COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES ASOCIADOS AL ...
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Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales
Profesor Patrocinante: Dr. Luis Humberto Vargas Chacoff Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas Facultad de Ciencias Universidad Austral de Chile
Profesor Co-patrocinante: Dr. Juan Pablo Pontigo Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas Facultad de Ciencias Universidad Austral de Chile
Profesor Informante: Dr. José Luis Varela Fuentes Departamento de Biología Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales Universidad de Cádiz
COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES ASOCIADOS AL METABOLISMO DEL CALCIO DURANTE
LA ESMOLTIFICACIÓN DE Salmo salar
Tesis de Grado presentada en colaboración con la UACh para optar al grado de Licenciado en Ciencias del Mar.
FRANCISCO JAVIER DOMÍNGUEZ MARCHÁN
VALDIVIA- CHILE
2016
Índice General
1.Resumen ................................................................................................................................. 1
2.Abstract .................................................................................................................................. 2
3. Introducción .......................................................................................................................... 3
3.1. La importancia de la acuicultura ..................................................................................... 3
3.2. Consideraciones del cultivo de salmón Atlántico (Salmo salar) ..................................... 3
3.3. Ciclo de vida. Regulación Hormonal de la Esmoltificación ............................................ 4
3.4. Relación del ión calcio con el tejido hepático y muscular ............................................... 7
3.5. Relación entre la producción hormonal y la expresión génica ........................................ 7
3.6. Hipótesis .......................................................................................................................... 8
3.7. Objetivos .......................................................................................................................... 9
3.7.1. General ...................................................................................................................... 9
3.7.2. Específico .................................................................................................................. 9
4. Materiales y Métodos ......................................................................................................... 10
4.1. Selección de genes y Diseño de Partidores (Oligonucleótidos)..................................... 10
4.2. Extracción de ARN total de Salmo salar ....................................................................... 11
A. Extracción de ARN Total en Hígado de Salmo salar ................................................ 11
B. Extracción de ARN Total en Músculo de Salmo salar .............................................. 11
4.3. Síntesis de ADNc ........................................................................................................... 12
4.4. Prueba de Partidores en PCR convencional: Gradiente de Temperatura ....................... 14
4.5. Amplificación fragmento de genes en PCR a Tiempo Real (RT-qPCR) ....................... 14
4.6. Análisis Estadístico ........................................................................................................ 15
5. Resultados ........................................................................................................................... 17
5.1. Hígado ............................................................................................................................ 17
5.2. Músculo ......................................................................................................................... 20
6. Discusión .............................................................................................................................. 23
6.1. Hormona de Crecimiento ............................................................................................... 24
6.2. Metabolismo del calcio .................................................................................................. 25
7. Conclusiones ........................................................................................................................ 29
8. Bibliografía .......................................................................................................................... 30
9. AnexoAnexo I. Determinación experimental de la temperatura óptima de funcionamiento de
oligonucleótidos (Tª de Melting) en electroforesis. .............................................................. 33
Índice de Figuras
Figura 1. Ciclo de vida del salmón Atlántico. ........................................................................... 5
Figura 2. Expresión génica relativa del precursor del receptor de la calcitonina (A), receptor
de la calcitonina (B), calcitonina isoforma (C) y estaniocalcina 2 (D) en hígado durante la
esmoltificación. ........................................................................................................................ 18
Figura 3. Expresión génica relativa de la Hormona de crecimiento (A), Hormona paratiroidea
(B), calmodulina (C) y 17β-Estradiol (D) en hígado durante la esmoltificación. .................... 19
Figura 4. Expresión génica relativa de la hormona paratiroidea (A), receptor de la calcitonina
(B), calcitonina isoforma (C) y estaniocalcina 2 (D) en músculo durante la esmoltificación.. 21
Figura 5. Expresión génica relativa de la hormona de crecimiento (A), 17β-Estradiol (B) y
calmodulina (C) en músculo durante la esmoltificación. ......................................................... 22
Figura 6. Calmodulina. ............................................................................................................ 34
Figura 7. Receptor de la Calcitonina. ...................................................................................... 34
Figura 8. Precursor del Receptor de la Calcitonina. ................................................................ 35
Figura 9. Calcitonina Isoforma. ............................................................................................... 35
Figura 10. Hormona paratiroidea. ........................................................................................... 36
Figura 11. Estaniocalcina 2 ..................................................................................................... 36
Figura 12. Hormona de Crecimiento. ...................................................................................... 37
Figura 13. Hormona 17β-Estradiol .......................................................................................... 37
Índice de Tablas
Tabla 1. Listado de Oligonucleótidos………………………………………………………..11
Tabla 2. Reactivos necesarios para la extracción de ARN. ..................................................... 12
Tabla 3. Disolución A……………..........................................................................................13
Tabla 4. Disolución B. ............................................................................................................. 13
Tabla 5. Reactivos PCR en gradiente de temperatura. ............................................................ 14
Tabla 6. Reactivos RT-qPCR. ................................................................................................. 15
Tabla 7. Perfil Térmico RT-qPCR. .......................................................................................... 15
Agradecimientos
En primer lugar, agradecer a la Universidad de Cádiz por la concesión de una Beca de
Movilidad Internacional que me ha permitido desarrollar mis estudios en la Universidad
Austral de Chile y a mi profesor, Dr. Antonio Medina, por guiarme antes de llegar a Chile.
Agradezco a mis tutores, Dr. Luis Humberto Vargas Chacoff y Dr. José Luis Varela Fuentes
por aceptarme en su grupo de trabajo, por sus consejos y su gran disposición. Al Dr. Juan
Pablo Pontigo y Julia Saravia por sus enseñanzas, pero sobre todo por tener tanta paciencia
conmigo. Por otra parte, también agradezco la ayuda de Danixa, Ricardo, Carolina y Manuel,
así como de Juan José y María José. Todos me habéis acogido como uno más en vuestro
equipo, ofreciéndome una experiencia inolvidable. Os lo agradezco de corazón.
Gracias a todos mis primos, a Daniel e Isaac por preocuparse de mi durante mi estancia y a
mis amigos Fran, Juan Carlos, Juan Luis, Mayte, José Manuel, Jennifer, José, Ana, Iván,
Daniel y Javier por apoyarme en todo momento. Agradezco a mi familia, en especial a mi
pareja Marta, a mis padres, Mª Ángeles y Salvador, y a mi abuela Isabel por haberme animado
a lograr este sueño.
Por último, dar las gracias al Proyecto INNOVA CORFO 13 IDL2-23565, al FONDAP-
INCAR No. 15110027 y al FONDECYT 1160877 por ofrecernos financiamiento, y a la
empresa Marine Harvest Chile por aportarnos los salmones de esta investigación.
Gracias a todos, sin ustedes no hubiera sido posible.
Lista de Abreviaturas
ACTH: Hormona Adenocorticotropina
ADNc: ADN complementario
CaM: Calmodulina
CT: Calcitonina
E2: 17β-Estradiol
e.g.: exempli gratia (por ejemplo)
GAPDH: Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa (EC 1.2.1.12)
GH: Hormona de Crecimiento
i.e.: id est (es decir)
IGF-1: Factor de Crecimiento Insulínico Tipo 1
OIE: Organización Mundial de Sanidad Animal
STC 2: Estaniocalcina 2
Pb: pares de bases
PTH: Hormona Paratiroidea
T: tonelada
T3: Triyodotironina (3,5,3′-Triiodo-L-tironina)
T4: Tiroxina
TSH: Hormona Estimulante del Tiroide
1
1. Resumen
Salmo salar es la especie más representativa y producida por la acuicultura de Chile. Uno de
los procesos más críticos y que requiere especial atención en el cultivo del salmón es la
esmoltificación. Por un lado, porque es el momento en el que los salmones migran de agua
dulce a agua de mar, y por otro, porque es cuando se produce las mayores mortalidades al no
determinarse con certeza el estado fisiológico de los salmones, perjudicando a la industria y al
medio ambiente. Por esto, la finalidad de este estudio fue determinar marcadores que permitan
conocer el momento exacto de la esmoltificación, mediante la variación relativa de la
expresión génica del ARN mensajero, en hígado y músculo, de hormonas que influyen en el
metabolismo del calcio: hormona de crecimiento, 17β-Estradiol, la hormona paratiroidea, la
estaniocalcina 2, la calmodulina, la calcitonina y su correspondiente receptor y precursor del
receptor, usando qPCR en tiempo real.
Los resultados determinaron que en hígado, la acción conjunta de las hormonas seleccionadas,
permitieron producir la energía y las proteínas necesarias para sobrevivir durante la
esmoltificación, usando el calcio de manera controlada, y expulsando así, el exceso al medio
extracelular. Además, estas hormonas estimularon la actividad muscular a través de la
asimilación y la utilización del calcio plasmático.
En un futuro, esta información génica apoyará en la selección de salmones fisiológicamente
preparados para el proceso de esmoltificación, favoreciendo la sustentabilidad y el desarrollo
de la industria de la salmonicultura.
2
2. Abstract
Salmo salar is the most representative and produced specie by aquaculture in Chile.
Smoltification is one of the most critical processes and it requires much special attention in
the salmon farming industry because, on the one hand, it is the moment when they migrate
from freshwater to seawater and, on the other hand, it is the time when the highest mortality
occurs. This time is difficult to determinate the physiological conditions of salmons, and it
harm industry and environment. Therefore, the purporse of this study was to determinate
markers that allowed knowing the appropiate moment to smoltification using the relative
change in gene expression of mRNA of hormones that have influence over calcium
metabolism in liver and muscle: growth hormone, estradiol-17β, parathyroid hormone,
calcitonin, stanniocalcin 2 and calmodulin, as well as calcitonin receptor precursor and
calcitonin receptor using Real Time qPCR.
In liver, the joint action of these hormones produced the neccesary energy and proteins to
survive during smoltification, using calcium ion efficiently. Thus, cells excreted unnecessary
calcium. Nevertheless, these hormones stimulated muscular activity, using plasma calcium
ion efficiently.
In the future, this genetic information could help industry to choose qualified salmons for
smoltification process, and to allow sustainable development of the salmon farming industry.
3
3. Introducción
3.1. La importancia de la acuicultura
El sector acuícola es uno de los sectores alimenticios de mayor crecimiento mundial. Su causa
principal es la generación de productos de alta calidad en nutrientes. A nivel global,
representa casi el 50% de los alimentos procedentes de animales acuáticos (OIE, 2015).
La diversificación del sector es tan alta que se puede diferenciar tanto por el ambiente de
cultivo (continental o marítimo) como por grupos de especies, producción por país,
productores e incluso por especies principales en función del tamaño de su producción (FAO,
2014b). China se clasifica como el país de mayor producción acuícola (incluyendo algas) con
un total de 58.795.275 t. Le sigue Indonesia (14.330.888 t), India (4.884.021 t) y Vietnam
(3.411.391 t) (FAO, 2014a). En relación a los países de mayor producción, los grupos de
especies más cultivadas son los peces de la familia Cyprinidae (28.225.908 t) y las algas rojas
(16.550.837 t). En concreto, la carpa herbívora (Ctenopharyngodon idellus), carpa plateada
(Hypophthalmichthys molitrix), carpa común (Cyprinus carpio) y la tilapia del Nilo
(Oreochromis niloticus) son las especies de peces más cultivadas del mundo (FAO, 2014d).
Por otra parte, es conveniente destacar la preferencia de cada país por cultivar en mayor
medida determinadas especies. Es el caso de la especie Pangasius hypophthalmus en Vietnam
(FAO, 2005), Sparus aurata en España (FAO, 2014f) y Salmo salar en Chile (FAO, 2014e).
3.2. Consideraciones del cultivo de salmón Atlántico (Salmo salar)
Salmo salares la novena especie más producida mundialmente con una cifra de 2.326.288 t
(FAO, 2014d), de las cuales Noruega produce en torno al 54,09% de la producción mundial
(1.258.356 t) y Chile un 27,7% (644.459 t) (FAO, 2014c). En Chile es el segundo producto
más exportado, después del cobre (Asociación de la Industria del Salmón de Chile A.G.,
4
2016). De esta manera, la producción mundial del salmón Atlántico está liderada por ambos
países con una producción acuícola de 81,79%.
Es evidente la necesidad de mejorar el conocimiento de la biología de la especie en cuestión.
Por un lado, para aumentar su productividad mediante la optimización en los métodos de
cultivo (e.g. alta densidad, enfermedades, calidad del alimento, tolerancia a cambios de
salinidad) (Folmar & Dickhoff, 1980) y disminuir la gran cantidad de ejemplares que mueren
o retrasan su crecimiento por ser trasladados al mar, para generar individuos “smolt” de
calidad (Vargas-chacoff et al., 2015). Por otro lado, para favorecer la sostenibilidad
ofreciendo bases para la gestión del recurso natural.
Los estudios fisiológicos han ofrecido beneficios directos a la crianza del salmón, como es la
obtención de un bioindicador del proceso de migración de agua dulce a salada: el incremento
de la actividad de la bomba Na+, K+-ATPasa en branquias (Björnsson & Bradley, 2007). Esto
ha permitido que parte de las toneladas de salmón Atlántico capturado sea abastecida por la
acuicultura, favoreciendo así, la conservación de reservas silvestres.
3.3. Ciclo de vida. Regulación Hormonal de la Esmoltificación
El salmón Atlántico (Salmo salar) es el miembro más representativo y más grande de la
familia Salmonidae. Son considerados peces anádromos, por pasar la primera parte de su ciclo
de vida en agua dulce y la mayor parte de su vida adulta en el mar, solo regresando al río en
épocas de reproducción. El tiempo que residen en el mar antes de volver al río varía de un
individuo a otro, habiéndose documentado desde uno hasta cuatro inviernos para volver al río
y reproducirse (Kennedy, 2004). A pesar de esta incertidumbre, es bien conocido que regresan
entre Mayo y Julio para desovar en los meses de Octubre y Noviembre, pasar el invierno en el
río y volver al mar en los meses comprendidos entre Abril y Junio (Folmar & Dickhoff, 1980;
5
Kennedy, 2004) junto a los nuevos reclutas, que tras dos o tres años post-eclosión, se unen al
grupo adulto para comenzar la migración (Kennedy, 2004).
Figura 1. Ciclo de vida del salmón Atlántico (Extraído y modificado de Øystein, 2011).
Este proceso de migración del salmón “parr” de un medio hipotónico (agua dulce) a un medio
hipertónico (agua salada), en el cual se conoce como salmón “smolt”, está asociado a unos
cambios morfológicos (longitud, peso y coloración), conductuales (alimentación, gregarios,
disminución velocidad de natación) y fisiológicos (hormonales, metabólicos y
osmorregulatorios) que le permite mantener la concentración iónica y un volumen de agua
estable (homeostasis). Este proceso de transformación del salmón se conoce como
“esmoltificación”, y está regulado por el aumento del fotoperíodo y la temperatura del agua
(Folmar & Dickhoff, 1980; McCormick & Björnsson, 1994; McCormick et al., 2007).
Estos cambios ambientales son percibidos como estímulos por los órganos de los sentidos del
salmón, son transformados en señales nerviosas, y posteriormente integrados y procesados por
el cerebro. A continuación, una región nuclear del cerebro conocida como hipotálamo secreta
una serie de factores hipotalámicos (de liberación o inhibición) que alcanzan la hipófisis para
regular la secreción de otras hormonas (neurohipófisis: vasotocina e isotocina; adenohipófisis:
6
hormona de crecimiento, estimulante del tiroides, prolactina) cuyo objetivo es alcanzar los
tejidos diana y generar una respuesta a los estímulos que dependerá del tipo de hormona, su
concentración y su relación con otras hormonas.
Estos tejidos dianas pueden ser órganos como las branquias, el hígado, el riñón, el músculo y
el intestino o glándulas secretoras de otras hormonas [e.g. tejido interrenal (cortisol) y
cromafin (catecolaminas), folículostiroideos (T3, T4), corpúsculos de Stannius (hipocalcina),
cuerpo últimobranquial (calcitonina), urófisis (urotensinas), timo (paratiroidea)]. A este
respecto, en el proceso de esmoltificación, la síntesis y liberación de hormona de crecimiento,
de ACTH y TSH a la circulación sanguínea, fomentará la producción de IGF-1 en el hígado,
de glucocorticoides (cortisol) en la glándula interrenal y hormonas tiroideas (T3, T4) en el
tiroides, respectivamente (Matteri et al., 2000). Estas hormonas, entre otras funciones,
provocarán el incremento en número y tamaño de las células de cloruro en branquias, así
como la actividad de la bomba Na+, K+-ATPasa en branquias, intestino y riñón, para mantener
la concentración interna de iones y aumentar la tolerancia del pez frente al incremento de la
salinidad (McCormick, 2012).
En el proceso de esmoltificación los iones más influyentes son el ión sodio (Na+), potasio
(K+), calcio (Ca2+), magnesio (Mg2+), cloro (Cl-) y sulfato (SO4-). Esto es por la gran
diferencia de concentración iónica entre el agua dulce respecto a la salada, que afectará al
equilibrio osmótico del pez de tal manera que tiene que modificar sus mecanismos
osmorreguladores para mantener la homeostasis.
En concreto, los peces teleósteos, como el salmón Atlántico, poseen una concentración de
Ca2+ comprendida entre 0,1 y 10 mM (P. M. Guerreiro, 2002), siendo la concentración
intracelular la más baja (Guerreiro, 2002; Velandia et al., 2001). Sus propiedades físicas (i.e.
radio atómico y cargas positivas) permiten que sea captado por proteínas específicas
7
dependientes de él como la calmodulina (CaM), parvoalbúmina y la troponina C, mediante las
cuales la célula regula la concentración del ión, almacenándolo o expulsándolo de la célula.
En el primer caso, se utiliza para activar rutas metabólicas, liberación de neurotransmisores o
síntesis y activación de proteínas. En el segundo caso, activa proteínas como la CaM, para
regular la afinidad por el calcio de una segunda proteína de membrana conocida como
ATPasa de Calcio. Esta proteína se activa con la energía liberada por la hidrólisis del ATP,
para expulsar el ión Calcio al espacio extracelular. Sin embargo, la expulsión de calcio
también puede ocurrir cuando el sodio es impulsado al interior de la célula a favor de
gradiente electroquímico (Velandia et al., 2001).
La modulación del ión calcio es determinada por la acción de diferentes hormonas como la
hormona paratiroidea (PTH), calcitonina (CT), estaniocalcina (STC 2), calmodulina (CaM),
17β-Estradiol (E2), y por vitaminas como la D. Es importante destacar la calcitonina como
estimulador de los osteoblastos, células encargadas del desarrollo y crecimiento de la matriz
ósea de huesos y escamas mediante la deposición de calcio (Wendelaar Bonga, 1982).
3.4. Relación del ión calcio con el tejido hepático y muscular
El hígado y el músculo son tejidos que deben ser considerados en el proceso de
esmoltificación. El primero porque es un órgano potente en la generación de energía, ya que
además de otras funciones, interviene en el metabolismo de los glúcidos, los lípidos
(colesterol, triglicéridos) y las proteínas, además de almacenar el glucógeno, vitaminas
liposolubles (A, D, E, K) y el calcio. Sin embargo, el músculo es importante para este estudio
por el papel fundamental que posee el ión calcio en la contracción del mismo.
8
genes que codifican estas proteínas (McCormick, 2011). Ejemplo que destaca este hecho es el
aumento de la concentración de hormona de crecimiento (GH) en el plasma sanguíneo de
salmón Coho (Oncorhynchus kisutch) transgénico, debido a la sobreexpresión del gen que
codifica GH (Raven et al., 2008).
La expresión de genes que codifican para unas determinadas proteínas, incluidas las
hormonas, es específica de la función de las células que conforman el tejido (Devlin, 2004).
De esta forma, en glándulas como la tiroidea se expresará en mayor medida, cuando sea
necesario, la región del ADN que codifique la hormona T3 y T4. Sin embargo, la prolactina,
hormona encargada de mantener el balance iónico durante la aclimatación a agua dulce, se
expresa principalmente en la hipófisis, pero se ha demostrado que también en los demás
órganos, variando según la especie (Manzon, 2002). En cambio, los genes constitutivos, como
el gen codificante de la GAPDH, albúmina, actina, tubulina, L32, 28S y 18S, se expresan en
la totalidad de las células nucleadas debido a que su información es esencial para la
supervivencia de la misma (e.g. funciones estructurales, reguladoras) (Thellin et al., 1999).
3.6. Hipótesis
Variaciones fisiológicas de Salmo salar durante la esmoltificación generará cambios en la
expresión génica de las hormonas relacionadas con el metabolismo del calcio.
3.5. Relación entre la producción hormonal y la expresión génica
La posibilidad de producir hormonas, así como de aumentar o disminuir su concentración, y
por tanto, sus efectos en el organismo durante la esmoltificación, radica en la expresión de los
9
3.7.2. Específico
-Desarrollar la técnica de PCR y RT-PCR, desde la extracción hasta la cuantificación
de los genes.
-Identificar y diseñar oligonucleótidos claves para el proceso de esmoltificación de
Salmo salar.
-Caracterizar y validar la eficacia de los oligonucleótidos de genes del metabolismo
del calcio en hígado y músculo.
-Evaluar la expresión de genes influyentes en la aclimatación durante la
esmoltificación.
3.7. Objetivos
3.7.1. General
Determinar la variación relativa de la expresión génica en hígado y músculo del ARN
mensajero de hormonas que influyen en el metabolismo del calcio de Salmo salar para
determinar genes claves en el proceso de esmoltificación.
10
4. Materiales y Métodos
En el presente estudio se realizaron 2 muestreos de salmones Atlántico (Salmo salar,
Linnaeus, 1758) en la piscicultura Calabozo, perteneciente a la empresa Marine Harvest,
Chile. El muestreo 1 se corresponde con salmones en fase parr, mientras que el muestreo 2
con salmones en fase smolt. En cada muestreo se sacrificaron 20 salmones con sobredosis de
anestesia (1 mL/L 2-fenoxietanol, Fluka-77699-500ML), a los cuales se les extrajo una
porción de hígado y de músculo. Las 40 muestras de hígado y las 40 de músculo se guardaron
en tubos de microcentrifuga de 1,5 mL para su análisis molecular. Se conservaron
temporalmente en nitrógeno líquido para su transporte, y posteriormente se almacenaron a -80
ºC hasta su análisis.
4.1. Selección de genes y Diseño de Partidores (Oligonucleótidos)
El siguiente paso fue seleccionar en bancos de genes (GenBank), los genes de Salmo salar
relacionados con la modificación de la osmorregulación durante la esmoltificación y en
concreto con el metabolismo del calcio, que sirvan como marcadores del proceso de
esmoltificación. Los genes seleccionados fueron los que codifican la información para la
Calcitonina Isoforma, Receptor de la Calcitonina, Precursor del Receptor de la Calcitonina,
Calmodulina, Hormona Paratiroidea, Estaniocalcina, Hormona de Crecimiento y 17β-
Estradiol.
Los genes se analizaron en el programa "AmplifX", dónde se diseñaron oligonucleótidos de
18 a 22 pb para generar un transcrito de 100-150 pb para cada gen, con el requisito de que
contengan entre 40-60% de de las bases nucleotídicas "C" y "G".
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Tabla 1. Listado de Oligonucleótidos. La Tª de Melting es teórica. Nombre Forward Reverse TªMelting(ºC) Tamañ
o (pb)
Calmodulina GCACAGATAATCAGCCCACATCCA GCCGTCACCATCCTTGTCGAATAA 54 108 Receptor
Calcitonina TGTCGTGGTAGACGTTCTGGGTAT GCCAGGATGGATGCTAAAGGCATA 55 130
Precursor Receptor
Calcitonina
CTCCATAATGGGCTGAGTACCTGT CAACTAAACGGCTGTGGCCAAA 53 122
Calcitonina Isoforma
TGTCCCAGGACCTGCACAAATTAC GCGGAGGGTTAGATGCTGTCAAA 57 139
Hormona Paratiroidea
CCCAGTGTCTTGTGTCCTCTGTAA CTGAAGGTGGTCACCAAGAGGAAA 55 147
Estaniocalcina 2
TACCTACGGGTCTTCGCAGATA CTCTGACGGGTTGTCATGAACATC 53 129
Hormona de Crecimiento
CCATTAGGCTGTTGGAGATGGTCA TCTGTAACTCGGACTCCATCGTGA 55 147
17β-Estradiol CCTGCAGACCGATGGTTGTCA AAGGGAATCATTGTCCAGAGCGTG 56 133
4.2. Extracción de ARN total de Salmo salar
A. Extracción de ARN Total en Hígado de Salmo salar
Las muestras de hígado se homogeneizaron mediante el homogeneizador Pellet Pestle ®
Kontes. Se utilizó el Total ARN Mini Kit (Geneaid) para extraer el ARN Total, que se
conservó a -80ºC para su posterior utilización.
B. Extracción de ARN Total en Músculo de Salmo salar
La alta cantidad de grasa que contenían las muestras de músculo impedía extraer el ARN
Total mediante el método anteriormente comentado.Por tanto, se recurrió a realizar la
extracción usando Trizol y esferas de Zirconio/Silíceo de 0,1 y 1 mm de diámetro. Se utilizó
un Minibeadbeater (3450 oscilaciones/min) durante 40 segundos para moler y homogenizar el
tejido con Trizol. Después de seguir el protocolo especificado en la Tabla 2, se continuó la
extracción con elTotal ARN Mini Kit (Geneaid) a partir de la etapa correspondiente.
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Tabla 2. Reactivos necesarios para la extracción de ARN.
El volumen de Etanol 70%depende del volumen de
solución sobrenadante que contiene ARN.
Reactivo Volumen (µL)
Trizol 500 Cloroformo 200 Etanol 70% 200-400
El siguiente paso, consistió para ambos tejidos, en asegurar la calidad del ARN Total
contenido en las muestras. Se midió la concentración de cada muestra en un
espectrofotómetro del tipo MaestroNano y NanoDropThermoScientific, que ofrecen las
concentraciones de ARN Total en ng/µL y las relaciones 260/280 y 260/230. Estas relaciones
permiten determinar si la muestra está contaminada por exceso de proteínas, presencia de
fenoles u otros contaminantes, que absorben cerca de 280 o 230 nm, respectivamente (T009-
Technical Bulletin Nanodrop). Si ambas relaciones poseen un valor cercano a 2,0 o superior,
se acepta que la muestra contiene ARN “puro”.
A su vez, se realizó otros métodos como electroforesis y Bioanalyzer a determinadas muestras
mediante una selección al azar, para asegurar la existencia de ARN en las mismas. La
electroforesis se llevo a cabo en un gel de agarosa al 1,5% en tampón TAE 1X.
4.3. Síntesis de ADNc
La retrotranscipción consiste en la construcción de ADN a partir de ARN mediante el uso de
una retrotranscriptasa, en concreto, la M-MLV (MoloneyMurineLeukemia Virus).
En el primer paso, se realiza una esterilización ultravioleta por 15 minutos a todos los
materiales que se van a usar pipetas y puntas de pipeta (0,5-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL),
13
microplaca para PCR, film transparente, tubos de microcentrifuga (0,2 µL, 0,7 µL, 1,5 µL),
guantes de Nitrilo y agua destilada libre de ARNasa y ADNasa.
A continuación, se preparó la disolución A con Oligo DT y agua libre de nucleasas (Tabla 3).
El Oligo DT contiene ADN sintético compuesto por 15 nucleótidos con base de timina. Estos
nucleótidos se utilizan como “primer” universal en el proceso de retrotranscripción, ya que
son complementarios a la terminación poliadenilada presente en el ARNm de eucariotas
(Boletín Técnico #071).
Después de mezclar la disolución en un Agitador Vórtice ZX3, se añadió 8 µL de disolución a
cada pocillo. A estos se le añadió 2 µL de la muestra de ARN correspondiente. La placa
cubierta previamente con un film transparente, se introduce en el termociclador a 65ºC por 5
minutos. Esta operación se repite para cada uno de los tejidos y estadios.
Tabla 3. Disolución A. Reactivo Volumen 1x (µL)
Oligo DT 1 Agua libre de nucleasas 7
ARN 2
En el siguiente paso, se prepara la disolución B (Tabla 4) para añadirle 14 µL a cada muestra
y comenzar el proceso de síntesis de ADNc mediante una incubación de 1 hora a 42ºC.
Posteriormente, se mantuvo las muestras a 4 ºC de forma indefinida.
Tabla 4. Disolución B. Reactivo Volumen 1x (µL)
5x Buffer 5
dNTPs mix 10 µM 1,25
ARNasaout 40 U/µL 0,5
M-MLV 0,5
Agua libre de nucleasas 7
14
Se comprobó la calidad del ADNc mediante electroforesis (ver detalle más arriba).
4.4. Prueba de Partidores en PCR convencional: Gradiente de Temperatura
Para obtener la temperatura óptima a la que el oligonucleótido elegido se aparea con la región
complementaria del ADNc sintetizado anteriormente, se realizó una PCR en gradiente de
temperatura partiendo desde los 50ºC a 65ºC para cada uno de los partidores (ANEXO I).
Cada PCR en gradiente de temperatura constaba de 40 ciclos y una duración de 2 horas y 38
minutos. Las muestras que se utilizaron fueron elegidas al azar.
El resultado de la amplificación fue visualizado a través de electroforesis (Anexo I), mediante
la cual se puede observar cualitativamente la cantidad y la especificidad del partidor por
determinadas temperaturas.
Tabla 5. Reactivos PCR en gradiente de temperatura.
Reactivo Volumen 1x (µL)
GoTaq 10
Oligo (Forward y Reverse) 1
Agua libre de nucleasas 7
ADNc 2
Conocida la temperatura óptima de funcionamiento de los partidores, se procede a realizar
PCR en Tiempo Real.
4.5. Amplificación fragmento de genes en PCR a Tiempo Real (RT-qPCR)
Para cada tipo de oligonucleótido, incluyendo el del gen 18S se realizó una RT-qPCR en un
termociclador del tipo Mx3000P. A su vez, se ordenó por estadio del pez (“parr” y “smolt”) y
tejido. Cada una de las muestras se preparó por triplicado, para disminuir el error técnico y
humano. Los reactivos utilizados se muestran en la Tabla 6.
15
Tabla 6. Reactivos RT-qPCR. Reactivos Volumen 1x (µL)
2x Brilliant II Syber Green 6
Oligo 1,08
Agua libre de nucleasas 4,92
Se optimizó el proceso de amplificación utilizando varios perfiles térmicos. Sabiendo que los
fragmentos generados son pequeños y que van entre los 100 y 150 pb, se aplicó las etapas de
la Tabla 7, ya que ofrecía una amplificación más eficiente.
Tabla 7. Perfil Térmico RT-qPCR. Etapa Función Temperatura (ºC) Ciclos Tiempo
1 -Desnaturalización ADNc -Activación GoTaq 95 1 10´
2 -Desnaturalización 95
40 30´´
-Alineamiento -Extensión 50-65
1´
3 -Extensión fragmentos rezagados 72 1 4´
4 -Elaboración de la curva de melting 95
1
10´´
25 10´´
70 1´´
4.6. Análisis Estadístico
Los valores de CT obtenidos tras la amplificación de los fragmentos en los genes son
transformados en ΔCT (CT,Gen – C T,18s) y posteriormente en ΔΔCT (ΔCT - ΔCT,parr) según el
método propuesto por Livak & Schmittgen (2001).
Una vez comprobada la aleatoriedad, la normalidad y la homocedasticidad de los datos por
grupos, se evaluaron los ΔCT estadísticamente mediante el test de Welch (n=40) para datos no
homocedásticos, ANOVA de un factor (n=40) para los resultados que cumplían los tres
estadígrafos y el test de Kruskal-Wallis para los resultados no paramétricos. La significancia
16
se determinaba con un p≤0,05. Para obtener los resultados gráficos se utilizaron los valores de
2-ΔΔCT (veces de cambio) y sus correspondientes errores estándar (límite inferior-límite
superior).
17
5. Resultados
5.1. Hígado
En hígado, la abundancia relativa del transcrito del precursor del receptor de la calcitonina
(2A) aumentó 3,14 (2,54-3,89) veces en la fase smolt respecto al parr. A pesar de esto, no
presentó diferencias estadísticamente significativas (p=0,325). En cambio, sí presentó
diferencias estadísticamente significativas la abundancia relativa del transcrito del receptor de
la calcitonina (2B) con una expresión 2,06 (1,71-2,48) veces mayor (p=0,0016). Asimismo, la
calcitonina isoforma (2C) presentó diferencias estadísticamente significativas (p=0,0083) y un
aumento de 1,38 (1,16-1,63) veces. En el mismo caso, se encuentra la hormona de
crecimiento (3A), que se sobreexpresó 7,66 (5,69-10,32) veces con diferencias
estadísticamente significativas (p= 7,597·10-5). Del mismo modo, la calmodulina (3C) ofrece
una sobreexpresión de 5,13 (3,98-6,62) veces y diferencias significativas con un p=5,987·10-5.
La hormona paratioridea (3B) y la 17β-Estradiol (3D) presentaron una sobreexpresión con
valores de 5,04 (4,09-6,22) y 2,08 (1,75-2,48) veces, respectivamente, y ambas fueron
estadísticamente significativas con un p igual a 1,489·10-6 para la primera y 8,362·10-4 para la
segunda.
Sin embargo, la estaniocalcina 2 (2D) se expresó 0,84 (0,64-1,05) veces menos en el estadio
smolt, pero sin diferencias significativas (p=0,7408).
18
A B
C D
Parr Smolt
Est
anio
calc
ina
2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Figura 2. Expresión génica relativa del precursor del receptor de la calcitonina (A), receptor de la
calcitonina (B), calcitonina isoforma (C) y estaniocalcina 2 (D) en hígado durante la esmoltificación.
Estandarización del estadio smolt frente al parr. La expresión génica relativa de cada hormona o receptor
smolt está estandarizada respecto a su expresión en el estadio parr. La abundancia relativa de los ARN
mensajeros se obtuvieron con el método de Livak & Schmittgen (2001). El análisis estadístico que se realizó
para la calcitonina isoforma (C) y la estaniocalcina 2 (D) es el Test de Welch, mientras que para el precursor del
receptor (A) y el receptor de la calcitonina (B) se realizó un ANOVA. La significancia, representada con un
asterisco, se determinó para un p≤0,05. Los errores estándar representados (límites superiores) presentan
diferencia a los inferiores.
Parr Smolt
Pre
curs
or R
ecep
tor
Cal
cito
nin
a
0
1
2
3
4
5
Parr Smolt
Rec
epto
r C
alci
ton
ina
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
*
Parr Smolt
Cal
cito
nin
a Is
ofor
ma
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
*
19
A B
C D
Figura 3. Expresión génica relativa de la Hormona de crecimiento (A), Hormona paratiroidea (B),
calmodulina (C) y 17β-Estradiol (D) en hígado durante la esmoltificación. Estandarización del estadio
smolt frente al parr. La expresión génica relativa de cada hormona o receptor smolt está estandarizada respecto
a su expresión en el estadio parr. La expresión de los ARN mensajeros se obtuvieron con el método de Livak &
Schmittgen (2001). El análisis estadístico que se realizó para las 4 hormonas (A, B, C y D) es el Test de Welch.
La significancia, representada con un asterisco, se determinó para un p≤0,05. Los errores estándar representados
(límites superiores) presentan diferencia a los inferiores.
Parr Smolt
Hor
mon
a C
reci
mie
nto
0
2
4
6
8
10
12
*
Parr Smolt
Hor
mon
a P
arat
iroi
dea
0
1
2
3
4
5
6
7
*
Parr Smolt
Cal
mod
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na
0
1
2
3
4
5
6
7 *
Parr Smolt
17B
-Est
rad
iol
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
*
20
5.2. Músculo
En músculo, el único gen que se sobreexpresó en el estadio smolt presentando diferencias
significativas (p=0,0123) fue el que codificante de la calmodulina (5C). Su abundancia
relativa fue 1,85 (1,41-2,42) veces mayor. Un caso particular fue la ausencia de expresión del
gen codificante para el precursor del receptor de la calcitonina.
En cambio, los demás genes se subexpresaron. La expresión del gen codificante de la
hormona paratiroidea (4A) fue 0,35 (0,26-0,47) veces menor y presentaba diferencias
significativas con un p=4,68·10-3. El receptor de la calcitonina (4B) se expresaba 0,18 (0,13-
0,24) veces menos en los peces smolt, con diferencias significativas (p=1,91·10-4) respecto a
los peces parr. La calcitonina isoforma (4C) poseía una subexpresión 0,37 (0,28-0,50) veces
menor, y también se demostró diferencias significativas (p=5,81·10-3) entre ambos estadios.
La estaniocalcina 2 (4D) se expresaba 0,45 (0,34-0,60) veces menos en el estadio smolt, con
diferencias significativas (p=0,0228). La hormona de crecimiento (5A) se expresaba 0,06
(0,04-0,07) veces menos en el estadio smolt, y también presentaba diferencias
estadísticamente significativas (p=3,61·10-6). Sin embargo, la expresión de 17β-estradiol (5B)
fue 0,82 (0,63-1,06) veces menor en el estadio smolt, pero no presentaba diferencias
significativas (p=0,6654).
21
A B
C D
Figura 4. Expresión génica relativa de la hormona paratiroidea (A), receptor de la calcitonina (B),
calcitonina isoforma (C) y estaniocalcina 2 (D) en músculo durante la esmoltificación. Estandarización del
estadio smolt frente al parr. La expresión génica relativa de cada hormona o receptor smolt está estandarizada
respecto a su expresión en el estadio parr. La expresión de los ARN mensajeros se obtuvieron con el método de
Livak & Schmittgen (2001). El análisis estadístico que se realizó para el caso A, B, C y D fue un ANOVA de un
factor, ya que cumplían los criterios de aleatoriedad, normalidad y homocedasticidad. La significancia,
representada con un asterisco, se determinó para un p≤0,05. Los errores estándar representados (límites
superiores) presentan diferencia a los inferiores.
Parr Smolt
Hor
mon
a P
arat
iroi
dea
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
*
Parr Smolt
Rec
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r C
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ina
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
*
Parr Smolt
Cal
cito
nin
a Is
ofor
ma
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
*
*
Parr Smolt
Est
anio
calc
ina
2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
*
22
A
Parr Smolt
Hor
mon
a C
reci
mie
nto
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
*
B
Parr Smolt
17B
-Est
rad
iol
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
C
Figura 5. Expresión génica relativa de la hormona de crecimiento (A), 17β-Estradiol (B) y calmodulina (C)
en músculo durante la esmoltificación. Estandarización del estadio smolt frente al parr. La expresión
génica relativa de cada hormona o receptor smolt está estandarizada respecto a su expresión en el estadio
parr. La expresión de los ARN mensajeros se obtuvieron con el método de Livak & Schmittgen (2001). El
análisis estadístico que se realizó para la hormona A fue el Test de Kruskal Wallis debido a su falta de
normalidad, test de Welch para la hormona B y es el Test de Welch y un ANOVA de un factor para la C. La
significancia, representada con un asterisco, se determinó para un p≤0,05. Los errores estándar representados
(límites superiores) presentan diferencia a los inferiores.
Parr Smolt
Cal
mod
ulin
a
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
*
23
6. Discusión
En el presente trabajo se evaluó la expresión de genes relacionados con el metabolismo del
calcio durante la esmoltificación de Salmo salar. Los registros bibliográficos (e.g. Wendelaar
Bonga, 1982; Wagner et al., 1998; Guerreiro, 2002) permitieron determinar los genes que
influían, tanto directa como indirectamente, en el control del metabolismo del ión calcio.
Entre otros genes, encontramos la calmodulina, el precursor del receptor de la calcitonina, el
receptor de la calcitonina, la calcitonina, la estaniocalcina 2, la hormona de crecimiento, la
hormona paratiroidea y el 17β-Estradiol. Es de gran importancia conocer la variación de la
expresión génica de estos genes durante la esmoltificación, porque permitirán entender los
mecanismos fisiológicos que ocurren durante la misma, y en especial, los mecanismos
osmorreguladores de la concentración iónica de calcio y del balance hidrológico del
organismo. Con esta finalidad, se escogieron 2 tejidos, siendo uno de ellos el hígado, esto
debido a la relación existente entre el calcio y el aporte de energía (e.g. glucólisis,
fosforilación oxidativa) en momentos cruciales de supervivencia y como segundo tejido el
músculo, debido a que la contracción muscular sería imposible sin iones calcio.
En la actualidad, se utiliza la actividad de la bomba N⁺, K⁺-ATPasa branquial como indicador
de que los salmónidos están preparados para el traspaso al agua salada, es decir, son los
llamados “smolt”. Sin embargo, la alta tasa de mortalidad que produce en la industria acuícola
este cambio de ambiente desde agua dulce al agua de mar, hace necesario conocer otros
indicadores más específicos, que ayuden a una mejor toma de decisiones. La variación de la
expresión de genes que regulan el metabolismo del calcio, incluyendo la osmorregulación del
mismo, podrían determinar el momento exacto en el que los salmones estarían
fisiológicamente preparados para la esmoltificación. Por todo esto, la importancia de esta
investigación radica en la posibilidad de otorgar otros marcadores para así conocer el
24
momento más exacto donde el proceso de esmoltificación se esté llevando a cabo con éxito y
con esto, desarrollar una producción de Salmo salar más eficiente y sustentable.
6.1. Hormona de Crecimiento
En la transformación parr-smolt se produce un incremento de la producción de la hormona de
crecimiento para incrementar la tolerancia a la salinidad (McCormick, 2011), además de
estimular el crecimiento somático para poder hacer frente a los grandes cambios osmóticos y
generar glucosa partir de la ruptura del glucógeno (Glucogenolisis) almacenado en el hígado
(Björnsson, 1997). Esto se refleja en el aumento de la expresión de la hormona de crecimiento
(Figura 3A) en el hígado, que induce la producción local de los factores de crecimiento
insulínico tipo 1 (IGF-1). La liberación de IGF-1 al torrente sanguíneo le permite alcanzar las
branquias como tejido diana y así estimular la excreción de iones como cloro y sodio, esto
debido al aumento del tamaño de las células de cloruro y la actividad de la bomba N⁺, K⁺-
ATPasa (McCormick, 2011). Sin embargo, en músculo la expresión de GH es
significativamente menor en la fase smolt (Figura 5A). Esto podría deberse a que en la
transformación parr-smolt, el salmón necesita demandar más cantidad de GH en el tejido
hepático y obtener la energía suficiente para sobrevivir durante el proceso de aclimatación al
agua salada.
En relación a esto, Foster et al. (1991) demostraron la estimulación de síntesis de proteínas en
hígado y la disminución de la concentración de proteínas del músculo blanco, debido al
suministro de GH a ejemplares de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss). Según Björnsson
(1997), esto puede ser porque la redistribución de proteínas musculares a otros órganos,
provee la base para que la GH fomente el rápido crecimiento de dicho órgano. Mientras tanto,
en músculo estas proteínas son reemplazadas por agua hasta que el pez tenga suficiente
proteínas para reponer los músculos.
25
Por tanto, puede que los salmones tengan un mecanismo por el cual evitan degradar proteínas
musculares esenciales para alcanzar el agua salada, sobretodo del músculo blanco, cuya
característica es la contracción rápida.
6.2. Metabolismo del calcio
La calcitonina (CT), la estaniocalcina 2 (STC2) y la hormona paratiroidea (PTH), junto con la
vitamina D3 parecen ser las principales hormonas reguladoras de la circulación extracelular
de calcio, así como el consumo, la excreción y la movilización de calcio de los huesos
(Guerreiro, 2002). Por un lado, la sobreexpresión de la CT (Figura 2C) permite al pez
mantener los niveles internos de calcio, debido a que esta hormona estimula la actividad de
los osteoblastos para formar huesos y escamas previniendo la liberación de iones calcio, y la
excreción de calcio en el intestino y en el riñón (Guerreiro, 2002). De esta forma, impide que
se genere un exceso de calcio en el plasma sanguíneo. Así, es de esperar que aumente la
expresión del precursor del receptor y del propio receptor de la CT en hígado (Figura 2A y
2B), ya que permite captar y activar las células objetivo de la calcitonina. Por el contrario, en
el músculo la ausencia de expresión del precursor del receptor de la CT y la disminución
significativa de la expresión del gen que codifica para el receptor y la CT, puede deberse a
que durante la esmoltificación, el músculo requiere iones calcio disponibles para realizar la
contracción muscular.
Se podría suponer que durante la esmoltificación, el calcio que obtienen las fibras musculares
procede de la circulación sanguínea y esta a su vez del medio externo (agua y dieta). De esta
manera, el consumo de calcio por parte del tejido muscular y el control del ión por la CT,
disminuye la concentración de calcio sanguíneo en el agua salada, manteniendo así la
homeostasis. Además, es por esta razón que los niveles de STC2, hormona que disminuye la
absorción y el transporte de calcio en las branquias y en el intestino ( Wagner et al., 1998;
26
Guerreiro, 2002), está subexpresada tanto en hígado como en músculo (Figura 2D y 4D), ya
que según lo informado por Wagner et al. (1998), una mayor cantidad de calcio, induce la
generación de STC2, con lo que al bajar los niveles de calcio, disminuirán los de STC2.
En concreto, que la expresión del gen que codifica para la STC2 sea estadísticamente
significativa en el tejido muscular, debe ser porque es de vital importancia la obtención de
calcio en este tejido, y una menor expresión de STC2 permitirá la entrada de calcio al tejido
muscular. Además, la diferencia de expresión relativa entre parr y smolt debe ser mayor en
músculo que en hígado, como demuestra la Figura 2D y 4D, debido a que en agua dulce el
salmón necesita más cantidad de calcio en el músculo para hacer frente a las fuertes corrientes
e incrementar la contracción muscular.
Por otro lado, la PTH es una hormona que es secretada por la glándula paratiroidea a la
sangre, para restaurar los niveles de calcio cuando estos poseen una concentración inferior a la
habitual o al rango fisiológico necesario. Para ello, realiza una serie de funciones como,
inducir la liberación de calcio de los huesos activando los osteoclastos, aumentando la
reabsorción de calcio en el intestino y en el riñón y así evitar la pérdida del ión a través de la
orina (Guerreiro et al., 2007). Debido a esto, su producción debe disminuir en peces
adaptados al agua de mar. Sin embargo, se encuentra un aumento significativo de la expresión
génica de PTH en el hígado (Figura 3B) y una disminución significativa en el tejido muscular
(Figura 4A). Para entender esto, hay que entender el funcionamiento de la hormona 17β-
Estradiol (E2). Esta hormona aumenta la producción de vitelogenina en hígado para la
formación de los ovocitos, pero también incrementa hasta 2,5 veces los niveles del ión calcio
en plasma y hasta 10 veces el calcio total (Guerreiro, 2002). El aumento significativo que
presenta la expresión génica de la hormona E2 (Figura 3D), indica que los niveles de calcio en
el tejido hepático deben incrementar. Ahora bien, como afirma Fuentes et al. (2007) el
27
incremento de E2 produce un efecto hipercalcémico que se ve menguado por la presencia de la
PTH, estabilizando el balance de calcio en el pez. Para ello, la PTH podría estar liberando los
iones calcio del citoplasma celular, que a su vez son captados por la calcitonina a nivel renal o
directamente utilizados para la formación de los huesos y las escamas durante el crecimiento
asociado a la esmoltificación.
De esta manera, la acumulación del ión calcio intracelular gracias a la E2, la PTH y la GH
(comentado arriba) permite a hormonas como la CaM (Figura 3C), hormona que forman un
complejo Ca2+-CaM (Carter & Török, 2002), activar rutas metabólicas como la glucólisis (i.e.
rotura de las moléculas de glucosa para obtener energía en forma de ATP), fosforilación
oxidativa (i.e. formación de energía en forma de ATP), lipólisis (i.e. consumo de los ácidos
grasos de reserva o triglicéridos) y la glucogenolisis (i.e. transformación de glucógeno en
glucosa) para la obtención de energía, así como favorecer la síntesis y la activación de
proteínas, como es el caso de la bomba ATPasa de Calcio (Velandia et al., 2001).
Como explica Somlyo et al. (1985) el retículo endoplasmático y las mitocondrias son los
orgánulos hepáticos más importantes en la regulación de calcio citoplasmático, ya que en el
primero se produce procesos tan importantes como la síntesis de proteínas y en el segundo la
fosforilación oxidativa. Ahora bien, conforme a los resultados de este estudio, Velandia et al.
(2001) confirma que la activación de la ATPasa de Calcio por el complejo Ca2+-CaM genera
la entrada en contra de gradiente electroquímico de iones calcio al interior de los orgánulos
como el retículo endoplasmático rugoso y liso.
Por otra parte, la hormona E2 no presenta variaciones significativas (Figura 5B) en el tejido
muscular, mientras que la PTH disminuye significativamente (Figura 4A). Esto quiere decir
que las células musculares no demandan más cantidad de calcio, sino que es suficiente con el
calcio incorporado del medio ambiente (agua y dieta). En relación a esto, una sobreexpresión
28
significativa de CaM (Figura 5C) podría indicar el aumento de la actividad de las proteínas
musculares (Velandia et al., 2001).
29
7. Conclusiones
Las variaciones fisiológicas de Salmo salar durante la esmoltificación generan
cambios de expresión de las hormonas que regulan el metabolismo del calcio, tanto en
hígado como en músculo, por lo que se acepta nuestra hipótesis.
En hígado, la acción conjunta de la hormona de crecimiento, 17β-Estradiol, la
hormona paratiroidea, la calcitonina y la estaniocalcina 2 permiten consumir, de
manera controlada, el calcio celular para activar rutas metabólicas que ofrezcan la
energía y síntesis proteica necesaria para hacer frente al proceso de esmoltificación.
Además de expulsar el exceso de calcio del citosol y mantener la homeostasis.
En músculo, la disminución de la calcitonina, la estaniocalcina 2 y la hormona
paratiroidea, facilita la asimilación y utilización del ión calcio por parte de las células
musculares, favoreciendo la formación del complejo Ca2+-CaM que a su vez estimula
la actividad de proteínas musculares.
En el futuro, el conocimiento de esta de la variación de la expresión génica de genes
que regulan el metabolismo del calcio, y que por tanto, beneficia el proceso de la
osmorregulación durante la esmoltificación, ofrecerá apoyo en la selección de
salmones fisiológicamente preparados para el paso a agua salada, disminuyendo la
gran mortalidad ejemplares cultivados y favoreciendo el desarrollo sustentable de la
salmonicultura.
30
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34
9. ANEXO
Anexo I. Determinación experimental de la temperatura óptima de funcionamiento
de oligonucleótidos (Tª de Melting) en electroforesis.
Figura 6. Calmodulina. PCR en gradiente para
determinar la temperatura óptima de los
oligonucleótidos de la calmodulina.
La temperatura elegida fue 63,8ºC.
Figura 7. Receptor de la Calcitonina. PCR en
gradiente para determinar la temperatura óptima
de los oligonucleótidos del receptor de la
calcitonina. La temperatura elegida fue 63,8ºC.
Ladder Temperatura (ºC) 100 pb 65 63,8 62 59,1 55,7 52,9 51 50
Ladder Temperatura (ºC) 100 pb 65 63,8 62 59,1 55,7 52,9 51 50
35
Figura 8. Precursor del Receptor de la Calcitonina.
PCR en gradiente para determinar la temperatura
óptima de los oligonucleótidos del precursor del
receptor de la calcitonina. La temperatura elegida
fue 63,8ºC.
Figura 9. Calcitonina Isoforma. PCR en gradiente
para determinar la temperatura óptima de los
oligonucleótidos de la calcitonina isoforma.
La temperatura elegida fue 63,8ºC.
Ladder Temperatura (ºC) 100 pb 65 63,8 62 59,1 55,7 52,9 51 50
Ladder Temperatura (ºC) 100 pb 65 63,8 62 59,1 55,7 52,9 51 50
36
Figura 10. Hormona paratiroidea. PCR en
gradiente para determinar la temperatura óptima
de los oligonucleótidos de la hormona paratiroidea.
La temperatura elegida fue 62ºC.
Figura 11. Estaniocalcina 2. PCR en gradiente
para determinar la temperatura óptima de los
oligonucleótidos de la estaniocalcina 2.
La temperatura elegida fue 59,1ºC.
Ladder Temperatura (ºC) 100 pb 65 63,8 62 59,1 55,7 52,9 51 50
Ladder Temperatura (ºC) 100 pb 65 63,8 62 59,1 55,7 52,9 51 50
37
Figura 12. Hormona de Crecimiento. PCR en
gradiente para determinar la temperatura
óptima de los oligonucleótidos de
la hormona de crecimiento. La
temperatura elegida fue 51ºC.
Figura 13. Hormona 17β-Estradiol. PCR en
gradiente para determinar la temperatura óptima
de los oligonucleótidos de la hormona 17β-Estradiol.
La temperatura elegida fue 51ºC.
Ladder Temperatura (ºC)100 pb 65 63,8 62 59,1 55,7 52,9 51 50
Ladder Temperatura (ºC) 100 pb 65 63,8 62 59,1 55,7 52,9 51 50