Clase 2 Microbiologia Aplicada a La Mineria
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Lixiviacin Microbiana
Dr. Mario Esparza Mantilla Laboratorio de Biominera. Departamento de Acuicultura. Facultad de
Recursos del Mar. Universidad de Antofagasta. Chile.
FACULTAD DE RECURSOS DEL MAR-DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA
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Mayo, 2013
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A. ferrooxidans
Unidad I: MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA
BIOMINERIA
Microbiologa
Gentica
Biologa Molecular
Bioinformtica
Bioprocesos
Bio-Hidrometalurga
UNIDAD II. LIXIVIACION MICROBIANA
A. caldus
Unidad III. OPERACIONES DE BIOHIDROMETALURGICA
Contenidos del curso terico- prctico
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Desde las clulas microbianas a la obtencin industrial de metales
FACULTAD DE RECURSOS DEL MAR-DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA
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Lixiviacin Microbiana
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OBJETIVOS: Entrenar a los estudiantes en tcnicas de muestreo, aislamiento, conteo e identificacin molecular de microorganismos biolixiviantes. CONTENIDOS: 1. Introduccin a la microbiologa. Los dominios de la vida. Bacterias, arqueas y eucarias. 2. Cintica de crecimiento microbiano. Parmetros de anlisis. 3. Fisiologa Microbiana. Metabolismo auttrofo y hetertrofo, nutrientes, demanda de oxgeno, carbono y sustratos energticos. 4. Muestreo y aislamiento de bacterias, recuento microbiano, caracterizacin morfolgica y cultivos slidos y lquidos de bacterias y arqueas biolixiviantes. 5. Identificacin molecular de microorganismos biolixiviantes. Anlisis de ADN y marcadores genticos asociados al metabolismo energtico de metales y al metabolismo de carbono.
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA
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Cintica de crecimiento microbiano
Fisiologa Microbiana
Muestreo y aislamiento de bacterias
Recuento y caracterizacin microbiana
Identificacin molecular y genmica
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Introduccin a la Microbiologa
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA
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GEOMICROBIOLOGIA MINERA
Las clulas microbianas digieren minerales
Sulfuro Metlico (MFeS2)
Bacterias Biolixiviantes
M2+
Fe2+
Fe3+
S
SO42- + 2H+
M2+
1. Cmo realiza el proceso? 2. Qu elementos biolgicos tiene para
digerir el mineral? 3. Cmo evade la toxicidad del metal,
mecanismos?
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1. Comprender como crecen y funciona la clulas microbiana.
2. Entender el rol de la clula en un ambiente extremo: pH cido, poco sustrato, metales pesados, etc.
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Fisiologa Microbiana: El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes
El cultivo debe asegurar que siempre haya suministro de fuentes energticas (Fe2+, S, etc), fuentes de carbono ( CO2, HCO3
-, Ca2CO3 ) y fuente de Nitrgeno ( sales de amonio), oxgeno (aireacin). Todo debe estar a pH cido y en agitacin constante (180 RPM) para asegurar la homogenizacin de los nutrientes.
El cultivo en laboratorio debe homologar las condiciones del ambiente natural
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Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
2 Schrader, J & D. Holmes (1998). J. Bacteriol (170)9: 3915-3923.
Fisiologa Microbiana: Medio lquido 9K para A. ferrooxidans
1 Yates, J. R. & D. Holmes (1987). J. Bacteriol (169)5: 1861-1870.
Ingredientes 10X ( g/L) 1X( g/L)
(NH4)2SO4 150 15
KCI 5 0,5
K2HPO4 2,5 0,25
MgSO4 . 7H20 25 2,5
Ca(NO3)2 0.72 0,072
H2SO4 10N 50 ml 5
Almacenar a 4C.
FeSO4.7H2O 330 33
S 50 5
Na2S2O3.5H2O 50 5
O2 (72%)
CO2 (0,036%)
Aireacin
Aireacin
9K+ Fe 2+
9K+ S
9K+ S
H2
Carbono
Nitrgeno
Energa
Oxgeno
pH: 3,5
pH: 1,6
pH: 3,5
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
Los ingredientes para la receta del medio salino 9K
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MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Schrader, J & D. Holmes (1998). J. Bacteriol (170)9: 3915-3923.
Fisiologa Microbiana
El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes permite conocer la morfologa de la colonia y es aplicable para poder aislar a las bacterias as como hacer anlisis de recuento de viables cultivables. Esto permite tener mayor informacin que el mtodo de recuento en cmara bajo microscopio en donde se cuentan clulas muertas, clulas daadas y clulas viables.
Medio slido para A. ferrooxidans
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Yong-Quan Li y cols (2011). J Curr Microbiol (2010) 60:1724.
Fisiologa Microbiana
El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes permite conocer la morfologa de la colonia y es aplicable para poder aislar a las bacterias as como hacer anlisis de recuento de viables cultivables. Esto permite tener mayor informacin que el mtodo de recuento en cmara bajo microscopio en donde se cuentan clulas muertas, clulas daadas y clulas viables.
Medio slido para A. ferrooxidans
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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Compuesto Concentracin % Inhibicin
As (III) 200 ppm 70
As(V) 500 ppm 70
Fluoruro 4.7 ppm 100
Cianuro 6.2 ppm 99
Molibdato 1 mM 85
Nitrato 5.8g/l 100
Cloruro de sodio 5g/l 50
Cloruro de sodio 10g/l 90
Luz: la luz visible y la no filtrada tienen un efecto inhibitorio sobre algunas especies del genero Acidithiobacillus,
pero el frrico ofrece alguna proteccin a los rayos visibles.
Presencia de Inhibidores: en los procesos de molienda o por accin propia del agente lixiviante se liberan algunos
iones que en ciertas concentraciones resultan txicas para las bacterias ferroxidantes afectando el desarrollo bacterial.
La literatura seala que los niveles de tolerancia de las bacterias para ciertos metales es Zn+2= 15 72 g/l; Ni+2 =12
50 g/l; Cu+2 =15g/l; Ag+ =1ppb; UO2+2 = 200 500 mg/l, entre otros.
MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Jo, M (2008).
Inhibidores del crecimiento en A. ferooxidans
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Tcnicas microbiolgicas y herramientas para aislamiento y
cultivo de bacterias
Muestreo y aislamiento de bacterias biolixiviantes
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Muestreo y aislamiento de bacterias acidfilas
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MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Aislamientos de A. ferrooxidans
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
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Muestreo y aislamiento de bacterias acidfilas
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Muestreo y aislamiento de bacterias acidfilas
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Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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Recuento microscpico en cmara de Petroff-Hausser
Determinacin del nmero ms probable
Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables (azul de metileno)
Recuento bacteriano basado en tcnicas moleculares (PCR y qPCR)
MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Recuento y caracterizacin microbiana
MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.
Discusin: viable/no viable; efecto del medio cultivo
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MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Recuento y caracterizacin microbiana
Recuento por filtracin en membrana
Determinacin del nmero ms probable en placas de ELISA
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Recuento por siembra por extensin
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.
Recuento y caracterizacin microbiana
Recuento en placa por siembra por incorporacin o extensin (solo crecen los microorganismos cultivables).
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.
Recuento y caracterizacin microbiana
Recuento en placa mediante diluciones seriadas
Migracin celular por preferencia del oxgeno
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.
Caracterizacin microbiana por tincin de Gram
Las bacterias biolixiviantes preferentemente son Gram negativas Por qu?
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Tcnica de hibridacin fluorescente in situ (FISH): es una tcnica de tincion de cromosomas en la que se provoca que los cromosomas especificos brillen bajo el microscopio.
Microcolonias en DEFT: tcnica de epifluorescencia directa en filtro. En esta tcnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina que tie especificamente los acidos nuclecos). La deteccion de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopia de fluorescencia o por cualquier otro metodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son mas facilmente detectables.
Recuento de microcolonias al microscopio: se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a un portaobjeto y se incuba para seguir la formacion de microcolonias al microscopio.
Gotitas de agar: se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias
en las gotitas tras la incubacin.
MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Jo, M (2008).
Caracterizacin microbiana
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Las bacterias Lixiviantes son o no sensibles a los antimicrobianos?
MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.
Recuento y caracterizacin microbiana
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ETAPAS
UFC (bact/ml)
Preparacin de
inculo
Propagacin de
inculo
Proliferacin de
inculo
Anlisis Qumico y
Biolgico
108
104
Tiempo(h)
Fe2+ Fe3+ Potencial Redox
Velocidad de crecimiento ()
UFC= 106 bact/ml
500 ml (volumen total) 50 ml
(cultivo de trabajo)
106 bact/ml
5 ml (inculo)
104 bact/ml
Todos los matraces deben
contener al inicio del experimento 104 bact/ml
Los experimentos deben hacerse por triplicado
MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Preparacin de inculos de A. ferrooxidans
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5000 ml (volumen total)
104 bact/ml
500 ml (volumen de
trabajo)
108 bact/ml
10 000 rpm x10 min 4C
Lavar 2 Veces
en 9K
Cosechar Pellet Celular
48 h
Resuspender Pellet Celular
1,0ml de Glicerol (50%)+ 9K Repartir 0,5 ml en dos nuevos
tubos y aforar a 1.0ml con Glicerol (50%) + 9K
Alicuotar 40 tubos eppendorf de 1,5ml con 50 l de inculo (2,5x10
10 bact/ml) y almacenar a -20C hasta su uso.
MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Preparacin de inculos de A. ferrooxidans
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Alicuotar 40 tubos eppendorf de 1,5ml con 50 l de inculo (2,5x10
10 bact/ml) y almacenar a -20C hasta su uso.
Resuspender o llevar al vortex por 1 min
Aforar hasta 1 ml con 9K y traspasar a matraz con 49
ml de medio a usar (9K+Fe)
Incubar por 48h a
30C A 180 RPM
ETAPAS
MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Proliferacin de clulas de A. ferrooxidans
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A. ferrooxidans
Aislamiento y cultivo de bacterias
Caractersticas de colonia,
forma y tamao Crecimiento en
placa
Aislamiento de
ADN
secuenciacin Respaldo y produccin de cultivos
tipo
Tiempo
+ A.ferrooxidans Fe 2+
Medio de cultivo 9K
ETAPAS
MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Produccin de cultivos tipo de A. ferrooxidans
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A. ferrooxidans
Li y cols. (2011). Folia Microbiol 56:439451
Anlisis mediante microarreglos (ADN chip) en bacterias lixiviantes
L. ferrooxidans
Moreno-Paz , M. & V. Parro(2006) .Environmental Microbiology 8 (6), 10641073.
Identificacin molecular y genmica
MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
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Qu hacer para que las bacterias Biolixiviantes crezcan mas rpido a nivel industrial?
Perspectivas de la Microbiologa Minera
Ustedes deben responder y Tarea N1
MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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Los Microorganismos biolixiviantes crecen muy lento. Por qu?
BIOMINERIA ( quimiolitoautotrofos oxidantes del hierro o azufre) La mayoria son bacterias entre ellas destacan Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus thiooxidans Thiobacillus Thiooxidans
Muchos de estos microorganismo son de inters biotecnolgico en:
Aplicacin Biotecnolgica Acelerar el crecimiento
Produccin de Biomasa
La realidad biolixiviante
MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Ingeniera Gentica en Bacterias Lixiviantes
En la industria de alimentos, la agricultura, la salud, entre otras usan organismos genticamente modificados (Transgnicos) para potenciar la productividad de sus procesos y tener sistemas biolgicos con capacidades mejoradas pero en la Industria de la Minera eso no ha ocurrido ni mucho menos se hace procesos biolixiviantes con microorganismos transgnicos
El Desafo
Realizar manipulacin gentica y producir microorganismos transgnicos con capacidades genticas mejoradas que permitan realizar los procesos biolixiviantes en menores tiempos que los microorganismos nativos.
Los Obstculos
Poca investigacin, escasa reproducibilidad experimental, no hay vectores eficientes de transferencia de material gentica, escaso crecimiento de bacterias mineras en medio solido en presencia de antibiticos o marcadores de seleccin y
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.
Ingeniera Gentica en Bacterias Lixiviantes
Los Virus son excelentes vectores para hacer manipulacin gentica bacteriana
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Kusano y cols., (1992). J Bacteriol. 174: 6617-6623.
Bacteria Tcnica
Acidiphilium sp. electropermeabilizacin
conjugacin
Acidithiobacillus thiooxidans
conjugacin
Acidithiobacillus ferrooxidans
electropermeabilizacin
Acidithiobacillus ferrooxidans
conjugacin
MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Ingeniera Gentica en Bacterias Lixiviantes
Estrategias para producir bacterias transgnicas Biolixiviantes
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Ingeniera Gentica en Bacterias Lixiviantes
Los vectores conocidos de organismos acidfilos son:
Cardenas y Cols (2010). Appl Microbiol Biotechnol 88:605620.
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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Ingeniera Gentica en Bacterias Lixiviantes
Las bacteria lixiviante A. ferrooxidans presentan sistema inmune
Horvath.P, y cols (2010).Science. - Josiane E. & Garneau, Marie-ve Dupuis (2010) Nature.
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Biologa sinttica en Biominera
Construccin de la bacteria ideal para la Minera (La bacteria Top1)
MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Alta resistencia a los metales
pesados
Alta produccin de biomasa
Alta recuperacin de
metales
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Microbiologa Aplicada a la Minera
Anlisis y discusin de papers
Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla
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Paper 1
Anlisis y discusin de papers
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Paper 2
Anlisis y discusin de papers
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Anlisis y discusin de papers
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Johnson, D.B ( 1998). FEMS Microbiol Ecol:307-317.
Anlisis y discusin de papers
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Johnson, D.B ( 1998). FEMS Microbiol Ecol:307-317.
Anlisis y discusin de papers
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Johnson, D.B ( 1998). FEMS Microbiol Ecol:307-317.
Anlisis y discusin de papers
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Anlisis y discusin de papers
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Anlisis y discusin de papers
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Hallberg, K.B ( 2010). Hidromet. 104:448-453
Anlisis y discusin de papers
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Hallberg, K.B ( 2010). Hidromet. 104:448-453
Anlisis y discusin de papers
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Hallberg, K.B ( 2010). Hidromet. 104:448-453
Anlisis y discusin de papers
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Rawlings, D.E & D. B. Johnson. ( 2007). Microbiol. 153: 315-324.
Anlisis y discusin de papers
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Rawlings, D.E & D. B. Johnson. ( 2007). Microbiol. 153: 315-324.
Anlisis y discusin de papers
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Rawlings, D.E & D. B. Johnson. ( 2007). Microbiol. 153: 315-324.
Anlisis y discusin de papers
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Rawlings, D.E & D. B. Johnson. ( 2007). Microbiol. 153: 315-324.
Anlisis y discusin de papers
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Brierley, C. D. ( 2008). Trans. Nonferrous Met. Soc. China..18: 1302-1310.
Anlisis y discusin de papers
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Anlisis y discusin de papers
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Brierley, C. D. ( 2008). Trans. Nonferrous Met. Soc. China..18: 1302-1310.
Anlisis y discusin de papers
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Donati, E & S. Wolfgang ( 2007). Microbial Processing of Metal Sulfides.
Anlisis y discusin de papers
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Donati, E & S. Wolfgang ( 2007). Microbial Processing of Metal Sulfides.
Anlisis y discusin de papers
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Donati, E & S. Wolfgang ( 2007). Microbial Processing of Metal Sulfides.
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Donati, E & S. Wolfgang ( 2007). Microbial Processing of Metal Sulfides.
Anlisis y discusin de papers
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Preguntas
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