CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA...

Clase 3: Balance de Flujos Metabólicos

Prof: Guillermo R. Castro

Lab de Nanobiomateriales – CINDEFI

UNLP – CONICET, La Plata

Materia de Articulación CEBI - E4b

Ingeniería Metabólica

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA

INDUSTRIAL . FCEyN-INTI

Como caracterizar un flujo metabolico?

Sink fluxes

Source fluxes

Metabolite Pool

Guillermo R. Castro

Flujo metabólico (def.)

El flujo metabólico se define como la velocidad a

la que un sustrato se convierte en un producto

mediante reacciones y rutas metabólicas.

Sustrato –> Metabolito Intermedio –> Producto

4

Vias en E. coli

(A) This version of the overview shows all interconnections between occurren-ces of the same metabolite to communicate the complexity of the interconnections in the metabolic network.

Ouzonis, Karp, Genome Res. 10, 568 (2000)

5

Ouzonis, Karp, Genome Res. 10, 568 (2000)

(B) In this version many of the meta-bolite interconnec-tions have been removed to simplify the diagram; those reaction steps for which an enzyme that catalyzes the reaction is known to have a physiologi-cally relevant acti-vator or inhibitor are highlighted.

Vias en E. coli

7

Vías bifurcadas

8

Metabolic Networks

Network Reconstruction

Genome Annotation

Biochemistry Cell

Physiology Inferred Reactions

Metabolic Network Analytical Methods

9

Probs. de composición de biomasa Varia de acuerdo a diferentes organismos

Depende del medio de crecimiento y el medio ambiente

Depende de la velocidad de crecimiento

La biomasa optima no cambia demasiado con cambios en la

composición de macromoléculas

relacionadas

La biomasa optima cambia con

cambios relativos en la

composición de las

macromoléculas mas

relevantes

10

El numero de reacciones (744) y el numero de

enzimas (607) es diferente ...OOOOOpssss!!

WHY??

I. No existe un mapeo de uno a uno entre enzimas y

reacciones!!

II. Algunas enzimas catalizan reacciones multiples y

otras reacciones son catalizadas por multiples

enzimas.

III. En algunos casos las enzimas NO han sido

identificadas Ouzonis, Karp, Genome Res. 10, 568 (2000)

Caso: E. coli

Para un desarrollo exitoso de la ingeniería

metabólica es importante el uso de:

los balances,

la aplicación de técnicas de Ing. genética,

la genética clásica,

la biología celular y

la fisiología del cultivo

Guillermo R. Castro

Metodologia de análisis de Flujos metabólicos

El Método para determinar los flujos metabólicos utiliza modelos estequiométricos de las vías y balances de masa para metabólicos intracelulares.

Se miden los flujos de metabólicos extracelulares

Se obtiene un mapa de flujos metabólicos que permite comparar distintas condiciones y encontrar posibles problemas en la vía

Guillermo R. Castro

Análisis de Flujos metabólicos

El análisis de flujos metabólicos se puede definir como el cálculo y la distribución de flujos de una vía metabólica

de un sistema en estudio

(Este diagrama puede ser representado en una matriz estequiométrica S de m metabolitos (filas) y n reacciones (columnas).

Guillermo R. Castro

Guillermo R. Castro

Estequiometria y balances

• En Biología de sistemas:

Input -> processing -> output.

Guillermo R. Castro

Que se necesita para realizar un análisis de flujos metabólicos?

Definir el sistema (vías metabólicas)

Considerar comportamiento estacionario o

pseudo-estacionario del sistema

Aplicar restricciones termodinámicas

Definir condiciones nutricionales

Definir un objetivo: biomasa

Predecir la velocidad de crecimiento para las

cepas salvajes y mutantes en dif. condiciones exp.

Guillermo R. Castro

Analisis estructural del sistema

• m – numero de especies qcas.

• q - numero de reacciones

• N = q*m, es la matrix estequiometrica

Reacciones

• Rev - reversibles

• Irrev - irreversibles

Guillermo R. Castro

Ley de acción de masas (Guldberg & Waage, 1864)

La velocidad de una reacción química es proporcional a la

probabilidad de colisión EFECTIVA de los reactantes. Se asume la probabilidad como proporcional a la concentración

Reaccion: 2 sust y 1 producto =>

La vel de reaccion Total es (v):

Guillermo R. Castro

De manera genérica:

En donde mi y mj son las molecularidades de los Si y los Sj respect.

En el equilibrio: v= 0 =>

P=Peq y S=Seq. => Reordenando:

=-v

Para la reacción:

Guillermo R. Castro

Para una reacción genérica de un sustrato:

…

Integrando:

Guillermo R. Castro

Análisis estequiométrico:

(las vel son -1, -1 y 2)

y

Y para n moléculas y r reacciones

con

Con nij los coeficientes estequiométricos de la molécula i de la reacción j

Guillermo R. Castro

Los coeficientes estequiométricos nij de la moléculas Si y a

las reacciones Vj se combinan para dar una matrix

denominada ESTEQUIOMETRICA

Con i= 1,…,m y j= 1,…,r

En donde cada:

1 columna = 1 reacción 1 fila = 1 molécula

Guillermo R. Castro

Ejemplo 1:

Reacciones: 4 => 4 columnas

Moleculas : 3 => 3 hileras

(V1 v2 v3 v4)

S1

S2

S3

( - ) ( + )

Guillermo R. Castro

Análisis de V2

Columna 1: 1 molécula de S1 desaparece => (-1)

Col. 2: 2 moléculas de S2 son producidas (+2)

Col. 3: S3 se mantiene constante (0).

0

1

S1

S2

S3

Reacción:

Guillermo R. Castro

Descripción matemática de un modelo metabólico

En que consiste:

Un vector de concentraciones: S = (S1, S2, …, Sn)T

Un vector de velocidades de reacción: V = (V1, V2,…, Vn)T

Un vector paramétrico: p= (p1, p2,…, pn)T

Y la matriz esquiometrica N

V

Guillermo R. Castro

Sustrato (S)

1

Metabolito Intracelular 1 (A)

2 3

Metabolito Intracelular 2 (B) Producto 1 (P1)

4

Metabolito Intracelular 3 (C)

5 6

Producto 2 (P2) Producto 3 (P3)

Guillermo R. Castro

Sea la siguiente vía metabólica:

Reacciones

1

1. S A

2

2. A B

3

3. B P1

4

4. B C

5

5. C P2

6

6. C P3

Guillermo R. Castro

Balance en Estado

Estacionario

para la vía Metabólica

Guillermo R. Castro

Matriz de Coeficientes

estequiométricos

V1

V2

V3

V4

V5

V6

Guillermo R. Castro

• La resolución de este simple sistema se podría hacer mediante cálculos manuales, pero esto no es posible en todos los casos y no es recomendable

Se definen 3 conceptos

• Matriz estequiométrica (T)

•Vector de flujos en estado estacionario (v)

•Vector de flujos medibles (r)

Guillermo R. Castro

• En vez de esto, se utiliza una aproximación matricial, en el cual las reacciones son tratadas utilizando álgebra lineal:

Ecuación de Balance Metabólico real

Guillermo R. Castro

(teóricos)

Matrices (repaso):

Guillermo R. Castro

Sea:

La inversa (T) de la matriz es:

= 1

Cuando una matriz NO es invertible el det (A) es CERO (ad-bc= 0).

Ecuación de Balance Metabólico

6 incógnitas, 3 metabolitos en estado estacionario 3 grados de libertad, hay que medir 3 metabolitos: rs = -1 rp1 = 0.3 rp2 = 0.5

Guillermo R. Castro


-1 -1 0 0 0 0 0 1

0.3 0 0 1 0 0 0 2

0.5 0 0 0 0 1 0 3

0 = 1 -1 0 0 0 0 4

0 0 1 -1 -1 0 0 5

0 0 0 0 1 -1 -1 6

Guillermo R. Castro


-1 0 0 0 0 0 -1 1

-1 0 0 -1 0 0 0.3 2

0 1 0 0 0 0 0.5 3

-1 -1 0 -1 -1 0 0 = 4

0 0 1 0 0 0 0 5

-1 -1 -1 -1 -1 -1 0 6

35 Guillermo R. Castro

Ojo que aquí la matriz es la TRANSPUESTA!!!

Resultado

Guillermo R. Castro

Reacciones bioqcas en un esquema metabolico

Ident: Intercambios Intracellulares Objetivos

Biomass: R8

B

A

F

2D

E

C

R3

R2

Waste: R9

Uptake: R5

Uptake: R1

R4

R7

R6 D

2B

Ejemplo de una matriz estequimetrica: Representacion de una via metabolica

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R8

A +1 -1 -1

B +1 -1 -2

C +1 +1 -1

D 2 +1 -1

E -1 +1

F +1 -1

R4: B + E → 2D

R5: → E

R6: 2B → C + F

R7: C → D

R8: D →

R9: F →

R1: → A

R2: A → B

R3: A → C

Como balancear un flujo metabolico?

dt

Bd

dt

Adv

][][2

Para la reaccion estequiometrica

R2: A → B

La vel de reaccion (flujo) es igual:

Para la reaccion estequiometrica

R4: B+E → 2D

El flujo es :

dt

Dd

dt

Ed

dt

Bdv

][

2

1][][4

Guillermo R. Castro

Asi por ej en condiciones de EE un modelo dinamico no-linear se simplifican en flujos lineales.

0321

][

]3][[

][

]2][[

][

]1][[

3,

3

2,

2

1,

1

vvvdt

dA

KC

PCk

KB

PBk

KA

PAk

dt

dA

mmmext

ext

Aext A P1

P2

P3

B

C

Aext A

v1

B

v2

v3

C

k1

k2

k3

Guillermo R. Castro

En estado estacionario se

ASUME que la suma de los

flujos que produce un

metabolito es igual a la

suma de los que los

consume.

0][

i

iivcdt

Ad

Aext A

v1

B

v2

v3

C

Guillermo R. Castro

En la matriz estequiometrica: mas incognitas que ecuaciones…..?????????????

0763][

046*22][

0321][

vvvdt

Cd

vvvdt

Bd

vvvdt

Ad

R1 R2 R4 R4 R5 R6 R7 R8 R9

A +1 -1 -1

B +1 -1 -2

C +1 +1 -1

D 2 +1 -1

E -1 +1

F +1 -1

v1

v2

v3

v4

v5

v6

v7

v8

v9 096][

054][

vvdt

Fd

vvdt

Ed

d[D]

dt 2*v4 v7 v8 0

Reacciones bioqcas en un esquema metabolico

Nota: Intercambios Intracellulares Objetivos

Biomass: R8

B

A

F

2D

E

C

R3

R2

Waste: R9

Uptake: R5

Uptake: R1

R4

R7

R6 D

2B

B

A

F

2D

E

C

v3

v2

R9

v5

v1

v4

v7

v6 v8 D

2B

B

A

F

2D

E

C

v3

v2

v9

v5

v1

v4

v7

v6 v8 D

2B

B

A

F

2D

E

C

v3

v2

v9

v5

v1

v4

v7

v6 v8 D

2B

E

Discriminando vias en EE

V1 v2 v3 v4 v5 v6 v7 v8 v9

A +1 -1 -1

B +1 -1 -2

C +1 +1 -1

D 2 +1 -1

E -1 +1

F +1 -1

Se elige una de las vias alternativas para optimizar

B

A

F

2D

E

C

v3

v2

v9

v5

v1

v4

v7

v6 v8

D

2B

10

10

10

10

20

Optimal Growth Flux

Consideraciones: conservar relaciones

• Detectar estados conservados en la vía

• Cuales pueden ser computados con

algoritmos determinados

• Que reacciones pueden ser removidas sin

que haya un impacto gral. en la vía

Guillermo R. Castro

Rutas metabólicas

Obtengo una serie de balances que indican la velocidad con que se

consumen sustratos, se producen productos y

se consumen/producen intermediarios

Esto genera una serie de ecuaciones con n incógnitas (flujos). Para resolver el sistema debe haber tantas ecuaciones (o sea componentes relevantes) como flujos

Resolución por cuadrados mínimos.

Matriz estequiométrica X

Matriz V

= Matriz

Q

Sale de las rutas

metabólicas

Sale de datos experimentales previamente reconciliados

Despejo Matriz V

A x V = Q

V= Q . AT =(A.AT)-1.AT.Q A AT

Relaciones conservadas:

• Una combinacion de una

columna con valores

linealmente dependiente.

• La matriz transpuesta (NT)

puede ser representada

por NTy=0

N

1

1

1

1

NT y [1 1 1 1)y 0

y

1 1 0

1 0 1

0 1 0

0 0 1

Guillermo R. Castro

Se asume Quasi EE

• 0=Nr

• Se considera que en el EE las concentraciones y las velocidades de reaccion son CONSTANTES

Guillermo R. Castro

Analisis de flujos Metabolicos como se procede…?

• Determinar las velocidades de reaccion en experimentos en EE

• Desarrollar un modelo de flujos en EE

Guillermo R. Castro

Modelo vectorial

Guillermo R. Castro

Analisis del balance de flujos

• Identificar patrones que:

– Mantengan la via balanceada

– Maximizar linealmente la funcion blanco

Guillermo R. Castro

Analisis de la via met

Guillermo R. Castro

Ejemplo:

1. 1 - 2 - 3 = 0

2. 3 - 4 - 5 = 0

3. 2 - 25 = 0

Se asume estado pseudo-estacionario para los intermediarios B, D y NADH, luego son 3 restricciones en el sistema

Especie B:

D:

NADH:

Guillermo R. Castro

Resolviendo para v2, v3 y v4 en términos de v1 y v5

1. 2 = 25

2. 3 = 1 - 25

3. 4 = 1 - 35

Guillermo R. Castro

Matriz de coeficientes estequiométricos

Guillermo R. Castro

Ejercicio B A

C

D E

F G

H

1

ATP

CO2

2 NAD+

NADH

3 ATP

4

CO2

5

ATP

CO2 6 NAD+

NADH

7

NAD+

NADH

ATP

ADP

ADP

ADP

ADP

Guillermo R. Castro

Reacciones 1

1. A + ATP C + CO2 2

2. B + NAD+ C 3

3. C D + ATP 4

4. C E + CO2 5

5. D + ATP F + CO2 6

6. D G + NAD+

7

7. F + ATP H + NAD+

Guillermo R. Castro

Balance Estado Estacionario para Metabolitos Intracelulares

C: 1 + 2 - 3 - 4 = 0 1 + 2 = 3 + 4

D: 3 - 5 - 6 = 0 3 = 5 + 6

F: 5 - 7 = 0 5 = 7

ATP: - 1 + 3 - 5 - 7 = 0 3 = 1 + 5 + 7

NAD+: - 2 + 6 + 7 = 0 2 = 6 + 7

Guillermo R. Castro

Matriz de Coeficientes estequiométricos

A B E G H CO2 C D F ATP NAD+

-1 0 0 0 0 1 1 0 0 -1 0

0 -1 0 0 0 0 1 0 0 0 -1

T = 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 1 0

0 0 1 0 0 1 -1 0 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 -1 1 -1 0

0 0 0 1 0 0 0 -1 0 0 1

0 0 0 0 1 0 0 0 -1 -1 1



r

= T T V

0

V : vector de flujos

r : vector de flujos medibles

T: matriz de coeficientes estequiométricos

Guillermo R. Castro

7 incógnitas, 5 metabolitos en estado estacionario 2 grados de libertad, hay que medir 2 metabolitos: rA = -2 rB = -3


RA -1 0 0 0 0 0 0

RB 0 -1 0 0 0 0 0

RE 0 0 0 1 0 0 0 ν1

RG 0 0 0 0 0 1 0 ν2

RH 0 0 0 0 0 0 1 ν3

RCO2 = 1 0 0 1 1 0 0 ν4

0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν5

0 0 0 1 0 -1 -1 0 ν6

0 0 0 0 0 1 0 -1 ν7

0 -1 0 1 0 -1 0 -1

0 0 -1 0 0 0 1 1



-2 -1 0 0 0 0 0 0 ν1

-3 0 -1 0 0 0 0 0 ν2

0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν3

0 = 0 0 1 0 -1 -1 0 ν4

0 0 0 0 0 1 0 -1 ν5

0 -1 0 1 0 -1 0 -1 ν6

0 0 -1 0 0 0 1 1 ν7



-1 0 0 0 0 0 0 -2 ν1

0 -1 0 0 0 0 0 -3 ν2

0 -1 0 1 1 0 1 0 ν3

-1 0 -1 -1 -1 0 -1 0 = ν4

0,5 -0,5 0 0,5 1 -0,5 0,5 0 ν5

-0,5 -0,5 0 -0,5 0 0,5 0,5 0 ν6

0,5 -0,5 0 0,5 0 -0,5 0,5 0 ν7


Resultado

2 3

3

2

0.5

2.5

0.5

B A

C

D E

F G

H

ATP

CO2

NAD+

NADH

ATP

CO2

ATP

CO2 NAD+

NADH

NAD+

NADH

ATP

ADP

ADP

ADP

ADP

2 ν1

3 ν2

3 ν3

2 = ν4

0,5 ν5

2,5 ν6

0,5 ν7


Sistema exactamente determinado

Según la estructura de la matriz estequiométrica, el sistema puede encontrarse de 3 formas:

Determinado, sobredeterminado o subdeterminado


vT)(T r )(T T-1T-1T

vT r T

r -1T )(T v

Guillermo R. Castro


-1 -1 0 0 0 0 0 1

0.3 0 0 1 0 0 0 2

0.5 0 0 0 0 1 0 3

0 = 1 -1 0 0 0 0 4

0 0 1 -1 -1 0 0 5

0 0 0 0 1 -1 -1 6

Guillermo R. Castro


-1 0 0 0 0 0 -1 1

-1 0 0 -1 0 0 0.3 2

0 1 0 0 0 0 0.5 3

-1 -1 0 -1 -1 0 0 = 4

0 0 1 0 0 0 0 5

-1 -1 -1 -1 -1 -1 0 6


Sistema exactamente determinado (matriz no invertible)




vS r

rS v-1T TSS

r -1(S) v

Guillermo R. Castro

Sistema exactamente determinado

Sistema sobredeterminado: Es necesario agregar información al sistema, medición de metabolitos extracelulares (vector b).




rS v -1

vS r

rS v-1T TSS

Guillermo R. Castro

7 incógnitas, 5 metabolitos en estado estacionario 2 grados de libertad, hay que medir 2 metabolitos: rA = -2 rB = -3


RA -1 0 0 0 0 0 0

RB 0 -1 0 0 0 0 0

RE 0 0 0 1 0 0 0 ν1

RG 0 0 0 0 0 1 0 ν2

RH 0 0 0 0 0 0 1 ν3

RCO2 = 1 0 0 1 1 0 0 ν4

0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν5

0 0 0 1 0 -1 -1 0 ν6

0 0 0 0 0 1 0 -1 ν7

0 -1 0 1 0 -1 0 -1

0 0 -1 0 0 0 1 1


Sistema subdeterminado: Es necesario agregar restricciones, solución con optimización lineal.




vS r

Guillermo R. Castro

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