractoriness versus mismatched platelets

New antibodies

Platelet transf let transfusionsb Platelet refractorinessc Anti A/Bd Anti-HLAPlatelet-specific

ABO matched –9) 1 (8%) 0 1 (8%) 1 (8%)ABO

mismatched–30) 9 (69%) 7 (54%) 5 (38%) 4 (31%)

P value 0.001aPossible priorbMedian (rangcOne-hour postdA � 3 doublinData from Carr ets leads to early platelet refractoriness. Br J Haematol 1990;75:408–13.

70

8SLIC

HTER

and alloimmunization rates after transfusing ABO matched

usions Enrolled Female patientsPossible priorsensitizationa Plate

13 10 (77%) 9 (69%) 7 (513 2 (15%) 4 (31%) 9 (4

sensitization after pregnancy/transfusion.e).transfusion CCI < 4500.g dilution increase over their baseline.R, Hutton JL, Jenkins JA, et al. Transfusion of ABO-mismatched platel


alloantibodies. The authors postulated that transfusion of ABO-incompatibleplatelets also stimulated the recipients’ immune systems to make other alloan-tibodies. Therefore, providing ABO-compatible platelets is important both toachieve the best posttransfusion platelet increments but also to reduce the inci-dence of alloimmune platelet refractoriness.

Platelet Modification—Leukoreduction or UV-B IrradiationIt has been well documented that alloantigen recognition requires the expres-sion of both Class I and Class II HLA-antigens on the surface of transfusedcells. Platelets (in contrast to white cells) express only Class I but not ClassII HLA-antigens [62]. Early animal studies first demonstrated that leukore-duced platelets were able to markedly reduce the incidence of alloimmunization[63]. Besides removing the alloimmunizing white cells by filtration leukoreduc-tion, it is also possible to inactivate white cells using UV-B irradiation ofplatelets [64].

Several prospective randomized platelet transfusion trials have clearly docu-mented the effectiveness of transfusing leukoreduced platelets and red cells ascompared with standard blood products (control) in preventing the develop-ment of HLA-antibodies (Table 2) [16,65–71]. The largest of these trials [16]made several other observations of significant interest: (1) UV-B irradiationof platelets was as effective as leukoreduction in preventing platelet alloimmu-nization; (2) there was no additional advantage of giving single-donor leukore-duced platelets compared with leukoreduced pooled random-donor platelets,the rates of platelet alloimmunization in both of these arms were the same;(3) leukoreduction or UV-B irradiation was beneficial even for patients whohad had prior antigen exposure by pregnancy or transfusion; (4) not allpatients who became alloimmunized developed platelet refractoriness; (5) the

Table 2Prospective randomized filter leukocyte-reduced prevention of platelet alloimmunizationtransfusion trials

Development of lymphocytotoxic antibodies

Authors Total no. patients Control (%) Leukocyte-reduced (%) P value

Schiffer et al [65] 56 42 20 .07Murphy et al [66] 50 48 16 <.02Sniecinski et al [67] 40 50 15 <.01Andreu et al [68] 69 31 12 <.05Oksanen et al [69] 31 26 13 NSvan Marwijk Kooy et al

[70]53 42 7 <.004

Williamson et al [71] 123 38 22 .07AML 53 63 31 .03TRAP Trial [16] 268 45 18 <.001

Data from Slichter SJ. Understanding the effects of different types of white cells on patient’s responses totransfusion: immunization versus tolerization. Vox Sang 2002;83(Suppl 1):421–4.

710 SLICHTER

residual rate of alloimmunization in the treated arms was 18% overall and re-mained at that rate even in a subset of patients who had no prior antigen ex-posure and who received all of their blood products appropriatelyleukoreduced or UV-B irradiated based on their randomization assignment;and (6) none of the platelet modifications prevented the development of plate-let-specific alloantibodies, and these antibodies were not predictive of plateletrefractoriness.

There remain several unanswered questions with regard to preventingplatelet alloimmunization. The actual effectiveness of the current methodsof leukoreduction to prevent platelet alloimmunization may very well be de-pendent on the immunocompetence of the patients transfused. With theexception of the study by Williamson and colleagues [71] that admitteda wide range of cancer patients, all the other prevention of platelet alloim-munization transfusion trials have evaluated leukoreduced blood products inpatients receiving induction chemotherapy for AML [16,65–70]. Interest-ingly, Williamson and colleagues [71] did not demonstrate a statisticallysignificant benefit of leukoreduction in patients who had solid tumors andwere receiving chemotherapy (although a trend was noted). Benefit wasshown only in the subset of patients who had AML and were receiving in-duction chemotherapy, similar to the results of the other trials. Thus,whether our current methods of leukoreduction will be proven effective inreducing platelet alloimmunization rates in patients who may be receivingpotentially less or no immunosuppressive therapy—as in cancer patientswho have solid tumors or in patients with aplastic anemia or myelodyspla-sia, respectively—remains to be determined [72].

As the rates of antibody development in the TRAP Trial [16] were substan-tially different from the rates of alloimmune platelet refractoriness, one mightquestion the cost-effectiveness of modifying platelets to prevent alloimmuniza-tion. HLA alloantibodies developed in 45% of the patients in the control armand in 17% to 21% of the patients in the treated arms, and this compares torates of alloimmune platelet refractoriness of only 13% and 3% to 5%, respec-tively. As many of the patients were no longer receiving platelet transfusionsby the time antibodies developed, platelet refractoriness could not be docu-mented. Therefore, the actual rates of alloimmune platelet refractorinessmay be higher than reported. HLA-antibodies may become important duringsubsequent courses of chemotherapy-induced thrombocytopenia but only ifthey are durable. However, it has been documented that HLA antibodiesmay not persist in up to 42% of patients even with continued transfusions[73].

Finally, there is some evidence from animal studies that prevention of plate-let alloimmunization may not just be related to a quantitative reduction in thenumber of transfused WBCs. Rather, it may be important to document bothwhat types of white cells are removed [74] and which ones remain [75]. It isknown that the types of white cells that are removed differ among filters andamong apheresis machines that produce in-process leukoreduction [76,77].


PLATELET TRANSFUSION THERAPYEvidence from early studies convincingly demonstrated that platelet transfu-sions were able to prevent bleeding in chronically thrombocytopenia patients[78,79].

Prophylactic Platelet TransfusionsThere are three aspects of prophylactic platelet transfusions that can be physi-cian controlled: (1) whether to provide prophylactic platelet transfusions tochronically thrombocytopenic patients; (2) what prophylactic platelet countshould initiate a platelet transfusion (ie, what is the appropriate platelet trans-fusion trigger); and (3) what dose of platelets should be used [80].

Are prophylactic platelet transfusions necessary?The first issue that has not yet been resolved and that awaits the results ofongoing trials is whether prophylactic platelet transfusions are indicated inchronically thrombocytopenic patients to prevent bleeding or whether anequally effective strategy would be to transfuse platelets only with the onsetof active bleeding. The latter strategy has been documented to be safe in a selectgroup of patients; ie, those undergoing autologous peripheral blood stem celltransplants [81]. In this study, the need for platelet transfusions was reducedby as much as 50% when transfusions were given only for active bleeding.

Identification of a safe and effective platelet transfusion triggerTwo early studies performed in chronically thrombocytopenic patients not re-ceiving platelet transfusions both suggested that significant spontaneous bleed-ing through an intact vascular system does not occur until the platelet count is�5000 platelets/lL (see Fig. 5) [45,82]. This fits with estimates of the daily lossof 7100 platelets/lL/day that are needed to maintain the integrity of the vesselwall [34].

Previously, a platelet count of �20,000/lL was considered to be an indica-tion for a prophylactic platelet transfusion. However, four randomized prospec-tive transfusion trials comparing prophylactic platelet transfusion triggers of10,000 platelets/lL versus 20,000 platelets/lL showed no differences in hemor-rhagic risks (Table 3) [83–86]. Because fewer platelet transfusions were used inthe lower trigger arm, cost-savings of 22% to 33% were achieved comparedwith patients in the higher trigger arm.

Because of concerns about achieving accurate platelet counts at very lowlevels, some clinicians have expressed concerns about reducing the transfusiontrigger to the 10,000 platelets/lL level [87]. However, newer methods of plate-let counting may alleviate these concerns [88]. Furthermore, some unnecessaryplatelet transfusions may be avoided by detecting the appearance of reticulatedplatelets that indicate marrow platelet recovery [89]. In addition, a stool bloodloss study using transfusion triggers of 5000, 10,000, or 20,000 platelets/lL wasperformed to alleviate concerns about adopting the 10,000 platelets/lL triggerif a 5000 platelets/lL trigger was found to be safe [90]. As can be seen fromTable 4, there was no difference in stool blood loss or red cell transfusion

TableRandom s/lL versus 20,000 platelets/lL

10,000 /lL Platelet transfusion trigger

Platelet transfusions

Units

No. ofpatients

r Majorbleeding(%)

Hemorrhagicdeaths Concentrates Apheresis

Transfusionsperpatient

RBCtransfusions

Costsavings Reference

78 17 0 10.2 � 11 5.9 [83]135 20 0 9.0 � 5.2 9.1 � 4.1 22% [84]58 17 0 25.4

(0–180)4.8

(0–33)8.3 (2–28) 33% [85]

37 0 11 (6–15) 10 (6–14) [86]

Major b volved bleeding requiring red cell transfusions.Dat rted as the median (ranges 25 to 75 percentile). Statistically significant improvements in the results

and co telets/lL trigger. If no statistical information is given, the results did not differ.aP <bP <cP <dP ¼

From S patients. Transfusion Medicine Reviews 2004;18:153–67; with permission.

3ized trials comparing prophylactic platelet transfusion ‘‘triggers’’ of 10,000 platelet

/lL Platelet transfusion trigger 20,000

Platelet transfusions

Units

Majorbleeding(%)

Hemorrhagicdeaths Concentrates Apheresis

Transfusionsperpatient

RBCtransfusions

Numbeofpatients

14 0 10.4 � 17 6.0 8122 1 7.1 � 4.6a 9.6 � 5.2 12018 0 15.4b

(0–152)3.0c

(0–16)7.3

(0–21)47

0 7d (5–11) 11 (8–14) 41

leeding was defined as more than petechia, ecchymosis, or epistaxis and usually ina for [83–85] are reported as the mean with ranges or � 1 SD. Data for [86] are repost savings are all in favor of the 10,000 platelets/lL compared with the 20,000 pla

.001.

.01.

.05..07.

lichter SJ. Relationship between platelet count and bleeding risk in thrombocytopenic


requirements in patients randomized to any of the study arms. However, themedian number of platelet transfusions given was progressively reduced inthe three arms from a median of 5.0 in the 20,000 platelets/lL arm to 3.5 inthe 10,000 platelets/lL arm and to 2.0 in the 5,000 platelets/lL arm. Stan-dard-setting groups both in the United States [91] and England [92] have rec-ommended the use of a 10,000 platelet/lL prophylactic platelet transfusiontrigger for all chronically thrombocytopenic patients due to chemotherapy,bone marrow transplantation, or to marrow conditions resulting in thrombocy-topenia such as aplasia or myelodysplasia.

Platelet doseAs opposed to the consensus that has been reached on the safety and efficacy ofa prophylactic platelet transfusion trigger of �10,000 platelets/lL, well-de-signed prospective studies to evaluate the effects of platelet dose on hemostasisand rates of platelet use are not available. The effects of platelet dose on trans-fusion outcomes has recently been reviewed [93]. All three prospective studiesevaluating posttransfusion platelet counts and interval-to-next transfusion havebeen performed by giving different doses of platelets to the same patient. Thesestudies showed both a greater increase in the posttransfusion platelet count aswell as a longer interval-to-next transfusion with higher compared with lowerdose platelet transfusions [94–96]. These results would have been predictedbased on the known relationship between platelet count and platelet survival[34]. However, these preliminary studies [94–96] did not address the clinicallyrelevant issue of outcomes when a patient receives repeated transfusions of thesame dose of platelets compared with other patients who are receiving a differ-ent dose. Theoretically, lower dose platelets should reduce the total number ofplatelets transfused, but would increase the frequency of transfusions [97]. Asthe major cost of a platelet transfusion is the platelets themselves (88% of thecost) [98], low-dose, frequent transfusions should be the most cost-effective

Table 4Stool blood loss and red blood cell transfusions in patients randomly assigned to receiveplatelet transfusions at platelet triggers of 5000, 10,000, or 20,000 platelets/lL

Stool blood loss (mL) RBC transfusions

Transfusiontrigger(platelets/lL) Patients Total

Per thrombocytopenicdaya Total

Per thrombocytopenicdaya

5000 31 111 � 29 11 � 2 4.1 � 0.6 0.4 � 0.0410,000 26 71 � 15 6 � 1 4.8 � 0.7 0.4 � 0.0420,000 24 136 � 53 10 � 3 5.5 � 1.0 0.4 � 0.05aData reported as average 1 � SE. Total stool blood loss divided by number of days platelet count�20,000/lL.Data from Slichter SJ, LeBlanc R, Jones MK, et al. Quantitative analysis of bleeding risk in cancer patientsprophylactically transfused at platelet counts of 5,000, 10,000, or 20,000 platelets/lL [abstract]. Blood1999;94(Suppl 1):376a.

714 SLICHTER

strategy as long as hemostasis is maintained. The issue of hemostasis is criticalas low-dose platelet transfusions will likely result in patients spending moretime at lower platelet counts. However, as hemostasis seems well-maintainedat platelet counts of �5000/lL, bleeding may not be an issue with low-doseplatelet transfusions. Although a low-dose platelet transfusion strategy maybe cost-effective for hospitalized patients who can be given frequent platelettransfusions at nominal cost, this may not be the case for outpatient platelettransfusion therapy. For outpatients, a better approach may be to give high-dose platelet transfusions that will reduce their transfusion frequency and,thereby, the number of required clinic visits. A large prospective randomizedclinical trial sponsored by the National Heart, Lung, and Blood Institute ofthe National Institutes of Health is ongoing comparing three platelet doses: me-dium dose of 2.2 � 1011 platelets/m2; low dose of 1.1 � 1011 platelets/m2 (onehalf the medium dose); and high dose of 4.4 � 1011 platelets/m2 (twice themedium dose) in hospitalized thrombocytopenic patients [99]. This trial shouldprovide definitive data on the most cost-effective dosing strategy for maintain-ing hemostasis while reducing platelet use rates.

Thrombopoietin adsorption by platelet transfusionsThrombopoietin (TPO) has been recognized as the major hematopoieticgrowth factor that stimulates platelet production [100]. TPO is constitutivelymade in the liver at a constant rate. TPO binds to its ligand (Mpl) on the sur-face of platelets and megakaryocytes. In the absence of either megakaryocytesor platelets, TPO levels rise. It had been anticipated that the administration ofTPO would both shorten the duration of thrombocytopenia and decrease theneed for platelet transfusions in hematologic/oncologic thrombocytopenicpatients. This has been the case for patients receiving nonmyeloablative chemo-therapy but not for patients who are receiving myeloablative chemotherapy orhematopoietic stem cell transplants. In the latter situation with the completeloss of megakaryocytes, TPO has no ability to enhance platelet production.

It has been documented that TPO is adsorbed onto the surface of transfusedplatelets [101]. Therefore, reductions in the number of transfused platelets bydecreasing the platelet transfusion trigger and the platelet dose should furtherreduce the number of platelet transfusions required by decreasing the durationof patients’ thrombocytopenia. As soon as megakaryocytes appear in the mar-row, elevated TPO levels will be able to stimulate platelet production.

Therapeutic Platelet TransfusionsChronically thrombocytopenic patientsPlatelet transfusions are considered ‘‘therapeutic’’ if they are given to controlactive bleeding whether because of thrombocytopenia and/or platelet dysfunc-tion. Platelet transfusions are usually indicated when bleeding is � WHOGrade 2 in chronically thrombocytopenic patients. WHO bleeding grades 1and 2 are usually considered directly attributable to the degree of a patient’sthrombocytopenia [102], while more severe bleeding—WHO Grades 3 and


4—are more often associated with contributing factors such as medications, anunderlying disease state (ie, uremia) that may interfere with platelet function,anticoagulants, coexistent plasma clotting factor deficiencies, or disruption ofthe vascular system (ie, necrotic tumors). Therefore, because of these other fac-tors that may contribute to bleeding, it is not surprising that platelet transfu-sions may not prevent or control all bleeding in thrombocytopenic patients.In fact, in spite of prophylactic platelet transfusions given at transfusion triggersof 10,000 to 20,000 platelets/lL, several clinical trials have demonstrated thatbleeding still occurs. The risk of bleeding varies substantially among studies;ie, WHO Grade 1 bleeding was observed in 46% of patients [84], WHO Grade2 in 12% [84], or 58% [56] of patients, and WHO Grades 3 and 4 in 5% [56] or11%, 20%, or 36% of patients depending on the study [103]. In the SPRINTTrial [56], bleeding grades were assessed before and after 186 therapeutic plate-let transfusions given for active bleeding [104]. WHO bleeding grades de-creased following only 21% of the transfusions, they were unchanged after69%, and they actually increased after 10%.

Invasive proceduresPlatelet counts of 40,000/lL to 50,000/lL are sufficient to perform invasiveprocedures such as laparotomy, craniotomy, tracheotomy, catheter insertion,tooth extractions, liver biopsy, and transbronchial biopsy in the absence of as-sociated coagulation abnormalities (reviewed in Schiffer and colleagues [91]).Other procedures such as bone marrow aspiration and biopsy can safely beperformed at platelet counts of <20,000/lL. For lumbar puncture, the plateletcount should be >20,000/lL. Before any invasive procedures, it is important todetermine a platelet count to ensure that the count is at the desired level beforethe procedure is initiated.

BLEEDING ASSESSMENTS SPECIFIC TO THE PATIENTS’UNDERLYING DISEASEAcute LeukemiaData from a transfusion trigger trial involving 255 patients who had AML [84]have recently been reanalyzed to determine factors that were associated withthe onset of bleeding. Bleeding was classified as minor (WHO Grades 1 and2) or major (WHO Grades 3 and 4) as well as what would be considered tobe clinically significant bleeding (WHO Grades 2, 3, and 4) [105]. Variableswere evaluated on the day before bleeding to determine if an association ex-isted between the variables and bleeding. Bleeding �WHO Grade 1 occurredin 58.4% of the patients. Factors that correlated with either an increase or a de-crease in bleeding risk are given in Table 5. The majority of major bleedingevents (WHO Grades 3 or 4) were proceeded by minor bleeding events.WHO bleeding Grades 1 or 2 on the previous day were associated witha 3.1-fold increased risk of severe bleeding on the following day. Even Grade1 bleeding on the prior day increased the risk of clinically significant bleeding(WHO Grades 2, 3, and 4) on the following day by 2.6 times. Grade 2 bleeding

716 SLICHTER

alone did not predict Grades 3 and 4 on the following day. The risk of clinicallysignificant bleeding (Grades 2, 3, or 4) increased progressively at temperatures>38�C. At temperatures >38.5�C, the relative risk was 3.95, but there was noeffect of temperature on severe bleeding (Grades 3 or 4).

The finding of an increase in bleeding risk with decreased platelet counts forall bleeding grades in this study [105] is in direct contrast to findings in two otherlarge studies that evaluated factors that affected bleeding risk. These involved2942 patients [106] and 64 patients [102] who had a variety of hematologicand solid tumor malignancies. In the first study [106], there was no relationshipbetween platelet count and bleeding risk, and, in the second study [102], therewas no difference in bleeding risk—either minor or major—for patients who hadplatelet counts of 10,000 to 20,000/lL versus those who had platelet counts of20,000 to 50,000/lL. Both studies confirmed a relationship between prior bleed-ing and a subsequent risk of bleeding. Recent serious hemorrhage in the prior5 days (WHO Grades 2, 3, or 4) correlated with subsequent bleeding (odds ratio6.72) [106]. On 25% of the days with minor bleeding (WHO Grades 1 and 2),major bleeding (WHO Grades 3 and 4) was also observed. Conversely, minorbleeding was noted on 98% of the days with major bleeding [102]. Other factorsthat increased the odds radio for bleeding were uremia, liver dysfunction, andrecent bone marrow transplantation, but the effects were relatively small(odds ratios of 1.64, 1.54, and 1.32, respectively) [106].

Table 5Factors that affect bleeding risk in patients who have AML

Bleeding severitya

Mild Clinically significant Severe

Factorb RRc (CI) P RRc (CI) P RRc (CI) P

Antifungalmedication

0.59(0.39–0.90)

.014

Clinicalinfection

1.98(1.00–3.92)

.05

Bodytemperature

1.52(1.25–1.85)

<.005 1.87(1.40–2.49)

<.005

Platelettransfusion

0.45(0.28–0.72)

<.005

Plateletcount

0.97(0.96–0.98)

<.005 0.96(0.93–0.98)

<.005 0.96(0.93–0.99)

.005

Abbreviations: CI, confidence interval; RR, relative risk.aMild (WHO Grades 1 and 2), clinically significant (WHO Grades 2, 3, and 4), and severe (WHO

Grades 3 and 4).bFactor refers to the presence of this variable on the day before the assessment of bleeding.cTemperature RR, the increase in bleeding risk for every 1�C increase in body temperature; platelet

count RR, the decrease in bleeding risk for every 1000/lL increase in the platelet count.Data from Webert KE, Cook RJ, Sigouin CS, et al. The risk of bleeding in thrombocytopenic patients withacute myeloid leukemia. Haematologica 2006;91:1530–7.


The most dreaded bleeding risk is intracranial hemorrhage. In 792 patientswho had newly diagnosed acute leukemia, 79 patients died of hemorrhage, andfatal intracranial hemorrhage occurred in 52% of the hemorrhagic deaths [107].Median days from diagnosis to hemorrhage was 2, and time to death fromdiagnosis was 2. In a multivariate analysis, relative risk (RR) factors for fatalintracranial hemorrhage were female gender (RR ¼ 5.2, P < .001), acutepromyelocytic leukemia (RR ¼ 4.1, P ¼ .003), leukocytosis (RR ¼ 3.3,P¼ .004), thrombocytopenia (RR¼ 3.3, P¼ .005), and prolonged prothrombintime (RR ¼ 3.3, P ¼ .02). Platelet counts of <35,000/lL increased the risk offatal intracranial hemorrhage.

Acute Promyelocytic Leukemia (APML)In almost all studies evaluating platelet counts and/or platelet transfusion therapyand bleeding risk, APML patients have been excluded because of their knownhigh risk of bleeding. Most patients who have APML have evidence of dissemi-nated intravascular coagulation (DIC). Although DIC can be found in associationwith almost all malignancies [108] because of the release of tissue thromboplastinfrom malignant cells [109], it is particularly prominent in leukemias and especiallyAPML. The cause of the coagulopathy in APML is complex resulting from a com-bination of tissue factor– and cancer procoagulant–induced DIC with exagger-ated fibrinolysis due predominantly to enhanced expression of Annexin II onAPML blast cell membranes and blast cell production of cytoxines [109]. A clin-ically significant coagulopathy is present in 80% of APML patients at diagnosisresulting in fatal hemorrhage (mainly intracerebral and pulmonary) in up to20% of patients within the first 5 to 10 days of diagnosis. The introduction ofall-trans retinoic acid (ATRA) has had a dramatic effect on survival in APMLas a direct consequence of a reduction in early hemorrhagic mortality to only5% [110]. ATRA promotes the terminal differentiation of leukemic promyelo-cytes resulting in the normalization of tests of clotting and fibrinolysis within 7to 14 days of starting therapy [111]. In contrast to prior therapy of APML, whichcaused lysis of blasts exacerbating the DIC, ATRA has the opposite effect.

In patients who have APML, the bleeding risk still remains high. ATRAshould be given as soon as the diagnosis is made, and aggressive platelet trans-fusion therapy should be initiated. In this disorder, it is recommended that theprophylactic platelet transfusion trigger should be maintained at 20,000 plate-lets/lL rather than at 5000 to 10,000 platelets/lL as is appropriate for otherpatients [111]. If the patient is actively bleeding, the platelet count should bemaintained at 50,000/lL. Plasma and cryoprecipitate transfusions for pro-longed prothrombin time, partial thromboplastin time, or low fibrinogen levels,respectively, should not be given prophylactically but only for active bleeding.There are no definitive data to support the use of heparin or antifibrinolyticdrugs in the management of patients who have AMPL.

Stem Cell TransplantationAn observational study was conducted at 18 transplant centers in the UnitedStates and Canada to evaluate platelet use and hemorrhagic events [3]. The

718 SLICHTER

study included 789 patients transplanted in 1995. Platelets were transfused pro-phylactically at all 18 transplant centers, usually at platelet counts between10,000/lL and 19,000/lL. One hundred forty-three hemorrhagic events ofmoderate or greater severity occurred in 89 patients (11%). Most eventsoccurred in patients undergoing allogeneic transplantation (78%) and beforeplatelet recovery (89%). The median (range) time of hemorrhage from thedate of stem cell infusion was 19 days (0-60). The major site of bleeding wasgenitourinary, often related to chemotherapy-induced cystitis. The secondmost common site of bleeding was gastrointestinal. Most events (66%) oc-curred when the morning platelet count was >20,000/lL. Sixteen patients(2%) died from a hemorrhagic event. Because most bleeding occurred whenthe morning platelet counts were >20,000/lL, this finding suggests that clinicalevents that occur during the early posttransplant period such as mucositis,graft-versus-host disease, cystitis, and infection may be more important predic-tors of hemorrhage than platelet count.

Bleeding associated with mortality was investigated in a retrospective analy-sis of 83 leukemic patients with a terminal course after transplantation [112].Fatal bleeding was identified in 16 (19%) of the patients, and the bleedingwas intracranial in 5 patients, gastrointestinal in 5 patients, and generalizedin 6 patients. There were no significant differences in platelet counts betweenthose patients with a terminal hemorrhage (25,000/lL) versus those without(31,000/lL), indicating that factors other than the platelet count (such asGVHD and white cell counts) were more likely related to hemorrhagic mortal-ity. The overall hemorrhagic incidence was similar in allogeneic and autolo-gous bone marrow transplant populations (18% and 19%, respectively).

Acute bleeding after bone marrow transplantation was also investigated in1402 patients receiving transplants at Johns Hopkins Hospital between 1986and 1995 [113]. The overall incidence of bleeding was 34.0%, with minorbleeding in 10.6%, moderate bleeding in 11.3%, and severe bleeding in12.0% of all patients. Fourteen percent of patients had moderate or severe gas-trointestinal hemorrhage, 6.4% had moderate or severe hemorrhagic cystitis,2.8% had pulmonary hemorrhage, and 2.0% had intracranial hemorrhage.Moderate and severe bleeding was more common in allogeneic (31.0%,P < .0001) and unrelated transplants (62.5%, P < .0001) compared with autol-ogous transplants (18.5%). The higher incidence of bleeding in allogeneic andunrelated transplant patients compared with autologous transplants may berelated to an increased incidence of GVHD and infectious complications inthe allogeneic transplant patients. Overall, the bleeding risk in bone marrowtransplantation may be higher than in patients with acute leukemia or thosewith solid tumors (see the following paragraph) and also higher for allogeneicversus autologous transplant recipients.

Solid TumorsFive retrospective studies of solid tumor patients who had thrombocytopeniaand associated bleeding have been reported to date [114–118]. No prospective


or controlled trials in this population have been reported. Four of these studiesconfirm the findings in leukemia patients (ie, the rate of bleeding increased as theplatelet count decreased, and no clear threshold could be shown) (Table 6) [91].

These studies reported a relatively low overall rate (<5% in the three largeststudies) of major or life-threatening episodes of bleeding except when the plate-let count fell below 10,000/lL. These observational data also show that hem-orrhage at necrotic tumor sites, including fatal hemorrhages, can occur atplatelet counts well above 20,000/lL. In one study [115], there was no clearrelationship between platelet count and risk of bleeding because the majorityof cases of serious bleeding (37 of 44 cases) occurred at platelet counts exceed-ing 20,000/lL, often at necrotic tumor sites.

MECHANISMS AND MANAGEMENT OF PLATELETREFRACTORINESSRefractoriness to platelet transfusions can be separated into nonimmune andimmune-mediated mechanisms. Because isolated poor responses to an individ-ual platelet transfusion are not uncommon, platelet refractoriness requires twoserial platelet transfusions with poor responses [119]. Responses are usuallymeasured by determining corrected count increments (CCI) or percent plateletrecovery (PPR).

Refractoriness is usually defined as a CCI of �7500 or �5000 (equivalent toa PPR of 30% to 20%, respectively) within 1 hour posttransfusion and isapproximately 40% less at 24 hours; ie, a CCI of 4500 or 3000 at 18 to 24hours posttransfusion (PRP of <15%) [120]. The lower values of an acceptableCCI correspond to an absolute platelet increment of about 6000 and 2000platelets/lL/platelet concentrate transfused at one and 18 to 24 hours posttrans-fusion, respectively.

Management of the platelet-refractory patient is outlined in Fig. 6 [121]. Aplatelet-refractory patient should first be given ABO-compatible fresh plateletsdrawn within 48 to 72 hours of transfusion. Compatibility is defined as thedonor platelets not expressing any A or B antigens incompatible with the pa-tient’s naturally occurring anti-A and/or anti-B antibodies. If the patient re-mains refractory to two sequential transfusions of ABO-compatible freshplatelets, then it is worthwhile to proceed with platelet antibody tests to deter-mine if the patient is alloimmune platelet refractory or has adverse clinical ordrug effects that are producing poor platelet responses [29].

Management of Alloimmunized PatientsThere are basically three strategies for managing alloimmunized platelet refrac-tory patients: (1) select HLA-compatible donors from an HLA-typed registry ofapheresis donors; (2) identify HLA-antibody specificities and select antigen-compatible apheresis donors; and (3) perform platelet crossmatch tests to selectcompatible platelets [120]. All of these strategies are equally effective in select-ing compatible donors. Recently, another method of expanding the donor poolof HLA-antigen compatible donors has been developed based on identifying

Table 6

00 platelets/lL <10,000 platelets/lL

95% CI % 95% CI

52 214–23 38.1 18–622–19 14.3 3–36

576a

00 days 4–21

142 4912–25 40.1 18–45<1–6 10.2 3–22

62 38b

9–30 18.4 8–340–6 0 0–9

365 1977–14 20.1 15–272–6 7.1 4–12

cal practice guidelines of the American Society of Clinical Oncology.

72

0SLIC

HTER

Thrombocytopenia and bleeding in patients who have solid tumors

20,000 to 50,000 platelets/lL 10,000 to 20,0

Reference % 95% CI %

Belt [114]Total cycles of therapy 197All bleeding 9.6 6–15 11.5Major bleeding 2.5 1–6 7.7

Dutcher [115]Days at risk 4,393All bleeding 8 episodes/1000 days 6–12 10 episodes/10

Goldberg [116]Total cycles of therapy 347All bleeding 2.3 1–4 17.6Major bleeding <1 <1–2 2.1

Fanning [117]Total cycles of therapy 79All bleeding 0 0–5 17.7Major bleeding 0 0–5 0

Elting [118]Total cycles of therapy 700All bleeding 4.7 3–7 10.1Major bleeding 2.3 1–4 3.6

Abbreviation: CI, confidence interval.aData available for 10,000 to 2000 platelets/lL and <10,000 platelets/lL combined.bData available for 5000 to 10,000 platelets/lL; data for <5000 platelets/lL not provided.

Data from Schiffer CA, Anderson KC, Bennett CL, et al. Platelet transfusion for patients with cancer: cliniJ Clin Oncol 2001;19:1519–38.


HLA-antigens at the molecular level [122]. This approach has been evaluated ina small group of 16 patients who had aplastic anemia and has shown improvedpredictability for selecting compatible donors compared with increasing thedonor pool size based on identifying donors with HLA-serologically definedcross-reactive groups (CREG) [123]. Unfortunately, even with donors selectedby any of these techniques, 20% to 30% of the selected donor transfusions maygive poor responses. These poor responses are likely related to: (1) nonimmunecauses of platelet refractoriness that may also be present in alloimmunizedpatients (see the next section); (2) drug-related or autoantibodies; or (3) failureto detect relevant antibodies because of insensitivity of the assay systems.

It should be remembered that up to 40% of patients may lose their antibodiesover time (1 week to several months) despite continued platelet transfusions[120]. Therefore, periodic assessments of antibody status may allow somepatients to be returned to random donor platelet transfusions with continuedgood responses to these platelets for extended periods of time.

Nonimmune Platelet RefractorinessWhen platelet refractoriness in the TRAP Trial was redefined as two sequentialposttransfusion platelet increments of �11,000 platelets/lL at 1-hour posttrans-fusion rather than basing refractoriness on CCI measurements, 27% of the 533patients receiving induction therapy for AML developed platelet refractoriness.Analyses of the results of 6379 transfusions given to these TRAP Trial patientswas used to determine the clinically important patient and product-relatedfactors that affected transfusion outcomes (Table 7) [29]. Only two factors

ABO COMPATIBLE PLATELETS

“FRESH” PLATELETS

PRESUMED ALLOIMMUNE REFRACTORY

PLATELET ANTIBODY TESTS

REFRACTORY TO POOLED RANDOM DONOR PLATELETS

SELECT COMPATIBLE DONORS BY:

HLA MATCHING.

IDENTIFY SPECIFICITY OF HLA-

ANTIBODIES AND AVOID HLA-

ANTIGEN INCOMPATIBLE DONORS.

PLATELET CROSSMATCH TESTING.

ADVERSE CLINICAL FACTORS OR

DRUGS.

POSITIVE NEGATIVE

ALGORITHM FOR MANAGING PLATELET-REFRACTORY PATIENTS

Fig. 6. Platelet refractory algorithm. The sequence of steps, detailed in the text, for providingplatelet support for platelet refractory patients is outlined. (Reprinted from Slichter SJ. Algorithmfor managing the platelet refractory patient. J Clin Apher 1997;23:4–9; with permission.)

o 24-hour plateletment (platelets/lL)

Refractoriness(hazard ratio)

Days-to-nexttransfusion

00 1.7500a �2.0b �0.35a

,400c

00c

00c 3.48c �0.36c

00c 2.78c �0.40c

00c �0.2300c 2.43c �0.37c

00c 2.00c �0.3300 2.12c �0.2500c �0.28

�0.40c

fusion was considered to be a �20% difference (either an increased or

atistically significantly different but does not meet the clinically importantference for the outcome measure.arms except UV-B. UV-B platelets were reduced by only 750 platelets/ll.or all arms.s, platelet refractoriness, and platelet transfusion intervals in thrombocy-

72

2SLIC

HTER

Table 7Clinically important factors affecting platelet transfusion outcomes

1-Hour plateletincrement (platelets/lL)

18- tincre

FactorOverall response 24,900 12,0Clinically important change �5000a �24

Improved platelet responsesSplenectomy þ24,800c þ12ABO compatible þ4600 þ63

Decreased platelet responsesLymphocytotoxic antibody-positive �9300c,d �40Females with �2 pregnancies, and males �8900c �57Palpable spleen �3500 �44Heparin �38Bleeding �1700 �31Fever �1600 �20Amphotericin �2700 �25DIC

aA clinically important change for 1-hour and 24-hour posttransfusion increments and days-to-next transa decreased response) from the overall responses observed in the trial.bFor the hazard ratio, an increase of �2.0 was considered clinically important.cValue meets the criteria for a clinically important change. If a result is given but not noted with‘‘c’’, it is stcriterion. If no value is listed (—), there was neither a clinically important nor statistically significant difdThe platelet increment was estimated to be 9300 platelets/lL less at 1 hour after transfusion for all studyThe platelet increment was estimated to be 4000 platelets/lL less at 18 to 24 hours after transfusion fReprinted from Slichter SJ, Davis K, Enright H, et al. Factors affecting post-transfusion platelet incrementtopenic patients. Blood 2005;105:4106–14; with permission.


improved platelet responses: splenectomy, and giving ABO-compatible plate-lets. Conversely, factors that reduced platelet responses progressing downwardfrom the most adverse were: patients who developed lymphocytotoxic anti-bodies; females with �2 pregnancies and males; splenomegally; receiving hep-arin; bleeding; fever; amphotericin; and DIC. Because of the knownrelationship between platelet count and platelet survival [34], those factorsthat reduced platelet increments usually also reduced platelet survivals. Mostof these adverse factors were also related to the onset of platelet refractoriness.In a separate population of patients undergoing hematopoietic stem cell trans-plantation, factors specific to these patients that adversely affected platelet trans-fusion outcomes were veno-occlusive disease of the liver (VOD), GVHD, highbilirubin levels, total body irradiation (TBI), and high serum tacrolimus orcyclosporin levels [124].

Management Strategies for Persistently Refractory PatientsWhether the cause of the refractoriness is immune or nonimmune, there arepatients who remain platelet-refractory in spite of our best efforts to find com-patible donors for alloimmunized patients or eliminate adverse clinical condi-tions that are associated with refractoriness. For patients who are havingmajor bleeding that is considered life-threatening, several approaches may pro-vide some benefit, but there is only anecdotal data supporting their use: (1) giv-ing small-dose frequent platelet transfusions (eg, 3 to 4 platelet concentratesevery 4 to 8 hours). These transfusions may be helpful in maintaining vascularintegrity even though there is no increase in the patient’s posttransfusion plate-let count; (2) intravenous IgG may transiently increase posttransfusion plateletincrements (reviewed in McFarland [125]); (3) fibrinolytic inhibitors may helpstabilize any clots that are being formed [126]; and (4) recombinant Factor VIIamay control bleeding in some patients [127,128].

AcknowledgmentsThe author gratefully acknowledges the excellent administrative support ofGinny Knight.

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CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALESDE LAS PLAQUETAS

Lic. Milagros García Mesa1 y Lic. Cristina Coma Alfonso2

RESUMEN: La importante participación de las plaquetas en el proceso de formación deltrombo arterial determina el interés que despierta el conocimiento de sus características estructura-les y funcionales, ya que esto constituye la base, entre otros aspectos, para el diseño de fármacosy estrategias de tratamiento antitrombótico. En este trabajo se reúne la información existenteacerca de la estructura de la plaqueta, los componentes bioquímicos y su importancia para la funcióncelular, los mecanismos de adhesión y activación plaquetaria, así como su interacción con ertrocitos,leucocitos y con el endotelio vascular, los cuales definen la participación de las plaquetas en losprocesos de hemostasia y trombosis.

Descriptores DeCS: PLAQUETAS/ultraestructura; PLAQUETAS/fisiología; ACTIVACION PLAQUETARIA;ADHESIVIDAD PLAQUETARIA.

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La función de las plaquetas en los procesos de aterogénesis y trombogénearterial las han convertido en interés de tdos los especialistas relacionados con diagnóstico, prevención y tratamiento dlas enfermedades aterotrombóticas.

Los conocimientos alcanzados acercde las características estructurales y fucionales de las plaquetas han permitido umejor comprensión de los mecanismos dtrombogénesis y del mecanismo de accióde un fármaco antiagregante plaquetario tantiguo como la aspirina, así como el desrrollo de nuevos fármacos antiagreganteplaquetarios tales como las tienopiridina

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ticlopidina y clopidogrel, antagonistas dereceptor de ADP en la plaqueta, y los antagonistas de la integrina glicoproteína (GPIIb/IIIa.1

Esta revisión bibliográfica tiene el ob-jetivo de reunir los elementos fundamentales que caracterizan a las plaquetas deslos puntos de vista estructural y funcionapara así facilitar la comprensión de los principios sobre los cuales se basa la utilización de marcadores plaquetarios en los etudios de estados pretrombóticos y el dseño de fármacos antiagregantes plaquetarios.

1 Doctora en Ciencias Biológicas. Investigadora Titular. Lic. en Bioquímica.2 Investigadora Agregada. Licenciada en Bioquímica.

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de las plaquetas

Las plaquetas son fragmentos ciplasmáticos anucleados que se producomo consecuencia de la ruptura de megakariocitos de la médula ósea, las cles son células extraordinariamente gran(" 20 mm de diámetro), con un núcleo almente poliploide y un citoplasma subdivdido por capas de membranas onduladSe forman a partir de vesículas que se prenden en grandes cantidades de las mbranas externas de los megakariocitos. culan en la sangre en forma de disbiconvexo (discocitos) de aproximadamete 3 mm2 de diámetro, 4 – 7 mm3 de volumeny 10 pg de peso. Poseen carga eléctricagativa en su superficie. Su concentracnormal en la sangre es de 150 a 350 x 106/mLy su tiempo de vida media en sangrede 7 a 10 días. Junto a los eritrocitoleucocitos constituyen los elementos fomes de la sangre.2-4 Poseen algunos elemetos comunes a otras células y otros quedistinguen y caracterizan.

MEMBRANA EXTERNA

La tabla muestra su composicióConstituye una bicapa lipoproteica cglicoproteínas que funcionan como rectores de los agonistas fisiológicos de plaquetas (ADP, TXA2, trombina), protenas adhesivas (fibrinógeno, fibronectinlaminina, trombospondina, vitronectinfactor de von Willebrand [vWF]) y parligandos fibrosos como el colágeno, admás, posee enzimas importantes para elcionamiento celular y fosfolípidos3,4 Es res-ponsable de la interacción de la célula cel medio circundante a través de receptoentre las que figuran las integrinas las cles se caracterizan por enlazarse a pro

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nas que tienen la secuencia arginina-glicina-aspartato (RGD): fibrinógeno, fibronectina,vitronectina, factor de von Willebrand,colágeno. Las integrinas más estudiadashan sido GPIIb/IIIa y la GPIb/IX .5-8

La GPIIb/IIIa ocupa una gran propor-ción de la superficie plaquetaria (∀ 15 % dela proteína total de la membrana y 3 % de lacélula). Hay de 3 a 8 réplicas en la plaquetaen reposo. Es un heterodímero de 228 kDadependiente de calcio, cuyas subunidadesa y b son codificadas por genes diferentesLa mayor proporción de esta glicoproteínaes extracelular y dispone de 2 segmentostransmembrana y 2 cortos segmentoscitoplasmáticos formados por los extremosC terminales. En la plaqueta en reposo sehalla en forma de monómero, ya que la aso-ciación de las subunidades requieren cal-cio extracelular, que se enlaza a la subunidadIIb.3,4,9-12

La GP Ib/IX es un heterodímero forma-do por la asociación de las GP Ib y IX. LaGPIb consta de una cadena a y una b enlazadas por puentes disulfuro. Tiene regionesextracelulares (" 40 nm), que garantizan lainteracción con los ligandos vWF ytrombina), submembrana y citoplasmáticos,que actúan como anclaje del complejo a lacélula. Esta glicoproteína es rica en leucina.Después de la GPIIb/IIIa es la mayoritaria enla membrana plaquetaria (1 – 3 x 104 molécu-las /plaqueta). Las subunidades GP1 a y b yla GPIX son codificadas por genes diferen-tes, localizados en cromosomas diferentesLa región extracelular posee los dominios deidentificación de la trombina y el vWF. Lasdiferentes porciones de este complejo tienenuna función: la región extracelular facilita elacceso al subendotelio y la interacción contrombina y vWF; la región intracitoplasmáticaune los dominios funcionales extraplaquetarioscon el citoesqueleto de actina; la regióntransmembrana actúa como anclaje de laglicoroteína en la membrana plaquetaria.3,4,9-11

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CITOPLASMA

Contiene partículas de glucógeno dseminadas o aglomeradas que constituyla fuente energética de esta célula en forsimilar a las células musculares. Contieribosomas en muy pocas cantidades, fudamentalmente en las células jóvenes,que concuerda con la casi nula actividade síntesis proteica. Soporta, además, microtúbulos que aparecen en forma de ccunferencia, ubicados de manerconcéntrica y que mantienen la formdiscoide de la célula y garantizan su restencia a la deformación.3,4

CITOESQUELETO

Es un gel viscoelástico que contienfilamentos de actina entrecruzados, conetados a la GPIb por proteínas enlazantesactina. Tiene como funciones: a) la regulción de las propiedades de la membrantales como sus contornos y estabilidad, juto a los microtúbulos propicia el mantenmiento de la forma de la plaqueta en repso, b) mediación de la distribución laterde las glicoproteínas receptoras en la mebrana, c) constituyen una barrera paraexocitosis. Su alteración puede llevar a fragmentación del citoplasma formandmicropartículas.3,4

GEL CONTRACTIL

Está formado por largos filamentos dactina enrejados, conectados con citoesqueleto submembranoso y miosinque se encuentra en forma no poliméricala célula en reposo. Constituye el cuerpde los organelos celulares, los cuales desplazan hacia el centro de la célula a cosecuencia de la contracción del gel.3-4

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SISTEMA CANALICULAR ABIERTO

Está formado por canales ramificadose conecta a la membrana externa y poscaracterísticas similares a ella en cuantosu composición. A través de este sistemse transportan las GPIIb/IIIa y la GP1b hacia los gránulos a.3,4

SISTEMA TUBULAR DENSO

Es un sistema de membranas que aprece en la vecindad de los microtúbulosrodea los organelos, con apariencia, y fuciones similares a las del retículo endoplásmico liso de otras células. Regula activación plaquetaria mediante el secuetro o liberación de calcio, de forma similar los túbulos del músculo esquelético13 y porun mecanismo más rápido que el de lmitocondrias.13 También posee ATPasasenzimas del metabolismo del ácidaraquidónico y adenilato ciclasa.3,4

Las plaquetas poseen organeloinespecíficos, como mitocondrias, lisosomas y peroxisomas, que tienen caracrísticas y funciones similares a los de otracélulas14 pero, además, portan organeloespecíficos, que son los gránulos alfa y lgránulos densos.

GRÁNULOS ALFA

Son organelos esféricos de 140 a 40nm en diámetro, ricos en macromo-lécula(tabla) con una porción de alta densidaen electrones. Constituyen un 15 % dvolumen total de las células. Sus membrnas contienen GPIIb/IIIa, pequeñas cantdades de GPIb, GPIX y P selectina. Tieneuna importante participación en el funcionamiento celular, al propiciar la interaccióentre plaquetas, de ahí que la cantidad dgránulos a (como promedio 35-40) determna el valor funcional de la célula. Tambiéparticipan en la interacción con otras célulaa través de la liberación de su contenido.3,4

4

TABLA. Componentes de la membrana externa y de los gránulosplaquetarios

Integrina Ligando Gránulos alfa Gránulos densos

GPIIbIIIa fibrinógeno Factor plaquetario 4 (PF4) AT P

vWF b tromboglobulina(bTG) ADP

vitronectina Factor decrecimiento Calcio

trombospondín (PDGF) MagnesioFibrinógeno 5 HT (Serotonina)

GPIbIX vWF vWF EpinefrinaGPIaIIa colágeno Trombospondín NorepinefrinaGPIV trombospondín Fibronectina DopaminaGPVI colágeno P SelectinaGPIcIIa fibronectina Colagenasa

ElastasaInhibidores deproteasas

Receptor Ligando

Receptor Trombinaa2 adrenérgico EpinefrinaS2 SerotoninaP2Y1 ADPT P tromboxano A2Receptor factor activante de plaquetasReceptor Fragmento Fc de InmunoglobulinasEnzimasFosfolipasas C y A2Adenil y Guanil ciclasasFosfolípidos

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GRÁNULOS DENSOS

Se caracterizan por su alta densidelectrónica que le confieren el elevado cotenido en calcio (50 % del total, en una cocentración 2 mol/L) y fósforo inorgánico(tabla).3,4

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Las plaquetas se caracterizan por unconsumo muy extenso de oxígeno, es 6 ve-ces más rápido que en las células muscula

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res en reposo. La fuente de energía esglucosa que se obtiene a partir deglucógeno y la vía fundamental es lglicolisis anaerobia, que convierte la glucosa en lactato e iones de hidrógeno, lcuales son captados por el acetato, qentra a las mitocondrias para su oxidacióen el ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo deKrebs), lo que propicia la síntesis de ATpor la fosforilación oxidativa y la estabiliza-ción del pH celular. Incorporan a su interio(por un mecanismo independiente de enegía) fragmentos de membrana que continen GPIIb/IIIa y también fibrinógeno, y (porun mecanismo dependiente de energía), framentos de membrana que contienen GPesto permite la regeneración de los recetores de membrana.4

Estas células concentran la mayoría dla serotonina de la sangre la cual tomaunida a calcio mediante transporte activo15

También toman del plasma ligandos comfibrinógeno, colágeno, fibronectina yaminas biógenas.4

ACTIVACIÓN PLAQUETARIA

La participación de las plaquetas en loprocesos de hemostasia y trombosis depede de la ocurrencia de 3 eventos: el enlaplaqueta -superficie o adhesión plaquetariel cambio de forma y el enlace plaquetaplaqueta o agregación plaquetaria.

ADHESIÓN PLAQUETARIA

Las plaquetas son capaces de adherse a superficies artificiales, sobre las cualse expanden. Utilizan como ligando afibrinógeno, a través de su unión a GPIIbIIIa. También se adhieren al colágeno (fundamentalmente de los tipos I y III), vWFfibronectina, laminina. En condiciones dbajo flujo sanguíneo, este evento es med

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do por la interacción vWF-GPIb, pero encondiciones de alto flujo también se requiere la participación de GPIIb/IIIa. Se formanenlaces firmes que dependen de la estrutura fibrilar del colágeno y de la cantidad dsubunidades RGD.

La adhesión plaquetaria al colágenrequiere de la interacción del colágeno covWF del plasma, GPIb, GPIaIIa de la membrana plaquetaria que durante la formaciódel coágulo establecen enlaces plaquetfibrina. Se produce la internalización de lamallas de fibrina o de colágeno, que sorodeados de microfilamentos.16,20

CAMBIO DE FORMA

La primera manifestación física de laactivación plaquetaria es el cambio de forma de discocito a esferocito, que se acompaña de un incremento en la superficie dede 8,02 mm2 (en la plaqueta en reposo) a13,0 mm2 (en la plaqueta activada). Dismi-nuye la longitud del subesqueletosubmembrana cuya evaginación aportmembranas para este proceso. Se produla redistribución de los microtúbulos, lo quele confiere la característica de deformabilidad celular y la posibilidad de emitirseudópodos. Los microtúbulos que estáen estrecho contacto con el gel contractise trasladan hacia el centro de la célulSe procede a la desintegración decitoesqueleto y se restituye a partir de lainternalización de fragmentos de la membrana externa. Es un proceso independiete de calcio (cuando el estímulo es el ADPy dependiente de energía.4

AGREGACIÓN PLAQUETARIA

Estímulos fisiológicos para la activa-ción plaquetaria son la trombina, e

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colágeno, el ADP, la epinefrina, eltromboxano A2 (TXA2). Los eventos pos-teriores tienen elementos comunes y otroque lo diferencian. Por ejemplo, ocurrencomo resultado de la estimulación de receptores específicos (tabla).19,21-26 En elcaso de la trombina, el ADP y el TXA2, setrata de receptores acoplados a proteínaenlazantes de nucleótidos de guanina (proteínas G). El de trombina es una glicopro-teína con 7 dominios transmembrana, de lcual hay de 1 500 a 2 000 copias que sdesensibilizan rápidamente al producirse laactivación las cuales no son recuperables.25

El receptor del ADP es purinérgico, él secaracteriza por responder con activaciónfrente al ADP y con inhibición frente al ATP.Su estructura no ha sido identificada y pormucho tiempo se ha denominado far-macológicamente como receptor P2T. Sinembargo, algunas evidencias experimentales recientes, sugieren que se trata de receptores, uno P2Y

1, igual al que media la

vasodilatación y que es causante del aumento del calcio citoplasmático, el cambiode forma y la agregación plaquetaria, otroP2

Y1 cyc, que media la inhibición de la

adenilciclasa y uno P2X1 (no acoplado a

proteína G) con una menor significa-ción.22-24

Se plantea que al menos unaglicoproteína, la GPVI, actúa como receptorpara la fase de activación inducida por ecolágeno y que su estimulación es una señal para una fosfolipasa C.19

Un evento que sigue a la activación esel incremento de la concentración de calciocitoplasmática, cuyo mecanismo bioquímicono ha sido determinado totalmente en lamayoría de los casos. Con respecto a ltrombina, el colágeno y el TXA2, se ha de-mostrado la ocurrencia de activación de lafosfolipasa C, que da lugar a la formaciónde 1,4,5 trifosfato de inositol (que liberacalcio del sistema tubular denso y activauna miosina kinasa) y 1,2 diacilglicerol (que

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activa la proteína kinasa C, que desencadna una serie de fosforilaciones de proteínas que parecen importantes para el procso de agregación plaquetaria).19,25,27 En elcaso del TXA2 se cree que también haentrada a la célula del calcio extracelular través de una intensificación del intercambio Na+/H+ de lo cual depende más de lamitad del incremento del calcio citoplas-mático.26

La trombina, el ADP y la epinefrina in-ducen inhibición de la actividad ade-nilciclasa en la plaqueta, cuya implicaciónen el resultado final no está bien determinado.22,25,28

Se desconocen los mecanismobioquímicos que llevan a la activación de laGPIIb/IIIa y el enlace del fibrinógeno, perohay evidencias de que este último es independiente del calcio.29

La activación plaquetaria por agentescomo trombina, colágeno, ADP y epinefrinapuede conducir a la activación de lafosfolipasa A2 citoplasmática, que requie-re concentraciones fisiológicas de calciopara activarse, la cual cataliza la hidrólisisde los fosfolípidos de membrana y da lugaal ácido araquidónico que se metabolizapreferencialmente por la vía de la TXA2sintetasa para dar lugar al TXA2, productoinestable (sólo 5 s dura su actividad) cuyoprecursores, los endoperóxidos cíclicosson también capaces de activar el receptoDe esta manera el TXA2 constituye un amplificador de la señal de activaciónplaquetaria.26

Después de un estímulo fuerte losgránulos alfa y densos se alargan y emten seudópodos, se aproximan a la membrana plasmática (lo que es posible debdo a la disolución del sistema canaliculaabierto), se funden con la membrana, aumentan de volumen debido a la entradde agua y esto propicia la liberación desu contenido al medio exterior, lo que sedenomina secreción.4

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Un elemento que distingue a los agetes inductores de agregación plaquetariael peso relativo que tienen la síntesis TXA2 y la secreción en el resultado finaPor ejemplo, la agregación inducida potrombina, es resultado fundamentalmende la señal dada por la activación de su ceptor, ya que no es afectada por la inhición de la síntesis del TXA2 por aspirina.23

El ADP produce una primera fase de agregción reversible, de aproximadamente 30 sduración y que es consecuencia de la sede activación del receptor, a lo que siguuna segunda fase irreversible y que depede la síntesis de TXA2.21,22,24 El TXA2 parecerequerir de la liberación de ADP.29

La conocida susceptibilidad a la asprina de la agregación inducida por colágensugiere la importancia de la liberación dTXA2 en su mecanismo de activacióplaquetaria. La epinefrina se considera agonista débil que amplifica el efecto dotros estímulos a través del incremento la concentración de calcio intracelular,28 yde la actividad adenilato ciclasa.30

Regulación fisiológica de la adhesión/agrega-

ción plaquetaria

Las plaquetas circulantes se encuetran en una interacción dinámica con locomponentes del plasma, los demás elemtos formes de la sangre y con el endotevascular a través de las glicoproteínas las membranas plaquetarias y de diferenmediadores químicos.20 Los eritrocitos, queviajan por la parte central de la corriensanguínea, desplazan a las plaquetas halas cercanías de la pared del vaso, lo qpuede dar lugar a enlaces reversibles. adhesión plaquetaria sólo será efecti

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cuando se produzcan enlaces irreversibles.16,20 La célula endotelial libera media-dores químicos que impiden que ocurra laadhesión plaquetaria a un endotelio sanoEstos mediadores son la prostaciclina(PGI2), principal metabolito del ácidoaraquidónico en la célula endotelial, y elóxido nítrico (NO), producto del metabolis-mo de los aminoácidos.32 La PGI2 estimulala adenilciclasa en la plaqueta y aumentalos niveles intracelulares de AMPc, mien-tras el NO estimula la síntesis de GMPc,que es el más potente inhibidor de lahidrólisis del AMPc. Ambos inhiben la ad-hesión plaquetaria y además, estimulan lareducción del calcio libre intracelular asímodulan la agregación plaquetaria.16,26,31,33

Entre los mecanismos que favorecenla adhesión/agregación están la liberaciónde ADP de los eritrocitos, que se lisan;34 laliberación del factor activante de plaquetas(potente estimulante de la agregaciónplaquetaria cuya función fisiológica en elhumano no se ha determinado) y TXA2 delos leucocitos activados,35 la exposición deP selectina en las membranas de célulaendoteliales y plaquetas, que media lainteracción intercelular a través del recono-cimiento de estructuras hidrocarbonadasricas en ácido siálico y fucosa.35 Otro ele-mento influyente es el “shear stress” delflujo sanguíneo, que induce agregaciónplaquetaria a través del enlace del vWF conla GPIb y con una fuerte participación delADP liberado.37

El estímulo para la participación de lasplaquetas en los procesos de hemostasistrombosis es la lesión del endoteliovascular, considerado como tal el daño físi-co con exposición de la membrana basal ricaen colágeno o la disfunción endotelial condesbalance de la producción de mediadores anti y proagregantes.28

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Cuando las plaquetas se adhierenendotelio atraen más plaquetas P selectpositivas. Se reclutan y activan a loleucocitos, los cuales se unen irreversibmente a la superficie plaquetaria por medde la molécula de adhesión ICAM-2. La ativación del receptor para el fibrinógeno sluble y la participación de los fosfolípidode la membrana plaquetaria como cofactopara la cascada de reacciones enzimátide la coagulación favorece la formación dtrombo arterial.36

Por otra parte algunos componentes los gránulos plaquetarios, que se liberdurante la activación, influyen sobre otracélulas, uno de ellos es el factor de cremiento derivado de la plaqueta (PDGF), qestimula la proliferación celular y juega upapel importante en la cicatrización de hedas38 y al parecer también en el proceso aterogénesis:39 el TXA2 y la 5HT, que sonpotentes vasoconstrictores39-41 y el inhibidordel activador del plasminógeno tipo (PAI-1), que tiene acción antifibrinolítica.42

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Consideraciones finales

A partir del análisis global de la com-posición de las plaquetas y los elementoque rigen su funcionamiento queda claroque se trata de una célula compleja y sujea la influencia de una gran diversidad defactores. Es evidente la importancia de inhibir la activación plaquetaria para prevenirla trombosis arterial, así como el significa-do práctico que pudieran tener los estudios de función plaquetaria para el diagnóstico de estados pretrombóticos, lo cuaes reforzado por el incremento de la reactividad plaquetaria que ocurre en las horadel día en que son más frecuentes el infartdel miocardio y la muerte súbita cardiaca.43

Saltan a la vista la GPIIb/IIIa, el ADP yel TXA2 como principales blancos para lamodulación de la reactividad plaquetariaconocimiento que ha tenido una gran trascendencia para el desarrollo de fármacoantitrombóticos.

Summary: The important participation of blood platelets in the process of formation of thearterial thrombus determines the interest the knowledge of their structural and functionalcharacteristics arises, since it is the basis, among other aspects, for the design of drugs andantithrombotic treatment strategies. All the information existing about the platelet structure, thebiochemical components and their significance for the cellular function, the mechanisms of plateletsadhesiveness and activation, as well as their interaction with erythrocytes, leukocytes and with thevascular endothelium, which define the participation of platelets in the processes of haemostasisand thrombosis, is gathered in this paper.

Subject headings: BLOOD PLATELETS/ultrastructure; BLOOD PLATELESTS/physiology; PLATELETSACTIVATION; PLATELETS ADHESIVENESS.

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Recibido: 24 de mayo del 2000. Aprobado: 5 dejunio del 2000.Dra. Milagros García Mesa. Departamento deBioquímica. Instituto Nacional de Angiología yCirugía Vascular. Calzada del Cerro No. 1551. Ciu-dad de La Habana, Cuba.

1

KIEFEL ET AL.


Alloantibodies against platelet membrane glyco-proteins (GPs) are a common cause for febrilenonhemolytic transfusion reactions. Most fre-quently, they react with HLA class I antigens.

However, platelet-specific alloantibodies also have the po-tential to induce febrile transfusion reactions.1

Patients who are given platelets over longer periods oftime, such as those under treatment for hematologic oroncologic disorders, may develop a condition called refrac-toriness to platelet transfusions: platelet count incrementsdeteriorate even though the platelet doses are adequate. Ithas been reported2,3 that a variety of clinical conditions,such as splenomegaly, fever, septicemia, and severe bleed-ing, as well as the presence of antibodies to alloantigens onplatelets, can be responsible for an inadequate rise in plate-let count in the recipient. Recently, the proportion of pa-tients with platelet refractoriness due to alloantibodiesalone has been estimated at approximately 18 percent4; inan additional 20 percent, both sepsis and alloimmunizationwere observed. Similarly, Doughty et al.5 found alloantibod-ies in approximately 25 percent of patients who were refrac-tory to platelet transfusions.

Platelet alloantibodies in transfused patients

Volker Kiefel, Claudia König, Hartmut Kroll, and Sentot Santoso

BACKGROUND: Patients receiving cellular blood com-ponents may form HLA antibodies and platelet-specificalloantibodies.STUDY DESIGN AND METHODS: Serum samples froma cohort of 252 patients with hematologic or oncologicdiseases who are receiving cellular blood componentswere studied for platelet-reactive antibodies. Specificityof platelet alloantibodies was determined with a panel oftyped plateletsRESULTS: Platelet-reactive antibodies were detected inthe sera of 113 patients (44.8% of 252), HLA antibodiesin the sera of 108 (42.9%), and platelet-specific antibod-ies in the sera of 20 (8%). The following platelet-specificantibodies were identified: anti-HPA-5b (n = 10), anti-HPA-1b (n = 4), anti-HPA-5a (n = 2), anti-HPA-1a (n = 1),anti-HPA-2b (n = 1), anti-HPA-1b+5b (n = 1), and anti-HPA-1b+2b (n = 1). Fifteen sera from the 108 patientswith anti-HLA (13.9%) contained additional platelet-spe-cific alloantibodies, while in 5 sera, platelet-specific al-loantibodies only were detected: anti-HPA-5b (n = 4) andanti-HPA-1a (n = 1). Of the 108 sera with HLA antibod-ies, 29 (26.9%) showed discordant results when studiedwith the lymphocytotoxicity test and the glycoprotein-specific immunoassay. Ten sera contained panreactiveantibodies against platelet glycoproteins (GP) IIb/IIIa,GPIa/IIa, and/or GPIb/IX. Alloimmunization occurred in58.3 percent of female patients with previous pregnan-cies, but in only 23.3 percent of those without previouspregnancies (p = 0.0049).CONCLUSION: Platelet alloantibody specificities intransfused patients (predominantly anti-HPA-5b and -1bwith antigen frequencies <30% among whites) differ sig-nificantly from those observed in patients with neonatalalloimmune thrombocytopenia or posttransfusion pur-pura, in whom anti-HPA-1a (antigen frequency >95%) isthe most prevalent specificity. HLA antibody detectionyields discordant results when the lymphocytotoxicityassay and a glycoprotein-specific immunoglobulin-bind-ing assay are used.

ABBREVIATIONS: GP(s) = glycoprotein(s); LCT = lymphocyto-

toxicity test; MAIPA = monoclonal antibody immobilization of

platelet antigens; NAIT = neonatal alloimmune thrombocytope-

nia; PTP = posttransfusion purpura.

From the Department of Transfusion Medicine, University of

Rostock, Rostock, Germany; and the Institute of Clinical Immu-

nology and Transfusion Medicine, Justus Liebig University,

Giessen, Germany.

Address reprint requests to: Volker Kiefel, MD, Department

of Transfusion Medicine, University of Rostock, Ernst-

Heydemann-Strasse 6, D-18057 Rostock, Germany; e-mail:

[email protected].

This work is part of the doctoral dissertation of Claudia

König.

Received for publication May 23, 2000; revision received

November 8, 2000, and accepted November 30, 2000.

TRANSFUSION 2001;41:766-770.


PLATELET ALLOANTIBODIES AND TRANSFUSION


Some of the nonimmunologic clinical factors associ-ated with impairment of posttransfusion platelet count in-crements are more difficult to influence. In contrast, accel-erated destruction of platelets by platelet alloantibodies canbe avoided by selecting platelets from antigen-compatibledonors, as was shown for HLA antibodies decades ago.6 Thispossibility explains the continuing interest in immunologictechniques that allow the detection and characterization ofantibodies to platelets and the selection of compatibleplatelet donors. In an attempt to predict impairment ofplatelet transfusion outcome by antibodies, a serologiccrossmatch procedure (recipients’ sera incubated with do-nor platelets) is performed by many laboratories. Manyserologic techniques have been proposed as crossmatchassays. As a technically simple assay, the lymphocytotox-icity test (LCT) has been recommended by many authorsfor platelet donor selection.6

If the use of HLA class I-compatible platelets does notlead to an adequate rise in platelet count in an immunizedpatient, this may be due to formation of antibodies againstplatelet-specific alloantigens. Kurz et al.7 showed that seramay contain antibodies reacting with HLA class I antigensas detected by antiglobulin-binding tests but not by LCT(complement-independent antibodies). Independent fromtheir capacity to activate complement, HLA class I-specificantibodies have been detected with the immunobead8 andmonoclonal antibody immobilization of platelet antigens(MAIPA)9 assays, as well as with solid-phase ELISA tech-niques.10,11

The aim of this serologic study was to analyze the spec-trum of specificities of platelet alloantibodies in a largegroup of multiply transfused patients who presented withclinical problems of transfusion refractoriness and/or non-hemolytic transfusion reactions. The results of this studywill allow more precise assessment of the technical require-ments for antibody testing and platelet crossmatching. Thespectrum of platelet alloantibody specificities has impacton the availability of apheresis donors for patients who areimmunized (especially to HLA and platelet antibodies).


Patients

Serum samples from 252 patients (124 female, 128 male)were shipped to our laboratory. Most of these patients werebeing treated for hematologic or oncologic diseases (Table1) and had received multiple transfusions of cellular bloodcomponents. We included patients with hematologic ma-lignancies (leukemias, lymphomas); patients with hematologicdisorders primarily associated with deficient thrombocy-topoiesis (aplastic anemia, pancytopenia), myelodysplasticsyndromes, and chronic myeloproliferative disorders; andpatients with oncologic diseases.

MAIPAThe characterization of platelet-reactive antibodies wasperformed with the MAIPA assay9 with some minor modi-fications12: platelets were incubated with the sera to bestudied, washed once, and then allowed to react with MoAbagainst GPIIb/IIIa, GPIa/IIa, GPIb/IX, and HLA class I anti-gen (β2 -microglobulin). Human antibodies fixed to the im-mobilized GPs were detected by conventional ELISAtechnology by the use of horseradish peroxidase-labeledgoat anti-human IgG and OPD. The following MoAbs wereused to immobilize platelet GPs: MoAb B1G6 reacting withthe β2-microglobulin moiety of the HLA class I moleculewas purchased (Immunotech, Marseille, France); MoAbFMC 25, specific for GPIX, was a gift from Heddy Zola, PhD(Adelaide, Australia); and MoAb Gi5, specific for the GPIIb/IIIa complex, and MoAb Gi9, specific for Ia/IIa, were raisedand characterized in our laboratory. The specificity of plate-let alloantibodies was assessed with a panel of donors typedfor HPA-1a, -1b, -2a, -2b, -3a, -3b, -5a, and -5b.

LCTAll sera were studied for antibodies against HLA class I an-tigens by use of the LCT as described by Terasaki.13 Dyeexclusion (eosin) was used to detect the cytotoxic effect.

Platelet adhesion immunofluorescence testThe platelet adhesion immunofluorescence test (PAIFT)method described by Schneider and Schnaidt was used.14

Test platelets from typed donors, stored in liquid nitrogen,were thawed and allowed to adhere to the glass bottom ofa microtiter tray. After incubation with the serum to be stud-ied (10 µL), the platelets were washed with isotonic salineand incubated with FITC-labeled rabbit anti-human IgG(Fcγ-chain specific, Dakopatts, Hamburg, Germany). Plate-let-bound fluorescence was read in an inverted fluores-cence microscope and graded as negative (0), weakly reac-tive (1, 2), moderately positive (3), or strongly positive (4).

Platelet agglutination testAlloantibodies against the HPA-2 alloantigens were lookedfor in all serum samples by using the platelet agglutination

TABLE 1. Diagnoses of patientsDiagnosis Number

Systemic hematologic diseases (n = 187)Acute leukemia 43Myeloproliferative syndromes 25Myelodysplastic syndromes 36Hodgkin’s disease 10Other lymphomas 73

Severe aplastic anemia 18Solid tumors 14Thrombocytopenia (various causes) 33

Total 252

KIEFEL ET AL.


technique,15 according to a modified protocol obtainedfrom the Central Laboratory of the Netherlands Red Cross(Amsterdam, Netherlands). In brief, platelets were freshlyisolated from EDTA blood by differential centrifugation.Platelet suspensions and sera (supplemented with 0.005 MNa2EDTA) were pipetted into wells of Terasaki trays coveredwith mineral oil. These trays were read microscopically af-ter horizontal rotation at 4°C for 3 hours.16

Statistical methodsThe frequency of alloimmunization in female patients withand without previous pregnancies was compared byFisher’s exact test.17

RESULTSPlatelet-specific antibodiesThe antibody specificity found with the highest frequencywas anti-HPA-5b (Bra) (Table 2). Other specificities found(in decreasing order of frequency) were anti-HPA-1b (PlA2),anti-HPA-5a (Brb), anti-HPA-2b (Koa), and anti-HPA-1a(PlA1). The prevalence of platelet-specific antibodies in allpatients was 20 (8%) of 252; in 5 (2%) of 252 patients, plate-let-specific alloantibodies (anti-HPA-5b in 4 patients andanti-HPA-1a in 1) were not accompanied by HLA class I-specific antibodies. Of the 108 patients with HLA antibod-ies, 15 (13.9%) exhibited additional platelet-specific alloan-tibodies. Anti-HPA-5b was found almost exclusively infemale patients: only 1 of 10 examples of anti-HPA-5b wasfound in a male patient. In 10 patients (4%) (Table 3), weidentified platelet-specific antibodies with “broad” speci-ficity (i.e., the antibodies reacted with one or more platelet

GPs and usually with all platelets of the test panel). Nine ofthese 10 sera contained IgG antibodies reacting in thePAIFT, and in four sera, the LCT showed positive results.

HLA antibodiesSera of all patients were analyzed by two techniques forantibodies to HLA class I antigens, the LCT and the MAIPAassay. Of the 252 patients studied, 108 (42.9%) had HLAantibodies in their sera (a positive result with at least 1/8platelets in the MAIPA assay with an OD >0.8, or panel re-activity of >20% in the LCT). In 66 female patients, we wereable to obtain information about previous pregnancies(Table 4): female patients who had been pregnant weremore likely to be immunized (p = 0.0049).

To study the degree of concordance obtained with theLCT and the MAIPA assay, we studied 40 sera by both tech-niques with an identical panel of platelets and lymphocytes(Table 5) from six individuals. In this comparison, 9 sera

TABLE 2. Frequencies of platelet-specific and HLAclass I antibodies

Antibody specificity Female Male Total

HLA 56 37 093HLA + HPA-5b 05 01 006HPA-5b 04 00 004HLA + HPA-5a 02 00 002HPA-1a 01 00 001HLA + HPA-1b 01 03 004HLA + HPA-1b + HPA-5b 01 00 001HLA + HPA-2b 00 01 001HLA + HPA-1b + HPA-2b 00 01 001

Total 70 (56.5%) 43 (33.6%) 113 (44.8%)

TABLE 3. GP specificities of sera with broadreactivities against platelet GPs

GP specificity Number of sera

IIb/IIIa 04IIb/IIIa + Ia/IIa 02IIb/IIIa + Ib/IX 01IIb/IIIa + Ia/IIa + Ib/IX 03

Total 10

TABLE 4. Relation between rate of immunization andprevious pregnancies in female patients

Immunized

Previous pregnancy No Yes

No 23 07Yes 15 21

TABLE 5. Results of 40 sera studied with the samepanel of six lymphocyte (LCT) and platelet

suspensions (HLA class I MAIPA)LCT/MAIPA*

–/– +/+ –/+ +/– Number of sera

6 0 0 0 91 5 0 0 25 0 1 0 34 0 2 0 23 0 3 0 32 0 4 0 23 1 2 0 13 2 1 0 22 2 2 0 11 2 3 0 12 3 1 0 10 5 1 0 15 0 0 1 34 0 0 2 12 0 0 4 12 3 0 1 11 0 0 5 10 0 0 6 10 1 0 5 10 3 0 3 10 4 1 1 12 0 3 1 1

40

* Number of negative results in both assays, –/–; number of posi-tive results in both assays, +/+; discordant results with nega-tive reactions in LCT/positive reactions in MAIPA, –/+; discor-dant results with positive reactions in LCT/negative reactionsin MAIPA, +/–.

PLATELET ALLOANTIBODIES AND TRANSFUSION


exhibited negative results with platelets and lymphocytesand 2 sera showed concordant positive reactions. The re-maining 29 sera showed discrepant results with 1 to 6 cells(Table 5). Of these, 17 showed graded 1 to 4 positive reac-tions with platelets in MAIPA (HLA class I) but not in theLCT; in 10 sera, 1 to 6 discrepant reactions were positive inLCT, and in 2 sera, discrepant results were observed in bothdirections.

DISCUSSION

Platelet-specific antibodies have been shown to be impli-cated in neonatal alloimmune thrombocytopenia (NAIT),posttransfusion purpura (PTP), and rare cases of passivealloimmune thrombocytopenia. The detrimental effect ofplatelet alloantibodies on the survival time of transfusedplatelets in the circulation was made evident in a patientwith anti-HPA-1b and anti-HPA-3a.18 The clinical signifi-cance of HPA-5b antibodies with regard to the efficiency ofplatelet transfusions has been demonstrated by Bierling etal.,1 who retrospectively analyzed febrile transfusion reac-tions and platelet increments in a multiply transfused pa-tient.

Therefore, the search for platelet-specific alloantibodiesseems rewarding in patients who are refractory to HLA-com-patible platelets. This study provides representative figuresfor platelet alloantibody specificities that can be expectedin transfused patients from a European population.

It is interesting that alloantibody specificities encoun-tered in multiply transfused patients differ considerablyfrom those in patients with PTP and maternal alloantibod-ies in NAIT. In those two conditions, anti-HPA-1a is thespecificity most frequently encountered among white pa-tients,19 whereas anti-HPA-1b and anti-HPA-5b are preva-lent among multiply transfused patients. As these two al-loantigens have approximate frequencies of less than 30percent in the white population, they can be circumventedin the selection of platelet donors. Therefore, each sus-pected platelet antibody should be analyzed for its speci-ficity. Anti-HPA-1b has been found by Schnaidt et al.20 andAllen et al.21 to be quite common in transfused patients.Bonacossa et al.22 found anti-HPA-3b to be the most fre-quently encountered alloantibody, but this specificity isidentified only rarely in other laboratories. In a large seriesof multiparous blood donors, anti-HLA-5b was the mostcommon alloantibody23; however, anti-HPA-1a was the sec-ond most frequent alloantibody in that donor group, whichreflects the different mode of immunization in that studypopulation (pregnancy). Among Japanese24 and AfricanAmericans,25,26 immunization against the Naka alloantigenon GPIV should be taken into consideration in cases ofimmunologically induced refractoriness.

The data reported in this study indicate that, amongmultiply transfused patients, antibodies reacting with one

or more GPs of virtually all donor platelets are encountered.Such antibodies have been observed by other authors andare referred to in the literature as “autoantibodies” or“panreactive antibodies.” Panreactive antibodies were ob-served by Kurz et al.7 in 26 percent of patients, while, in 20percent, they were associated with HLA antibodies. In stud-ies published by Novotny et al.27 and Godeau et al.,28 mostantibodies with undefined specificity were not associatedwith refractoriness to transfused platelets. Godeau et al.28

interpret these antibodies as autoantibodies. As we werenot able to test these sera with the autologous platelets, theantibodies listed in Table 3 cannot be characterized as au-toantibodies, and their significance in platelet transfusionsremains unclear. It is, however, hard to understand why theautoantibodies described by Godeau et al.28 have practicallyno impact on platelet survival time, whereas the antibod-ies encountered in alloimmune thrombocytopenia dra-matically shorten the survival time of allogeneic platelets,which can directly be measured with 51Cr- or 111In-labeledplatelets.29

The significant impact of alloantibodies against HLAclass I antigens on the immunologic compatibility of plate-let transfusions was recognized some decades ago. Thisstudy again confirmed the high incidence of HLA antibod-ies in transfused patients. It demonstrates that sera fromHLA-alloimmunized patients tested against a panel of bothlymphocytes and platelets from identical donors do notalways yield concordant results. One can speculate on thepossible reasons. Antibodies to HLA class I antigens maynot be able to activate complement, or mixtures of HLAantibodies may contain portions that are able to bind tocertain HLA molecules without the capability to activatecomplement. On the other hand, sera were found that re-act positively in the LCT, but that do not contain antibod-ies binding to HLA class I antigens. This constellation canbe anticipated in patients with autolymphocytotoxins intheir sera—that is, antibodies reacting with structures onlymphocytes other than HLA class I antigens. In such pa-tients, a serologic crossmatch procedure assessing thebinding of antibody to platelets would be more appropri-ate than the LCT. Another reason for discrepancies betweenLCT results and immunoglobulin-binding assays withplatelets and lymphocytes from the same donor may be thevariable and sometimes low expression of certain HLA classI antigens on platelets. Thus, Liebert and Aster30 could dem-onstrate that HLA-B12 is expressed on platelets at densitiesvarying ± 35 times from lowest to highest density.

It remains to be determined whether HLA antibodiesthat are not detectable in the LCT but are detectable in an-tiglobulin-binding assays have the capacity to shorten thesurvival of transfused platelets. The nature and the clinicalsignificance of panreactive antibodies should also be ad-dressed in future clinical observations. It is almost certainthat not every positive result in any serologic assay predicts

KIEFEL ET AL.


a low increment in platelet count after platelet transfusion.The optimal strategy for platelet substitution in immunizedpatients remains a challenge.

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Revista de la Facultad de Medicina ISSN 0798-0469 versión impresa

RFM v.25 n.2 Caracas dic. 2002

Como citar

este artículo

REACCIONES POSTRANSFUSIONALES

JA Vázquez1, E Vassallo

1 y MA Storino

2.

1. Médico Cirujano egresado de la Escuela Luis Razetti, Facultad de Medicina,

Universidad Central de Venezuela.

2. Interno de Pre-Grado del Hospital Victorino Santaella de los Teques, Escuela Luis

Razetti, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela.

RESUMEN:

Las numerosas, variadas y potencialmente peligrosas reacciones y complicaciones

de la transfusión de productos alogénicos hacen necesario el conocimiento de su

clínica y tratamiento con el objeto de identificarlas precozmente y prevenir sus

consecuencias. En esta revisión se detalla sobre las diversas reacciones que pueden

presentar los pacientes a los que se le han transfundido productos sanguíneos. Se hace

especial hincapié en aquellas reacciones que tradicionalmente no son objeto de una

revisión profunda y, por lo tanto, poco reconocidas, como la lesión pulmonar aguda

relacionada con la transfusión, la enfermedad injerto-versus-huésped, la

refractariedad plaquetaria, y la inmunomodulación. Los leucocitos presentes en los

productos sanguíneos parecen ser los responsables de muchas de estas reacciones, por

lo que se está recurriendo cada vez más a la leucodepleción de estos productos y a la

irradiación gamma.

Palabras Clave: Transfusión, Reacciones postransfusionales, Sangre alogénica,

Hemoderivados.

ABSTRACT:

The numerous, variety, and potentially dangerous reactions and complications

following an allogenic blood transfusion make necessary the knowledge about their

clinical manifestations and treatment in order to identify them early and avoid their

consequences. In this review, we detail all these reactions that patients who have been

transfused with blood products can complain of. We focus especially in those

reactions traditionally not deeply reviewed, and therefore, barely known, such as

transfusion-related acute lung injury, graft-versus-host disease, platelet refractoriness,

and immunomodulation. The presence of allogeneic leukocytes in transfused cellular

blood products seems to be responsible for many of these reactions, by which

leukodepleted blood products and gamma-irradiation are being increasingly used.

Key Words: Transfusion, Postransfusion reactions, Allogenic blood, Blood products.

INTRODUCCIÓN

A pesar de la cuidadosa selección de donantes y el análisis extenso, la transfusión

de productos sanguíneos alogénicos se asocia ocasionalmente con reacciones

adversas. Existe cada vez más evidencia que algunas de estas reacciones pueden

atribuirse a la presencia de leucocitos en la sangre donante, por lo que se ha

recomendado el uso de componentes sanguíneos leucodepletados como medida

preventiva. Las reacciones postransfusionales se pueden clasificar en agudas y

crónicas, y éstas a su vez, en inmunes y no inmunes, (Tabla 1).

Tabla 1: Reacciones postransfusionales.

I- Agudas II- Crónicas

A- Inmunes 1- Hemolítica

2- Febril no hemolítica

3- Alérgica

4- TRALI*

1- Hemolítica retardada

2- GVHD**

3- Refractariedad

plaquetaria

4- Inmunomodulación

B- No Inmunes 1- Contaminación bacteriana

2- Hipervolemia

1- Hemosiderosis

2- Transmisión de

infecciones

* Lesión pulmonar aguda relacionada con la transfusión

** Enfermedad injerto-versus-huésped

IA1- Reacción transfusional hemolítica aguda

A pesar de avances en el conocimiento de los antígenos de los eritrocitos y su

importancia clínica, las reacciones hemolíticas agudas fatales con la transfusión

ocurren en 1:250.000 a 1:1.000.000 transfusiones(1)

, usualmente (>90%) por

incompatibilidad ABO, debido a error en la identificación del paciente o del

espécimen sanguíneo(2)

. Los aloanticuerpos contra eritrocitos pueden lisar estas

células en la circulación o cubrirlas, acelerando su remoción por el sistema retículo-

endotelial. Otros anticuerpos que causan hemólisis intravascular incluyen el anti-

http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S0798-04692002000200004&script=sci_arttext#t1

Duffy, anti-Kelly y anti-Lewis. Esta reacción no ocurre con componentes del plasma

ni con plaquetas. La rápida destrucción celular generalmente involucra al sistema

ABO, ya que los anticuerpos anti-A y anti-B fijan complemento y están preformados.

Clínica

Dolor en el área de la infusión, eritema, dolor lumbar (por necrosis tubular aguda)

o torácico (por formación de microémbolos), fiebre alta, escalofríos, taquicardia,

taquipnea, fatiga, ansiedad, náuseas, diarrea, diseña, dolor abdominal, hipotensión,

shock, coagulación intravascular diseminada (CID), anemia y oligoanuria. En

pacientes comatosos o anestesiados, el primer signo puede ser la presencia de fiebre,

taquicardia y hemorragia generalizada debida a CID.

Tratamiento

Detener inmediatamente la transfusión e iniciar una hidratación IV a través de

soluciones expansoras, para así restablecer la presión arterial e inducir diuresis.

Pueden administrarse 80-120 mg de furosemida y 25-50 g de manitol IV para inducir

aún más la diuresis. Alcalinizar la orina con una ampolla de bicarbonato en un litro de

Ringer-lactato. Se debe extraer sangre del paciente para realizar pruebas de Coombs

directo e indirecto, identificación del anticuerpo causal, hemoglobina-hematocrito,

bilirrubina, BUN y creatinina y obtener una muestra de orina para cuantificar

hemoglobina en orina.

IA2- Reacción transfusional febril no hemolítica (RTFNH)

Se define como un incremento en la temperatura en 1ºC o más, que ocurre en

asociación con la transfusión de sangre alogénica(3)

. Se ha estimado que RTFNH

ocurre en el 1% de las transfusiones de concentrado de glóbulos rojos (CGR) y en el

30% de las transfusiones de concentrados plaquetarios (CP)(4,5)

. La RTFNH ha sido

atribuida a la presencia, en el plasma del receptor, de aloanticuerpos que reaccionan

con antígenos HLA u otros aloantígenos presentes en los leucocitos y/o plaquetas del

donante(6)

. La remoción del 75% a 90% de los leucocitos de los CGR ha demostrado

reducir significativamente la incidencia de RTFNH en la mayoría de los pacientes(7)

.

Estas observaciones hacen pensar que los pacientes multitransfundidos deben recibir

solo componentes sanguíneos leucodepletados, para prevenir o minimizar la

severidad de esta reacción(7)

. Sin embargo se ha observado una correlación positiva

entre los niveles de factor de necrosis tumoral (TNF), interleukina 1 (IL-1) e IL-6 en

los CP y la frecuencia de RTFNH, aportando evidencias de que tal reacción puede no

siempre ser el resultado de una reacción antígeno-anticuerpo, sino que puede resultar

de la transfusión de mediadores biológicos solubles (citoquinas), que son activamente

sintetizados por los leucocitos presentes en un componente sanguíneo y que se

acumulan durante el almacenamiento(8,9)

. De esta forma, la remoción de leucocitos de

los componentes sanguíneos poco después de su recolección (leucodepleción

prealmacenamiento) puede reducir la incidencia de tales reacciones.

Clínica y manejo

Fiebre y escalofríos que aparecen después de haber transfundido más de media

unidad. Deben utilizarse antipiréticos.

IA3- Reacción alérgica

Se debe a la transferencia pasiva de antígenos del donante a un receptor

sensibilizado. Hay 2 tipos: la reacción alérgica cutánea tipo urticaria, que ocurre con

una frecuencia de 1:200, y la reacción anafiláctica (1:150000).

La reacción urticarial se caracteriza por fiebre, escalofríos, eritema, urticaria y

prurito, y puede ser manejada disminuyendo la velocidad de la transfusión y

administrado antihistamínicos tipo difenhidramina por VO o IV. La transfusión puede

continuar si el tratamiento es eficaz.

La reacción anafiláctica ocurre sobre todo en pacientes con deficiencia de IgA, que

poseen anticuerpos contra la IgA y desarrollan dicha reacción cuando se exponen a

componentes que contienen plasma. La clínica es la de una shock anafiláctico y se

trata como tal (epinefrina, antihistamínicos, esteroides, beta-2 agonistas inhalados).

Estos pacientes deben ser transfundidos con componentes que carecen de IgA, o con

concentrados celulares lavados (CGR o CP), para así remover el plasma ofensor.

IA4- Lesión pulmonar aguda relacionada con la transfusión (TRALI)

Es una complicación potencialmente letal de la transfusión de productos

sanguíneos alogénicos. Aunque la incidencia actual no se conoce y su ocurrencia es

casi con certeza subregistrada, su frecuencia estimada es de aproximadamente 1 en

5000 transfusiones(10)

. Ha sido asociada con la transfusión de sangre completa, CGR,

plasma fresco congelado (PFC) y crioprecipitado. La patogénesis de TRALI se ha

atribuido a la transferencia pasiva de anticuerpos antileucocitos en el donante que

reaccionan con aloantígenos en los leucocitos del receptor, tales como aloanticuerpos

contra HLA-A, HLA-B y aloanticuerpos contra antígenos específicos de granulocitos

que reaccionan con los neutrófilos del receptor(12,13)

. Se ha demostrado que la

filtración vascular pulmonar asociada con TRALI está precedida por la activación del

sistema de complemento, lo que produce lesión de las células endoteliales y

neutrófilos. Las manifestaciones son principalmente en pulmón, ya que este tejido

posee abundantes leucocitos y porque es por donde primero pasan los anticuerpos

transfundidos. Más recientemente, se han implicado en la fisiopatología de TRALI a

productor lípidos reactivos provenientes de membranas de células sanguíneas del

donante que se producen durante el almacenamiento de productos sanguíneos(14)

.

Clínica y manejo

Se caracteriza por fiebre, escalofríos, distress respiratorio agudo, edema pulmonar

bilateral no cardiogénico e hipoxemia severa, que ocurre 1 a 6 horas después de la

transfusión alogénica(3)

. Aunque las características clínicas de TRALI son

indistinguibles de las asociadas al distress respiratorio agudo del adulto, los

infiltrados pulmonares en la mayoría de los pacientes con TRALI se resuelven

rápidamente, en 48 a 96 horas, sin secuelas a largo plazo(3,15)

. La tasa de mortalidad

de TRALI es del 5%. El tratamiento se basa en oxígeno, broncodilatadores y

esteroides.

IB1- Contaminación bacteriana

El organismo más comúnmente implicado en la contaminación bacteriana por CGR

es Yersinia enterocolitica(16)

. También se han descrito otros organismos gram

negativos. La contaminación bacteriana de las unidades de sangre está directamente

relacionada con el tiempo de almacenamiento, aunque la sepsis por yersinia ha sido

reportada después de la transfusión de eritrocitos que habían sido almacenados por

solo 7 a 14 días(17)

. Los síntomas clínicos comienzan típicamente durante la

transfusión. La tasa de mortalidad es de 60% y el tiempo promedio entre la

transfusión y la muerte del paciente es de solo 25 horas. Bacterias como

Staphylococcus aureus y especies de Citrobacter crecen bien a 4ºC y en sangre

citratada, y pueden causar shock séptico y muerte.

El riesgo de sepsis relacionada con la transfusión de CP es de 1:12000. Los

organismos más frecuentemente implicados en estas muertes son, en orden,

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, y

Staphylococcus epidermidis(18)

. La presentación clínica de los pacientes con sepsis

relacionada con CP es más variable que aquella de paciente infectados por transfusión

de CGR contaminados, y puede variar desde fiebre de bajo grado (que puede ser

indistinguible de la RTFNH) a sepsis aguda, hipotensión y muerte. La sepsis debido a

la transfusión de plaquetas contaminadas es subreconocida, en parte debido a que los

organismos que la provocan son los mismos implicados en la sepsis relacionada con

catéteres. La tasa de mortalidad de la sepsis asociada a la transfusión de plaquetas es

de 26%. Por ello, en cualquier paciente que desarrolle fiebre en las primeras 6 horas

de la transfusión de plaquetas, debe ser evaluada la posibilidad de contaminación

bacteriana mediante hemocultivo y debe considerarse el uso de antibióticoterapia

empírica(17)

.

IB2- Hipervolemia

La sobrecarga circulatoria manifestada por edema pulmonar es un riesgo particular

de los pacientes ancianos, los niños, los pacientes con compromiso cardíaco o renal, y

los pacientes con anemia crónica en los cuales la masa de eritrocitos es baja pero su

volumen plasmático está incrementado. En caso de que se presente, debe ser tratada

mediante el uso de diuréticos o sangría.

IIA1- Reacción hemolítica extravascular retardada

Se debe a la presencia de antígenos en los eritrocitos del donante que no están

presentes en los del receptor. Los antígenos más frecuentemente involucrado son los

del sistema Rh, aunque también se incluyen los sistemas Duffy, Kell y Kidd. Una vez

transfundida la sangre incompatible, el receptor fabrica IgG en el curso de 1 a 2

semanas, las cuales cubren los eritrocitos que fueron transfundidos, siendo removidos

por el sistema retículo-endotelial(19)

.

Clínica, tratamiento y prevención

Malestar, fiebre e ictericia son los más comunes, usualmente de leve intensidad y

generalmente 5 a 10 días después de la transfusión. En las pruebas de laboratorio se

evidencia anemia e hiperbilirrubinemia indirecta; es rara la hemoglobinuria con daño

renal. Tanto el Coombs directo como el indirecto son positivos. Debe asegurarse una

buena hidratación y diuresis, vigilar la función renal y evitar el uso de agentes

nefrotóxicos. Como medida preventiva, debe utilizarse sangre que no posea el

antígeno para el cual el paciente tiene anticuerpos.

IIA2- Enfermedad injerto-versus-huésped (GVHD)

La GVHD es un desorden mediado inmunológicamente y potencialmente letal que

resulta del injerto de linfocitos T donante inmunocompetentes en los tejidos del

receptor(20)

. Las transfusiones de sangre completa y de CGR han sido implicadas en la

mayoría de los casos, pero los concentrados de granulocitos, CP, y plasma fresco (no

congelado) que contienen linfocitos viables también han sido implicados. No se ha

reportado que los productos sanguíneos congelados produzcan GVHD. El diagnóstico

de la GVHD usualmente es clínico, pero los hallazgos histopatológicos en la piel que

muestran infiltrado linfocítico con disqueratosis satélite pueden ayudar a distinguir la

GVHD de una toxicidad medicamentosa o una infección cutánea. Recientemente, se

ha usado la dactiloscopia genética (genetic fingerprinting) y la reacción en cadena de

la polimerasa para confirmar el quimerismo HLA en los linfocitos de sangre

periférica de los individuos afectados(21)

.

Recientemente, se ha demostrado que la GVHD es causada por una red de

interacciones que involucra a células efectoras, múltiples citoquinas, y células

blanco(22)

. Las células epiteliales y las células madre hematopoyéticas representan las

células blanco del huésped, mientras que los linfocitos T citotóxicos y las células

natural killer (NK) actúan como las células efectoras primarias del donante alogénico.

Aunque las células NK pueden causar histolisis por contacto celular directo, el daño

de los tejidos del huésped puede ocurrir debido a la liberación de TNF-a, TNF-b, e

IL-1 por los linfocitos T citotóxicos y células NK del donante(23)

. La GVHD puede

exacerbarse por la infección concomitante por herpes virus o citomegalovirus (CMV),

ya que estas infecciones pueden producir alteraciones en la regulación inmune del

huésped, así como provocar modificaciones en las superficies celulares,

incrementando la susceptibilidad de las células blanco del huésped al ataque por las

células efectoras.

La ocurrencia de la GVHD en un receptor de transfusión depende de la

inmunocompetencia del huésped, la similitud genética entre el donante y el receptor,

y el número de linfocitos T donantes viables presentes en el producto sanguíneo

transfundido(23)

. Típicamente, se ha reportado que la GVHD ocurre en pacientes

inmunosuprimidos cuyo sistema inmune está alterado como resultado de

prematuridad, estados de inmunodeficiencia congénitos, cánceres hematológicos,

tumores sólidos, o receptores de transplantes de médula ósea(20)

. Sin embargo, se ha

acumulado evidencia que indica que la GVHD también puede afectar a individuos

inmunocompetentes.

La prevención de la GVHD se basa en la alteración de la viabilidad o del número

total de linfocitos T en un producto sanguíneo celular antes de la transfusión. La

radiación gamma es el procedimiento generalmente utilizado para prevenir la GVHD.

La dosis mínima recomendada de 15 Gy ha demostrado disminuir la respuesta

mitógena de linfocitos en un 90%, sin comprometer la función de las otras células

sanguíneas(24)

. Sin embargo, debido a que un pequeño porcentaje de linfocitos puede

sobrevivir a la radiación con 15 Gy, se ha sugerido que una dosis de 25 a 30 Gy

puede ser más apropiada para prevenir la GVHD.

Otro enfoque preventivo ha sido la reducción en el número de linfocitos donantes

usando filtros de leucocitos que produzcan una reducción de al menos 3 unidades

logarítmicas.

IIA3- Refractariedad plaquetaria (púrpura postransfusional)

Aproximadamente el 50% de los pacientes politransfundidos se vuelven

refractarios a los CP, limitando la efectividad clínica de esta terapia. La mayor parte

de la refractariedad a la transfusión plaquetaria parece ser causada por

aloinmunización a antígenos HLA o contra antígenos específicos de plaquetas, pero la

presencia de fiebre, sepsis, CID, uso concurrente de drogas, esplenomegalia e

incompatibilidad del grupo sanguíneo ABO pueden contribuir a la recuperación

inadecuada de plaquetas después de una transfusión(25)

. Se ha estimado que en el 20%

a 50% de los pacientes que reciben múltiples transfusiones de plaquetas pueden

detectarse aloanticuerpos contra antígenos HLA y/o antiplaquetarios específicos(26)

.

Se desconoce el mecanismo preciso de la aloinmunización plaquetaria. Debido a

que las plaquetas expresan solo antígenos HLA clase I, se ha postulado que es

necesaria la presencia en el componente sanguíneo donado, de células presentadoras

de antígenos funcionales, que expresen antígenos HLA clase I y II, para iniciar la

respuesta inmune en el receptor(27)

. Es así como se ha postulado que las células

presentadoras de antígenos presentan péptidos antigénicos en conjunción con

antígenos HLA clase II del donante a linfocitos T CD4 (TH2) del receptor, para

inducir la producción de citoquinas y así estimular a los linfocitos B para producir

aloanticuerpos. Los péptidos HLA clase I también pueden ser reconocidos por los

linfocitos T CD8 (TH1), iniciando así una respuesta inmune citotóxica. Por ello, esta

respuesta inmune mediada por linfocitos T requiere de la interacción entre las células

presentadoras de antígenos del donante y linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 del

receptor(27)

.

Se han utilizado varios métodos para reducir o prevenir la aloinmunización

plaquetaria. Éstos incluyen el uso de plaquetas ABO-compatibles provenientes de un

solo donante (obtenidas por plaquetaféresis), el uso de plaquetas HLA-compatibles de

donantes únicos (obtenidas también por plaquetaféresis), radiación UV-B, y la

leucodepleción de los componentes sanguíneos celulares alogénicos. Los estudios

indican que los pacientes que reciben productos sanguíneos leucodepletados tienen un

menor riesgo de refractariedad plaquetaria que los receptores de productos no

leucodepletados(28,29)

. A pesar de estos resultados, quedan algunas preguntas sin

responder con respecto al impacto clínico de la leucodepleción para prevenir la

refractariedad plaquetaria. Éstos incluyen el grado y momento de la leucodepleción y

la relación costo-efectividad de esta intervención. En modelos animales, se demostró

que leucodepleción de sangre completa alogénica antes de su almacenamiento

(leucodepleción prealmacenamiento) se asocia con una frecuencia reducida de

refractariedad plaquetaria y mayor supervivencia plaquetaria in vivo, comparada con

la leucodepleción de sangre completa después del almacenamiento(30)

. Estos

experimentos animales sugieren que la aloinmunización puede estar relacionada no

solo con el número de leucocitos presentes en el componente transfundido, sino

también con la presencia de antígenos MHC u otros, ya sea en su forma soluble o

como micropartículas (formando parte de membranas biológicas fragmentadas), que

escapan a la filtración leucocitaria. Es probable que los antígenos HLA clase I

particulados, en forma de micropartículas presentes en el plasma alogénico,

contribuyan a la aloinmunización asociada con la transfusión de componentes

sanguíneos. La reciente demostración que la combinación de leucodepleción y

remoción de plasma elimina la refractariedad plaquetaria soporta esta hipótesis.

La radiación UV-B parece modificar la presentación de antígenos alogénicos,

deprimiendo la expresión de antígenos HLA clase I y II en los inmunocitos. También

se han reportado cambios en las moléculas de adhesión, como ICAM-1 y CD14 con

este tipo de radiación, lo que interfiere con la producción de IL-1 e IL-6, lo cual, a su

vez, altera la presentación de antígenos a los linfocitos B. La radiación UV-B parece,

entonces, reducir la aloinmunización plaquetaria sin afectar la función de las

plaquetas in vitro ni la sobrevida plaquetaria postransfusional(31)

.

IIA4- Inmunomodulación

Transfusión de sangre y transplante de aloinjertos

El efecto benéfico de la transfusión de sangre alogénica en el transplante renal fue

descrito hace más de 20 años, y ha sido reproducido en numerosos estudios(32,33)

. En

general, los pacientes transfundidos con productos sanguíneos alogénicos tienen tasas

de sobrevida del aloinjerto renal significativamente mejores que los pacientes no

transfundidos, sin importar el número de locus HLA-A o HLA-B no compatibles.

Aún con aloinjertos de gemelos HLA idénticos, se demostró que 33% de los

receptores alogénicamente transfundidos experimentan rechazo del injerto,

comparado con el 75% de los receptores no transfundidos.

El mecanismo por el cual la transfusión de sangre alogénica mejora la sobrevida de

aloinjertos no se ha dilucidado completamente. Se ha propuesto que el efecto de la

transfusión de sangre alogénica ocurre por el desarrollo de una red de células

supresoras, la inactivación de clones alorreactivos mediante inmunosupresión y/o la

inducción de anticuerpos antiidiotipo y anticlonotipo(27)

. Existe evidencia

considerable para sugerir que la transfusión de sangre alogénica induce la producción

de linfocitos T supresores. Se ha demostrado la presencia de anticuerpos antiidiotipo

en el suero de receptores de sangre y en pacientes con aloinjertos funcionales a largo

plazo(34)

. Además, la presencia de anticuerpos antireceptor de Fc en el suero de

receptores renales se ha asociado con una tasa de sobrevida del aloinjerto de 93% al

año y 71% a los 3 años, comparado con el 29% al año y 25% a los 3 años de

pacientes que carecen de dichos anticuerpos(35)

.

Transfusión de sangre y crecimiento tumoral

La posible asociación entre la transfusión de sangre alogénica y la recurrencia del

cáncer se sugirió hace más de 10 años, surgiendo la preocupación que el efecto

inmunomodulador de las transfusiones administradas perioperatoriamente pudiera

afectar a los pacientes que fueran operados con intención curativa por una

enfermedad maligna. Se ha recopilado gran cantidad de información sobre estos

efectos a partir de estudios de pacientes con carcinoma colorectal. El efecto adverso

de la transfusión de sangre se ha reportado en el 50% de estos estudios, mientras el

otro 50% no reportan un efecto adverso. Sin embargo, los resultados de meta-análisis

soportan la hipótesis que la recurrencia de carcinoma colorectal y las muertes

relacionadas con dicho cáncer es mayor en pacientes alogénicamente

transfundidos(36,37)

. Los estudios en animales indican que el efecto de la transfusión

de sangre alogénica en el crecimiento tumoral se relaciona con la presencia de

leucocitos en la sangre donada, y que este efecto deletéreo puede minimizarse

mediante la leucodepleción prealmacenamiento. Hay datos que evidencian que la

leucodepleción después del almacenamiento carece del beneficio preventivo sobre el

efecto promotor del crecimiento tumoral inducido por la transfusión de sangre(3)

.

Transfusión de sangre e infección

La asociación entre la transfusión de sangre perioperatoria y el aumento en la

incidencia de infecciones bacterianas después de la cirugía se ha examinado en varios

estudios clínicos y experimentales. Se ha demostrado también que esta relación es

dosis-respuesta, es decir, mientras mayor es el número de unidades transfundidas,

mayor es el riesgo de infección. Las complicaciones postquirúrgicas no infecciosas no

se ven afectadas(37,38)

.

Los leucocitos alogénicos parecen participar en el desarrollo de infecciones

postoperatorias, ya que los pacientes transfundidos con sangre leucodepletada

muestran un riesgo de infección significativamente menor que aquéllos transfundidos

con sangre completa(3)

. La tasa de infección bacteriana reportada en pacientes

transfundidos con sangre alogénica es de 20% a 30%, comparada con el 5% a 10% de

los pacientes no transfundidos o transfundidos con sangre autóloga(3)

.

Mecanismo de la inmunomodulación inducida por la transfusión

Aunque el mecanismo preciso no se conoce, se ha postulado que los efectos

inmunosupresores están mediados inmunológicamente(27,39)

. Los leucocitos

alogénicos presentes en los productos sanguíneos celulares exhiben antígenos MHC

clase II, y se ha sugerido que las células presentadoras de antígenos del donante

presentan estos antígenos a los linfocitos T del receptor(27)

. La interacción MHC-

linfocito T provee la primera señal que produce la expresión de receptores de IL-2 en

los linfocitos T. Esto es insuficiente para evocar una respuesta inmune, ya que se

requiere de una segunda señal para inducir la secreción de varias citoquinas, que

causarán la proliferación y diferenciación de linfocitos T específicos para el

aloantígeno(40)

. La inmunogenicidad de los antígenos MHC depende de la habilidad

de las células presentadoras de antígenos del donante para estimular los linfocitos T

del receptor a través de las 2 señales diferentes requeridas. La ausencia de la segunda

señal produce anergia de células T, y eso explicaría la inmunosupresión inducida por

la transfusión de sangre alogénica(41)

.

IIB1- Hemocromatosis

La sobrecarga de hierro inducida por transfusiones es una consecuencia fatal

frecuente con la transfusión crónica para ciertos tipos de anemias. Los niños con

talasemia constituyen el grupo aislado más grande afectado. Cada mililitro de

eritrocitos deposita 1,08 mg de hierro en los tejidos a medida que dichos eritrocitos

envejecen y mueren. El depósito de hierro comienza a afectar las funciones

endocrinas, hepática y cardíaca cuando la carga alcanza los 20 g, el equivalente a 100

unidades de CGR. Las complicaciones cardíacas letales ocurren con 60 g (300

unidades). Por lo tanto, debe considerarse la terapia con quelantes de hierro en todos

los pacientes que requieran de transfusiones crónicas.

IIB2- Transmisión de infecciones

Numerosos virus pueden ser transmitidos a través de transfusiones. Para disminuir

el potencial de transmisión de enfermedades, los donantes son evaluados a través de

una historia médica para detectar factores de riesgo, y la sangre donada se somete a

una batería de estudios de pesquisa en el laboratorio. Se han desarrollado técnicas de

esterilización para algunos componentes plasmáticos, pero todavía no existe un

método para esterilizar los componentes sanguíneos celulares.

Hepatitis B y C (HBV y HCV)

El énfasis en la donación de sangre voluntaria, la pesquisa de donantes y las

pruebas específicas para detectar anticuerpos contra el HBV y HCV han disminuido

las tasas de transmisión a 1:30.000-1:250.000 para la hepatitis B y 1:150.000 para la

hepatitis C. La incidencia actual de hepatitis B postransfusional es extremadamente

baja, y está disponible una vacuna contra el HBV efectiva para pacientes susceptibles

que requieran de una terapia transfusional crónica. La importancia de la infección

postransfusional con el HCV radica en que el 85% de las infecciones se hacen

crónicas, 20% llevan a cirrosis, y 1 a 5% conducen a carcinoma hepatocelular(17)

.

Retrovirus

Varios retrovirus humanos pueden ser transmitidos mediante transfusión de sangre.

Después de la implementación de la prueba de detección de anticuerpos anti-HIV en

Marzo de 1985, la incidencia de HIV postransfusional ha disminuido

significativamente, hasta ubicarse en la actualidad en 1:200.000-1:2.000.000(42)

. Para

disminuir aún más el riesgo de HIV trasmitido a través de transfusiones, los bancos

de sangre de Estados Unidos han comenzado a detectar el antígeno p24 en los

donantes, con el objeto de disminuir el riesgo de transmisión de HIV en donante s que

se encuentran en el período de ventana serológica. En un año de experiencia, de un

total de 6 millones de donaciones evaluadas, solo se identificaron 2 donantes

positivos (ambos fueron positivos para el antígeno p24 pero negativos para

anticuerpos contra el HIV)(17)

.

CMV

Las infecciones por CMV asociadas a transfusión son una causa significativa de

morbimortalidad en receptores de productos sanguíneos es riesgo, tales como mujeres

embarazadas seronegativas para CMV, recién nacidos prematuros nacidos de madres

seronegativas, receptores de transplante de médula ósea alogénica seronegativos, y

pacientes con SIDA seronegativos para CMV(43)

.

El CMV se ha aislado de los leucocitos de sangre periférica de individuos

infectados. Esto sugiere que la remoción de los leucocitos de la sangre donada puede

prevenir la infección. En este contexto, el uso de CGR congelados y desglicerolizados

ha prevenido la transmisión de CMV, y la transfusión de CGR lavados (remoción del

87% de los leucocitos) de donantes seropositivos para CVM a neonatos se ha

asociado con una frecuencia de seroconversión en el receptor de 1,3%, comparado

con una seroconversión de 13% a 35% en los receptores de CGR no lavados(44)

.

El mantenimiento de un inventario satisfactorio de sangre seronegativa para CMV

puede ser difícil. El uso de filtros de leucocitos ha demostrado disminuir la infección

por CMV asociada a transfusiones a casi cero, y ciertos estudios indican que el uso de

productos sanguíneos leucodepletados equivale al uso de productos provenientes de

donantes seronegativos.

Otros virus

La prevalencia de hepatitis G entre los donantes de sangre de Estados Unidos es de

1 a 2%. Aunque el virus puede ser transmitido por transfusiones, no existe evidencia

convincente que el virus ser hepatotrópico o produzca enfermedad(45)

. Actualmente,

no existe un método de pesquisa aprobado, y no hay evidencia que la implementación

de tal método tenga algún beneficio.

La transmisión del virus de la hepatitis A a través de transfusiones se ha estimado

en un caso por millón de unidades (1:1.000.000). La ausencia de un estado de

portador crónico y la presencia de síntomas que podrían excluir la donación de sangre

durante la breve fase virémica de la enfermedad explican por qué el HAV está

infrecuentemente asociado a la transfusión de sangre(17)

.

El riesgo de transmisión de parvovirus B19 relacionado con transfusión es incierto,

ya que depende de la prevalencia en los donantes de sangre, lo cual varía

ampliamente de año a año. Sin embargo, se ha estimado en 1:10.000. Generalmente,

la infección no es clínicamente significativa, excepto en ciertas poblaciones, como

mujeres embarazadas (en las cuales puede producir hidropesía fetal), pacientes con

anemia hemolítica (en los cuales puede inducir crisis aplásicas) y en pacientes

inmunocomprometidos (en los cuales puede desarrollarse anemia aplásica crónica)(46)

.

Un 20% a 60% de los receptores de sangre infectada con el virus linfotrópico de

linfocitos T humanos tipos I y II (HTLV-I y HTLV-II) desarrollarán infección(47)

.

Estos virus han sido aislados de pacientes con paraparesia espástica tropical, leucemia

de células T y leucemia de células pilosas. El riesgo de transmisión está influenciado

por el tiempo en que la sangre ha sido almacenada y por el número de leucocitos en la

unidad de sangre. La sangre que ha sido almacenada por más de 14 días y los

productos sanguíneos no celulares, como el crioprecipitado y el PFC, parecen no ser

infecciosos. El riesgo de infección postransfusional es de 1:250.000 a 1:2.000.000. A

partir de 1988 se introdujo la primera generación de pruebas que detectan estos virus

en la sangre donada.

El virus de Epstein-Barr (EBV), virus asociado a linfocitos B, puede ser trasmitido

por transfusiones de sangre y causar un síndrome de mononucleosis infecciosa.

Aunque la remoción de los leucocitos de los productos sanguíneos podría prevenir la

transmisión de EBV, no hay evidencias que soporten esta hipótesis(3)

.

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Los concentrados de plaquetas se pueden administrarcomo tratamiento de un proceso concreto en caso de

hemorragia por alteración cuantitativa o cualitativa de las pla-quetas, o más frecuentemente como profilaxis de la hemorra-gia en pacientes trombopénicos.

CONSIDERACIONES GENERALESAnte una indicación de CP es muy importante valorar:

- La cifra de plaquetas del paciente.- Rapidez en la instauración de la misma trombopenia.- Valoración de otros parámetros sanguíneos (hematocri-

to y alteraciones de la coagulación asociadas).- Situación clínica del paciente: hemorragia activa en el

momento de la TS.- Causa de la trombopenia, por ejemplo: déficit de pro-

ducción medular (aplasia, postquimioterapia, etc.). - Consumo periférico (PTI, PTT, CID), esplenome-

galia.

Dosis de CP y valoración del rendimientoPara que el incremento post-transfusional sea de unas20.000 plaquetas/µ, la dosis adecuada de transfusión en

125

TRANSFUSIÓN DE CONCENTRADOS DEPLAQUETAS, PLASMA Y COMPONENTESPLASMÁTICOS, Y GRANULOCITOS

Capítulo 7

L. Barbolla. Hospital de Móstoles, Madrid. M.M. Pujol. Hemo-Institut Grifols. Banco de Sangre.

Clínica Corachan. Barcelona.

Cap.

7

12. Cap.7. Indicaciones 18/12/2003 14:26 Página 125

un adulto es de 3 x 1011 l. La cantidad de CP a transfundir,depende de la fuente de obtención de los mismos:

- CP obtenidas por aféresis: la cifra suele estar indicadaespecíficamente y habitualmente esta en torno a 3 x 1011.Dosis: 1 CP.

- CP procedentes de unidades de ST estándar: contenidode cada unidad 0,5-0,6 x 1011. Para llegar a la cifra anteriorse requieren 5-7 U por lo que se suele indicar como dosis1 U/10 kg de peso del receptor.

- CP obtenidos de capas leucoplaquetarias: la mezcla de4-5 U alcanza habitualmente las cifras antes mencionadas.Dosis: 1 mezcla de 4-5 U.

- Dosis en pediatría. Recién nacidos: 10 ml de CP por kgde receptor. Niños hasta 10 kg: 1 U de CP.

La frecuencia de administración estará de acuerdo con la indi-cación clínica. En indicación profiláctica lo habitual es 1 dosis/24-48 h. En los casos de profilaxis para intervenciones qui-rúrgicas se transfundirán inmediatamente antes de la cirugía.

El rendimiento del CP, además del cese de la hemorragia encaso de sangrado, se mide por el incremento de la cifra de pla-quetas circulantes post-transfusión, lo que depende de recuen-to pre-transfusional, unidades de plaquetas transfundidas,superficie corporal de receptor. Existen diversas fórmulas sien-do una de las más utilizadas el incremento de conteo corregido.

Nº Pla PreTx - Nº Plaq PostTx x Superficie corporal m2

CCI= ---------------------------------------------------------------------------------------------Número de plaquetas transfun. x 1011

El incremento esperado en pacientes con TS profiláctica,con dosificación correcta de CP y AB0 compatibles es de10-20.000 Pla/µl. Rendimientos menores pueden observar-

126

Transfusión de concentrados...


se en caso de hemorragia o esplenomegalia (10-20% delnormal), y aumentos mayores en caso de esplenectomía.

El incremento debe medirse a la hora y a las 24 horaspost-TS. En casos rendimiento de < 7.500 Pla en más de 2TS seguidas, con CP correctos, se considera que existerefractariedad plaquetaria, de causa inmune o no inmune,procediéndose al estudio de la misma.

En los casos de bajo rendimiento a la hora de la TS, se sos-pechará destrucción inmune mientras que un rendimientoadecuado a la hora y no duradero a las 24 horas, indica con-sumo por diversos factores (hemorragia, sepsis, coagulopa-tía de consumo, administración de antibióticos [vancomici-na cefalosporinas o anfotericina] esplenomegalia, etc.).

A pesar de que el esquema propuesto es el más habitual, sehan publicado estudios mostrando la conveniencia de trans-fusión de dosis mayores de plaquetas y mayor intervalo,sobre todo en pacientes trasplantados, sin que de momentoexista un consenso a cerca de la conveniencia de uno u otroesquema.

Refractariedad plaquetariaFallo en el incremento del número de plaquetas después dedos TS seguidas, con CP de calidad comprobada, AB0 com-patibles y en ausencia de fiebre, infección, hemorragia,esplenomegalia o CID. Puede ser de causa inmune y noinmune.

• Refractariedad de causa inmune. Debe sospecharse lapresencia de Ac anti plaquetas, HLA o PLA en los casos derefractariedad sin causa clínica que la justifique. Es más fre-cuente en mujeres multiparas y politransfundidos. Su demos-tración se hará mediante el estudio de Ac antiplaquetarios.

127

L. Barbolla, M.M. Pujol


• Refractariedad plaquetaria no inmunológica. Falta derendimiento numérico en ausencia de Ac antiplaquetarios.Investigar otras causas: sepsis, esplenomegalia, antibióticos,sangrado en mucosas, etc.

Indicación de transfusión de CP Una disminución en la cifra de plaquetas per se, no es indica-ción de transfusión de CP. Trombopenias de 50.000 /µl rara-mente precisan CP, entre 20 y 50.000 pueden tener indica-ción en determinadas ocasiones (cirugía, pruebas diagnósticaso terapéuticas invasivas, etc.) y en torno a 10.000 es el nivelmás frecuente de su uso como profilaxis de hemorragia.

Aunque posiblemente la prueba de laboratorio idónea parala indicación de CP sería el tiempo de hemorragia, debido ala dificultad de realización en algunos pacientes y de su estan-darización, no se usa de forma rutinaria. El parámetro que seutiliza habitualmente como umbral de decisión de CP es elnúmero de plaquetas, a pesar del error de recuento en nivelestan bajos como 5-10.000 Pla/µl.

• Factores de riesgo. En la indicación de CP, además de lacifra de plaquetas, pueden modificar el criterio algunos datosque se consideran factores de riesgo de sangrado, como son:

- Anemia.- Edad avanzada.- Neonatos. - Hipertensión.- Infección grave.- Mucositis (cavidad oral, microhemorragia intestinal o

vesical).- Tratamiento con determinados fármacos (antibióticos/

antifúngicos).

128



- Alteración de la coagulación, coagulopatía de consumo.- Esplenomegalia.- En pacientes trasplantados con CPH: EICH y enferme-

dad venoclusiva.- Presencia de Ac antiplaquetarios/refractariedad.- Situación clínica concreta: pruebas diagnósticas invasi-

vas de riesgo, intervención quirúrgica inminente sobre SNCu oftalmológica.

• Requisitos específicos en la administración de CP. Ade-más de los requisitos generales en transfusión de CS, sonespecíficos de la administración de CP:

- Compatibilidad AB0: es preferible la administración deCP con AB0 idéntico al receptor, si no es posible, administrarlas plaquetas con incompatibilidad menor, tomando la pre-caución de retirar el plasma sobrenadante cuando son trans-fusiones repetidas, para evitar la anemia inmune. En algunoscasos de transfusión con incompatibilidad menor, se haobservado un menor rendimiento (destrucción de plaquetaspor depósito de complejos inmunes).

- Como última opción, plaquetas con incompatibilidadmayor, que tiene un rendimiento menor que en los casosanteriores.

- En caso de CP unitarios, se han de mezclar las bolsas, conmedidas de asepsia, en el Banco de Sangre antes de transfun-dirlas. La caducidad del CP es de 6 horas a partir de la horade la mezcla.

Efectos desfavorables más frecuentes en los CPLa transfusión de plaquetas los CP tiene algunos efectosdesfavorables que, aunque no son específicos, sí se producencon más frecuencia que en otros actos transfusionales:

129



- Reacciones febriles no hemolíticas, relacionadas con Acantiplaquetarias y la liberación de citoquinas por los leuco-citos contaminantes. Son más frecuentes con los CP no leu-correducidos prealmacenamiento, incluso aunque se usenfiltros a pie de cama.

- Contaminación bacteriana, más frecuente que en losCH, debido a la conservación a 22°C .

- Aloinmunización, HLA o frente a Ag propios de las pla-quetas.

- Hemolisis de hematíes del receptor en caso de TS reite-radas con incompatibilidad menor AB0.

INDICACIONES DE CPTrombopeniasAdministración profiláctica: objetivo y umbral de transfusión. El objetivo de la administración profiláctica de CP es elmantenimiento de cifras de plaquetas en niveles que se con-sideran suficientes y con la frecuencia necesaria para evitarla hemorragia en pacientes estables sin sangrado activo.Además de otras consideraciones ya expuestas, el umbralnumérico para establecer la indicación será el siguiente:

- Pacientes sin factores de riesgo: cifra de plaquetas de5.000-10.000 µl en hemograma.

- Pacientes con factores de riesgo: cifra de plaquetas de10-15.000 µl en hemograma.

- Cirugía mayor: 50.000 µl. - Si la cirugía es en SNC u oftalmológica: 100.000 µl.- Esplenomegalia y cirugía: transfundir mayor cantidad

de CP que habitual inmediatamente antes de la cirugía,debido al escaso rendimiento numérico por secuestro esplé-nico, pero considerar niveles efectivos más bajos.

130



Administración terapéutica en hemorragia: objetivo y umbral de transfusión.En pacientes con hemorragia activa, el objetivo es cese de lahemorragia lo más rápido posible y mantenimiento de pla-quetas para evitar recidiva de la misma.

- Hemorragia en pacientes con trombopenia intensa:Intentar cese de hemorragia y mantener Pla. por encima de50.000 µl.

- Hemorragia en SNC: Idem y mantener 100.000 µl.- Será necesario la administración de otros CS, principal-

mente CH.- Además del CP, se tendrán en cuenta medidas coadyu-

vantes, locales y generales, para tratamiento de la hemorragia.

Trombopenias con indicación de CP: situaciones clínicas.• Fallo de producción medular.Trombopenia central aguda:- Aplasia u ocupación medular (leucemia/linfoma). - Aplasia yatrogénica: quimio/radioterapia.- Otros: anemia megaloblástica. La trombopenia puede ser debida a ocupación medular por

la enfermedad del paciente (leucemias y otros tumores hema-tológicos) o a la aplasia secundaria a la quimioterapia admi-nistrada como tratamiento antineoplásico. En general, se tra-ta de cuadros de trombopenia grave, pero con posibilidadesde recuperación medular a corto-medio plazo y constituyenla indicación principal de administración de CP profiláctico.Otro caso específico es el periodo de aplasia en el trasplantede CPH, sobre todo alogénico de donante no emparentadocon el paciente o trasplante de sangre de cordón; en amboscasos, la trombocitopenia suele ser prolongada.

131



Actitud terapéutica:- Hemorragia activa: indicación de CP hasta cese de la

hemorragia.- Considerar transfusión de otros CS así como medidas

complementarias: compresión en zonas de sangrado accesi-bles, cirugía en lesiones con posible actuación quirúrgica,taponamiento nasal, enjuagues con E-aminocapróico orales,etc.

- Indicación profiláctica: la cifra de plaquetas admitidageneralmente es de 10.000 /µl, aún cuando existen numero-sos estudios que fijan niveles de 5.000, para pacientes establessin factores de riesgo descritos. Además de la valoración clíni-ca y la cifra de palquetas, es importante considerar medidascomplementarias:

• Hb g/dl o hematocrito que debe ser de 27-30%.• Corrección de alteraciones de coagulación: vitamina K

en deficiencias o hepatopatías o administración de PFC encasos seleccionados.

• Corrección si posible de alteración de la función plaque-taria (uremia, administración anfotericina B, etc.).

• Etapa de la quimioterapia en la que se encuentra elpaciente: administración más liberal en periodo de quimiote-rapia grave y más restrictivo cuando el paciente se está recu-perando, con cifras de granulocitos de más de 500, menorriesgo de infección, etc.

• Presencia de anticuerpos antiplaquetarios. Si es posiblese transfundirá CP compatibles o fenotipados. Aún así, elincremento de plaquetas post-TS no es siempre el esperado.Si esto no es posible y se han de transfundir plaquetas notipadas HLA, su administración profiláctica es un temacontrovertido. Mientras unos autores indican transfusión

132



de CP diario, sin vigilar incrementos, otros indican CP sola-mente en caso de sangrado.

• Profilaxis en procesos invasivos (punción lumbar) o ciru-gía con observación del campo quirúrgico y posibilidad dehemostasia: ,deben mantenerse en 50.000/µl. No es necesariaesta cifra para punción-biopsia de médila ósea.

• Cirugía en SNC: en 100.000/µl. • Trombopenias centrales crónicas: aplasias idiopática,

mielodisplasias, etc. • Aplasia crónica o mielodisplasia: transfundir CP sola-

mente en caso de sangrado activo, riesgo elevado o interven-ción quirúrgica.

• Anemia megaloblástica. Suele responder muy bien al tra-tamiento etiológico, pero pueden ser necesarios CP en situa-ciones puntuales.

• Las dosis y precauciones son las que se han indicado ante-riormente.

• Aumento de consumo: trombopenias periféricas. Cua-dros con producción normal o aumentada de plaquetaspero con destrucción periférica elevada, lo que originatrombopenia. La destrucción puede ser debida a:

Destrucción inmune: anticuerpos. - Autoanticuerpos: trombopenia en PTI secundaria a

otras enfermedades: LED, LLC, etc.- Aloinmune: púrpura post-transfusional (PPT) y púrpu-

ra neonatal (PNI).Destrucción no inmune: - CID.- Trasplante hepático.- CEC. - Sepsis, hiperesplenismo.

133



Otras causas:- Transfusión masiva, trombopenia dilucional.

• Destrucción inmune. Autoinmune y aloinmune. Enestos procesos la causa de destrucción de las plaquetas es lapresencia de Ac frente a Ag plaquetarios. Pueden ser:

Autoanticuerpos: - PTI, LED, síndromes linfoproliferativos, etc. - Trombopenia inducida por heparina (TIH) en relación

con la administración del medicamento.- Los Ac son generalmente IgG, suelen tener carácter de

panaglutinina y reaccionan con Ag presentes en todas las pla-quetas. Por ello la eficacia de los CP transfundidos es mínima.

Actitud terapéutica:- El tratamiento es siempre el del proceso base, reserván-

dose los CP para casos de hemorragia grave concomitante(úlcera de estómago, amenaza de hemorragia cerebral, etc.).Actualmente se preconiza la administración de los CP tras laadministración de una dosis de Igs IV.

- PTI. Comenzar siempre con tratamiento farmacológico(esteroides, IgIV, inmunosupresores, pulsos de glucocor-ticoides en dosis elevadas, CyA, anti CD 20). Los CP noestán indicados de manera profiláctica, pero pueden sernecesarios en caso de hemorragia (digestiva, SNC).

- Esplenectomía en PTI: tener CP disponibles para casosde hemorragia quirúrgica aunque son necesarias en rarasocasiones; de ser así, administrarlas preferiblemente tras laligadura quirúrgica del pedículo esplénico.

- En caso de PTI con sangrado, se recomienda adminis-trar los CP tras una dosis de IgS IV.

- TIH. Los CH están contraindicados. Considerar trata-miento con hirudina y recambio plasmático.

134



Aloanticuerpos:- Púrpura post-transfusional (PPT) y trombopenia neo-

natal inmune (TNI). Generalmente el AloAc tiene especifi-cidad anti HPA-1a.

- Transfusional. Casos excepcionales de trombopenia enreceptores de transfusión de PFC de donantes con PTI nodetectados en el reconocimiento.

Actitud terapéutica:- PPT. Su causa es compleja (capítulo 8). Los CP suelen

ser ineficaces con independencia de la ausencia del antígenoimplicado.

- TNI . No está demostrado fehacientemente la ventajade la administración profiláctica intrautero de CP. Sinembargo, en casos concretos de riesgo de hemorragia, losCP carentes del Ag, tanto intrautero como en el periodoneonatal, parecen reducir la incidencia de hemorragiaintracraneal.

• Consumo plaquetario de causa no inmune. Constituyenun grupo heterogéneo de situaciones clínicas en las que lasplaquetas son destruidas por causas diversas. Generalmenteno existen estudios randomizados y la indicación de CP, trasla corrección de la causa que produce la destrucción plaque-taria, es individual y debe ser valorada en cada caso.

- CID. Se transfunden con niveles inferiores a 50 x109/l, aún cuando no hay series randomizadas para valo-rar su eficacia.

- Trasplante hepático. En el receptor suelen existir combi-nación en diversa proporción de trombopenia y trombopa-tía, defectos en hemostasia secundaria e hiperfibrinolisis. Latromboelastografía parece la prueba indicada como guíapara la indicación de CP.

135



- Transfusión masiva. Aparece trombopenia a partir de latransfusión de 1,5-2 veces la volemia total en 24 h. Se recurri-rá la transfusión de CP sólo si hay trombopenia documentaday hemorragia grave, intentando mantener más de 50 x 109/l.

- Circulación extracorpórea. Se puede producir sangradopor la suma de distintos factores : hemodilución, efecto deheparina y/o AAS, hipotermia, trombopenia y/o trombopatíaasí como hiperfibrinólisis. La tendencia actual es disminuir lahemoterapia a expensas de tratamientos farmacológicos(aprotinina, ac. tranexámico, desmopresina) y de la recogidapreoperatoria de plasma autólogo rico en plaquetas, reco-mendándose los CP por debajo de 50 x 109/l, en presencia dedatos de sangrado. En casos de antiagregación por aspirina,ésta debe ser suspendida días antes de la intervención.

- Trombopenia neonatal (no inmune). Se asocia con situa-ciones de compromiso clínico importante: Sepsis, CID, etc.Debe intentarse mantener la cifra de plaquetas a niveles simi-lares a los del adulto con trombopenia no inmune.

TrombocitopatíasPlaquetas en número normal, o casi normal, con alteraciones dela función hemostática y en ocasiones también morfológicas.

Trombocitopatías congénitas Bernard-Soulier, Glanzman. Indicación de CP sólo en caso desangrado activo, riesgo elevado o preparación para cirugía.

Trombocitopatías adquiridasA pesar del número normal de plaquetas, puede estar indicadala transfusión de CP en trombocitopatias con episodio de san-grado o profilácticamente antes de cirugía programada.

136



137

Se debe evitar su uso indiscriminado, ya que puede ser cau-sa de aloinmunización y otros efectos desfavorables.

Los cuadros clínicos más frecuentes son:- Aspirina, antiagregantes plaquetarios.- Uremia.- Paraproteinemia.- Alteración de función plaquetaria en síndromes mielo-

proliferativos: trombocitemia esencial, leucemia mieloidecrónica, PV, etc.

Actitud terapéutica: - Tratamiento de la causa (retirada de la droga [aspirina],

diálisis, plasmaferesis [paraproteinemia], tratamiento deSMP hasta conseguir plaquetas en cifras normales).

- En casos de ingesta de AAS y cirugía urgente se ha ensa-yado el uso de DDAVP.

- En casos de uremia, además de diálisis, se ha preconizadola administración de Crioprecipitados ya que en la tromboci-topatía urémica la transfusión de CP solo está indicada en casode hemorragia grave, dado que las plaquetas tienen una efecti-vidad reducida. La tendencia hemorrágica puede disminuirse:

• Manteniendo el Hto por encima de 30%. • Mediante la diálisis. • En algunos casos se ha demostrado efectiva la adminis-

tración de DDAVP.• En SMP, como profilaxis de cirugía.

Situaciones en las que no está indicada la transfusión de CPLa administración de CP puede conducir a diversos efectosdesfavorables, entre otros aloinmunización, por lo que debevalorarse la relación riesgo/beneficio frente a cualquier solici-



tud de transfusión de CP. En las siguientes circunstancias nose considera correcto la administración profiláctica reglada.

- Como administración profiláctica, independiente delnúmero de plaquetas de manera programada en:

- Trombopenias crónicas centrales.- Transfusiones masivas sin hemorragia.- CEC, cirugía general con más de 50x109/l.- Trombopenias inmunes: (PTI, PPT, etc.).- Trombocitopatias congénitas.

Contraindicaciones de CPLa transfusión de CP, en principio, está contraindicada en:

- TIH, en la que actualmente puede considerarse el trata-miento con hirudina.

- PTT y en el SUH, en estos casos pueden precipitar eldesarrollo de trombosis.

- En ambos casos considerar el recambio plasmático comoopción de tratamiento

TRANSFUSIÓN DE PLASMA FRESCO CONGELADO (PFC)A pesar de su amplia utilización, el PFC es probablementeel CS que tiene menos indicaciones establecidas. El valorterapéutico del PFC no está bien documentado. Salvo encasos puntuales, es preferible el uso de sus derivados DP,que se han conseguido en forma purificada, concentrada,con posibilidades de dosificación precisa e inactivados paravirus potencialmente contaminantes.

El uso indiscriminado, además de falta de efectividad enmuchos casos, supone una merma notable para la autosu-ficiencia en DP (albúmina, factores de coagulación, inmu-

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noglobulinas específicas e inespecíficas, colas hemostáticasetc ), de los cuales el PFC es la materia prima. Actualmen-te disponemos de alternativas mucho más eficaces y seguraspara la mayoría de sus indicaciones que pueden ser utiliza-das de forma precisa.Siempre que exista un concentrado deuna proteína plasmática purificada, se preferirá su uso al dePFC.

Efectos desfavorables del PFCEntre los riesgos frecuentes de la TS de PFC, incluso las uni-dades sometidas a reducción de la carga viral para determina-dos virus, están la sobrecarga circulatoria, la hemolisis encasos de Transfusión con incompatibilidad AB0, toxicidadpor citrato, reacciones febriles, alérgicas, edema pulmonar nocardiogénico (TRALI), contaminación bacteriana, etc.

Indicaciones clínicas del PFCExisten numerosas guías de indicaciones de TS de PFC, enlas que de manera más generalizada, se indican las condicio-nes que se deben dar para su administración y en las situa-ciones clínicas donde se admite su uso. Dado que la mayo-ría se refiere a alteraciones analíticas de la coagulación,conviene recordar que como cambios valorables en los datosde coagulación se consideran:

- T de protrombina: INR > 1,5.- TTPA: 1 vez y media el tiempo del control.- Fibrinógeno: < 100 mg/dl.

Indicaciones absolutasTanto en el caso de deficiencia de factores procoagulantes,como en los de anticoagulantes endógenos, proteína C, S y

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antitrombina III, sólo está indicado el PFC cuando no exis-ta, o no esté disponible el concentrado del factor deficitario(caso del Factor V).

Las indicaciones establecidas de PFC son:- Púrpura trombótica trombocitopénica (PTT), en infu-

sión de PFC o como líquido de reposición en plasmaféresis,lo que permite la transfusión de grandes volúmenes de PFCpor sesión. También se ha utilizado el plasma libre de crio-precipitado, con menor contenido en multímeros del Factorvon Willebrand.

- Púrpura fulminante del recién nacido por deficienciacongénita de proteína C o S, si no se dispone de concentra-dos de estos factores.

- Reconstitución de CH para exanguinotransfusión, si nose dispone de sangre total.

Indicaciones relativasSon las más frecuentes en clínica y, en general, implicandefectos de coagulación con deficiencia simultánea devarios factores. El PFC se tomará en consideración cuandocoexistan: síndrome hemorrágico y alteraciones de las prue-bas de coagulación. Situaciones en las que pueden concurrirestas circunstancias y que deben ser valoradas individual-mente son:

- Coagulación intravascular diseminada. - En los casos sobredosificación de anticoagulantes orales,

con hemorragia con riesgo vital inminente, así como lospacientes que deben ser sometidos a procedimientos cruen-tos con carácter de extrema urgencia, sin tiempo para lacorrección del defecto plasmático mediante actuación de vita-mina K endovenosa (6-8 h). También puede estar indicado

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en casos de no respuesta al tratamiento con vitamina K:malabsorción, enfermedad hemorrágica del recién nacido.

- Trasplante hepático. - Hepatopatía con hemorragia microvascular difusa.- Tansfusión masiva. - Cirugía extracorpórea. - Déficits congénitos de factores de coagulación, en

ausencia de concentrado de factores específicos.

Situaciones en las que el PFC no está indicadoEl PFC no está indicado en todas aquellas circunstanciasque se puedan resolver con medidas alternativas: tratamien-to de la hipovolemia, como solución de recambio plasmáti-co, salvo en los casos mencionados, como aporte nutricio-nal, o de Igs, o de factores del complemento, ni en esquemastransfusionales preestablecidos, a pesar de que los pacienteshayan sido transfundidos con CH, ni para corrección delefecto anticoagulante de la heparina. La revisión de muchasde estas indicaciones, y su utilización en aquellos casos apro-piados, constituyen una disminución importante de su con-sumo con posibilidad de derivarlo a su principal provecho,como materia prima para la fabricación de derivados plas-máticos.

TRANSFUSIÓN DE CRIOPRECIPITADOAl tener una composición tan específica sus indicacionesestán bien establecidas, siendo su uso principal:

- Aporte de fibrinógeno en los casos de deficiencia deeste factor en los que no se disponga de éste concentradoinactivado, tanto en los casos de hipofibrinogenemia(CID, tratamiento con l-asparraginasa) o déficits cualitati-

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vos de disfibrinogenemia (trasplante hepático, hepatopatíacon sangrado, etc.).

- Aporte de FvW y de F XIII si no se dispone de los con-centrados apropiados.

Entre los riesgos específicos, además de los propios delPFC, salvo la sobrecarga circulatoria, se han descrito ane-mias hemolíticas de mecanismo inmune, en casos deincompatibilidad AB0 por su elevado contenido en AcIgM, e hiperfibrinogenemia, en los casos, poco frecuentes,que se usa como aporte de FvW o excepcionalmente deFactor VIII.

- Colas de fibrina. De manera circunstancial el cripopre-cipitado es también útil como aporte de fibrinógeno deaplicación local en focos de sangrado quirúrgico en conjun-ción con trombina para formar las colas de fibrina, prepara-das incluso a partir de crioprecipitado autólogo, utilizadasprincipalmente en cirugía cardiovascular y cerebral.

- Fibronectina. Existen diversos ensayos clínicos queemplean el crioprecipitado como fuente de fibronectinapara mejorar la cicatrización de heridas: quemaduras, úlce-ras corneales, etc.; aunque no existen ensayos controladosde su efectividad.

TRANSFUSIÓN DE LEUCOCITOSSu aplicación ha sido objeto de discusión, tanto por lasdudas acerca de su efectividad como al mejorar el trata-miento de los pacientes neutropénicos por disponer denuevos y potentes antibióticos. Actualmente se han vueltoa considerar debido, entre otros factores, a la posibilidadde obtención de mayores cantidades de leucocitos deldonante.

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Se ha estudiado su uso en:- Tratamiento de pacientes neutropénicos con falta de res-

puesta a tratamiento antibiótico, con infecciones micóticaso por Gram negativos, aunque no hay existen estudios ran-domizados.

- Sepsis neonatal en prematuros. - Defectos función fagocítica.

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