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Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Posgrado en Ciencias Biológicas ANÁLISIS METAGENÓMICO DE COMUNIDADES BACTERIANAS DE SUELOS CONTAMINADOS CON DETERGENTES Tesis que presenta ALEJANDRA SOCORRO RAMOS CASTILLO En opción al título de MAESTRO EN CIENCIAS (Ciencias biológicas: Opción Biotecnología) Mérida, Yucatán, México 2013
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Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Posgrado en Ciencias Biológicas
ANÁLISIS METAGENÓMICO DE COMUNIDADES BACTERIANAS DE SUELOS CONTAMINADOS CON
DETERGENTES
Tesis que presenta
ALEJANDRA SOCORRO RAMOS CASTILLO
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS
(Ciencias biológicas: Opción Biotecnología)
Mérida, Yucatán, México
2013
CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCA TÁN, A. C.
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
RECONOCIMIENTO
POSGRADO EN
CIENCIAS BIOLÓGICAS
Por medio de la presente , hago constar que el trabajo de tesis titulado ANÁLISIS
METAGENÓMICO DE COMUNIDADES BACTERIANAS DE SUELOS CONTAMINADOS
CON DETERGENTES fue realizado en los laboratorios de la Unidad de Biotecnología del
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. bajo la dirección de la Dra. Aileen
O'Connor Sánchez y del Dr. Rafael Rojas Herrera , dentro de la opción de Biotecnología,
perteneciente al Programa de Posgrad n Ciencias Biológicas de este Centro.
Atentamente,
Coordinador de docencia
Centro de Investigación Científica de Yucatán , AC.
Mérida, Yucatán , México , Marzo del 2013.
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación
Científica de Yucatán, A.C. , y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los
servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos
de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece
patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya
manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le
pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica, A.C., y en el mismo
tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley
Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo
expuesto en la presente Declaración .
./ IBQ. ALEJANDRA SOCORRO RAMOS CASTILLO
Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación
Científica de Yucatán, y fue financiado con recursos del proyecto fiscal CICY-1039200015
bajo la dirección de la Dra . Aileen O'Connor Sánchez (UBT-CICY) y el Dr. Rafael Rojas
Herrera (FIQ-UADY)
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada con el
número 255397.
Al Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY) y a la Facultad de Ingeniería
Química de la Universidad Autónoma de Yucatán (FIQ-UADY) por las facilidades
otorgadas en el uso de las instalaciones y equipos para la realización de este proyecto.
, Al Posgrado en Ciencias Biológicas por proporcionarme los conocimientos durante mi
formación académica.
A mis asesores, Dra. Aileen O'Connor Sánchez y Dr. Rafael Rojas Herrera por las
asesorías, críticas y comentarios.
A mi com ité revisor de tesis integrado por la Dra. Blondy Canto Canché, Dra. Cecilia
Mónica Rodríguez García y Dr. Héctor Estrada Medina por el tiempo invertido en la
revisión del presente trabajo y sus valiosos comentarios.
Al Dr. Juan Manuel Dupuy Rada de la Unidad de Recursos Naturales del CICY, así como
al M. en C. Salvador Castell González, por el apoyo proporcionado en los análisis
estadísticos.
A la M. en C. lcela Ortiz Carrillo, por el apoyo técnico proporcionado en la realización de la
DGGE.
A la Dra. Neyi Estrella Gómez por las observaciones realizadas durante mis exámenes
tutorales semestrales.
Por último, pero con especial cariño, agradezco a los técnicos, Q.F.B Miguel Keb Llañes y
Dr. César de los Santos Briones por la invaluable ayuda que me proporcionaron a lo largo
de la realización de este proyecto.
DEDICATORIAS
Agradezco primeramente a Dios por la vida y salud que me ha regalado y por la
oportunidad de vivir esta etapa de mi vida junto a personas tan maravillosas.
A mis padres Evodio y Dulce María y a mis hermanos Lucy y Carlos, quienes son mi
principal fortaleza , mi inspiración, mi motivación en la vida. Los amo.
A mi amado esposo Angel. Gracias por estar a mi lado y por todos los momentos tan
bonitos que me has regalado, te amo compañero.
Amigos y compañeros.
En memoria de mis abuelitos Lucila, Higinio y Félix. Q.E.P.D.
ÍNDICE
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................................................. V
IN DICE DE FIGURAS ...... .......... .... . ............. .......... ................ .. . ................... .... ............ .... ............ . VIl
IN DICE DE CUADROS ................................................................................................................. VIII
RESUMEN .................................................................................................................................. IX
ABSTRACT ............ ........... ... .. .... .. ..... .. ... .... .......... .. ... ..... .... .... .... .. ...... .. .......... ... ........... . ..... ... ....... X
CAPÍTULO l. Planteamiento del trabajo
1.1 INTRODUCCION ..................................................................................................................... 1
1.2 ANTECEDENTES .................. .... ...... ................................. ..... .... ... .. ....... ......... .... ..................... 2
1.2.1 EL SUELO COMO ECOSISTEMA ........................... ................ .... ................................................ 2
1.2.1.1 CLASES TEXTURALES DEL SUELO .................................................................................... 3
1.2.2 ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA EN SUELOS .............................................................. 5
1.2.3 CAMBIOS EN LAS COMUNIDADES MICROBIANAS EDÁFICAS ..... .......... ........ .... ........ ..................... 6
1.2.4 IMPACTO DE LOS DETERGENTES EN LAS PROPIEDADES DEL SUELO Y LOS MICROORGANISMOS ... 7
1.2.5 METAGENÓMICA APLICADA A SUELOS .................................................................................... 8
1.2.6 TÉCNICAS APLICADAS AL ESTUDIO DE METAGENOMAS .......................................................... 1 0
1.2.6.1 ANÁLISIS DEL GEN ARNr 16S .......................................................................................... 11
1.2.6.2 ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DESNATURALIZANTE ..................... ................ . 12
1.2.6.3 PIROSECUENCIACIÓN .......... ............... .... ....... ............... ... ............. . ............... .... ..... ....... 13
1.2.7 HERRAMIENTAS PARA EL ANÁLISIS DE COMUNIDADES ......... .. ................ ............ .................. ... 15
ÍNDICE
1.2. 7.1 ÍNDICES ECOLÓGICOS .. ....... ....... .. ... ........ ... . .............................. . ...... .. .. .. . ....... ... ... ..... . ... 15
1.2.7. 1.1 DIVERSIDAD ALFA (a) ... ............................. .............. .... ... ... ....... ... ..... .. ... ............ .... . 15
1.2.7.1.2 DIVERSIDAD BETA (¡3) .............. ... ..... .... ... ... ..... ... ........... ... ... .. .. ..... ........ .... ... .... .... .... 18
1.3 JUSTIFICACIÓN . .. .. ... .... .............................................................. .. .... .... ... ....... ...... ... ...... ... .... 21
1.4 HIPÓTESIS .. ... ... .......... .. .......... ........ ... .... ... ........ ............................................................... ..... 21
1.5 OBJETIVOS .......... ..................... ..... .. ..... .. ... .... ..... ... .......... ..... ..... ...... .... ......... .. .. ...... ... ... ... ... .. 22
1.5.1 OBJETIVO GENERAL .. ..... .. .. ... ... .. ... ... ... .. .. ..... ....... ... .. .. .. .. . ....... ..... .. ............. ... ... .. ....... ..... ..... 22
1.5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .... . .... . .... . ......................... ...... ... .... ... .... ........... .. ... ...... ... ... .. .. .. ...... 22
1.6 ESTRATEGIA DE TRABAJ0 ... .............. ............. ............... ... ..... ......................... ............. ....... 23
1.7 BIBLIOGRAFÍA ......... .............. ............... .. ... ... ...... .... ... .... ..... ...... .... .. ... ... ... .. .... .... ..... ... ...... ... .. 24
CAPÍTULO 11. Análisis de las propiedades fisicoquímicas del suelo
2. 1 INTRODUCCIÓN .......... ... .. ... ............ ................ .... ........ ... ... .... .... ...... .... .. ........... ..... ... .... ........ 29
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS ............ ............. ..... .................... ........ .. .... ... ...... ............... ..... ...... 29
2.2.1 SITIO DE MUESTREO ........ ...... .................... . ............. ................. . ....... ... .. ............. .. .... .......... 29
2.2.2 TOMA DE MUESTRAS DE SUELO ... ............ ... . ........... ... ........... ....... ........ ... ........ ..... ... .... ........ . 30
2.2.2 ANÁLISIS EDÁFICOS .... .. .. .......... .. ...... ........... .. ... ... . .............................. .. ... . ............ .............. 30
2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN . ..... .. .......... ... ... ... ..... ..... ... .. .. ..... ...... .. .. .. ...................... .. .. ........ 31
2.3.1 ANÁLISIS EDÁFICOS ......... ........ .... ... . .... ...... ...... .. ... .... . .... .. .. .. .. ... .. . ... ... ... . ......... .... .. ... .. .... ..... 31
2.4 BIBLIOGRAFÍA ................... .... .. ..... ............... ...... ... .. ...................... .......... ..... ..... ..... .. ... ... ...... . 34
11
ÍNDICE
CAPÍTULO 111. Determinación de los índices ecológicos de suelos contaminados con
detergentes mediante DGGE.
3.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 35
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 36
3.2.1 EXTRACCIÓN DEL ADN METAGENÓMICO ................................................................................ 36
3.2.2 DETERMINACIÓN DE LA INTEGRIDAD DEL ADN METAGENÓMICO ............................................... 36
3.2.3 CUANTIFICACIÓN DEL ADN METAGENÓMICO .......................................................................... 36
3.2.4 AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL GEN 16S RIBOSOMAL BACTERIANO ... .... ..... ...... ..... ..... ............... 36
3.2.5 AMPLIFICACIÓN POR PCR DE LA REGIÓN VARIABLE V3 DEL GEN 16S RIBOSOMAL BACTERIANO ... 37
3.2.6 DGGE ... .. ... .. .................. .... . .. ........... .......... ....... .. .. ... ......... ... ... .... . .. .. ......... . .. .. ... .. ... ......... ... 38
3.2.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA DGGE ..................................................................................... 38
3.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN . ... ..... .... .. .. ...... .. ... .... .. ... .... .. ............ ... ..................................... 39
3.3.1 EXTRACION DEL ADN METAGENÓMICO .................................................................................. 39
3.3.2 CUANTIFICACIÓN DEL ADN METAGENÓMICO ............ .. ... ... ......... ...... . ... .... ...... ... .... .... ........... ... 39
3.3.3 AMPLIFICACIONES POR PCR ............................................................................................... .40
3.3.4 ANÁLISIS POR DGGE ........................ 00 ....... oo• ..................... 000 ....... 00 ................. 00 ................... 41
3.3.4.1 COEFICIENTE DE SIMILITUD DE DICE oo .... oo ............ oo .............. oo .......... oo ........ oo .... oo .. OOoOOOo000.43
3.4 BIBLIOGRAFÍA ........... ......... ....... ... ... ..... .................... ................. ..... ..... ............... .. .... ... ..... ... .45
111
ÍNDICE
CAPÍTULO IV. Identificación de los principales grupos bacterianos mediante el
análisis de las secuencias del gen 16s ribosomal
4.11NTRODUCCIÓN ............................. .. ..... .. ........ ............ ..................... .. ............ ............. ........ .47
4 .2 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................. .49
4.2.1 SECUENCIACIÓN DEL GEN ARNr 16S .. .................................................................................. .49
4 .2.2 ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS .. ... ... .... .. ........... ............................................ ....... .. ... ........... .49
4.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................... ., ........ .. .. .... .. 50
4.3.1 ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS , .......................... . .................................................. .. ............. 50
4.3.2 ANÁLISIS DE LOS CAMBIOS EN LA ABUNDANCIA RELATIVA DE LOS PRINCIPALES GRUPOS
BACTERIANOS ........ . .. ... ....... ........ . ..... ... ..... .... .... .. .. ........... . ..... ......................................... 54
4.3.3 ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES (PCA) ................................................................... 62
4 .4 BIBLIOGRAFÍA .. .......... ......... ......... ........... .... ........... ........ ........ . .. .. ......... . ...... ... ................ ...... 64
CAPÍTULO V. Discusión y conclusiones generales
5.1 DISCUSIÓN GENERAL ................ .. ......... ..... .. .. .... ... ............. ... ............. .......................... ... .... ... ..... 67
5.2 CONCLUSIONES GENERALES ...................................................................................................... 70
5.3 PERSPECTIVAS . .. ....................... . .... ....... ...... ..... ... .. ....... ....... .. ............ . ............. ... ......... ........ ..... 71
5.4 BIBLIOGRAFÍA ..... ............... .... .... . ......................... ................... ......... ....... ... ...... .... .... ..... .... ........ 72
ANEXOS ................ .. .......... ... .. .. .. ............ ......... ... ... .... ... ................. .. .................. . .. .. ..... ... .............. 73
ANEXO 1. ÍNDICES DE DIVERSIDAD RELATIVA UTILIZADOS PARA LOS ANÁLISIS DE DIVERSIDAD ................ 73
ANEXO 2. MATRICES GENERADAS EN EL ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES ... .......................... .. 75
IV
LISTA DE ABREVIATURAS
ADN Ácido desoxirribonucleico
ADNMG ADN metagenómico
ADNr 165 1 ARNr 165 Gen codificante del ácido ribonucleico ribosomal de la subunidad 16s
APS Adenosín 5'-fosfosulfat o
ARDRA Análisis de restricción del ADN ribosomal amplificado
ARNr 165 Ácido ribonucleico ribosomal de la subunidad 16s
BAC Cromosoma artificial bacteriano
CE Conductividad eléctrica
CIC Capacidad de intercambio catiónico
DGGE Electroforesis en gel con grad iente desnatura lizante
dNTPs Deoxinucleosidos trífosfatos
dNDPs Deoxinucleosidos dífosfatos
dMPs Deoxinucleosidos mónofosfatos
LAS Sulfonato de alquilbenceno lineal
OTU Unidad taxonómica operacional
PPi Pirofosfato
PCA Anális is de componentes principales
PCR Reacción en cadena de la pol imerasa
pH Potencial de hidrógeno
V
VI
RED OX
TPFS
SSCP
TGGE
T-RFLP
UPGMA
Reacción de reducción-oxidación,
Tripolifosfato sódico
Conformación polimórfica de cadena sencilla
Electroforesis en gel con gradiente de Temperatura
Longitud de fragmentos de restricción polimórficos
Método de agrupamiento pareado no ponderado util izando media
aritmética
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Triangulo de Lyon para la clasificación de la textura del suelo ..................... .. .. ... ... .. ........ 4
Figura 2. Química de la pirosecuenciación ...................................................................................... 14
Figura 3. Clasificación de los métodos para medir la diversidad alfa ............................................... 17
Figura 4. Clasificación de los métodos para medir la diversidad beta ... ... ... .. .................................. 19
Figura 5. Integridad del ADN metagenómico ........... .................. .. .. ... ....... .......... ..... ....... ....... ... .. ...... 39
Figura 6. Productos de amplificación por PCR ................................................................................ .40
Figura 7. Desnaturalización y separación por DGGE de los fragmentos amplificados de la región V3
del gen 16S ribosomal bacteriano ........ ... ... ............ ..... .. ..... ... ... .. ..... ... .... ... .... ..... ......... ... . .41
Figura 7. Dendrograma de los perfiles de bandeo generados en la DGGE ......... ............ ........ ....... .44
Figura 9. Curvas de rarefacción representadas a nivel phylum ...... ............ .............. .... .. ... .. ........ .. ... 52
Figura 1 O. Curvas de rarefacción representadas a nivel especie ..................................................... 53
Figura 11. Abundancias relativas de los principales phyla bacterianos ...... .. .. .. ...... .. ......... ... ........ .. .. 57
Figura 12. Abundancias relativas de las principales clases bacterianas ..... ... .. ............... ... .. ..... ....... 58
Figura 13. Abundancias relativas de las principales especies bacterianas .. ... .......... .... ... ... ....... ..... . 59
Figura 14. Agrupamiento de las secuencias con base al índice de Jaccard y mapa de calor ... .. .... 61
Figura 15. Análisis de componenetes principales .. ....... .. ..... ..... ............. ............. ........ ... ... .... ..... ... ... 63
VIl
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Métodos utilizados para el análisis de la diversidad microbiana ...................................... 1 O
Cuadro 2. Datos obtenidos de los análisis de las muestras de suelo ........ ...................... ...... .. ...... .. 31
Cuadro 3. Determinación de la pureza y cuantificación del ADN metagenómico obtenido .............. 39
Cuadro 4. Valores de los índices de diversidad calculados a partir de la matriz de ausencia
presencia y la densidad de picos de las bandas resultantes de la DGGE . .. .. .............. .42
Cuadro 5. Matriz de similitud entre las muestras de suelo con base en el coeficiente de Dice ........ 43
Cuadro 6. Porcentaje de divergergencia utilizada para la identificación de los diferentes niveles
taxonómicos bacterianos ........... ........... .. ................ ..... ...... ..... ......... .... .......................... 50
Cuadro 7. Características estadísticas de los análisis de las secuencias ........................................ 50
Cuadro 8. Clasificación de las secuencias parciales del gen 16S ribosomal bacterano a diferentes
niveles taxonómicos ........................................................................................................ 54
VIII
RESUMEN
RESUMEN
Los suelos poseen una inmensa diversidad bacteriana que ha sido muy poco explorada
debido principalmente al carácter no cultivable de la gran mayoría de los
microorganismos. La metagenómica se caracteriza por permitir el estudio masivo del
conjunto de genomas (metagenoma) de las comunidades microbianas, sin la necesidad
de realizar cultivos previos, permitiendo el análisis del material genético de conjuntos de
microorganismos cultivables y no cultivables contenidos en una muestra ambiental.
Los detergentes descargados al ambiente constituyen · un contaminante que puede ser
degradado o utilizado como fuente de nutrientes por algunos microorganismos o un
inhibidor de las poblaciones para las cuales resulten nocivos, por lo que es de suponer
que modifican la estructura de las comunidades bacterianas. El presente trabajo analizó,
mediante técnicas metagenómicas, el impacto que los detergentes han ejercido sobre la
composición y diversidad de las comunidades bacterianas en muestras de suelo
recolectadas en el municipio de Hunucmá, Yucatán , México.
Se determinó y analizó la diversidad relativa bacteriana de suelos expuestos y no
expuestos a detergentes se analizó de dos maneras, mediante el análisis estadístico de
los datos obtenidos de la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) de
los productos amplificados de la región V3 del gen 16 ribosomal bacteriano, y mediante el
análisis de las lecturas obtenidas a partir de la secuenciación del gen 16S ribosomal. En
ambos casos fueron aplicados índices ecológicos, lo que permitió realizar comparaciones
entre las comunidades bacterianas de los diferentes suelos.
Se realizaron análisis edáficos para determinar los principales cambios en los factores
fisicoquímicos de los suelos que han sufrido contaminación con detergentes.
Se identificaron los taxa dominantes a diferentes distancias genéticas. Proteobacteria,
Acidobacteria , Actinobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Firmicutes y Ch/oroflexi
fueron los phyla dominantes en los ambientes edáficos. Las especies más representativas
en los suelos contaminados fueron Rhodomicrobium sp., e Hydrogenophaga sp.
Los parámetros fisicoquímicos y las abundancias relativas bacterianas de los suelos
analizados fueron correlacionados mediante un análisis de componentes principales, el
cual determinó que el sodio y la salinidad son los factores que más influyen en las
abundancias relativas bacterianas de los suelos analizados.
El presente estudio representa el primer reporte a nivel local en donde se analiza la
diversidad bacteriana en suelos contaminados con detergentes.
IX
ABSTRACT
ABSTRACT
Soil is a complex system that includes a great number and diversity of microorganisms,
which remains mostly unexplored due mainly to the large amount of microorganisms being
uncultivable. This limitation has been reduced because of the development of techniques
which allow the isolation of genetic material , directly from soil microorganisms without
requiring a previous culture. Metagenomics is the study of DNA obtained from cultured and
uncultured microorganism recovered directly from environmental samples (metagenome).
Soil contamination or soil pollution is caused by the presence of xenobiotic chemicals in
the natural soil environment. lt is typically caused by industrial activity, agricultura!
chemicals, or improper disposal of waste.
The relative proportion of microbial community members in ecosystems is subject to
physicochemical changes of enviroment as well as changes caused by pollutants.
A commercial laundry detergent is a chemical product with cleaning properties; in general,
they contain surfactants, bleach, enzymes and many other agents. After use, detergents
are discarded into environmental ecosystems. Detergents discarded on soils are pollutans
that could be degraded or used as a nutrient source for some microorganisms or prove
toxic to microbial growth, modifying the bacteria! community structure.
This study analyzed by application of metagenomics techniques, the impact of commercial
detergents contamination on the structure and diversity of bacteria! communities in soil
samples collected in Hunucma, Yucatan , Mexico.
Bacteria! communities on soils were analyzed using PCR amplification of the V3 region of
16S rRNA gene in denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and through
pyrosequencing-based analysis of 16S rRNA gene fragments. The dominant phyla across
all samples were Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes,
Verrucomicrobia, Firmicutes and Chloroflexi. At the species level, Rhodomicrobium sp. ,
and Hydrogenophaga sp., were the most abundant. Soil analysis was performed to
determine changes in the physicochemical parameters of contaminated soil with
detergents. Principal components analysis (PCA) based on the relative abundances of the
different bacteria! phyla and physicochemical parameters, was performed to analyze
interactions among microorganisms and their environment. The relative abundances of
bacteria! groups responded strongly to sodium content and soil salinity.
This is the first local report that analyzes the bacteria! diversity in contaminated soils with
detergents.
X
CAPÍTULO 1
CAPÍTULO 1
Planteamiento del trabajo
1.1 INTRODUCCIÓN
El suelo es un sistema complejo formado por diversos minerales, materia orgánica, agua y
aire (Tate, 1995); dichas características lo convierten en un ambiente apropiado para el
desarrollo de microorganismos eucariotas (algas, hongos, protozoos), procariotas
(bacterias y arqueas), virus y bacteriófagos. Todos estos organismos establecen
relaciones entre sí y con el ambiente de formas muy variadas y complejas, contribuyendo
notablemente a las características propias del suelo. Los microorganismos desempeñan
en el suelo funciones de gran importancia en relación con los procesos de edafogénesis,
así como en los ciclos biogeoquímicos y la degradación de compuestos xenobióticos
(Arias et al., 2005). Los suelos poseen una inmensa diversidad bacteriana que había sido
muy pobremente explorada debido principalmente al carácter no cultivable de la gran
mayoría de los microorganismos (Delmont et al. , 2011 ; Mocali y Benedetti , 201 0).
Aunque ha sido considerado tradicionalmente como un recurso ilimitado y renovable , el
suelo constituye un sistema frágil y limitado. La microflora del suelo es sensible a
perturbaciones producidas por el manejo agrícola, la contaminación y otros tipos de
modificaciones ambientales, es decir, tras un episodio de contaminación las comunidades
bacterianas sufren cambios en su diversidad y abundancia relativa , lo que les permite
adecuarse a las nuevas condiciones (Duarte et al. , 2001 ).
Los detergentes descargados al ambiente son un contaminante que puede ser degradado
o utilizado como fuente de nutrientes por algunos microorganismos, pero puede ser
nocivo y letal para otros, por lo que es de suponer que modifica la estructura de las
comunidades bacterianas originales. El presente trabajo analiza mediante técnicas
metagenómicas, la composición y diversidad de las comunidades bacterianas en
muestras de suelo expuestas y no expuestas a adiciones de detergentes en el municipio
de Hunucmá, Yucatán , México.
El estudio de la diversidad bacteriana se realizó en primer lugar mediante el análisis en
gel de electroforesis con gradiente desnaturalizante (DGGE) de los productos
amplificados de la región V3 del gen 16 ribosomal, y en segundo lugar, mediante el
análisis de las secuencias del gen 16S ribosomal.
1
CAPÍTULO 1
1.2 ANTECEDENTES
1.2.1 EL SUELO COMO ECOSISTEMA
El suelo es un hábitat apropiado para el desarrollo de microorganismos tanto eucariotas
(algas, hongos, protozoos, etc.) como procariotas (bacterias y arqueas); sin embargo, la
diversidad procariota supera por mucho a la de los organismos eucariotas (Whitman et al. ,
1998). Estos organismos establecen relaciones entre sí y con el ambiente en formas muy
variadas y complejas, formando algunos de los ecosistemas con mayor diversidad en el
planeta.
Los microorganismos tienen un papel importante en los ciclos biogeoquímicos terrestres,
contribuyendo a las características propias del suelo (Arias et al. , 2005; Nannipiere et al. ,
2003; Wardle et al. , 2004). El suelo es el mayor reservorio de carbono orgánico en la
tierra , esta característica lo convierte en un hábitat ideal para los microorganismos. Un
solo gramo de suelo puede albergar decenas de miles de microorganismos distribuidos en
cientos de especies. La diversidad microbiana del suelo describe la complejidad y la
variabilidad a diferentes niveles de organización biológica ya que abarca tanto la
variabilidad genética (especies), como el número (riqueza) y la abundancia relativa
(equilibrio) de taxa y grupos funcionales en comunidades (Torsvik y 0vreas, 2002).
Los organismos del suelo no se distribuyen al azar sino que siguen patrones espaciales
de agregación , a escalas diferentes y obedecen al efecto causado por diferentes factores
de control (Ettema y Wardle 2002). Se ha demostrado que la distribución de las bacterias
edáficas está altamente estructurada, y que esta estructuración es importante para la
funcionalidad del suelo (Nunan et al. , 2002). Factores como la presencia de raíces,
agregación, contenido de nutrientes y la porosidad parecen gobernar la distribución de
bacterias en estos hábitats (Bronick y Lal , 2005). La complejidad estructural del suelo
permite que los recursos sean fraccionados y se creen nuevos nichos con los que se
incrementa la especialización y división en especies (Torsvik et al., 2002).
La complejidad del suelo , junto con las particularidades inherentes a los microorganismos
tales como su tamaño microscópico y las dificultades para una diferenciación basada en
su rl")Orfología, propiciaron una visión tradicional del mundo microbiano edáfico como una
"caja negra" de la cual se intuía una importante función ecológica, aunque no se podía
precisar bien su contenido (lnsam, 2001 ).
2
CAPÍTULO 1
1.2.1.1 CLASES TEXTURALES DEL SUELO
El suelo es un sistema de interacción entre tres fases bien definidas: una fase sólida,
constituida por materia orgánica y mineral , una fase líquida, y una fase gaseosa
(Aiexander, 1991 ).
La materia orgánica procede de la actividad de los distintos organismos vivos del suelo y
su composición y cantidad es variable. El tipo y composición de la materia mineral se da
por las características de las rocas del subsuelo, así como de los procesos edáficos que
hayan tenido lugar en su formación. La porción inorgánica es muy importante por su
influencia en la disponibilidad de nutrientes, aireación y retención de agua. El resto del
volumen del suelo está prácticamente constituido por espacios porosos, que a su vez
pueden estar ocupados por agua ó gases (Bronick y Lal , 2005). La porosidad (cantidad y
tamaño de los poros) depende de la textura del suelo, la cual esta determinada por la
cantidad de partículas de arenas, limos y arcillas (Gee et al. , 2002), cada una con una
composición y tamaño distinto que le dan al suelo características particulares (Fig. 1 ).
Las partículas de arena tienen tamaños que varían entre 501Jm-20001Jm, representan la
parte inerte del suelo y tienen por lo tanto solamente funciones mecánicas, constituyen el
armazón interno sobre las cuales se apoyan las otras fracciones finas del suelo. El
componente más común de la arena es el sílice. Sin embargo, la composición varía de
acuerdo a los recursos y condiciones. Los suelos arenosos tienen poca fertilidad y
retienen poca agua.
Los limos son de menor tamaño que la arena , oscilan entre los 21Jm-501Jm y participan de
forma limitada en la actividad química del suelo . Su origen puede ser inorgánico
(desintegración de rocas) u orgánico, producto de la división de material de origen vivo o
su descomposición.
Las arcillas son las particulas más pequeñas del suelo (~ 21Jm), comprenden toda la parte
coloidal, y representa la fracción más activa , tanto desde el punto de vista físico como del
químico, participando en el intercambio iónico, retención de agua y gases, y estabilidad de
los agregados (van Olphen , 1977).
La textura tiene que ver con la facilidad con que se puede trabajar el suelo, cuando la
fracción de arena es igual que la suma de arcilla y limo, el suelo se denomina franco.
Éstos son los suelos óptimos para la agricultura, ya que poseen capacidad media de
retención de agua, la cual, igual que el aire circula con relativa facilidad .
3
CAPÍTULO 1
%Arcillas
Franco arcillo
arenosa
Franco arenosa
Franco arcillo limosa
Franco limosa
%Limos
1 o~----~------~----------~--------------~--------~100 1 00 90 80 70 60 50 40 30 20 1 o o
%Arena
Figura 1. Triangulo de Lyon para la clasificación de la textura del suelo. El interior del triángulo
está dividido en casillas, cada una de ellas representa una clase textura! de suelo caracterizado por
las proporciones de los elementos dominantes.
4
CAPÍTULO 1
1.2.2 ANÁLISIS DE LADIVERSIDAD BACTERIANA EN SUELOS
Tradicionalmente la visión acerca de la diversidad de los microorganismos edáficos
estaba basada 'en la obtención de cultivos de laboratorio en medios especialmente
formulados para ello, bacterias Gram positivas esporuladas (Bacillus y Clostridium),
Bacterias Gram negativas heterótrofas (Pseudomonas, Agrobacterium , y Rhizobium), y
actinomicetos como Streptomyces eran considerados procariotas típicos del suelo, ya que
habían sido aislados repetidas veces de estos ambientes mediantede técnicas
tradicionales.
A partir de la década de los ochentas se produjo una revolución espectacular en el
conocimiento de la diversidad microbiana de los suelos, debido a la incorporación de
novedosas y potentes técnicas de estudio que no requieren del cultivo previo de los
microorganismos. Estas técnicas se basan en el análisis de marcadores moleculares
como ácidos grasos de fosfolípidos (Guckert y White, 1986) y ácidos nucleicos (Torsvik,
1980). Ambos tipos de marcadores se encuentran presentes en todas las células, se
extraen directamente de muestras de suelo sin necesidad de realizar cultivos previos y
permiten diferenciar distintos grupos de microorganismos.
La utilización de ácidos nucleicos aplicada al estudio de comunidades microbianas se ha
impuesto rápidamente debido a la gran cantidad de información que proporciona. Un
estudio realizado por Torsvik y sus colaboradores (1990) demostró que un gramo de suelo
contiene alrededor de 4,000 diferentes especies, y la mayor parte de la diversidad se
encontró en la fracción que no podía ser aislada mediante técnicas estándar. La
complejidad de estas comunidades bacterianas no solo es interesante; representa
también un desafío para las nuevas técnicas de análisis molecular, ya que la mayoría de
las especies de estos ambientes no ha sido caracterizada, y dicha labor es solo posible
gracias al desarrollo de nuevas tecnologías o el mejoramiento de las ya existentes,
permitiendo un análisis más a fondo de los microorganismos cultivables y no cultivables
contenidos en las muestras de diferentes ambientes.
5
CAPÍTULO 1
1.2.3 CAMBIOS EN LAS COMUNIDADES MICROBIANAS EDÁFICAS
Aunque se ha considerado tradicionalmente como un recurso ilimitado y renovable, el
suelo constituye un sistema evidentemente frágil y limitado. La presión de uso y deterioro
del suelo por la acción humana incrementa a diario. A los problemas de pérdida de suelo
por erosión derivados de usos inadecuados y/o especulativos se les une la degradación
paulatina por acumulación de sustancias contaminantes procedentes de las diversas
actividades humanas.
La mayoría de las comunidades terrestres sufren perturbaciones, las cuales pueden ser
causadas por cambios medioambientales como inundaciones, sequías, congelamiento,
etc., o debido a los episodios de contaminación derivados de la influencia antropogénica.
La introducción de contaminantes o material exógeno al suelo puede traducirse en el daño
o pérdida de algunas o varias de sus funciones , lo cual repercute directamente en su
calidad como ecosistema y como recurso. La presencia de niveles altos de contaminantes
puede implicar múltiples consecuencias negativas para el suelo como ecosistema así
como para su red trófica y, por tanto, para los microorganismos que habitán en él.
Actualmente el suelo , como ecosistema, presenta elevadas tasas de degradación debidas
a la acción humana, que contrastan con los ritmos lentos de regeneración. Las
comunidades microbianas presentes en suelos contaminados tienden a estar dominadas
por aquellas bacterias que pueden sobrevivir a la toxicidad presente en el ambiente,
siendo capaces de degradar y/o utilizar el contaminante para crecer; en este sentido el
contaminante induce una ruptura en el equilibrio ecológico del sistema y, como
consecuencia , en todo su funcionamiento.
Duarte y sus colaboradores en el 2001 estudiaron el efecto que algunos productos
derivados del petróleo pueden ejercer sobre las abundancias relativas de las
comunidades microbianas, comprobando que los hidrocarburos favorecían la proliferación
de algunos microorganismos capaces de degradarlos mientras que otras especies eran
reprimidas.
Por estas razones algunos autores señalan que resulta de especial interés en ecología
microbiana la elaboración de estudios que analicen los cambios en la biodiversidad de la
microbiota edáfica después que ésta sufre episodios de contaminación (Abbed et al. ,
2002; Flynn et al., 2000).
6
CAPÍTULO 1
1.2.41MPACTO DE LOS DETERGENTES EN LAS PROPIEDADES DEL SUELO
Y LOS MICROORGANISMOS
La contaminación de los suelos por los agentes orgánicos e inorgánicos se ha convertido
en un tema de creciente preocupación en todo el mundo.
Los detergentes son productos que se usan para la limpieza y están formados
básicamente por un agente surfactante o tensoactivo. Los surfactantes son moléculas que
constan de una porción hidrofílica y otra hidrofóbica, y son los componentes principales
responsables de la acción de limpieza de los detergentes, ya que actúan modificando la
tensión superficial del agua, disminuyendo la fuerza de adhesión de las partículas de
suciedad (mugre) a una superficie por acción de los fosfatos (Farn , 2007). El contenido
del surfactante activo en detergentes comerciales , es entre el 10% y el 40%, el sulfonato
de alquilbenceno lineal, también conocido como LAS o ácido dodecilbenceno sulfonico
lineal es uno de los tensoactivos aniónicos más ampliamente utilizados en el mundo
(Scott y Jones, 2000). El resto se compone de cloro, estabilizador de la espuma,
constructores, perfume, agentes de suspensión de mugre o tierra y otros materiales
diseñados para mejorar la acción limpiadora del surfactante (Gülümser, 2010).
Los surfactantes pueden ser adsorbidos por los suelos y, posteriormente, afectar las
propiedades físico-químicas y biológicas de los mismos, así como la estabilidad de sus
agregados (Piccolo y Mbagwu, 1989), la conductividad hidráulica (AIIred y Brown, 1994) y
las propiedades de retención de agua (Karagunduz et al. , 2001.).
Estudios microbiológicos de suelos han demostrado que inclusive a bajas
concentraciones de LAS, éste inhibe notablemente la actividad de las bacterias reductoras
del hierro. Además de la interacción del LAS con las membranas celulares, su adsorción
sobre los óxidos de hierro interfiere de forma negativa en el proceso de respiración
bacteriano (Kristiansen et al. , 2003). Sin embargo, los sulfonatos de alquilbencenos son
degradados gracias a las actividades metabólicas propias de los microorganismos,
utilizándolos como fuentes de carbono y energía, lo que implica que algunos
microorganismos han desarrollado la capacidad de resistir el efecto lítico (lisis de la pared
celular) a altas concentraciones de surfactantes y así pueden degradarlos.
7
CAPÍTULO 1
1.2.5 METAGENÓMICA APLICADA A SUELOS
Los estudios para caracterizar la diversidad bacteriana en diferentes ambientes se
basaban en la suposición de que las técnicas de cultivo permitían recuperar la mayor
parte de los microorganismos contenidos en una muestra. En la actualidad se sabe que
las técnicas tradicionales permiten aislar únicamente entre 0.1 y 1% de las bacterias
presentes en la muestra (Torsvik et al., 2002). Para explicar este fenómeno se ha
argumentado que se desconocen los requerimientos nutricionales y las condiciones
fisicoquímicas necesarias para el desarrollo de un gran número de grupos microbianos en
su ambiente natural. Además, hay poca información sobre las relaciones simbióticas,
comensales o parasitarias que mantienen los miembros de una comunidad microbiana
(Keller y Zengler 2004 ). Se ha propuesto también que las bacterias no cultivables son
microorganismos filogenéticamente relacionados con los cultivables, pero en un estado
fisiológico que los hace recalcitrantes a ser cultivados. La base de esta explicación es que
algunas bacterias pueden convertirse en viables, es decir, mantienen su actividad
metabólica, pero no pueden cultivarse en determinadas condiciones, y dicha viabilidad se
revierte a un estado cultivable al restaurarse las condiciones favorables (McDougald et al.,
1998). Por tanto, hay quienes creen que el 99 a 99.9% de las bacterias no cultivables
están representadas por su contraparte cultivable (Rondan et al., 1999). No existe una
explicación totalmente satisfactoria para entender la baja proporción de bacterias
cultivables y este fenómeno ha sido una seria limitación de las técnicas tradicionales para
estudiar la diversidad microbiana de los diversos ambientes.
La incapacidad de poder cultivar en el laboratorio la mayoría de los microorganismos ha
restringido durante mucho tiempo la posibilidad de utilizarlos y aprender acerca de ellos.
El desarrollo de herramientas moleculares ha permitido comenzar a caracterizar desde un
punto de vista genómico estos microorganismos aún no cultivables. El avance en las
tecnologías de clonación y secuenciación ha posibilitado reducir la cantidad de material de
partida necesario para realizar una biblioteca genómica , y los costos de secuenciación
han estado disminuyendo, por lo que cada vez son más accesibles. Ambos factores han
generado las condiciones necesarias para posibilitar la construcción de bibliotecas
genómicas de muestras complejas, o bien , implementar los estudios de diversidad
bacteriana de diferentes ambientes.
Es así como nace un nuevo campo en la biología molecular llamada metagenómica, la
cual se caracteriza por permitir el estudio masivo del conjunto de genomas (metagenoma)
8
CAPÍTULO 1
de los microorganismos presentes en dichas muestras, incluyendo aquéllos que no son
cultivables en el laboratorio (Handelsman et al. , 2004); Esto permite aislar, identificar y
caracterizar el material genético total proveniente de muestras de un hábitat particular. El
análisis del metagenoma bacteriano por técnicas moleculares ha evidenciado que algunos
grupos bacterianos no son fáciles de cultivar y que la diversidad de esta mayoría no
cultivable es muy amplia (Keller y Zengler, 2004). Hasta el momento, se han investigado
metagenomas de diversos ambientes, incluyendo ecosistemas acuáticos, minas, suelos
agrícolas y forestales , entre otros (Venter et al., 2004; Wang et al. , 2009; Lee et al. , 2004;
Rondan et al. , 2000). En algunos casos, se han descubierto elementos genéticos que
podrían tener aplicación en la industria (Wang et al., 2000), mientras que otros, han
aportado novedosos aspectos de la ecología microbiana en un ecosistema en particular
(Tyson et al. , 2004 ).
Se han desarrollado técnicas cada vez más eficientes para extraer metagenomas
bacterianos de diversos ambientes. Para estudiar la diversidad bacteriana, las técnicas
del ADN recombinante permiten superar la limitación de no poder cultivar la mayoría de
las bacterias. Para muchos fines, la necesidad de cultivar los microorganismos presentes
en una muestra, ha sido sustituida por la capacidad de aislar y caracterizar su material
genético. El campo emergente de la metagenómica abre las puertas para explorar
microorganismos no estudiados hasta la fecha y, más innovador aún, para investigar
comunidades microbianas enteras basándose en la extracción , secuenciación y análisis
de ADN microbiano obtenido directamente de muestras de comunidades provenientes de
diversos ambientes. La metagenómica permite obtener así información no sólo de la
estructura de la comunidad (riqueza de especies, diversidad y distribución) sino también
de la función potencial de la comunidad en su ambiente (Handelsman et al. , 1998).
9
CAPÍTULO 1
1.2.6 TÉCNICAS APLICADAS AL ESTUDIO DE METAGENOMAS
Las técnicas moleculares y los avances de la genómica y metagenómica sin duda
contribuyen a un mejor conocimiento del funcionamiento de las comunidades microbianas
del suelo. Entender la función de los microorganismos en diferentes nichos ecológicos
permite lograr un mayor entendimiento de sus aspectos evolutivos y biológicos; sin
embargo es un desafío para la biología, debido a la gran cantidad de interacciones que
presentan las comunidades bacterinas con los factores bióticos y abióticos.
En la actualidad se han adaptado y desarrollado técnicas de biología molecular para el
estudio de la ecología de comunidades microbianas, que han permitido comenzar a
caracterizar a los microorganismos no cultivables con base en su información genética. A
continuación se describe de manera breve algunas de las técnicas más relevantes
aplicadas al estudio de las comunidades microbianas:
Cuadro 1. Métodos utilizados para el análisis de la diversidad microbiana. (Modificado de Rondan
et al. , 1999).
MÉTODO OBJETIVO DEL ANÁLISIS
Análisis del ARNr 168 Identificación de los miembros de la comunidad
ARDRA Análisis comparativo entre comunidades
Cinetica de reasociación DNA-DNA Visión global de la complejidad genética
DGGE ó TGGE Análisis comparativo entre comunidades
Hibridación In situ ldentificarción de microorganimos metabólicamente activos
Biblioteca BAC Diversidad funcional y filogenética de un ambiente
RNA dot or Slot blot Representación de los miembros metabólicamente activos
SSCP Análisis comparativo entre comunidades
T-RFLP Análisis comparativo entre comunidades
10
CAPÍTULO 1
1.2.6.1 ANÁLISIS DEL GEN ARNr 16S
La descripción de los microorganismos presentes en los diferentes ambientes
experimentó un gran avance gracias a la utilización de la información que proporciona el
gen que codifica la subunidad menor del ribosoma bacteriano: el ARN ribosomal 16S, el
cual es un polirribonucleótido de aproximadamente 1500 nucleótidos, codificado por el
gen rrs también denominado ADN ribosomal 16S ó ARN ribosomal 16S (ADNr 16S ó
ARNr 16S). Como cualquier secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, el ARNr 16S se
pliega en una estructura secundaria, caracterizada por la presencia de segmentos de
doble cadena, alternando con regiones de cadena sencilla (Neefs et al. , 1990).
Actualmente el gen ARNr 16S es la macromolécula más ampliamente utilizada en
estudios de filogenia y taxonomía bacteriana, su aplicación fue propuesta por Carl Woese
en la década de los ochentas, ya que presenta características que permiten que sea
aprovechado como cronómetro molecular (Woese, 1987):
• Está presente en todos los organismos y tiene la misma función en todos ellos.
• Debido a restricciones estructurales y de presión de selección natural, diferentes
regiones de la molécula presentan distinto grado de variabilidad en su secuencia, lo
que permite realizar comparaciones con diferente nivel de resolución.
• Su transmisión es principalmente vertical , ya que se considera que no está sujeta a
transferencia génica horizontal entre microorganismos.
• La longitud de su secuencia tiene un tamaño adecuado para proporcionar suficiente
información filogenética, minimizando las fluctuaciones estadísticas.
• El análisis de la secuencia nos permite realizar reconstrucciones filogenéticas de los
microorganismos y dado que resulta relativamente fácil secuenciar los genes del
ARNr 16S, actualmente existen amplias bases de datos, en continuo crecimiento.
El gen 16s ribosomal contiene regiones altamente variables que son exclusivas de una
sola especie de bacterias, las cuales se denotan como región variable V1 hasta la V9
(Neefs et al., 1990) y que sirven para diferenciar los filotipos bacterianos, inclusive hasta
el nivel de especie. Durante los últimos años, el análisis de los genes codificantes del
ARNr 16S se ha utilizando cada vez más para establecer las relaciones filogenéticas
dentro del mundo procariota, causando un profundo impacto en la clasificación e
identificación bacteriana.
11
CAPÍTULO 1
1.2.6.2 ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DESNATURALIZANTE
La DGGE es una técnica que se desarrolló para detectar mutaciones puntuales en las
secuencias del ADN (Fischer y Lerman, 1983); Actualmente, ha sido adaptada y permite
analizar comunidades bacterianas presentes en diferentes ambientes (Muyzer et a/. ,
1993). El método requiere la extracción de ADN y posterior amplificación por PCR con
iniciadores específicos para un fragmento del gen ARNr 16S bacteriano. Posteriormente
los productos amplificados (en respuesta a la aplicación de una corriente eléctrica),
emigran a través del gel de poliacrilamida, el cual contiene un gradiente creciente
desnaturalizante de urea-formamida, en consecuencia, cada molécula de ADN dejará de
moverse cuando la concentración de urea-formamida provoque su desnaturalización en
algún punto de la migración de acuerdo con el tamaño y la secuencia específica de cada
una de las hebras de ADN. La técnica de DGGE permite separar los fragmentos
amplificados del gen ribosomal 16S que son de un mismo tamaño pero que difieren en su
secuencia. Estos perfiles se caracterizan por el número, posición e intensidad relativa de
las bandas, donde cada banda representa una Unidad Taxonómica Operacional (OTU)
diferente. Este método no sólo permite la identificación de las bacterias contenidas en una
muestra, sino también la cuantificación relativa de los principales taxa de las mismas. Los
perfiles de DGGE pueden ser analizados con métodos estadísticos para determinar
dominancia, frecuencia , proporciones relativas de OTUs, entre otros indicadores, y de
esta manera hacer inferencias acerca de la diversidad bacteriana de la población , o bien
hacer comparaciones entre diferentes poblaciones. En la estimación de la abundancia de
los microorganismos con esta técnica se debe tener en cuenta que el número y las
intensidades de cada una de las bandas no pueden guardar una relación estrecha con el
número y abundancia de especies resultantes dentro de la comunidad bacteriana, esto
debido a los posibles sesgos en la técnica de PCR y a que una sola especie bacteriana
puede presentar varias copias del gen 16S ribosomal con diferentes secuencias entre si
(Kiappenbach et a/. , 2001 ). Es decir, una misma especie puede generar diferentes
bandas, por lo que lo más recomendable es considerar OTUs en lugar de especies. La
técnica de la DGGE ha sido utilizada para determinar el impacto de algunos
contaminantes en diferentes tipos de suelo algunos ejemplos son el uso de plaguicidas
(Bending et a/., 2003), contaminación por hidrocarburos (Duarte et a/., 2001; Juck et a/. ,
2000), uso de suelos (Avrahami y Conrad, 2003) y exposición a metales pesados (Joynt et
al. , 2006).
12
CAPÍTULO 1
1.2.6.3 PIROSECUENCIACIÓN
Recientemente el desarrollo y la disminución en los costos de las tecnologías de
secuenciación han brindado la posibilidad de realizar análisis metagenómicos amplios.
Las tecnologías actuales se enfocan en la secuenciación de grandes fragmentos de ADN
como plásmidos, genomas o metagenomas, y la ventaja de estos métodos sobre las
técnicas tradicionales de amplificación genética es la de obtener un menor sesgo
taxonómico al momento de clasificar los genomas aislados.
En la metagenómica las técnicas de secuenciación masiva son empleadas en el estudio
directo de comunidades microbianas en sus ambientes naturales (Venter et al., 2004;
Edwards et al. 2006). La pirosecuenciación forma parte de las técnicas de nueva
generación de secuenciación por síntesis; se fundamenta en la adición secuencial de
nucleótidos a un oligonucleotido que está hibridado a una secuencia de ADN de cadena
sencilla , la hebra molde. La secuencia de la hebra molde puede ser deducida del orden en
que los nucleótidos son incorporados a la hebra creciente de ADN (Ahmadian et al. 2006).
En la pirosecuenciación (Fig. 2) cada incorporación de un nucleótido por la ADN
polimerasa lleva a la liberación de pirofosfato, el cual inicia una cadena de reacciones que
finalizan con la producción de luz; la cantidad de luz producida es proporcional al número
de nucleótidos incorporados (Mardis 2008).
La secuenciación por síntesis ha sido aplicada con éxito a una variedad de estudios,
incluyendo genotipicación , detección de polimorfismos de nucleótidos únicos e
identificación de microorganismos a partir del análisis de regiones hipervariables dentro
del gen ADNr 16S (Petrosino et al., 2009).
La pirosecuenciación involucra un proceso bioinformático posterior de acuerdo con el tipo
de análisis para el cual se requiera . Para el caso de los aná lisis de biodiversidad , se
utilizan bases de datos con el fin de identificar los nombres de las especies, así como de
sus descripciones, distribuciones, información genética, y tamaño poblacional. La
comparación de secuencias es la forma más precisa y confiable para determinar
relaciones taxonómicas de los microorganismos.
13
CAPÍTULO 1
(ADN}n + dNTP Polimerasa ., dNDP + dNMP + Fosfáto
Secuencia de nucleótidos G C A CG CG T
Nucleótidos añadidos
dNTP dNDP + dNMP + Fosfáto
ATP ADP + AMP + Fosfáto
APS + PPi ATP
Luciferina Oxiluciferina
V Luciferasa
n Tiempo ATP uz
La incorporación del nucleótido genera luz, la cual es vista como un pico en el pirograma
Figura 2. Química de la pirosecuenciación. Reacciones bioquímicas y enzimas involucradas en la
generación de señales de luz por pirosecuenciación del ADN. Cada pico en el pirograma
representa un pulso de luz detectado en el instrumento. dNTP, deoxinucleosidos trifosfatos; dNDP,
deoxinucleosidos difosfatos; dNMP, deoxinucleosidos monofosfato; PPi , pirofosfato; APS;
adenosine 5' -fosfosulfato. Basado en Petrosino et al., 2009.
14
CAPÍTULO 1
1.2.7 HERRAMIENTAS PARA EL ANÁLISIS DE COMUNIDADES
1.2.7.1 ÍNDICES ECOLÓGICOS
La diversidad de una comunidad depende de la riqueza (número de especies) y de la
abundancia relativa de éstas (equitatividad).
Los estudios sobre medición de biodiversidad se han centrado en la búsqueda de
parámetros para caracterizarla como una propiedad de las comunidades ecológicas. Sin
embargo, las comunidades no están aisladas en un entorno neutro. En cada unidad
geográfica, en cada paisaje, se encuentra un número variable de comunidades. Por ello,
para comprender los cambios de la biodiversidad con relación a la estructura del paisaje,
la separación de los componentes alfa, beta y gamma (Whittaker, 1972) puede ser de
gran utilidad, principalmente para medir y monitorear los efectos de las actividades
humanas (Halffter, 1998). La diversidad alfa es la riqueza de especies de una comunidad
particular a la que consideramos homogénea, la diversidad beta mide las diferencias entre
las especies de dos puntos, dos tipos de comunidad en un paisaje, y la diversidad gamma
es la riqueza de especies del conjunto de comunidades que integran un paisaje,
resultante tanto de las diversidades alfa como de las diversidades beta (Whittaker; 1972).
1.2.7.1.1 DIVERSIDAD ALFA (a)
La gran mayoría de los métodos propuestos para evaluar la diversidad de especies se
refieren a la diversidad dentro de las comunidades (alfa). Para diferenciar los distintos
métodos en función de las variables biológicas que miden, los dividimos en dos grandes
grupos (Fig. 3), el primero son los métodos basados en la cuantificación del número de
especies presentes (riqueza específica) y el segundo grupo son los métodos basados en
la estructura de la comunidad, es decir, la distribución proporcional del valor de
importancia de cada especie (abundancia relativa de los individuos, su biomasa,
cobertura, productividad, etc.). Los métodos basados en la estructura pueden a su vez
clasificarse según se basen en la dominancia o en la equidad de la comunidad.
A continuación se describen algunos de los métodos expresados como índices para medir
la diversidad alfa.
El índice de Shannon expresa la uniformidad de los valores de importancia a través de
todas las especies de la muestra, es decir, mide el grado promedio de incertidumbre en
predecir a qué especie pertenecerá un individuo escogido al azar de una colección,
15
CAPÍTULO 1
asumiendo que los individuos son seleccionados al azar y que todas las especies están
representadas en la muestra (Magurran , 1988). Normalmente toma valores entre 1 y 4.5,
en esta escala los valores encima de 3 son típicamente interpretados como diversos.
Las curvas de rarefacción comparan la diversidad observada entre sitios que no han sido
muestreados equitativamente, para poder hacer una comparación justa entre sitios con
tamaños de muestra distintos. Una curva de rarefacción muestra también el cambio en el
valor esperado de riqueza de OTUs, de acuerdo con el tamaño de la muestra tomada
(Ricklefs y Miller, 2000).
El índ ice de Chao1 es un estimador del número de especies en una comunidad , basado
en el número de especies raras en la muestra (Chao, 1984; Chao y Lee, 1992; Smith y
van Selle, 1984). En este índice se consideran el número de especies que están
representadas solamente por un único individuo en esa muestra (número de "singletons")
y el número de especies representadas por exactamente dos ind ividuos (número de
"doubletons") en la muestra (Colwell y Coddington , 1994 ).
El índice de Simpson es la medida más simple de diversidad que toma en cuenta tanto la
abundancia como la riqueza de especies. Manifiesta la probabilidad de que dos individuos
tomados al azar de una muestra sean de la misma especie; valores cercanos a 1 indican
que sólo unas pocas especies predominan en la muestra. Es de uso común para medir el
grado de dominancia de unas cuantas especies en la comunidad (Magurran , 1988;
Simpson, 1949).
16
CAPÍTULO 1
- Riqueza de especies
- Margalef - Menhinick l Índices
-Alfa de Williams
~ Rarefacción
- Logarítmica
Riqueza ~ - Funciones de r- - Exponencial
especifica acumulación -De Clench
-Chao 2
Métodos no - Jacknife de 1 er orden - -paramétricos - Jacknife de 2° orden
- Bootstrap
Diversidad alfa (a) - - Serie geométrica
Modelos. -Serie logarítmica para métricos -
- Distribución de lag-normal
- Modelo de vara quebrada
Modelos no -Chao 1 1""' paramétrico ~ - Estadístico Q
Estructura ~ Índices - Simpson
de -Serie de Hill
dominancia - Berger-Parker
- Melntosh
Índices de .... abundancia ~ - Shannon proporcional - Pielou
Índices - Brillouin
de - -Bulla equidad - Equidad de Hill
- Alatalo
- Molinari
Figura 3. Clasificación de los métodos para medir la diversidad alfa.
17
CAPÍTULO 1
1.2. 7 .1.2 DIVERSIDAD BETA (¡3)
La diversidad beta es el grado de reemplazamiento de especies o cambio biótico a través
de gradientes ambientales (Whittaker, 1972). A diferencia de la diversidad alfa que puede
ser medida en función del número de especies, la medición de la diversidad beta está
basada en proporciones o diferencias (Magurran, 1988). Estas proporciones pueden
evaluarse con base en diferentes criterios (Fig. 4), en índices o coeficientes de similitud ,
de disimilitud o de distancia entre las muestras a partir de datos cualitativos (presencia
ausencia de especies) o cuantitativos (abundancia proporcional de cada especie medida
como número de individuos, biomasa, densidad, cobertura , etc.)
Los índ ices de simil itud/disimilitud expresan el grado en el que dos muestras son
semejantes por las especies presentes en ellas, por lo que son una medida inversa de la
diversidad beta, que se refiere al cambio de especies entre dos muestras (Magurran,
1988; Baev y Penev, 1995; Pielou , 1975). Sin embargo, a partir de un valor de similitud (s)
se puede calcular fácilmente la disimil itud (d) entre las muestras: d=1-s (Magurran , 1988).
Estos índices pueden obtenerse con base en datos cualitativos o cuantitativos
directamente, o a través de métodos de ordenación o clasificación de las comunidades
(Baev y Penev, 1995).
• Coeficiente de similitud de Jaccard (cualitativo): El intervalo de valores para este índice
va de O cuando no hay especies compartidas entre ambos sitios, hasta 1 cuando los dos
sitios tienen la misma composición de especies.
• Coeficiente de similitud de S0rensen (cuantitativo): Relaciona el número de especies en
común con la media aritmética de las especies en ambos sitios (Magurran, 1988).
Los métodos multivariados de ordenación y clasificación se basan en el análisis de
matrices de datos que pueden ser de dos tipos (Baev y Penev, 1995):
1. Anális is tipo R: se ordenan las especies en un espacio definido orig inalmente por las
muestras.
2.Análisis tipo Q: se ordenan las muestras en un espacio definido originalmente por las
especies.
Para el caso de la medición de la diversidad beta, se utilizan análisis tipo Q en los que las
muestras son las diferentes comunidades y se ordenan según las especies registradas en
cada una de ellas (Baev y Penev, 1995). Las matrices pueden hacerse con datos
cualitativos (presencia-ausencia) o cuantitativos (abundancia proporcional) de las
18
CAPÍTULO 1
especies y a partir de estos datos se obtienen valores de similitud o disimilitud con índices
como los mencionados anteriormente, o bien se calcula la distancia entre las
comunidades con diferentes tipos de medidas, de las cuales la más común es la distancia
euclidiana y las derivadas de ella (Magurran , 1988; Baev y Penev, 1995).
En la ordenación no se suponen discontinuidades entre los hábitats y éstos se agrupan en
series ecológicas o sistemas de coordenadas para reducir patrones complejos a formas
simples e interpretables. El método de ordenación más frecuentemente utilizado para la
medición de la diversidad beta es el análisis de componentes principales (PCA), con el
cual se hace una transformación de los datos originales de las especies para obtener un
nuevo conjunto de variables no correlacionadas entre sí, llamadas componentes
principales. Los mismos son calculados en un orden de importancia decreciente, de tal
forma que unos cuantos de los primeros componentes expliquen la mayor parte de la
variación en los datos originales (Baev y Penev, 1995).
Diversidad
Beta (P)
-t Similitud/Disimilitud t-
Índices de remplazo de especies
Complementariedad r-
Cualitativos ~ - Jaccard
- Sorensen
- Braun-Bianquet
- Ochiai-Barkman
-1 Cuantitativos ~ - Sorensen cuantitativo
- Morisita-Horn
Métodos de Análisis ...... ordenación y f- de componentes
clasificación principales (PCA)
- Whittaker
- Cody (1975)
- Cody (1993)
- Routledge
- Wilson y Schmida
- Magurran
Figura 4. Clasificación de los métodos para medir la diversidad beta.
19
CAPÍTULO 1
En las últimas décadas algunos índices de diversidad de uso común en ecología han sido
aplicados en ecología molecular para describir las comunidades microbianas del suelo
(Hill et al., 2003). Los índices ecológicos ayudan a resumir la información sobre los
cambios en las comunidades, así como algunas de sus características cuantitativas o
cualitativas en un solo valor, lo que permite unificar cantidades y realizar comparaciones
entre comunidades . Es importante tener en cuenta que el empleo de estos índices aporta
una visión parcial, pues no dan información acerca de la distribución espacial de las
especies.
La transformación de los datos obtenidos a partir de análisis moleculares, como PCR
DGGE o secuenciación, en valores numéricos , permiten también integrar información
sobre la diversidad bacteriana con otras variables del suelo (parámetros fisicoquímicos),
mediante análisis multivariados de componentes principales, lo que permite comprender
mejor la estructura de correlación existente entre las posibles variables que definen un
sistema.
Un análisis de componentes principales (PCA por sus siglas en inglés) es una técnica de
reducción de la dimensión que describe la información de un conjunto de variables
observadas, mediante un conjunto de variables más pequeño (los componentes
principales). Los componentes principales se ordenan en forma decreciente de
importancia, de manera que se espera que la primera componente proporcione la mayor
variabilidad posible de los datos (Jolliffe , 1986).
20
CAPÍTULO 1
1.3 JUSTIFICACIÓN
La actividad del ser humano sobre los ecosistemas se ha convertido en la mayor
amenaza actual para el equilibrio ecológico del planeta. Un aspecto hasta ahora
pobremente estudiado es cómo los desechos que los seres humanos descargamos al
ambiente alteran la diversidad microbiana de diferentes ecosistemas.
Es innegable la crucial importancia que los detergentes representan en la calidad de vida
de las personas, sin embargo, su elevada producción mundial, la necesidad de su
empleo, las cantidades empleadas y la toxicidad que presentan tanto sus formas iniciales
como algunos de sus productos de degradación; pueden poner en peligro el equilibrio
ecológico de los ecosistemas donde son desechados.
Los microorganismos presentes en el suelo resultan esenciales para el correcto
funcionamiento del ecosistema, ya que son indispensables en los ciclos biogeoquímicos
básicos que sustentan la biodiversidad general de este ambiente.
La presencia de compuestos ajenos al ecosistema (contaminantes), repercute en la
abundancia de las comunidades microbianas. Sin embargo, en todos los ambientes del
planeta existen microorganismos capaces de degradar compuestos exógenos para
emplearlos como fuente de nutrientes. En este contexto, y como objetivo principal de esta
investigación, se pretende analizar los cambios que los detergentes inducen sobre los
principales parámetros fisicoquímicos del suelo y sobre la diversidad bacteriana edáfica al
ser expuestos a la descarga de aguas residuales con detergentes, así como detectar la
posible correlación de estos datos.
1.4 HIPÓTESIS
Existen cambios en las comunidades microbianas edáficas cuando estos sufren
contaminación por detergentes ya que los componentes de estos productos afectan los
factores fisicoquímicos del suelo.
21
CAPÍTULO 1
1.5 OBJETIVOS
1.5.1 OBJETIVO GENERAL
• Analizar la relación entre el cambio de los parámetros fisicoquímicos y las
comunidades bacterianas en suelos que han sido expuestos a descargas de
aguas residuales con detergentes
1.5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
22
• Analizar las diferencias en propiedades edáficas selectas entre muestras
contaminadas y no contaminadas con detergentes
• Analizar mediante DGGE los índices de diversidad bacteriana con base en la
región variable V3 del gen 16S ribosomal de las muestras contaminadas y no
contaminadas con detergentes.
• Analizar la diversidad bacteriana para cada una de las muestras a diferentes
niveles taxonómicos con base en pirosecuenciación de la región del gen 16s
ribosomal.
• Analizar la posible correlación entre las propiedades edáficas y de diversidad
bacteriana en muestras de suelo contaminadas y no contaminadas con
detergentes.
CAPÍTULO 1
1.6 ESTRATEGIA DE TRABAJO
Para cumplir con los objetivos planteados, se realizó la siguiente estrategia de trabajo:
Análisis Edáficos
Colecta de las muestras
l l
Extracción de ADN metagenómico
Pirosecuenciación 165 tag
Análisis de Resultados (Composición microbiana)
Integración de Resultados
Amplificación por PCR del gen ARNr 165
Amplif icación por PCR de la región V3 del gen
ARNr 165
Desnaturalización de los fragmentos por DGGE
Análisis de la DGGE
23
CAPÍTULO 1
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CAPÍTULO 1
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28
CAPÍTULO 11
CAPÍTULO 11
Análisis de las propiedades fisicoquímicas del suelo
2.1 INTRODUCCIÓN
Las actividades que los microorganismos del suelo realizan en la transformación de los
componentes orgánicos e inorgánicos están relacionadas entre sí y con el medio
ambiente. Las poblaciones microbianas se adecuan a las variaciones en las condiciones
ambientales; los factores que favorecen la reproducción de un microorganismo o permiten
la sobrevivencia de otro pueden ser desfavorables para la existencia de un tercero.
La distribución y las abundancias relativas microbianas edáficas dependen, entre otros, de
las características físicas del suelo como son la textura, humedad, aireación, temperatura,
pH y tipo de nutrientes. Estas características varían dependiendo de la localización y el
clima y en el origen del suelo.
La contaminación del suelo consiste en la acumulación de sustancias exógenas al medio
a niveles tales que algunas de las propiedades fisicoquímicas del suelo se ven afectadas
por la presencia de los compuestos del agente contaminante. Con base en esto, en el
presente estudio se realizaron análisis edáficos para determinar los principales cambios
en las propiedades fis icoquímicas de suelos que han sufrido contaminación con aguas
residuales con detergentes.
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS
2.2.1 SITIO DE MUESTREO
La ciudad de Hunucmá está localizada en el estado de Yucatán , México, entre los
paralelos 20° 55' y 21° 14' de latitud norte y los meridianos 89° 48' y 90° 12' de longitud
oeste. Tiene una altura promedio de 8 metros sobre el nivel del mar y ocupa el 2.25% de
la superficie del estado. Cuenta con 7 localidades y una población total de 28,100
habitantes. Los climas a lo largo del año son: muy cálido, cálido y cálido subhúmedo con
lluvias en verano . En cuanto a la edafología del lugar, el tipo de suelo dominante es el
Leptosol , con un 69.67% de extensión territorial en el municipio. Los leptoles son suelos
someros, rocosos y pedregosos de textura franca , y pH neutro a ligeramente alcalino
29
CAPÍTULO 11
(Estrada-Medina et al. , 2013), el cual se limita a un espesor de unos cuantos centímetros,
lo que lo vuelve un suelo frágil y poco apto para las actividades agrarias. Otros tipos de
suelo que se encuentran en Hunucmá son el Regosol (1 0.51 %), 8olonchak (9.45%),
Histosol (5.54%) y Arenoso! (1 .12%). Las zonas urbanas se desarrollan sobre rocas
sedimentarias del neógeno y están creciendo sobre terrenos previamente ocupados por la
agricultura, pastizales y selvas (INEGI , 2009).
2.2.2 TOMA DE MUESTRAS DE SUELO
Las muestras de suelo utilizadas para el presente estudio fueron recolectadas en la
localidad de Hunucmá en tres diferentes sitios. En cada sitio se tomaron 2 tipos de
muestras, una que había estado expuesta (muestras 8Det1 , SDet2 y 8Det3) y otra que
nunca había estado expuesta a la descarga de agua con detergentes (muestras 81 , 82 y
83). El tiempo de exposición que los suelos habían ten ido a las descargas de agua con
detergente fue de 15 años para la muestra 8Det1 , 1 O años para la muestra 8Det2 y 20
años para la muestra 8Det3 . Las muestras que se denominaron 81 , 82 y 83, se
recolectaron a dos metros de distancia de los puntos de muestreo de 8Det1 , 8Det2 y
8Det3 respectivamente. Ambos tipos de suelo fueron recolectados utilizando una
espátula, a 3 cm de profundidad y fueron guardadas en bolsas de plástico, selladas y
almacenadas a -20°C hasta el momento de su uso.
2.2.3 ANÁLISIS EDÁFICOS
Aproximadamente dos kilogramos de cada una de las seis muestras colectadas fueron
enviadas al Laboratorio de Análisis de Suelos, Plantas y Agua (LASPA) del Campus de
Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CCBA) de la Universidad Autónoma de Yucatán
(UADY) para la determinación de: pH en agua (potenciométrico ), pH en KCI
(potenciométrico ), potencial RE DOX (potenciométrico ), conductividad eléctrica
(potenciométrico), textura (densímetro de Bouyoucus), capacidad de intercambio de
cationes (acetato de amonio pH 7, titulométrico), carbono orgánico (Walkley-Biack),
nitrógeno total (kjeldahl), fósforo (Oisen), potasio (flamometría) y carbonatos
(titulométrico ).
30
CAPÍTULO 11
2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
2.3.1 ANÁLISIS EDÁFICOS
En el Cuadro 2 se detallan los datos obtenidos en los análisis edáficos realizados a las
muestras de suelo S1 , SDet1, S2 , SDet2, S3 y SDet3.
De manera general se puede apreciar que factores como el contenido de humedad, pH,
conductividad eléctrica, salinidad , sodio, capacidad de intercambio catiónico, y fósforo
presentan valores mayores en las muestras contaminadas.
Cuadro 2. Datos obtenidos en los análisis de las muestras de suelo contaminadas (S1 , S2, S3) y
no contaminadas con detergentes (SDet1 , SDet2, SDet3)
51 5Det1 52 5Det2 53 5Det3
Contenido de humedad (%) 6.89 9.06 13.06 42.50 3.1 9 26.63
pH (agua) 1 :2 8.02 8.35 7.98 7.72 8.11 8.97
pH (KCI) 1:2 7.36 7.72 7.34 7.35 7.5 8.17
Potencial Redox (mv) 78.30 73.60 81.20 76.40 83.60 64.50
Conductividad eléctrica 0.364 0.82 0.385 2.68 0.28 1.001 (1 :5) mS/cm
Salinidad(%) 0.43 1.19 0.38 2.26 0.29 1.03
Sodio (cmoi/Kg) 2.32 16.45 3.89 21 .16 1.53 11.74
CIC (meq/1 OOg) 68.8 116.48 61.12 79.04 37.12 42.88
Fósforo (mg/Kg) 3.82 42.88 41.41 40.27 19.54 44.47
Nitrógeno(%) 0.69 0.66 0.76 0.82 0.32 0.42
Arenas(%) 28.40 46.40 24.40 32.40 38.40 54.40
Limos(%) 26.72 30.72 44.72 52.72 52.72 38.72
Arcillas(%) 44.88 22.88 30.88 14.88 8.88 6.88
Clase textura! Arcilloso Franco Franco Franco Franco Franco Arcilloso limoso limoso arenoso
31
CAPÍTULO 11
Los detergentes son una mezcla compleja de sustancias químicas que dependiendo del
producto pueden contener varios o todos los sigu ientes componentes: surfactantes o
tensoactivos, potenciadores o coadyuvantes, enzimas, abrillantadores, blanqueadores,
perfumes, antibacteriales y compuestos de relleno (NI IR, 2007; Gülümser, 201 0). Dentro
de los potenciadores de uso más común están los fosfatos de sodio y de potasio, siendo
el tripolifosfato sódico (TPFS) uno de los más usados; su fórmula empírica es Na5P30 10 ,
tiene una solubilidad de 13% a 25°C y un contenido de fosfatos de 55.88% (Romero,
2006). Con base en esto es de esperarse que el efecto directo sobre los suelos que se
exponen recurrentemente a descargas de aguas residuales ricas en detergentes sean el
incremento en el sodio, la conductividad eléctrica y los fosfatos . Los análisis edáficos
(Cuadro 2) confirman que el contenido de sodio es entre 2 a 6 veces mayor en suelos
expuestos a detergentes (SDet1 , Det2, SDet3) con respeto a los que no presentan
contenido de detergentes (S1 , S2, S3). Los valores de la CE aumentan al incrementarse
los de los valores de sodio , lo que sugiere que es el catión principal que determina la
salin idad de los suelos en contacto con las descargas de aguas residuales.
En cuanto al contenido de fósforo es importante señalar que el método utilizado para su
medición (Oisen) detecta únicamente el fósforo inorgánico disponible. El fósforo fue
menor en las muestras S1 y S3, lo cual pudiera deberse a la alta cantidad de fragmentos
rocosos de carbonato de calcio encontrados en las muestras (datos no publicados) , lo
cual podría estar propiciando la fijación del fósforo en forma de fosfatos de calcio (von
Wandruszka, 2006). El fósforo pudiera estar asociado a los fragmentos rocosos o ya fue
acarreado por el agua a las capas más profundas del suelo o a otros sectores del sitio de
muestreo. Estos niveles bajos de fósforo indican que probablemente no existe de manera
natural entrada constante de fósforo inorgánico al ecosistema, razón por la cual dichos
niveles aumentan considerablemente cuando los detergentes son vertidos en ellos.
Los valores de potencial REDOX muestran valores más bajos en los ambientes
contaminados, lo que evidencia condiciones de mayor anaerobiosis en estos sitios
(Patrick et a/, 1996), lo cual puede ser el resultado del anegamiento de dichos suelos por
las descargas de agua con detergente.
La clase textura! parece cambiar hacia clases más gruesas, es decir, de texturas
arcillosas a limosas y de limosas a arenosas en los suelos expuestos a detergentes. Esto
puede ser causado por la acción dispersante del sodio contenido en los detergentes de
las aguas contaminadas (NIIR, 2006) , lo que provoca que las partículas del suelo se
32
CAPÍTULO 11
separen , promoviendo que las partículas más pequeñas y livianas del suelo (arcillas) sean
lavadas hacia otras zonas y las más pesadas (arenas) permanezcan.
Los valores de CIC encontrados son mayores en los suelos contaminados, lo que puede
deberse a la saturación del medio con el catión sodio proveniente de las aguas
contaminadas. Los compuestos de los detergentes que aportan sodio al ambiente son los
agentes secuestrantes (Builders), cuya principal acción es "secuestrar" a los cationes
divalentes del agua dura (calcio, magnesio) para evitar la interacción de estos iones con
los surfactantes. La eliminación de los cationes se hace en forma de solubilización
(quelato), precipitación , o intercambio iónico, Algunos de los agentes secuestrantes mas
utilizados son los silicatos y carbonatos de sodio.
Los niveles de salinidad y sodio aumentaron de manera considerable , principalmente en
la muestra SDet2. Los altos valores en los niveles de sodio conllevan a un aumento en la
conductividad eléctrica, la cual es 3 a 5 veces mayor en las muestras expuestas a
detergentes.
Finalmente, los valores de nitrógeno no mostraron ningún cambio evidente. Se podría
esperar una disminución de nitrógeno por efecto de una posible eutrofización del suelo
por efecto de la adición de fósforo , pero al parecer no está ocurriendo así , o bien, se está
dando en las capas más profundas del suelo .
El pH en agua reportado para suelos de otras zonas del norte de Yucatán son similares a
los reportados en este estudio para las muestras no expuestas a detergentes (Aguila,
2007), por lo que las diferencias de pH observados con respecto a las muestras de suelo
expuestas a detergentes pueden ser atribuidos a las descargas de agua. Los valores de
pH en KCI en las muestras de los sitios 1 y 3 indican que existen otros cationes además
del sodio en el complejo de cambio del suelo, que determinan la acidez de reserva del
suelo. La medida del pH en KCI suele ser del orden de 0.5 - 1 unidades de pH inferior al
pH en agua. Esta disminución se debe a que el KCI desplaza a los cationes acidificantes
(como por ejemplo hierro y alumin io). Por la naturaleza de la zona de muestreo, este
catión podría ser hierro, ya que es muy abundante en éstos suelos y el TPFS tiene una
capacidad secuestrante baja para este elemento (Romero, 2006).En el caso de la muestra
del sitio 2 no hay diferencias en el pH con KCI, lo que sugiere que el sodio ha remplazado
todos los cationes del complejo de cambio y por lo tanto ya no hay acidez residual. Esto
es respaldado con el valor mas alto de conductividad eléctrica y de contenido de sodio en
esa muestra.
33
CAPÍTULO 11
2.4 BIBLIOGRAFÍA
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CAPÍTULO 111
CAPÍTULO 111
Determinación de los índices ecológicos de suelos contaminados con
detergentes mediante DGGE.
3.1 INTRODUCCIÓN
Los métodos tradicionales de cultivos bacterianos se han caracterizado por ser sencillos,
económicos y relativamente rápidos; sin embargo, la proporción de tipos bacterianos
cultivables en medios convencionales es apenas de 0.1 a 1 O% de la población total
(Torsvik et al., 2002), y consecuentemente conducen a una visión incompleta de la
diversidad bacteriana. Es por ello que los métodos moleculares están reemplazando a los
métodos trad icionales en el estudio y análisis de comunidades bacterianas. Entre los
métodos moleculares destacan las técnicas de reasociación del ADN, hibridación del
ADN , clonación , secuenciación y otros métodos basados en PCR tales como la
electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante ó de temperatura (DGGE/TGGE, por
sus siglas en inglés).
La DGGE es una técnica que se desarrolló para detectar mutaciones puntuales en las
secuencias del ADN (Borrensen et al., 1988); actualmente esta técnica ha sido adaptada y
permite analizar la diversidad de las comunidades bacterianas presentes en diferentes
ambientes.
A pesar de ser un método indirecto, el análisis por DGGE puede proveer información
sobre los cambios en la estructura de una comunidad (Muyzer et al. , 1993), y proporcionar
un esbozo generalizado de la biodiversidad presente en cada muestra ambiental,
permitiendo analizarlas mediante comparaciones entre ellas.
Es por ello, que la estimación de la diversidad en las comunidades bacterianas del
presente trabajo se realizó en primera instancia mediante el análisis de electroforesis en
gel con gradiente desnaturalizante de los productos amplificados de la región V3 del gen
16S ribosomal bacteriano.
35
CAPÍTULO 111
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS
3.2.1 EXTRACCIÓN DEL ADN METAGENÓMICO
La extracción del ADN metagenómico (ADN MG) se efectuó con el kit comercial
"PowerSoil® DNA lsolation Kit" (MO 810), siguiendo las instrucciones del fabricante ; este
kit está diseñado para aislar ADN genómico de muestras de suelo.
Las extracciones de ADN metagenómico de cada una de las muestras se realizaron por
triplicado y posteriormente fueron concentradas con el kit comercial "Amicon Ultra-0.5 mL
Centrifuga! Filters" (Millipore TM) siguiendo las instrucciones del fabricante .
3.2.2. DETERMINACIÓN DE LA INTEGRIDAD DEL ADN METAGENÓMICO
Se comprobó la integridad del ADN MG extraído mediante una electroforesis horizontal en
gel de agarosa (50mL de agarosa al 1% en amortiguador TBE) (40mM TRIS borato al
0.6% y 2m M de EDTA) teñido con Bromuro de Etidio (21-JL/1 OOmL). La carga de cada una
de las muestras de ADN se realizó con un volumen de 51-JI mezclado con 31-JI de buffer de
carga (azul de bromofenol 6x). Se incluyó un marcador de masa molecular (MM) para
ADN, HyperLadder 1 (Bioline®). La corrida se realizó a 80 V durante 40 minutos. El gel se
visualizó en un fotodocumentador con luz ultravioleta Gel Doc XR (Bio Rad Lab. lnc.).
3.2.3 CUANTIFICACIÓN DEL ADN METAGENÓMICO
Para evaluar la pureza del ADN metagenómico se determinó la proporción DO 260nm/DO
280nm y la cuantificación del ADN fue realizada mediante el análisis de la absorción UV.
Ambas mediciones se realizaron con el equipo NanoDrop 1000 Spectrophotometer de la
marca Thermo Scientific®; posteriormente a la cuantificación , las muestras fueron
estandarizadas a una concentración de 40 ng/1-JI.
3.2.4 AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL GEN 16S RIBOSOMAL BACTERIANO
Se amplificó una región de 1300pb del gen 16S ribosomal , utilizando los in iciadores 16SS
5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' y 16SR 5'-CGGGAACGTATTCACCG-3' (Strom et al.,
2002) específicos para bacteria. Las mezclas de reacción contenían 40 ng de ADN
metagenómico, 1 X de buffer de PCR (Biolane®), 0.2 mM de mezcla de dNTP's, 0.2 1-Jm
de cada iniciador (338Fgc y 518R), 7 mM de MgCI2 , 0.2% de albumina sérica bovina
36
CAPÍTULO 111
(BSA, por sus siglas en inglés) y 1 unidad de DNA polimerasa Biolase (Bioline®). Las
condiciones de amplificación consistieron en un ciclo de desnaturalización de 5 min a
94 oc , seguido de 30 ciclos de elongación (94 oc 1 m in , 52°C 30s, 72°C 1 m in) con una
extensión final de 72°C por 1 O m in en el termociclador GeneAmp® PCR System 9700 de
la marca Applied Biosystems®. La integridad de los productos de PCR se evaluó en un
gel de agarosa al 1.0% teñido con bromuro de Etidio (2 ¡JL/1 00 mL), con un tiempo de
corrida de 60 min a 80 V, utilizando el marcador de masa molecular (MM) para ADN,
HyperLadder 1 Bioline®.
3.2.5 AMPLIFICACIÓN POR PCR DE LA REGIÓN VARIABLE V3 DEL GEN 165
RIBOSOMAL
Se amplificó la región V3 del gen ARNr 16S utilizando los iniciadores 338FGc (5'
CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCTCCTACGGGAGG
CAGCAG-3') y 518R (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'); dichos iniciadores amplifican un
fragmento de aproximadamente 200 pb y fueron propuestos por Muyzer y colaboradores
para el estudio de las comunidades bacterianas (Muyzer et al., 1993 ). El alto contenido de
guaninas y citocinas (grapa GC) en el extremo 5' del iniciador 338FGc que se coamplifica
con el segmento de ADN, evita la separación completa de las dos cadenas de ADN, ya
que requiere condiciones más drásticas de desnaturalización, lo que permite que los
fragmentos amplificados queden anclados al gel de poliacrilamida.
Para cada 25 !JL de mezcla de reacción de PCR, se emplearon 40 ng de los productos
amplificados del gen 16S ribosomal , 1 X de buffer de PCR (Bioline®), 0.2 mM de mezcla
de dNTP's (Bioline®), 0.2 ¡Jm de cada iniciador (338Fgc y 518R), 6 mM de MgCI2 y 1
unidad de ADN polimerasa (Biolase DNA Poi de Bioline®). Las condiciones de
amplificación consistieron en un ciclo de desnaturalización de 5 m in a 94 oc , seguido de
1 O ciclos (94 oc 1 m in, 65oC 1 m in , 72°C 1 m in) disminuyendo un grado en cada ciclo, a
continuación 20 ciclos (94°C 1min, 55°C 1 min, 72°C 1 min) con una extensión final de
72°C por 1 O m in en el termociclador GeneAmp® PCR System 9700 de la marca Applied
Biosystems. La integridad de los productos de PCR se evaluó en un gel de agarosa al
1.5% teñido con bromuro de Etidio (2 ¡JL/1 00 mi), con un tiempo de corrida de 60 m in a
80v, utilizando el marcador de masa molecular (MM) para ADN, HyperLadder 1 Bioline®.
Las amplificaciones de la región V3 del gen 16S ribosomal fueron realizadas por triplicado
37
CAPÍTULO 111
y concentradas con el kit comercial "Amicon Ultra-0.5 mi Centrifuga! Filters" (Millipore ™),
siguiendo las instrucciones del fabricante. De la concentración de las réplicas se obtuvo
un volumen final de 50 !JI.
3.2.6 DGGE
La DGGE se llevó a cabo utilizando el equipo DCode® Universal Mutation Detection
System, siguiendo las instrucciones del fabricante (8io-Rad , USA). La concentración de
poliacrilamida en el gel fue de 8% con un gradiente desnaturalizante de urea-formamida
30-60%; la solución desnaturalizante al 60% contiene 15 M de urea, 8% de acrilamida/bis
acrilamida (37:5:1 ), formamida al 24% (v/ v) y buffer TAE a 0.5X (40 mM Tris-HCI, 20 mM
ácido acético, 1 M EDTA y pH 8). La solución desnaturalizante al 30% consistió en 7.5 M
de urea , 8% de acrilamida/bis-acrilamida (37:5:1), formamida al12% (v/v) y buffer TAE a
0.5X (pH 8). Se cargaron 50 IJL de producto de PCR mezclados con 25¡ .. tl de la solución
amortiguadora de carga (Azul de bromofenol 0.05gr, Xilen cianol 0.05gr, TAE 1 x 1 OmL) y
se vertieron en los pozos del gel en una sola carga. El gel se corrió en buffer TAE a 0.5X,
a una temperatura constante de 60°C y 50 V por 18 h. Transcurrido este tiempo se realizó
la tinción con SY8R Gold (Promega 1:10000, en solución TAE 0.5X) por 30min y se
realiza un lavado por 1Om in en solución TAE 1 X. El gel fue revelado en el
fotodocumentador Gel Doc 2000 System (810-RAD).
3.2.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS DE LA DGGE
Se realizó analizando las matrices de ausencia-presencia y de densidad de picos creadas
a partir de las bandas resultantes en el gel.
Los índices de Riqueza (S), Shannon (H ') y Simpson (O) fueron calculados con ayuda del
programa bioinformático "Species Diversity and Richness 3.02" (Pisces Conservation Ud .)
El dendograma que relaciona los patrones similares del bandeo obtenido en la DGGE fue
calculado automáticamente con base en el coeficiente de similitud de Dice, utilizando el
algoritmo UPGMA (Método de agrupamiento pareado no ponderado utilizando media
aritmética) mediante el programa informático "Quantity One 1-D Analysis Software" (810-
RAD).
38
CAPÍTULO 111
3.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.3.1 EXTRACCIÓN DEL ADN METAGENÓMICO
El ADNMG extraído de cada una de las muestras de suelo mostró integridad y presentó
una longitud aproximada de 10 kb (Fig. 5).
10 kb-
Figura 5. Integridad del ADN metagenómico obtenido de muestras de suelos con detergentes
(SDet) y sin detergentes (S). MM) Marcador de peso molecular Hyperladder 1 (Biol ine) . Gel de
agarosa al 1%, 30 minutos, 80 volts, teñido con bromuro de etidio.
3.3.2 CUANTIFICACIÓN DEL ADN METAGENÓMICO
La pureza del ADN MG extraído de cada una de las muestras de suelo se comprobó
midiendo la proporción DO 260nm/280nm (Cuadro 3). Los valores de dicha relación
estuvieron en el rango de 1.69 a 1.94, lo cual indicó que las muestras fueron de pureza
aceptable (libres de proteínas). Las concentraciones variaron entre 44 y 148 ng/¡.JI ; y
posteriormente todas las muestras fueron estandarizadas a una concentración de 40ng/¡.JI.
Cuadro 3. Determinación de la pureza y cuanti ficación del ADN metagenómico obtenido de los
suelos contaminados (SDet) y no contaminados (S) con detergentes
Muestra Relación DO 260nm/ 280nm ng/J.JI
S1 1.89 80.5
SDet1 1.94 64.2
S2 1.88 130.3
SDet2 1.61 44.8
S3 1.80 72.8
SDet3 1.69 148.2
39
CAPÍTULO 111
3.3.3 AMPLIFICACIONES POR PCR
Las amplificaciones por PCR del gen ARNr 16S y de la región variable V3 del mismo gen
se muestran en la Figura 6. En el panel A se encuentran las amplificaciones del gen ARNr
16S con un tamaño aproximado de 1300 pb ; dicha longitud era la esperada de acuerdo
con los iniciadores 16SS y 16SR utilizados. Utilizando como templado los productos de
PCR de la región 16S ribosomal (Fig . 6A) se realizó la amplificación de la región variable
V3 del gen ARNr 16S (Fig. 6B) la cual tiene un tamaño aproximado de 200 pb.
A)
1000 pb-
1500 pb-
Figura 6. A) Productos de amplificación por PCR de una región de 1300pb del gen 16S ribosomal
bacteriano. Como templado se utilizó ADNMG extraído de las muestras de suelos contaminados
(SDet1 , SDet2, SDet3) y no contaminados (S1 , S2, S3) con detergentes. B) Productos de
amplificación por PCR utilizando cebadores universales para la región variable V3 usando como
templado las amplificaciones de un fragmento del gen 16S ribosomal bacteriano. MM) Marcador de
peso molecular Hyperladder (1 Bioline).
40
CAPÍTULO 111
3.3.4 ANÁLISIS POR DGGE
La desnaturalización y separación de los fragmentos correspondientes a la región variable
V3 del gen 16S, a partir del ADN metagenómico de las muestras de suelo se observa en
la Figura 7.
51 5Det1 52 5Det2 53 5Det3
Figura 7. Desnaturalización y separación por DGGE de los fragmentos amplificados de la región
V3 del gen 16S ribosomal bacteriano. Productos de amplificación por PCR usando cebadores
universales de la región V3 del gen 16S ribosomal (gc338F y 518R) y como templado las
amplificaciones de un fragmento del gen 16S ribosomal bacteriano de ADN de muestras de suelos
contaminados (SDet1 , SDet2, SDet3) y no contaminados (S1 , S2, S3) con detergentes.
41
CAPÍTULO 111
Al revelar el gel un total de 189 bandas fueron contabilizadas. Se pudo apreciar un patrón
diferencial de bandas para cada una de las muestras. Utilizando el programa Quantity
One (Bio-Rad) se detectó la intensidad relativa del área de cada una de las bandas y con
base en estos datos y con la matriz de ausencia-presencia de las bandas resultantes de la
DGGE se determinaron los índices de diversidad que se presentan en el Cuadro 4.
Cuadro 4. Valores de los índices de diversidad calculados a partir de la matriz de ausencia
presencia y la densidad de picos de las bandas resultantes de la DGGE.
Muestra Riqueza (S) Shannon(H1 Simpson (D) j S1 26 3.24 25.53
SDet1 25 3.20 24.48
S2 34 3.52 33.74
SDet2 36 3.56 35.02
S3 30 3.39 29.65
SDet3 38 3.62 37.06
El análisis de los perfiles de bandeo de la DGGE mostró que los suelos que han estado
expuestos a detergentes por largos periodos son ambientes diversos, y dicha diversidad
es diferente con respecto a los suelos que no han sufrido la contaminación por
detergentes. En la Figura 7 puede observarse que cada una de las muestras de suelo
presentó bandas distintivas y que las bandas más intensas se sitúan en la zona media del
gel de poliacrilamida.
De acuerdo al índice de Riqueza (S), las muestras contaminadas con detergentes SDet2 y
SDet3 presentaron un mayor número de bandas (36 y 38 bandas respectivamente) que
las muestras S1 , S2 y S3.
En cuanto al índice de Shannon entre las muestras contaminadas y las no contaminadas,
los valores de diversidad para este índice variaron entre H'= 3.02 y H'= 3.62, lo que indica
que las muestras S 1, S2, S3, SDet1, SDet2 y SDet3 son abundantes en cuanto a
diversidad, siendo la muestra más rica SDet3 con H'= 3.62. Los resultados contrastan con
otros reportes en los cuales se ha analizado la diversidad bacteriana edáfica mediante
DGGE, por ejemplo en algunos estudios de suelos contaminados con hidrocarburos, se
reportaron valores de H'= 2.87 (Andreonia et al. , 2004) y H'= 2.52 (Maila et al. , 2005). En
42
CAPÍTULO 111
suelos que son aptos para el cultivo de diferentes plantas los valores para el índice de
Shannon varían entre 2.47 a 2.78 (Girvan et al., 2003); en suelos contaminados con
metales pesados tuvieron variaciones de H' entre 2.20 y 2.81 (Wang et al. 2007).
Los elevados niveles de H' en las muestras SDet1, SDet2 y SDet3 con respecto a otros
ambientes contaminados, se deben probablemente a la adaptabilidad que las bacterias
han desarrollado para utilizar los compuestos de las formulaciones de detergentes como
fuente de energía, lo que les ha permitido proliferar en este tipo de ambientes.
Valores altos en el índice de Simpson (D) indican una amplia diversidad así como una
buena distribución de los filotipos que conforman cada uno de los sistemas edáficos. Éste
índice presento los valores más altos en las muestras contaminadas SDet2 y SDet3 con
D= 35.02 y D= 37.06 respectivamente.
3.3.4.1 COEFICIENTE DE SIMILITUD DE DICE
El dendograma obtenido (Fig. 8) muestra los distintos perfiles de bandas en función de su
similitud , aplicando el algoritmo UPGMA y el coeficiente de Dice (Cuadro 5); este método
establece la similitud entre los perfiles en función de las posiciones relativas de las
bandas, pero sin tener en cuenta su densidad (intensidad relativa de la banda). El
coeficiente de Dice es comúnmente utilizado para comparar las especies entre
ecosistemas diferentes. Dos perfiles idénticos dan como resultado un valor igual al 100
mientras que dos perfiles completamente diferentes dan un valor igual al O (Dice, 1945).
Es decir a menor valor, más diferentes son las poblaciones de las muestras.
Cuadro 5. Matriz de similitud entre las muestras de suelos contaminados (SDet1 , SDet2, SDet3) y
no contaminados (S1 , S2, S3) con detergentes con base en el coeficiente de Dice
S1 100
. SDet1 54.2 100
S2 56.9 59.7 100
SDet2 58.4 48.8 61.2 100
S3 60.9 53.8 62.4 58.2 100
SDet3 52.0 51.4 57.3 68.3 52.9 100
S1 SDet1 S2 SDet2 S3 SDet3
43
CAPÍTULO 111
Se puede observar que los perfiles obtenidos de las muestras de suelo se segregaron en
dos ciados principales: En el primero se agrupan las muestras S 1, S2, S3, SDet2 y SDet3.
Las muestras de suelo que no han estado expuestas a detergentes (S1 , S2 y S3) se
agrupan en un ciado con una similitud del 59%. Los ambientes contam inados con
detergentes SDet2 y SDet3 se agruparon en un ciado con el 68% de simil itud en el
posicionamiento de sus bandas, el valor más alto de similitud reg istrado en este análisis.
El perfil de bandas de la comunidad de la muestra SDet1 , la cual ha estado expuesta a
descargas de aguas con detergente durante 15 años, se separó del resto de las muestras
analizadas, con las que mostró una similitud de tan sólo 54%, esto podría deberse a los
diferentes tipos de detergentes que fueron vertidos sobre los suelos, ya que los
compuestos químicos conten idos en los detergentes pudieran afectar de manera distinta a
cada una de las comunidades microbianas en los suelos contaminados Estos resultados
suponen que los agrupamientos observados con las seis muestras están altamente
influenciados por la presencia de los detergentes en -los ambientes edáficos.
0.54
52 53 51 5Det2 5Det3 5Det1
Figura 8. Dendrograma de los perfiles de bandeo generados en la DGGE de las comunidades
bacterianas de las muestras de suelos contaminados (SDet1 , SDet2, SDet3) y no contaminados
(S1 , S2, S3) con detergentes. En el anál isis se apl icó el algoritmo UPGMA y el coeficiente de Dice.
44
CAPÍTULO 111
3.4 BIBLIOGRAFÍA
Andreonia V., Cavalcaa L. , Raob M.A, Nocerinob G. , Bernasconic S. , Deii'Amicoa E. , Colomboa M., Gianfredab L. 2004. Bacteria! communities and enzyme activities of PAHs polluted soils. Chemosphere. 57 (5): 401-412.
Borresen A.L. , Hovig E., Brogger A. 1988. Detection of base mutations in genomic DNA using denaturing gradient gel-electrophoresis (DGGE) followed by transfer and hybridization with gene-specific probes. Mutat.Res. 202 :77-83.
Dice L. R. Measures of the amount of ecolog ical association between species. 1945. J. Ecology, 26: 297-302.
Girvan M.S, Bullimore J., Pretty J.N., Osborn A.M, and Ball A.S. 2003. Soil Type ls the Primary Determ inant of the Composition of the Total and Active Bacteria! Communities in Arable Soils. Appl. Enviran . Microbio!. 69 (3): 1800-1809
Maila M.P. , Randima P., Surridge K., Dronen K. , Cloete T.E. 2005. Evaluation of microbial diversity of different soil layers at a contam inated diesel site. lnt. Biodet. Biod. 55: 39-44
Muyzer G. , de Waal E.C., Uitterlinden A.G. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Enviran. Microbio!. 59 (3),695-700.
Strom K., Sjogren J., Broberg A. , Schnürer J. 2002. Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(l-phe-1-pro) and cyclo(l-phe-trans-4-oh-1-pro) and 3-phenyllactic acid . Appl. Enviran. Microbio!. 68 (9):4322-4327.
Torsvik V., 0vreas L. , 2002. Microbial diversity and function in soil : from genes to ecosystems. Curr. Opin . Microbio!. 5, 240-245.
Wang Y.P., Shi J.Y. , Wang H., Lin Q ., Chen X.C., Chen Y.X. 2007. The influence of soil heavy metal pollution on soil microbial biomass enzyme activity, and community composition near a copper smelter. Ecotox. Enviran. Safe. 67: 75-81 .
45
CAPÍTULO IV
CAPÍTULO IV
Identificación de los principales grupos bacterianos mediante el análisis de
las secuencias del gen 165 ribosomal
4.1 INTRODUCCIÓN
El análisis molecular de las comunidades bacterianas es actualmente uno de los retos y
objetivos más ampliamente perseguidos en ecología microbiana. Sin embargo, estimar la
diversidad entraña dos problemas: determinar el tamaño de muestra necesario para tener
representada a la comunidad y elegir el estimador de la diversidad más adecuado. El
problema del tamaño de muestra no es único para las comunidades bacterianas. Los
ecólogos del mundo macroscópico se han enfrentado al mismo problema y han diseñado
herramientas estadísticas para lidiar con el muestreo (Colwell y Coddington, 1994;
Magurran, 1988), que en la actualidad intentan aplicarse al mundo microscópico.
Hughes y sus colaboradores (2001) publicaron una revisión interesante sobre este
problema, y evaluaron el tamaño de muestra que en general se requiere para tener un
estimado útil de la diversidad de las comunidades. También evaluaron la utilidad de varios
estimadores de diversidad para el caso de comunidades bacterianas concluyendo que el
tamaño adecuado de una muestra puede visualizarse graficando una curva de
acumulación que consiste en relacionar el número acumulativo de OTUs observados
contra el esfuerzo de muestreo (número de lecturas obtenidas en la secuenciación). Este
tipo de curvas revelan la calidad del muestreo, pues ya que todas las comunidades
contienen un número finito de especies , si se continúan muestreando individuos las
curvas eventualmente alcanzarán una asíntota en el valor real del número de OTUs de la
comunidad.
El análisis de cualquier comunidad involucra la determinación estadística de la diversidad
a partir de la abundancia relativa de las especies presentes.
La secuenciación del gen 16S ribosomal de una muestra de ADN extraído directamente
del ambiente ayuda a estudiar la diversidad microbiana del ecosistema y permite
determinar la posible función de los microorganismos en el ambiente (Amann et al., 1995).
En las últimas décadas también se ha incrementado el uso de la información genética
47
CAPÍTULO IV
para analizar procesos evolutivos. En particular, la variación en la secuencia del ARN
ribosomal ha sido utilizado para realizar inferencias filogenéticas que permiten establecer
relaciones o visualizar cambios en las comunidades microbianas (Woese, 1987).
La secuenciación del gen ARNr 16S se ha aplicado a la identificación bacteriana, ya que
mediante el análisis de secuencias parciales de dicho gen, es posible encontrar patrones
específicos (secuencias variables) para diferentes grupos, e incluso especies bacterianas.
La comparación de las secuencias del ARNr 16S ha facilitado la identificación y
clasificación bacteriana (incluyendo los microorganismos no cultivables) y ha sido útil en la
determinación de las relaciones que los microorganismo establecen entre ellos mismos y
con el ambiente que los rodea.
El análisis bioinformático de las secuencias de ADN , permite el descubrimiento de
similitudes funcionales y estructurales, y las diferencias entre las múltiples secuencias
obtenidas. Esto puede hacerse comparando las nuevas secuencias (desconocidas) con
las secuencias ya estudiadas, las cuales están disponibles en diversas bases de datos.
La final idad de este estudio es determinar el impacto que los detergentes han ejercido
sobre la composición y diversidad de las comunidades bacterianas en muestras de suelo
recolectadas en el municipio de Hunucmá, Yucatán, México. Para cumplir el objetivo es
necesario identificar los principales phyla que integran las comunidades bacterianas
edáficas de los ambientes expuestos y no expuestos a descargas de aguas con
detergentes, por lo que se realizó la secuenciación shotgun de una región variable del gen
168 ribosomal a partir del ADN metagenómico extraído de las diferentes muestras de
suelo. Las secuencias obtenidas fueron analizadas con ayuda de la plataforma de análisis
"The Ribosomal Database Project's Pyrosequencing Pipeline" (http://pyro.cme.msu.edu/)
con la cual se obtuvieron datos cuantitativos de las poblaciones microbianas, permitiendo
identificar y comparar las distribución de taxa en cada uno de los ambientes edáficos.
48
CAPÍTULO IV
4.2 MATERIALES Y MÉTODOS
4.2.1 SECUENCIACIÓN DEL GEN ARNr 165
La pirosecuenciación de un fragmento del gen 16S ribosomal a partir del ADN
metagenómico extraído de las diferentes muestras de suelo fue realizada con los
iniciadores Forward: 28F 5'-GAGTTTGATCNTGGCTCAG-3' y Reverse: 519R 5'
GTNTTACNGCGGCKGCTG-3' los cuales amplificaron un fragmento que contiene las
regiones variables V1-V3 del gen 16S ribosomal bacteriano. Dicho método fue realizado
por la compañía "Research and Testing Laboratory" en Lubbock, Texas. Se envió un
volumen de 50 ¡..rl a una concentración de 40ng/ ¡..rl de cada una de las muestras de ADN
metagenómico.
4.2.2 ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS
Las secuencias fueron analizadas con ayuda de la plataforma de análisis "The Ribosomal
Database Project's Pyrosequencing Pipeline".
Todas las secuencias fueron alineadas y a partir de los alineamientos se obtuvieron datos
cuantitativos de las poblaciones microbianas, como el número de clusters . A partir de
estos grupos se obtuvieron los índices ecológicos de Shannon, Chao1 , Eveness, así
como las curvas de rarefacción y el coeficiente de Jaccard.
Se analizó la distribución de las secuencias a nivel de phyla, clase y especies de cada
una de las muestras.
El análisis de componentes principales fue realizado en base en las abundancias relativas
de los principales phyla bacterianos y los parámetros fisicoquímicos de las seis muestras
de suelo analizadas; para ello se utilizó el software "PC-ORD for Windows Version 4", con
el cual se calcularon automáticamente las matrices de coeficientes de correlación (Anexo
2), para finalmente presentar el resultado en un gráfico de componentes principales.
49
CAPÍTULO IV
4.3 RESULTADOS Y DISCUCIÓN
4.3.1 ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS
Se obtuvo un total de 54,210 lecturas parciales del gen 16S ribosomal bacteriano. El
tamaño promedio de cada secuencia fue de alrededor de 550 pares de bases.
Para determinar las curvas de rarefacción, riqueza, diversidad y número de OTUs (Cuadro
7) se identificaron las distancias genéticas a 20% (phylum) y 3% (especie) con ayuda de
la plataforma de análisis del RDP. Los porcentajes de divergencia están basados en el
clasificador de secuencias del NCBI (Cuadro 6).
Cuadro 6. Porcentaje de divergencia utilizada para la identificación de los diferentes niveles
taxonómicos.
Divergencia Nivel taxonómico
~ 3% Especie
3% >5% Género
5% > 10% Familia
10% > 15% Orden
15% > 20% Clase
20%< 23% Phylum
Cuadro 7. Características estadísticas de los anál isis de las secuencia de las seis muestras de
suelo, a un nivel de distancia máxima de 20% y 3%.
Distancia máxima de 20% Distancia máxima de 3%
Número de (Phylum) (Especie)
Secuencias OTUs H' Chao1 Eveness O TUs H' Chao1 Eveness
81 7 911 154 3.74 154 0.74 1 140 6.29 1 153 0.89
82 5 653 187 4.28 187 0.82 1 296 5.17 1 326 0.92
83 6 450 183 4.15 183 0.80 1 043 6.04 1 067 0.87
8Det1 12 562 185 3.68 186 0.67 981 5.47 1 012 0.79
SDet2 11 295 175 3.61 175 0.74 707 6.62 727 0.79
8Det3 10 339 224 4.03 225 0.59 921 5.62 921 0.83
50
CAPÍTULO IV
Para medir la riqueza de las OTUs de las muestras de suelo a las distancias genéticas de
20% y 3% se calcularon las curvas de rarefacción para cada una de ellas (Fig . 9 y Fig.
1 O). Se puede apreciar que a medida que se incrementa el esfuerzo de muestreo
aumenta el número de OTUs observadas. Sin embargo, las curvas eventualmente
alcanzaron una asíntota en el valor de OTUs de la comunidad, razón por la cual puede
considerarse que el muestreo fue completo y que abarca la mayor diversidad taxonómica
existente en cada uno de los seis ambientes .
La comparación de los análisis de rarefacción con el número de OTUs predichos por el
índice de Chao1 (Cuadro 7) revela que el 100% de la riqueza estimada fue cubierta por el
esfuerzo de muestreo a una distancia de genética de 20%, mientras que a una distancia
de 3% la riqueza observada se encuentra en un rango del 97%-100% de la riqueza
estimada, por lo cual se concluye que el presente estudio analizó toda la extensión de la
diversidad taxonómica a estas distancias genéticas.
El índice de diversidad de Shannon (H') fue determinado para todos los ambientes,
confirmando la alta diversidad bacteriana observada en el análisis de las muestras
mediante DGGE.
Los valores de H' obtenidos en el análisis de las secuencias a nivel de phylum tuvieron
valores entre 3.6 y 4.2 , mientras que a nivel de especie fueron de 5.1 hasta 6.6. Por lo
general la diversidad es ligeramente mayor para la muestras sin detergentes , con
respecto a las que si tienen el contaminante. El valor más alto de H' fue encontrado en la
muestras SDet2 con 6.62 a nivel de especie.
Por último, el índice de igualdad u homogeneidad de Evenness (E), reveló valores muy
cercanos a 1 en cada una de las muestras, lo que se traduce como una menor variación
en la abundancia relativa de los OTUs, indicando que estos se reparten homogéneamente
y que el muestreo fue totalmente uniforme para todos los OTUs en cada una de las
muestras.
51
CAPÍTULO IV
250
Esfuerzo de muestreo {Reads)
Figura 9. Curvas de rarefacción representadas a nivel de phylum (20%) y basadas en los datos
obtenidos de la pirosecuenciación del gen 168 ribosomal bacteriano.
Curvas de rarefacción (diversidad acumulada) del esfuerzo de muestreo con base en las
secuencias obtenidas en cada una de las muestras de suelo contaminados (8Det1, 8Det2, 8Det3)
y no contaminados (81 , 82, 83) con detergentes.
52
CAPÍTULO IV
1400
1300
1200
1100 - 51 1000
900 - 52
1/1 800 - 53 ;:::) 1- 700 o - 5Det1 600
500 - 5Det2 400
300 - 5Det3
200
100
o
Esfuerzo de muestreo (Reads)
Figura 10. Curvas de rarefacción representadas a nivel de especie (3%) y basadas en los datos
obtenidos de la pirosecuenciación del gen 16S ribosomal bacteriano.
Curvas de rarefacción (diversidad acumulada) del esfuerzo de muestreo con base en las
secuencias obtenidas en cada una de las muestras de suelo contaminados (SDet1 , SDet2, SDet3)
y no contaminados (S1 , S2, S3) con detergentes.
53
CAPÍTULO IV
4.3.2 ANÁLISIS DE LOS CAMBIOS EN LA ABUNDANCIA RELATIVA DE LOS
PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS
Con los datos obtenidos de la secuenciación del ARNr 16S se analizó la distribución (a
diferentes niveles taxonómicos) de cada una de las muestras.
Las 54,21 O lecturas parciales del gen 16S ribosomal bacteriano fueron clasificadas en
diferentes niveles taxonómicos (Cuadro 8). Las muestras contaminadas con detergentes
presentaron aproximadamente el doble de número de secuencias que los suelos no
contaminados.
Cuadro 8. Clasificación de las secuencias parciales del gen 16S ribosomal bacteriano a diferentes
niveles taxonómicos.
Muestra Secuencias Phyla Clases Ordenes Familias Géneros Especies
S1 7 911 21 34 67 122 239 294
S2 5 653 25 38 74 135 277 346
S3 6 450 26 40 76 136 253 292
SDet1 12 562 24 39 72 132 253 311
SDet2 11 295 22 36 68 119 247 297
SDet3 10 339 28 45 81 147 288 334
Los seis ambientes estuvieron dominados por los phyla Proteobacteria, Acidobacteria,
Actinobacteria y Bacteroidetes; estos grupos representan entre el 80%-90% de las
secuencias pertenecientes a cada una de las muestras. Estos phyla son congruentes con
la información reportada en otros estudios donde se analiza la composición de las
comunidades bacterianas en suelos (Janssen , 2006).
El phylum Proteobacteria presentó la mayor abundancia relativa en los seis ambientes
edáficos (Fig. 11 ); este patrón de dominancia se presenta en la mayoría de los
ecosistemas analizados, en los cuales se ha estudiado la diversidad bacteriana
empleando como marcador biológico al gen 16S ribosomal (Bernhard et al., 2005).
En una revisión realizada por Spain (2009), se evaluaron los diferentes porcentajes de
abundancia del phylum Proteobacteria en diferentes tipos de suelo, siendo en general
entre un 25% y 50%. En el presente estudio se reportaron valores de 68.41%, 72.24% y
60.69% para las muestras SDet1 , SDet2 y SDet3 respectivamente . Las Proteobacterias
54
CAPÍTULO IV
son un enorme grupo que comprenden una gran diversidad a nivel morfológico, fisiológico
y metabólico (Kersters et al. , 2006), por lo cual presentan gran capacidad de adaptación a
las condiciones que se establecen en los diferentes ambientes; y han sido reportadas
como el grupo más abundante en suelos contaminados con metales pesados (Sheik et al. ,
2012; Vishnivetskaya et al. , 2011) y petróleo (Yang et al., 2012) entre otros.
Las cuatro clases Alfa-, Beta-, Gamma- y Deltaproteobacteria, fueron encontradas en las
seis muestras de suelo (Fig. 12). Entre las Proteobacterias, las Alfaproteobacterias se
observan usualmente como la clase dominante (Spain et al. , 2009), esos reportes difieren
con los resultados obtenidos en el presente estudio, en el cual las clases más abundantes
de Proteobacteria fueron Gammaproteobacteria en las muestras S3 y SDet1, y
Betaproteobacteria en SDet2 y SDet3. La clase Actinobacteria fue la más abundante en
las muestras de suelo S1 y S2.
El phylum Actinobacteria estuvo presente en las muestras S1 y S2 con 27.56% y 17.6%
respectivamente. En las muestras S1 , SDet1 y SDet3 presentó valores entre 2% y 3.5%.
Las actinobacterias han sido descritas como un grupo capaz de degradar una amplia
cantidad de compuestos presentes en el suelo , así como un amplio rango de compuestos
xénobióticos (Jarerat y Tokiwa 2001; Schrijver y Mot, 1999)
El grupo Acidobacteria se encontró en los ambientes S1 , S2 y S3 , con abundancias que
varían entre el 11 % y 27%, mientras que en las muestras contaminadas estos valores
disminuyen hasta 6.28% en SDet1 y 3.62% en SDet3.
La muestra SDet2 presentó los niveles más altos de Bacteroidetes (17.23%); este phylum
junto con Proteobacteria (72.2%) representan el 90% de los phyla totales de esta muestra.
Los phyla Acidobacteria y Actinobacteria no fueron detectados en SDet2 .
En el ambiente contaminado con detergentes SDet3 se encontró el mayor número de
phyla de todas las muestras analizadas, con un total de 28 y presentó los phyla WS3
(1 .18%) y Deferribacteres (1.58% ), los cuales no fueron encontrados en otro ambiente.
BRC1 con una proporción del 1.88% solo fue encontrado en la muestra SDet1.
En cuanto a especies, Acidobacterium sp fue la más abundante en las tres muestras sin
detergentes, con abundancias relativas de 26.3%, 10.8% y 16.7% en S1 , S2 y S3
respectivamente. En los ambientes contaminados SDet1 y SDet3 las especies más
abundantes fueron Rhodomicrobium sp. con 13.5% y 7.29% respectivamente , mientras
que en SDet2 Hydrogenophaga sp. fueron las especies dominante con abundancias
relativas de 9.31% (Fig . 13).
55
CAPÍTULO IV
Ninguna especie del género Bacil/us fue reportada en los ambientes analizados, a pesar
de que dichas especies son consideradas bacterias típicas del suelo (Felske, 2004). En
condiciones estresantes los bacilos forman endoesporas, las cuales les confieren
tolerancia a diversos factores ambientales (Earl et al., 2008). Una probable explicación de
la ausencia de Bacillus en las muestras de suelo analizadas en el presente trabajo,
pudiera ser que el kit de extracción de ADN, tiene un sesgo para este tipo de bacterias, ya
que probablemente la etapa de lisis no es lo suficientemente astringente para lisar la
endoespora y la pared celular de las bacterias, por lo cual el ADN de estas especies no
pudo ser extraído .
Los miembros de la biosfera rara (microorganismos presentes en un porcentaje menor a 1
en el total de las secuencias) a nivel de especie representan el54.5% (S1), 66.6% (S2),
70% (S3), 70.2 (SDet1 ), 77.9% (SDet2) y 76.2%, repartidas en poco más de 300 especies
para cada una de las muestras (datos no presentados).
56
CAPÍTULO IV
100%
•Otros
90%
• Deferribacteres 80%
BRC1
70% • Nitrospirae
60% • Gemmatimonadetes
• Planctomycetes
50%
• Chloroflexi
40% • Firmicutes
• Verrucomicrobia
30%
• Bacteroidetes
20% • Acidobacteria
10% • Actinobacteria
• Proteobacteria
0% 51 52 53 5Det1 5Det2 5Det3
Figura 11. Abundancias relativas de los principales phyla bacterianos en las muestras de suelos
contaminados (SDet1 , SDet2, SDet3) y no contaminados (S1 , S2, S3) con detergentes.
57
CAPÍTULO IV
100% • Otros
• Verrucomicrobiae
90% • Sphingobacteria
• Opitutae 80%
• Caldilineae
70% • Bacteroidia
• Holophagae
60% • Anaerolineae
• Flavobacteria
50% • Gemmatimonadetes
• Actinobacteria
40% • Clostridia
Cytophagia
30% • Acidobacteria
• Alphaproteobacteria
20% • Deltaproteobacteria
Betaproteobacteria
10% • Gammaproteobacteria
0% S1 S2 S3 SDet1 SDet2 SDet3
Figura 12. Abundancias relativas de las principales clases bacterianas en las muestras de suelos
contaminados (SDet1 , SDet2, SDet3) y no contaminados (S 1, S2, S3) con detergentes.
58
CAPÍTULO IV
•Otros
• Hydrogenophaga sp
• Acidobacterium sp
• Rhodomicrobium sp 70%
• Thiobacil/us sp
60%
• Levilinea sp
50%
• Patulibacter sp
40% • Hydrocarboniphaga sp
30% • Verrucomicrobium sp
• Cellvibrio sp
• Conexibacter sp
• Phenylobacterium falsum
51 52 53 5Det1 5Det2 5Det3
Figura 13. Abundancias relativas de las principales especies bacterianas en las muestras de
suelos contaminados (SDet1, SDet2, SDet3) y no contaminados (S1, 82, S3) con detergentes.
59
CAPÍTULO IV
Para estimar el solapamiento de secuencias entre las seis comunidades, se calculó el
índice de Jaccard , el cual determina la relación entre el número de OTUs compartidos y el
número total de OTUs en las muestras (Magurran , 1988). Este índice se basa en datos de
ausencia/presencia , sin considerar las abundancias específicas de cada especie.
El agrupamiento de las secuencias se presenta mediante un dendograma (Fig. 14), en el
cual, el eje vertical muestra los valores de disimilaridad del coeficiente de Jaccard;
mientras más bajo se encuentre el punto de unión entre dos muestras , más similares son
éstas. Así, las muestras SDet2 y SDet3 son las muestras más similares, lo cual puede ser
apreciado en el mapa de calor, en el cual las tonalidades de azul varían conforme al
índice de Jaccard; un color azul intenso corresponde a las muestras que presentan
taxonomía similar y un tono blanco indica que la taxonomía es totalmente diferente.
El grupo formado por la muestras S2 y S3 con una similitud del 28% se agrupa a su vez
con la muestra contaminada con detergentes SDet1 y sucesivamente con la muestra S1.
Los resultados obtenidos en el análisis de las secuencias mediante el índice de Jaccard,
se asemejan a los obtenidos en el análisis de los patrones de bandeo en la DGGE
mediante el coeficiente de Dice (Fig .8); En ambos casos las muestras SDet2 y SDet3
reportaron los valore's de disimilitud más bajos agrupándose en un solo ciado. Las
muestras de suelo no contaminadas se agrupan en un mismo ciado, sin embargo en el
análisis por el coeficiente de Dice las muestras S1, S2 y S3 no se agrupan con la muestra
SDet1.
60
CAPÍTULO IV
00 o 1
1
"C (Q ... o ni (,) (,) ni .., Cll
"C "C
..,. :S o :!: ·e ·¡¡; e
N o
o o '
5Det2
5Det3
51
5Det1
53
52
5Det2 5Det3 51 5Det1 53 52
Figura 14. Agrupamiento de las secuencias y mapa de calor (heatmap) de las muestras de suelos
contaminados (SDet1 , SDet2, SDet3) y no contaminados (S1, S2, S3) con detergentes utilizando el
índice de Jaccard. Los colores intensos indican similitud y los colores claros diferencia.
61
CAPÍTULO IV
4.3.3 ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES (PCA)
Estudios previos indican que los factores como la salinidad (Hollister et al. , 2010), el pH
(Rousk et al. , 2010), el tamaño de partículas (Chenu y Stotzky, 2002) y el tipo de sustrato
(Jeffries et al. , 2011) influyen significativamente en la estructura de las comunidades
bacterianas. Con base en estos antecedentes, en el presente trabajo se realizó un análisis
de componentes principales para identificar las relaciones existentes entre las
propiedades del suelo y la abundancia relativa de los grupos bacterianos.
En el análisis se puede apreciar que las componentes principales forman tres grupos; el
primero formado por sodio, salinidad , conductividad eléctrica, fósforo y humedad; el
segundo por la capacidad de intercambio catiónico, nitrógeno y porcentaje de arcillas; el
tercero agrupa el porcentaje de limos, porcentaje de arena y pH (Fig. 15).
Se puede observar que el sodio, la salinidad, el fósforo y el nitrógeno ejercen una
correlación positiva en las abundancias relativas de los phyla bacterianos Proteobacteria,
Bacteroidetes y Verrucomicrobia , es decir, estos phyla aumentan en sus abundancias
relativas cuando los valores de éstos parámetros se incrementan.
La salinidad ha sido reportada en algunas ocasiones como el mayor determinante
ambiental de una comunidad microbiana en diferentes ambientes (Lozupone et al., 2007)
Los phyla Actinobacteria y Acidobacteria disminuyen sus niveles al aumentar los valores
de sodio y salinidad, comportamiento que ya se ha reportado en otros estudios (Hollister
et al. , 201 O).
El pH afecta únicamente y de manera negativa la composición de los phyla Firmicutes y
Chloroflexi en los suelos analizados, por lo cual se concluye que el pH en estos ambientes
no es un factor significativo en la composición de las comunidades bacterianas, al menos
sobre la mayoría de los phyla. Estos datos difieren de los resultados reportados por otros
autores (Lauber et al., 2009; Necke et al. , 2011 ), que han señalado que el pH es el factor
que más influye en la diversidad bacteriana de los suelos.
62
N G) ..... w
80
40
o
S1
•
o
Actin X
Acido X
S3
•
40
SDet3
• Eje 1
80
CAPÍTULO IV
SDet1
•
SDet2
•
Figura 15. Análisis de componentes principales que influyen sobre las comunidades bacterianas
presentes en suelos sin (S1, S2, S3) y con (SDet1, SDet2 y SDet3) detergentes. El análisis está
basado en las abundancias relativas de los principales phyla bacterianos y en los parámetros
fisicoquímicos: Sodio (Na), Salinidad (Salin), Conductividad eléctrica (CE) , Fósforo (P) , Humedad,
Capacidad de Intercambio Cationico (CIC), Nitrógeno (N), pH , Arcilla , Arena y Limos.
63
CAPÍTULO IV
4.4 BIBLIOGRAFÍA
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CAPÍTULO IV
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65
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CAPÍTULO V
CAPITULO V
Discusión y conclusiones generales.
5.1 DISCUSIÓN GENERAL
Las actividades microbianas son importantes para los ciclos biogeoquímicos que tienen
lugar en el suelo. Por tanto, la diversidad de los microorganismos es considerada crucial
para la función del suelo, lo que hace necesario estudiar la variabilidad espacial y
temporal de la estructura y función de las comunidades microbianas en respuesta a
factores externos, tales como los factores climáticos o la introducción de contaminantes .
En los últimos años, la aplicación de técnicas independientes de cultivo para el estudio de
la biología de los suelos ha supuesto un notable avance en el conocimiento acerca de la
ecología microbiana de los mismos. El uso de estas técnicas puede contribuir de forma
decisiva al conocimiento de los grupos microorganismos que juegan un papel importante
en el proceso de degradación de contaminantes xenobióticos. De igual modo, pueden ser
útiles en la identificación de aquellos otros que son afectados por la presencia del
contaminante. Debido a ello, este trabajo consideró esencial el empleo de un método
independiente de cultivo para estudiar el efecto de los detergentes sobre la biodiversidad
del suelo, usando para ello las metodologías de DGGE y pirosecuenciación del gen 16S
ribosomal bacteriano.
El análisis por DGGE demostró en primera instancia la alta diversidad microbiana
existente en la muestras de suelo contaminadas y no contaminadas con detergentes; así
mismo proporciono una visión general acerca de la similitud existente entre las muestras,
mediante un dendograma basado en el índice de similitud de Dice obtenido al analizar los
perfiles de bandeo de la región variable V3 del gen 16S ribosomal bacteriano, en el cual
las muestras no contaminadas con detergentes se agruparon en un mismo subclado y las
muestras contaminadas se agruparon en dos subclados distintos, siendo la muestra
SDet1 la que se aparta del resto de las muestras con las que tiene una similitud del 54%
en el posicionamiento de sus bandas.
Los análisis realizados con base en las secuencias del gen ARNr 16S por medio de
pirosecuenciación , proporcionaron una visión detallada de cada uno de los ambientes. Al
realizar el agrupamiento de las secuencias mediante un dendograma basado en el índice
de Jaccard, las secuencias se agruparon de manera similar al dendograma observado
67
CAPÍTULO V
con base en la DGGE, con la diferencia que la muestra contaminada SDet1 se agrupó
dentro del ciado de las tres muestras sin contaminante.
Los altos porcentajes en las abundancias relativas que el phylum Proteobacteria presentó
en los ambientes contaminados con detergentes, puede deberse a que este phylum es
uno de los que tiene mayor diversidad génica y en consecuencia presenta gran
adaptabilidad a casi todos los ambientes terrestres (Gupta, 2000), inclusive en aquellos
contaminados. Se pudo obseNar una notable disminución en el porcentaje de las
Acidobacterias en las muestras contaminadas; esto se debe probablemente al aumento
en los niveles de pH que los detergentes causan. Otros phyla que se presentaron en los
seis ambientes son Actinobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia , Firmicutes y
Chloroflexi. Estos phyla han sido reportados en un estudio donde se evaluó la
biodegradación del sulfonato de alquilbenceno lineal (LAS) en un reactor, en el cual
géneros pertenecientes a los phyla Proteobacteria fueron los encargados de la
degradación de LAS (O u arte et a/. , 201 0).
Algunos autores (Hartmann 1996) sugieren que las bacterias Gram positivas son más
susceptibles que las bacterias Gram negativas a algunos ingredientes de los detergentes,
posiblemente debido a que la membrana externa que protege a estos microorganismos
les permite resistir concentraciones más elevadas de estos compuestos. Sin embargo,
recientemente Elsgaard y colaboradores (2001) han demostrado que ambos grupos de
bacterias (Gram positivas y Gram negativas) son susceptibles a los compuestos de los
detergentes, en especial a los sulfonatos de alquilbenceno lineales. En este contexto, el
presente estudio demuestra que tanto las bacterias Gram positivas como Gram negativas
interaccionan cuando se ven afectadas por la presencia de los detergentes en el suelo, y
sugiere que probablemente sean las bacterias Gram positivas las más sensibles al
contaminante.
En cuanto a los análisis edáficos , a pesar de que no se pueden realizar obseNaciones
que ocurran de manera general cuando los suelos están expuestos a descargas de aguas
con detergentes, existen algunas características que se cumplen en dos o más casos , por
lo cual se han elucidado algunos de los cambios que existen cuando los suelos sufren
contaminaciones por detergentes. Las diferencias obseNadas entre estos parámetros
pueden atribuirse a los distintos tiempos en que los suelos han estado expuestos ~1
contaminante , o bien a los diferentes tipos de detergentes que han sido desechados en
los suelos.
68
CAPÍTULO V
El análisis de componentes principales permitió identificar que el sodio y la salinidad son
los dos factores que ejercen mayor influencia sobre las abundancias relativas de las
bacterias de los suelos analizados.
El catión sodio (Na+) participa en la regulación del pH citoplasmático, así como también
en la homeostasis de las células (Booth , 1985). Algunas bacterias requieren niveles altos
de Na+, mientras que otras mueren al incrementarse sus valores.
Estudios previos han reportado que la concentración de sodio y la salinidad del suelo, son
factores que provocan cambios en la diversidad·, abundancia relativa , composición y
funciones de las comunidades bacterianas en ambientes edáficos (Hollister et al. , 201 O;
lbekwe et al., 201 O).
Estos resultados constituyen el primer estudio de análisis microbianos y fisicoquímicos
realizados en suelos contaminados con detergentes a nivel local.
69
CAPÍTULO V
5.2 CONCLUSIONES GENERALES
• Los análisis edáficos mostraron que algunos parámetros fisicoquímicos como el
sodio, salinidad, capacidad de intercambio catiónico, conductividad eléctrica, contenido de
humedad y pH (KCI) se incrementan cuando los suelos sufren contaminación por
detergentes. Así mismo la clase textura! de los suelos contaminados es más fina que la de
los suelos que no presentan contaminación por detergentes.
• El dendograma obtenido con base en la DGGE y el coeficiente de Dice agrupó los
perfiles de bandeo de cada uno de los suelos en subclados distintos, en los cuales las
muestras contaminadas con detergentes se separan de los suelos no contaminados.
Estos resultados sugieren que los agrupamientos obseNados están altamente
influenciados por la presencia de los detergentes en los ambientes edáficos.
El análisis de las comunidades bacterianas por DGGE demostró ser una herramienta
eficaz para detectar los cambios en la estructura de las comunidades microbianas,
proporcionando puntos de partida para estudiar la diversidad presente en las muestras de
suelo.
• Con el análisis de las secuencias obtenidas a partir de la secuenciación de un
fragmento del gen 168 ribosomal se demostró la elevada diversidad bacteriana presente
en las muestras de suelo contam inadas (8Det1, 8Det2 y 8Det3), con respecto a los
ambientes sin contaminar (81 , 82 y 83).
Los phyla representativos de los ambientes edáficos fueron Proteobactería, Acídobactería ,
Actínobactería, Bacteroídetes, Verrucomícrobía, Fírmícutes y Chloroflexí. Estos phyla
representan entre 90% y 95% de la abundancia total de cada uno de los seis ambientes
edáficos. Las especie más representativas en los ambientes contaminados fueron
Rhodomícrobíum sp. , e Hydrogenophaga sp .
• El análisis de componentes principales demostró la correlación existente entre los
parámetros fisicoquímicos y las abundancias relativas de los phyla bacterianos, siendo el
sodio y la salinidad los factores que más influyen en la composición de la comunidad .
70
CAPÍTULO V
5.3 PERSPECTIVAS
Se propone complementar éste análisis con estudios de biotransformación e impacto de
detergentes mediante el empleo de microcosmos edáficos . Estos ensayos permitirán
complementar el comportam iento diferencial de los grupos bacterianos frente a la
presencia del contam inante bajo condiciones controladas.
Otra perspectiva a futuro seria la construcción de una biblioteca metagenómica a partir de
un pool genético de las muestras contaminadas , mediante las cuales se podrían obtener
productos génicos de interés biotecnológico, como por ejemplo, enzimas estables a pH
alcalino.
71
CAPÍTULO V
5.4. BIBLIOGRAFÍA
Booth I.R. 1985. Regulation of cytoplasmic pH in bacteria. Microbio!. Rev . 49(4), 359.
Duarte G., Soares A. , Seldin L., Arauja W. , Van Elsas J. 2001 . Analyses of bacteria! community structure in sulfurous -oil-containing soils and detection of species carrying dibenzothiophene desulfurization (dsz) genes. Appl. Enviran. Microbio!. 67(3): 1052-1062.
Elsgaard L. , Petersen S.O., Debosz K., Kristiansen 1.8. 2001 . Effects of linear alkylbenzene sulfonates (LAS) on soil microbiology. Tenside Surfactants Detergents. 38:94-97.
Gupta R. S. 2006. The phylogeny of proteobacteria: relationships to other eubacterial phyla and eukaryotes. FEMS Microbio! Rev 24(4), 367-402.
Hartmann L. 1996. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 219.
Hollister E.B., Engledow A.S. , Hammett A.J., Provin T.L. , Wilkinson H.H., Gentry T.J. 2010. Shifts in microbial community structure along an ecological gradient of hypersaline soils and sediments. ISME J. 4: 829-838.
lbekwe A.M. , Pass J. A. , Grattan S. R. , Grieve C. M., Suarez D. 2010. Bacteria! diversity in cucumber (Cucumis sativus) rhizosphere in response to salinity, soil pH, and boron. J. Soil. Biol. Biochem. 42(4), 567-575.
72
-....¡ (.V
ÍNDICE
Chao1
Coeficiente de similitud de Dice
Eveness
Similitud de Jaccard
Riqueza
FORMULA
ni -S +-Sc hao1 - obs 2n
2
2 Nab Sv = (Na+ Nb)
H' E= H'max
2 Nab Sj = N a + N b - N ab
NOMENCLATURA
S obs + = Número de especies/OTUs totales observados n1 = Número de especies/OTUs observados una vez (singletons) n2 = Número especies /OTus observados dos veces (doubletons)
Nab = Número de especies/OTUs presentes en ambas muestras Na = Número de especies/OTUs presentes en la muestra A Nb = Número de especies/OTUs presentes en la muestra B
H' = Número derivado del indice de Shannon H 'max =Valor máximo del índice se Shannon
Nab = Número de especies/OTUs presentes en ambas muestras Na = Número de especies/OTUs presentes en la muestra A Nb = Número de especies/OTUs presentes en la muestra B
S = Número de especies/OTUs presentes en la muestra
INTERPRETACIÓN
• Calcula la riqueza total de especies/OTUs basándose en el número de singletons y doubletons de la muestra.
• Establece patrones de similitud entre las población es por medio de conteos directos de las frecuencias de las bandas generadas por los marcadores moleculares.
• Indica la equidad en la cual las especies/OTUs están representadas en una muestra.
• Establece la similitud/disimilitud de dos comunidades. Este índice se basa en la relación de presenciaausencia entre el número de especies/OTUs comunes entre ambas muestras.
• Éste índice establece el número de especies/OTUs presentes en una muestra sin tomar en cuenta las abundancias relativas.
)> ::::J (1)
>< o ..... _, ::::J a. e:;· (1) 1/1 a. (1)
c.. e::· (1) ., 1/1 a: Q) a. ., (1)
ji) ::::!: < Q)
e ::::!: Ñ. Q) a. o 1/1 , Q) ., Q)
o 1/1 Q) ::::J ~ ¡¡;· ¡¡;· a. (1)
a. ~· ., 1/1 a: Q) a.
)> z m >< o en
)> 11 z .. m
X o (/)
-..,¡ +>-
ÍNDICE
Shannon
Simpson
FORMULA
H' = - L (Pi) Ln(Pi)
D = L I= tni (n¡ -1) N (N -1)
NOMENCLATURA INTERPRETACIÓN
Pi= Probabilidad de aparición del iesimo grupo • Este índice calcula la probabilidad en la población.
S= Número de especies/OTUs N = Total de organismos presentes
n =Número de ejemplares por especie/OTUs
de predecir la especie de un individuo tomado al azar de la comunidad .
• Calcula la diversidad de una muestra tomando en cuenta tanto la abundancia como la riqueza de
especies/OTUs.
)> 1r ~ ::S
C1) m >< X o ll ~ ..... -o
o ::S ~ ::S r::::: DI o c;: ::S -
ANEXOS
Anexo 2. Matrices generadas en el análisis de componentes principales
PCA S1 - 3 . 24971 1.13425 0 . 81990 - 0 . 16640 - 0 . 21292 S2 - 0 . 84952 0 . 23053 - 1 . 92893 - 0 . 61032 0 . 14033 S3 - 0 . 61738 - 1 . 01437 l. 00446 0 . 01952 0.44390 SOetl l. 91708 l. 59264 -0 . 13128 l. 06588 o. 07205 SOet2 2.93491 - 0 . 01975 0 . 62845 - 1 . 02021 - 0 . 16181 SOet3 - 0 . 13537 - 1 . 92329 -0 . 39260 o. 71153 - 0 . 28155
PCA Pro te 0 . 51571 - 0 . 05634 0 . 01822 0 . 03656 - 0 . 00266 Actin - l. 84411 0.61638 - 0 . 17067 - 0.18294 - 0 . 04143 Acido -l. 49448 0.15474 0 . 22238 - 0 . 02438 0.03412 Bacte 0.86956 - 0.24016 0 . 10623 - 0 . 21208 0 . 00335 Chlor - 0 . 64842 -0.57688 -0 . 54262 0.08705 0 . 00614 Firmi - 0 . 38535 - 0 . 19940 0 . 22040 0.06416 - 0.00708 Verru 0.72960 0.42971 - 0 . 00023 0 . 09989 0.00442
********* PRINCIPAL COMPONENTS ANALYSIS -- Muestras in Phyla PCA
space
Cross- products matrix contains CORRELATION COEFFICIENTS among Phyla
CROSS-PROOUCTS MATRIX
Pro te 0 . 10000+01 Actin - 0.92760+00 0.10000+01 Acido -o. 92020+00 0 . 78770+00 0 . 10000+01 Bacte 0 . 70560+00 - 0.70490+00 -0 . 68530+00 0.10000+01 Chlor - 0.30140+00 0.12210+00 0 . 90030-01 - 0 . 29910+00 Firmi -0.35180+00 0 . 93040- 01 0.58660+00 - 0.26810+00 Verru 0 . 59200+00 - 0 . 32260+00 - 0 . 53690+00 0 . 15070+00
VARIANCE EXTRACTEO , FIRST 7 AXES
1 2 3 4 S 6 7
3 . 995 l. 434 0.995 0.514 o. 062 0 . 000 0 . 000
57.073 20 . 487 14 . 210
7 . 342 0 . 887 0.000 0.000
FIRST 6 EIGENVECTORS
57 . 073 77.560 91 . 770 99 . 113
100 . 000 100 . 000 100 . 000
0 . 10000+01 o .11590+00
-0 . 64050+00
2 . 593 l. 593 l. 093 0.760 0.510 0.310 0 . 143
0 . 00000 0 . 00000 0 . 00000 0 . 00000 0.00000 0 . 00000
0 . 00000 0 . 00000 0.00000 0 . 00000 0 . 00000 0 . 00000 0 . 00000
**********
0 . 10000+01 - 0 . 63620+00
--------------------------------------------------------------------------------Pro te 0 . 4816 - 0.1466 0 . 0684 0 . 2654 - 0.1599 0 . 5554 Actin - 0 . 4148 0 . 3863 - 0 . 1542 - 0 . 3199 - 0.5993 0.0009 Acido - 0 . 4657 o. 1343 0 . 2783 -0.0590 0 . 6837 0.1818 Bacte 0.3797 - 0.2922 0 . 1863 - 0 . 7199 0 . 0940 - 0 . 3567 Chlor - 0 . 2015 - 0.4995 - 0.6773 0 . 2103 0 . 1227 - 0 . 2860 Firmi - 0.2755 - o. 3972 0.6330 0.3566 -0.3256 -o. 3411 Verru 0.3441 0.5645 - 0 . 0004 0.3662 0 . 1340 - 0 . 5773 --------------------------------------------------------------------------------
6
7
0 . 10000+01
75
ANEXOS
COORDINATE5 (5CORE5) OF Muestras
---------------------------------------------------------------------------------------------1 51 - 3 . 2497 l. 134 3 0 . 8199 - 0 . 1664 - 0 . 2129 0 . 0000 2 52 - 0 . 8495 0 . 2305 -l. 9289 - 0 . 6103 0 . 1403 0 . 0000 3 53 - 0 . 6174 - 1 . 0144 l. 004 5 0 . 0195 0 . 4439 0 . 0000 4 5Det1 1.9171 1 . 5 92 6 - 0 .1 313 l. 0659 o. 0720 0 . 0000 5 5Det2 2 . 9349 - 0 . 0198 0 . 6285 - 1 . 0202 - 0 . 1618 0 . 0000 6 5Det3 - 0 . 1354 -1. 9233 -o. 3926 o. 7115 - 0 . 2815 0 . 0000
********************************** End of PCA **********************************
76
