Cinética de degradación y mineralización del colorante Rojo ...
CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA...
Transcript of CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA...
CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Articulación CEBI_E3Materia de Articulación CEBI_E3Cultivos Celulares
Docente a cargo: Laura ALCHÉ
CEBI_E3_4 : Aplicaciones industriales de los cultivos celulares
ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD
1.- Viabilidad: alteración de permeabilidad de membrana y/o perturbación de las vía metabólicas se correlacionan con la proliferación o supervivencia.
2.- Supervivencia: la retención de la capacidad de división.
3.- Metabolismo: basados en la microtitulación, miden 3.- Metabolismo: basados en la microtitulación, miden respuesta metabólica (enzimas, RNA, DNA).
4.- Transformación: sobrevida, en un estado alterado.
5.- Irritabilidad: una respuesta análoga a la inflamación, alergia, irritación in vivo, difícil de cuantificar in vitro (citoquinas en cultivos organotípicos).
ENSAYOS DE VIABILIDAD
- Dependen de la integridad de la membranaintegridad de la membrana, medida por la captación de un colorante para el cual la célula es normalmente impermeable (azul tripán, eritrocina).eritrocina).
- Dependen de la liberación de un coloranteliberación de un colorante, que normalmente es captado y retenido por células viables (rojo neutro, diacetil-fluoresceína).
ENSAYOS DE MICROTITULACIÓN
ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN
- Son útiles para determinar el efecto de compuestos sobre la proliferación celular, con compuestos sobre la proliferación celular, con una curva de crecimiento completa.
- Para tomar una muestra pequeña, el tiempo debe ser elegido dentro de la fase log, preferentemente en la mitad, de las células control.
APLICACIONES INDUSTRIALES DE LOS CULTIVOS CELULARES DE LOS CULTIVOS CELULARES
ESCALADO EN SUSPENSIÓN
ESCALADO EN SUSPENSIÓN EN CULTIVO CONTINUO
PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN
Anclaje dependiente
Vial extraído del banco de trabajo, 1-5 x 105cells/mL
Frasco tipo T (25 cm2-225 cm2). 105 cels/cm2
Botellas roller (850 cm2-1600 cm2). 2 x 105 cels/cm2
Cell factories (600 cm2-40000 cm2). 2 x 105 cels/cm2
Microcarriers (3-15 gr/mL). 2 x 105 cels/cm2
cm2). 2 x 105 cels/cm2x 105 cels/cm2
Escalado en rollers (100000 cm2 por lote). 2 x 105 cels/cm2
Fibra hueca (300-7500 cm2 por lote). 3 x 105
cels/cm2
Cell cube (340.000 cm2
por lote). 2 x 105
cels/cm2
ESCALADO EN SUSPENSIÓN EN CULTIVO CONTINUO: FIBRA HUECA
PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN – Fibra hueca
Batería de fibras hueca y porosa en su interior, colocadas en paralelo. Las células se concentran y aumenta la densidad celular, en los intersticios de las fibras huecas. El medio de cultivo fluye en contrasentido desde el exterior del reactor o a través de una carcasa.
PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN – Fibra hueca
Ventajas: Se puede llegar a muy altas densidades. El producto se separa de las células.
Desventajas: Limitaciones de transferencia de oxígeno y nutrientes, poco control del ambiente.
ESCALADO EN MONOCAPA
PLATAFORMAS DE PRODUCCION – Cell cube system
Consiste en:� Un oxigenador. � Una bomba de circulación.� Una bomba de flujo de medio� Módulos (1 a 4) con una superficie de 85.000 cm2 cada uno. � Controlador � Electrodos de O , electrodos de pH, sensores de O , sistemas de flujo de gases. � Electrodos de O2, electrodos de pH, sensores de O2, sistemas de flujo de gases.
PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN – Microcarries
Permiten:� Alta área de superficie de cultivo por unidad de volumen (30 cm2 por mL con 4 mg de microcarriers). � Cultivar células en sistema compacto, importante cuando se trabaja con patógenos (fiebre amarilla, rabia, etc).� Tiene todas las ventajas de un sistema en suspensión. � 1 Lt de microcarriers puede equivaler a 50 rollers. Disminución de mano de obra. � Es usualmente utilizado para producción de virus (herpes, polio, rabia, influenza, FMD, etc). � Se pueden controlar los parámetros del cultivo simplemente sacando una muestra (observación microscópica, mediciones de pH, 02, etc).
PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN – Microcarries
SE USAN EN UNA CONCENTRACIÓN DE 0.5-5 mg/mL FINAL. SE PUEDE ALCANZAR UNA DENSIDAD CELULAR DE 5-10 x 106 CELLS/cm2
1 mg de microcarries = 6 cm2, un reactor de 1000 Lts puede tener una superficie de alrededor de 2 millones cm2 de superficie. Pueden usarse en frascos spinner o frascos con agitación, en botellas rollers.
Desventajas:
� Difícil escalado� En algunos casos las células no se pegan bien a los carriers. Hay que probar diferentes superficies y optimizar. � Daño causado por remolinos microscópicos� Son más sensibles que los cultivos en suspensión.
Requerimientos: � Superficie adecuada para el pegado de las células.
PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN – Microcarries
� La densidad de microcarriers debe ser mayor que la del medio de cultivo. � Propiedades ópticas adecuadas para poder observarlas al microscopio. � No tóxicos� No rígidos.
COMPARACIÓN DE DIFERENTES METODOS DE CULTIVO
Botellas roller área de superficie 490 cm2/ botella
Microcarriers área de superficiedensidad normalSuperficie área/l
6000 cm2/ g peso seco5 g/l 30000 cm2Superficie área/l
Equivalente en botellas roller
30000 cm60 roller
Fibra hueca Tamaño Superficie área fibra huecaEquivalente en botellas roller
40 x 40 x 4,5 cm2
9300 cm2
19 roller
SCALING UP – Anclaje dependiente, comparación de superficies
Area de
crec (cm2)
maximo
volumen (mL) N° cells/cm2 N° cells tot
Volumen de
trabajo (mL)
Volumen/
superficie
Frascos T75 75 60 100000 7,50E+06 22,5 0,30
Frascos T225 225 370 100000 2,25E+07 67,5 0,30Frascos T225 225 370 100000 2,25E+07 67,5 0,30
Rollers 800-1700 255-525 100000 1,70E+08 100-350 0,21
Cellstacks 636-25440 1 a 40 pisos 500000 1,27E+10 10000 0,39
CellCubes 85000-340000 35000 500000 1,70E+11 35000 0,10
Microcarriers 2000000 1000 1000000 2,00E+12 1000000 0,50
Fibra hueca 25000 150 1000000 2,50E+10 60 0,002
MEDIOS DE CULTIVO – Libres de suero
� ¿Por qué eliminar el suero animal?
(+) Simplifica formulación del medio de cultivo
(+) Inhibidores de proteasas presentes en el suero(+) Inhibidores de proteasas presentes en el suero
(+) Protección contra daño mecánico.
(-) Incremento de la carga proteica
(-) Composición no definida/ variable/ estandarización
(-) Riesgo de contaminación
(-) Disponibilidad/ Costo
(+) Facilidad de purificación
(+) Composición definida
MEDIOS DE CULTIVO – Libres de suero
(+) Aspectos regulatorios y de seguridad
(-) Crecimiento celular
(-) Formulación del medio de cultivo caso a caso
(-) Estabilidad del producto de interés
(-) Disponibilidad/ Costo
Suplementos utilizados para sustituir las funciones esenciales del suero:
� Hidrolizados proteicos, BSA, extractos: Composición química no definida,
origen y fuente poco claro, componente de origen animal
� Compuestos utilizados en la formulación de medios libres de suero:
MEDIOS DE CULTIVO – Libres de suero
� Insulina, Transferrina, Selenio,
Etanolamina, lípidos.
CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES EN PROCESOS DE PRODUCCIÓN
- Procesos en los cuales el objetivo es la producción de producción de una sustanciauna sustancia, generalmente una molécula bioactiva y también virus, y en los cuales las células cumplen la también virus, y en los cuales las células cumplen la función de medio de producción;
- Procesos en los cuales el objetivo es la producción de producción de las propias célulaslas propias células, generalmente organizadas en tejidos u órganos (desarrollo de la ingeniería de tejidos y cultivo de stem cells).
¿ Por qué células eucariotas superiores?
� Modificaciones post- traduccionales: glicosilación, metilación, carboxilación, fosforilación, enlaces disulfuro.
CÉLULAS DE MAMÍFERO – Conceptos básicos
carboxilación, fosforilación, enlaces disulfuro.
� Estructura 3D compleja
� Secreción al medio de cultivo.
�Principales Ventajas:
- Con respecto al cultivo de células primarias y modelos animales: REPRODUCIBILIDAD.
CÉLULAS DE MAMÍFERO – Conceptos básicos
REPRODUCIBILIDAD. - Con respecto a sistemas microbianos: Genéticamente capaces de secretar proteínas correctamente ensambladas y con las modificaciones post-traduccionales correctas, por ej. fidelidad en los patrones de glicosilación: secreción, degradación y actividad biológica.
Las más usadas por la industria:
- CHO K1: Aisladas de un ovario de hamster, células epiteliales que se pueden adaptar a crecimiento en suspensión. Proteínas recombinantes
- BHK-21: Células de hamster bebé, fibroblastos que pueden ser
CÉLULAS DE MAMÍFERO – Conceptos básicos
- BHK-21: Células de hamster bebé, fibroblastos que pueden ser adaptadas a crecer en suspensión. Utilizada comúnmente para propagación de virus.
- VERO: Aisladas de riñón de mono africano, fibroblastos. Para propagación de virus y producción de vacunas.
- NSO: Células de mieloma de ratón utilizadas para la producción de anticuerpos monoclonales.
Células en suspensión vs Células anclaje dependiente
Suspensión Anclaje dependiente
Facilidad de escalado Fácil Difícil
CÉLULAS DE MAMÍFERO – Conceptos básicos
Necesidad de adaptar No Sí
Características de la original Poca mayor
Optimización de reactor y medio de cultivo
Sí Sí, más crítico
1.- Anticuerpos monoclonales
2.- Fármacos naturales
PRODUCTOS DE CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES
3.- Fármacos recombinantes
4.- Hormonas
5.- Vacunas virales
Productos que se obtienen:
� Anticuerpos monoclonales: anti TNF, anti cáncer, etc.
� Proteinas recombinantes: insulina, EPO, interferón beta, G-CSF,
CÉLULAS DE MAMÍFERO – Conceptos básicos
� Proteinas recombinantes: insulina, EPO, interferón beta, G-CSF, interferón alfa, hormona de crecimiento humana, etc.
� Vacunas tradicionales: Aftosa, diarrea viral bovina, rabia, etc.
� Vacunas de nueva generación: Vivas delecionadas, recombinantes, A DNA. Ejemplos: vacuna ADN contra salmones, Vacuna recombinante contra E2 del virus de la fiebre porcina, Vacuna ADN terapéutica cáncer canino.
PRODUCTOS RECOMBINANTES COMO TERAPÉUTICOS HUMANOS
CUIDADOS
1.- Que no desencadenen respuesta inmune;1.- Que no desencadenen respuesta inmune;
2.- Seleccionar el tipo de célula en el cual se va a expresar el gen;
3.- Monitorear cuáles son las modificaciones post-transcripcionales y/o post-traduccionales que pueden condicionar su actividad biológica o su antigenicidad.
Producción de virusProducción de virus
Obtención de stocks de virus para purificación de partículas virales o subcomponentes:
• Producción de vacunas
Virus vivo
PRINCIPALES APLICACIONES DEL USO DE CULTIVOS CELULARES EN
VIROLOGÍA
Virus vivo
Virus inactivado
Virus recombinante
Subunidades
• Producción de antígenos virales para diagnóstico
• Producción de vectores virales
• Producción de virus entomopatógenos para el control de plagas agrícolas
Cuando el objetivo es la producción de las producción de las producción de las producción de las propias células…propias células…
CULTIVO DE CÉLULAS TRONCALES HEMATOPOYÉTICAS O STEM CELLS
STEM CELLS DE EMBRIÓN: las de ratón han sido usadas in extenso para estudiar diferenciación, porque desarrollan una variedad de diferentes tipos celulares (músculo, hueso, nervios).
STEM CELLS MULTIPOTENCIALES DE ADULTO: se aíslan de médula ósea, hígado, cerebro, músculo y cordón umbilical.