Citometría de Flujo      La citometria de flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparametrico  cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas  (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. La citometría de flujo es una tecnología (proceso) que permite la medida simultánea de múltiples características físicas de una sola célula. Estas medidas son realizadas mientras las células (partículas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a 4000 células por segundo, a través del aparato de medida en una corriente de fluido.

EL CITOMETRO NECESITA UN SISTEMA COMBINADO DE:

SISTEMA HIDRAULICO: Controles neumático y fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo. SISTEMA OPTICO: Láser (Argón con luz monocromática de 488nm , filtros , lentes y detectores. SISTEMA ELECTROINFORMATICO: Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis.

Sistema optico 

    

El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores.PARAMETROS Características Morfológicas  de la célula : tamaño y complejidad del citoplasma Características antigénicas  de la célula : Inmunofenotipo.PARAMETROS FISICOS

Su tamaño relativo (forward scatter-FSC) Su granularidad relativa o complejidad interna (side scatter SSC).

FLUORESCENCIA RELATIVA  Determinación cuantitativa de características antigénicas, bioquímicas y biofísicas de células individuales.

OBJETIVOS PRINCIPALES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas. Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas (por deflexión electrostática; esta tecnología de

separación se llama "electronic cell sorting") Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas

FLUORESCENCIA         Un fluorocromo es una  molécula química que absorbe la luz a una determinada longitud de onda (ENERGIA) energía de excitación y emite a una longitud superior (MENOR ENERGIA) Interacciona con la luz de excitación procedente de el láser. Se utiliza unido a anticuerpos específicos (monoclonales) para antígenos de la célula. La cantidad de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la cantidad de sitios de unión.Cómo se obtiene la luz fluorescente.

Unión de sitios específicos con anticuerpos marcados con fluorocromos El fluorocromo absorbe energía del láser El fluorocromo libera energía absorbida por : Vibración y disipación del calor. Emisión de fotones a una mayor longitud de onda llamada  fluorescencia.

REACTIVOS FLUORESCENTESMarcadores fluorescentes de unión covalente: Isoticianato de Fluoresceina, Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas. Marcadores fluorescentes de unión no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acrimina, yoduro de propidio, rh12. Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente .

Pequeñas moléculas orgánicas (FITC, biotina): unión covalente directa con grupos amino libres en anticuerpos Proteínas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a través de algunos reactivos.

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Hematología : tipificación y conteo de células Farmacología :estudios de cinética celular Inmunología :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular Oncología :Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos Determinación del contenido celular de DNA  Apoptosis  Fagocitosis 

VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Análisis de un número estadísticamente significativo de células (1000 a más de 100.000 células). Múltiples marcajes de una sola célula. Análisis de alto número de partículas en corto tiempo (5.000 eventos /seg.). Alta sensibilidad y objetividad. Medidas separadas de cada célula (no sólo el promedio). Medidas cuantitativas: discriminación de las células según la cantidad de marcador. Múltiples parámetros: define subpoblaciones complejas. Miles de células por segundo.

DESVENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Poca información morfológica de la célula No proporciona información de la localización celular en un tejido Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de células / hora) Necesita suspensión de células individuales. Costos de la tecnología. Método destructivo.