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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyN-INTI
Materia de Especialización CEBI_E13 Técnicas de formulación y
estabilización de biomateriales
Docente a cargo: Pilar Buera Colaboradores: Florencia Mazzobre, Patricio Santagapita
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Desarrollo del curso Lunes 01/10- 18-20 Teórica 1. Aspectos básicos de las formulaciones para conservación de biomoléculas y microorganismos. Transiciones de fase y estado. Problemas 1 a 3.
Lunes 08/10- 18-20 Teórica 2. Metodología para la caracterización de las transiciones. Proc. de congelación. Probl. 4 a 6.
Lunes 20/10- 18-22 TP DSC; Problemas 7 a 10.
Teórica 3: Liofilización. Problemas 11 y 12.
Lunes 05/11- 18-22 Teóricas 4 y 5 y demostraciones prácticas RMN y encapsulación.
Lunes 12/11- 18-20 Teór. 6. Isot. de sorción de agua. Probl. 13 a 18.
Lunes 26/11 - 18-20 Estabilidad/reacciones de deterioro. Problemas 19 a 22.
Miércoles 12/12 18-20 Examen
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•Aspectos básicos de las formulaciones para conservación de biomoléculas y microorganismos. •Transiciones de fase y estado.
Teórica 1.
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Ciencia de Materiales
Aspectos Estructurales
Ciencia de Polímeros
Estabilidad de biomoléculas
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Aplicaciones
Medicina Biotecnología
Tecnología
Farmacia
Biología
embriones
enzimas células
anticuerpos liposomas
hormonas
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Objetivo obtener biomoléculas conservables a largo plazo, con actividad recuperable. Para ello: deben estar inhibidas las reacciones químicas y biológicas que son responsables de la degradación. Debe conservarse la estructura física y funcionalidad
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Mapa de estabilidad y aW
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Opciones:
Congelación
Deshidratación
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Pero… Qué pasa si las biomoléculas quedan en ambientes restringidos de agua? Puntos críticos: •Membranas celulares •Proteínas
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En ambientes de humedad restringida las biomoléculas sufren estrés causado por alteraciones en sus interacciones con el agua.
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La estructura y funcionalidad de biopolímeros está determinada en gran parte por su afinidad por el agua.
También el agua juega un papel decisivo en las estructuras celulares.
Los cambios en el estado físico del agua provocan alteraciones con distinto grado de irreversibilidad.
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-El agua y la vida: mecanismos de protección en organismos vivientes en condiciones extremas de humedad y temperatura.
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Cómo se busca la solución?
1. Planteando cómo resuelve la naturaleza el mantenimiento de la vida en condiciones extremas? •Muy altas o muy bajas temperaturas
•Muy altas o muy bajas presiones
•Deshidratación
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Los organismos que viven bajo condiciones des estrés hídrico o térmico tienen su bioquímica adaptada, o bien tienen los mecanismos que les permiten sobrevivir en estado de latencia hasta que las condiciones ambientales sean favorables:
Extremófilos
Criptobiotes
Anhidrobiotes
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Tardigrade 500mm
α, α -trehalosa
O
H
HO
H
HO
H
OHHH
OH
O
H
OH
H
OH
H
HO H
OH
H
O
Células de levadura 3 ~ 8mm
Artemia salina 0.1cm
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O
H
HO
H
HO
H
OOHH
H
OH
H
HHO H
H OHO
OH
OH
Sacarosa Plantas de la resurrección
Polen
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Plantas de la resurrección
Ej.Selaginella lepidophylla
Anhidrobiosis
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OO
CH2
OHOH
OH OH
OH
OH
CH2
OH
rafinosa
OCH2
OCH2OHOH
OH
OH
O
O
OCH2OH
OHOH
OH OH
OH
OH
CH2
OH
sacarosa
OCH2
β -fructofuranósidos
O
O
O
CH2OH
OHOH
OHOH
OH
OHCH2OH
α ,α- trehalosa
α-glucopiranósido
sacarosa
rafinosa β-fructofuranósidos
Semillas
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Lecciones de la Naturaleza: Solutos que acumulan organismos resistentes a la deshidratación Proteínas
Sales/ aminoácidos
Azúcares
Contribuyen al ajuste osmótico
Puentes de H
Estabilización de proteínas y membranas
Medios de alta viscosidad
Capturan radicales libres
Vidrios
Protector de proteínas
Protector de membranas
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Pereira et al. Biophys J 2004
w.o. T, 200C w.o. T, 52C
+ T 1M, 200C + T 2M, 200C
Efecto de trehalosa sobre membranas biológicas- Altas T
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Totalmente hidratado
Parcialmente deshidratado
Deshidratado
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Totalmente hidratado
Parcialmente deshidratado Deshidratado
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Solutos protectores de biomoléculas
•Sacarosa.
•Manitol.
•Lactosa.
•Trehalosa.
•Sorbitol.
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Propiedades estabilizantes de azúcares amorfos.
Inhibición de reacciones químicas
Protección de proteínas
Protección de membranas
Medios de alta viscosidad
Capacidad de interactuar por puentes H
Vidrio
No cristalino (vítreo o sobreenfriado)
}
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Pasos para el desarrollo de sistemas de biomoléculas estables:
• Formulación
• Operación y control de proceso
• Evaluación de la calidad
• Estimación de la estabilidad
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Principales aspectos: •Características de los comp. activos del producto (proteínas, enzimas, pigmentos, membranas, microorganismos, etc.) •Características de componentes del medio (biopolímeros, azúcares, sales, buffers) •Proceso, equipos •Acondicionamiento final de producto •Estabilidad
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Requerimientos: Las biomoléculas lábiles y estructuras deben ser : • preservadas durante el proceso. • preservadas durante su posterior almacenamiento. • su actividad recuperable al rehidratar o descongelar.
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Aspectos a considerar:
•Mecanismos involucrados
•Relación vitrificación estabilidad
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Las transiciones de fase y estado de las biomoléculas afectan su funcionalidad y pueden servir como índice para predecir estabilidad Esencialmente corresponden a: Vitrificación Transiciones entálpicas
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Vitrificación
La estabilidad de muchas biomoléculas en medios congelados o deshidratados se logra mediante la formación de vidrios.
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Matriz
Agua
Biomoléculas
Interacciones
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Vitrificación.
Los sólidos amorfos son materiales meta-estables con alta viscosidad y baja movilidad molecular, existen en un estado de no-equilibrio
Muchos cambios químicos y estructurales ocurren muy lentamente en los sistemas vítreos, y no se perciben en marcos de tiempo prácticos.
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Vidrio (amorfo)
Demasiado quebradizo y muy alta Tm
Vidrio común
vidrios SiO2 en su estado cristalino: cuarzo
cristal
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El estudio de los vidrios se realizó inicialmente en sólidos inorgánicos, y se desarrolló en ciencia de polímeros, pero sustancias como azúcares pueden generar estructuras vítreas y están ampliamente relacionados con la estabilidad de biomoléculas.
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El cambio en el estado físico que sufre un material amorfo vítreo al pasar al estado de líquido sobreenfriado se conoce como transición vítrea.
Esta transformación ocurre a cierta temperatura, temperatura de transición vítrea (Tg), que depende del contenido de agua y de las características de cada sistema.
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Los vidrios dejan de comportarse como sólidos amorfos cuando la temperatura supera el valor de Tg, temperatura de transición vítrea.
En este punto pierden la rigidez que los caracteriza y se tornan flexibles o gomosos.
En sistemas biológicos se le atribuye a este cambio efectos nocivos sobre su conservabilidad.
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Colapso estructural por almacenamiento de muestras de maltosa liofilizadas a temperaturas superiores a su Tg.
control Almacenada a T>Tg
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Los diagramas temperatura/composición permiten mostrar la influencia de los solutos en las transiciones de fase del agua. Por simplicidad solo se muestran los cambios de fase sólido/líquido, que son los que interesan en la liofilización. Hay que considerar 2 casos: •Sistemas en equilibrio con formación de eutéctico. •Sistemas que forman vidrios fuera del equilibrio.
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Reid, 2006
Caso 1. Sistemas en equilibrio termodinámico que forman eutécticos. Ej.: sales, manitol
A
D
C
B E La línea DBE
determina la menor temperatura a la cual puede existir líquido
Tm
Tms
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Tm es la temperatura de fusión/cristalización de agua pura (0°C) y Tms es la temperatura de crist/fusión de soluto puro.
A medida que se agrega agua al soluto o soluto al agua, las correspondientes temperaturas de fusión disminuyen (curvas AB y CB).
La curva CB corresponde a la de solubilidad.
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Al enfriar una solución inicialmente a la temperatura T y composición C2 , en forma lenta para permanecer en equilibrio, disminuye la temperatura y no hay cambio de fase, permaneciendo líquida hasta T1 que es la temperatura de cristalización correspondiente a esa composición. Se forman los primeros cristales de hielo.
T
T1
solución
Solución + soluto Solución
+ hielo
Al seguir enfriando hay menos agua en la solución, que se concentra. En el punto U tenemos un mezcla de cristales de hielo y una solución de comp. C3
U
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Si consideramos ahora una solución de composición C3 a la temperatura T, podemos ver que es necesario enfriarla hasta T2 para que se formen los primeros cristales de hielo. En este punto la solución no congelada de C3 será idéntica a la de C2 enfriada hasta T2. La diferencia entre ambas es la cantidad de hielo formado.
T
T2
T
solución
Solución + soluto Solución
+ hielo
Cuanto más concentrada es la solución inicial, menos cantidad de hielo presente.
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Reid, 2006
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La realidad:
Muchas veces el equilibrio termodinámico no se alcanza en escalas de tiempo compatibles con los experimentos, y los solutos no cristalizan, dando lugar a una prolongación de la curva AB.
En cierto punto, alcanzamos una T y conc. de soluto donde la cristalización de hielo está cinéticamente impedida, y corresponde a la intersección con la curva del vidrio.
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Reid, 2006
A
B
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Reid, 2006
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En los procesos de deshidratación o congelación se pueden generar sistemas vítreos.
La fusión de sólidos cristalinos, seguido por un enfriamiento rápido también genera estructuras vítreas.
Sólidos amorfos y estado vítreo
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Esquema de la formación de sólidos amorfos o cristalinos 1. Durante la congelación
Congelado rápido
matriz amorfa
Congelado lento
hielo
agua soluto
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Esquema de la formación de sólidos amorfos o cristalinos 2. Durante la deshidratación
Deshidratación rápida
Deshidratación lenta
Cristales de soluto
agua soluto
matriz amorfa
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Tem
pera
ture
W 0.25 0.5 0.75 1
2
4
150
100
50
0
-50
-100
-150
0
Diagrama de estado
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Compuesto Tg (C) Triosas
Glicerol -93
Pentosas
Ribosa -10
Xilosa -10
Arabinosa -2
Hexosas
Fructosa 13
Glucosa 39
Manitol 30
Sorbitol -3
Disacáridos
Sacarosa 70
Trehalosa 106
Maltosa 87
Trisacáridos
Rafinosa 109
Maltotriosa 100
Tetrasacáridos
Estaquiosa 132
Temperaturas de transición vítrea de compuestos secos.