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CARACTERIZACIÓN Y PRUEBAS DE PATOGENICIDAD CRUZADA ENTRE AISLAMIENTOS DE Colletotrichum spp. OBTENIDOS DE

FRUTOS DE LULO (Solanum quitoense Lam), TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betacea Sendt), GRANADILLA (Passiflora ligularis Juss), MANGO (Mangifera indica L) Y TALLOS DE MORA (Rubus glaucus

Benth) CON SÍNTOMAS DE ANTRACNOSIS

CAMILO ADOLFO CONTRERAS HERNÁNDEZ

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

Microbiólogo Agrícola y Veterinario

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTA

2006

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.





APROBADO

______________________________ Maria Clemencia De La Rotta

Ingeniera Agrónoma M.Sc. Fitopatología Directora

________________________ ________________________

Jimena Sánchez José Salvador Montaña Microbióloga Biólogo





APROBADO

______________________ ___________________ ANGELA UMAÑA MUÑOZ LUIS DAVID GÓMEZ Ph.D Biología Microbiólogo Decana Académica Directo de Carrera

v

Agradecimientos

A Dios.

A mi mamá Blanca Cecilia Hernández Sandoval, por brindarme la

oportunidad de estudiar y ser alguien en la vida; a mi padre, Jorge Enrique

Contreras Fino; a mis hermanos Ernesto, Karla, Lucy, Marilyn y a mis

sobrinas Valentina y Juanita por su apoyo moral, compartir conmigo los

buenos y malos momentos y brindarme todo su apoyo.

Un agradecimiento muy especial a mi novia Angie, por su gran colaboración

y por ser una persona tan maravillosa; y a Pilar Rojas Gracia por sus aportes

en la investigación.

María Clemencia de la Rotta, por sus enseñanzas, por ser una gran persona,

por preocuparse en promover la investigación en busca de respuestas y

alternativas que nos permitan vivir un mejor mañana, por orientarme, por su

gran interés y apoyo.

A Sandra Fernanda Cerón Guerrero. Laboratorio de Cuarentena Vegetal,

ICA. por su apoyo.

A Sandra Gómez. Laboratorio Fitopatología. Universidad Nacional.

A Carlos, Jesús, Rubén, Mateo . Universidad Nacional.

vi

RESUMEN

Doce aislamientos de Colletotrichum spp, aislados de frutos de granadilla,

lulo, mango, tomate de árbol y tallos de mora fueron estudiados para

describir aspectos morfológicos, culturales y su potencial de infección

cruzada. Las características evaluadas fueron la morfología y tamaño de las

conidias, el color de la colonia y el crecimiento de las colonias a diferentes

temperaturas. La morfología de las conidias varió significativamente entre los

aislamientos (p<0.05); el tamaño de las conidias no varió en cuanto a

longitud (p<0.05) pero se presentaron diferencias significativas en el ancho (p

>0.05) de las mismas. La tasa de crecimiento óptima para los asilamientos

de frutos de clima frío moderado se presentó a los 20ºC, mientras que para

mango se presentó a los 28ºC.

Las pruebas de sensibilidad al benomyl en dosis de 1g/L y de 1,5 g/L y la

prueba cualitativa de la proteasa fueron realizadas para determinar la

presencia de al menos dos especies causantes de la antracnosis; C.

gloeosporioides y C. acutatum. La patogenicidad de los aislamientos se

evaluó inoculando bloques de agar y suspensiones conidiales ajustadas a

1x105 conidia/ml sobre los frutos y tallos con y sin heridas. Se demostró el

potencial de infección cruzada entre los asilamientos de clima frío moderado

y mango en los tratamientos con heridas y sin heridas.

vii

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 12

2. OBJETIVOS................................................................................................. 14

3. REVISIÓN DE LITERATURA....................................................................... 15

3.1. Granadilla (Passiflora ligularis Juss) ...................................................15

3.1.1. Botánica y descripción de la planta ..............................................15

3.1.2. Condiciones agroecológicas.........................................................16

3.1.3. Plagas .........................................................................................17

3.2. Lulo (Solanum quitoense Lam) ...........................................................17



3.2.3. Plagas ..........................................................................................19

3.3. Mango (Mangífera indica L.) ...............................................................20



3.3.3. Plagas ..........................................................................................23

3.4. Mora de castilla (Rubus glaucus Benth) .............................................23



3.4.3. Plagas ..........................................................................................27

3.5. Tomate de árbol (Solanum betaceum cav Sendt)...............................27



3.5.3. Plagas ..........................................................................................30

3.6. Agente causal de la antracnosis .........................................................31

3.6.1. Posición taxonómica.....................................................................32

3.6.1.1. Estado anamorfo ...................................................................... 32

viii

3.6.1.2. Estado telomorfo ...................................................................... 32

3.6.2. Generalidades del patógeno ........................................................32

3.6.2.1. Desarrollo de la enfermedad ................................................... 34

3.6.2.1.1 Germinación y formación del apresorio. ................................. 34

3.6.2.1.2. Formas de penetración.......................................................... 36

3.6.2.1.3. Infección y colonización de tejidos vegetales ........................ 37

3.6.2.1.3.1. Patógenos hemibiotróficos .......................................... 38

3.6.2.1.3.2. Patógenos subcuticulares intramurales ...................... 39

3.6.2.1.3.3. Desarrollo y reproducción necrotrófica........................ 40

3.6.2.2. Fuentes de inóculo y dispersión ............................................... 41

3.6.2.3. Infección quiescente y latente ........................................... 43

3.6.2.4. Síntomas y rango de hospederos............................................. 46

3.6.2.5. Consideraciones epidemiológicas ............................................ 49

3.6.2.6. Métodos diagnósticos............................................................... 51

3.6.2.7. Control de la enfermedad ......................................................... 52

4. MATERIALES Y MÉTODOS:....................................................................... 54

4.1 Tipo de estudio......................................................................... 54

4.2 Recolección de muestras......................................................... 55

4.3 Aislamientos............................................................................. 55

4.4. Conservación de los aislamientos........................................... 57

4.5. Caracterización macroscópica ................................................ 57

4.5.1. Color de las colonias............................................................ 58

4.5.2. Tipo de micelio ..................................................................... 58

4.5.3. Crecimiento radial diario en PDA ......................................... 59

4.6. Caracterización microscópica ................................................. 59

4.6.1. Conidias ............................................................................... 60

4.6.1.1. Forma y tamaño de las conidias ...................................... 60

4.7. Sensibilidad al Benomyl ......................................................... 61

4.8. Prueba de la proteasa............................................................. 61

ix

4.9. Pruebas de patogenicidad cruzada......................................... 62

5. RESULTADOS Y DISCUSION .................................................................... 64

5.1 Descripción macroscópica ....................................................... 64

5.1.1. Características de la colonia. ............................................... 64

5.2. Curva de Crecimiento a 20,25 y 28ºC..................................... 66

5.2.1. Características de las conidias a 20, 25 y 28ºC ................... 69

5.2.1.Tamaño de las conidias ........................................................ 73

5.3. Prueba de Benomyl................................................................. 76

5.4. Prueba de Proteasa ................................................................ 77

5.5 Pruebas de Patogenicidad cruzada ......................................... 79

6. CONCLUSIONES ........................................................................................ 84

7. RECOMENDACIONES................................................................................ 85

8. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................ 86

9. ANEXOS...................................................................................................... 98

x

TABLA DE FIGURAS

Figura 1. Ciclo de la enfermedad de la antracnosis causado por Glomerella

cingulata y Colletotrichum o Gloeosporium sp. .............................................36

Figura 2. Estrategias de infección de Colletotrichum acutatum .....................41

Figura 3. Síntomas de antracnosis ................................................................55

Figura 4. Tipo de micelio predominante en los aislamientos .........................64

Figura 5. Color de las colonias ......................................................................65

Figura 6. Variación en el color de las colonias...............................................66

Figura 7. Curva de crecimiento del hongo Colletotrichum spp en frutos de

granadilla, lulo, mango, tomate de árbol y tallos de mora bajo temperaturas

de 20, 25 y 28ºC ............................................................................................68

Fig 8. Forma de las conidias. ........................................................................70

Figura 9. Efecto de la temperatura sobre la forma de las conidias. ..............72

Figura 10. Efecto de la temperatura sobre el tamaño de las conidias ...........75

Figura 11. Prueba de Benomyl ......................................................................77

Figura 12. Halo producido por la prueba positiva de la proteasa. ..................78

Figura 13. Pruebas de patogenicidad cruzada ..............................................82

Figura 14. Pruebas de patogenicidad cruzada en tallos de mora. .................83

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Tamaño de las conidias. ..................................................................73

xi

LISTA ANEXOS

ANEXO 1. Preparación del agar PDA............................................................98

ANEXO 2. Medio para evaluar la reacción de la proteasa.............................99

ANEXO 3. Características morfológicas de los aislamientos.......................100

ANEXO 4. Análisis estadístico para crecimiento radial...............................101

ANEXO 5. Tasa de crecimiento para los diferentes aislamientos bajo 20, 25 y

28ºC.............................................................................................................103

ANEXO 6. Forma de las conidias ................................................................104

ANEXO 7. Estadística para el largo de las conidias ...................................106

ANEXO 8. Estadística para el ancho de las conidias...................................108

ANEXO 9. Tamaño de las conidias en temperaturas de 20, 25 y 28ºC .......110

ANEXO 10. Prueba de Benomyl para diferenciar entre C. acutatum y

C.gloeosporioides ........................................................................................111

ANEXO 11. Prueba de la proteasa en 5 repeticiones ..................................112

ANEXO 12. Pruebas de potencial de patogenicidad cruzada......................113

ANEXO 13. Presencia de síntomas iniciales de antracnosis en los

tratamientos de patogenicidad cruzada. ......................................................114

12

INTRODUCCIÓN

Con el transcurso de los años las frutas tropicales se han convertido en uno

de los productos con una mayor perspectiva comercial en el ámbito

internacional; es por esta razón que los países productores han

incrementado sus niveles de producción y han enfocado líneas de

investigación al conocimiento y mejoramiento de estos cultivos con el fin de

obtener frutos de excelente calidad.

Colombia participa en el mercado internacional de las frutas tropicales con

productos como: el mango, donde se estima un área de cultivo de 12.000

hectáreas en las cuales se producen alrededor de 119.000 Tn/año, los

departamentos de mayor producción son Tolima y Cundinamarca, seguidos

por Antioquia, Bolívar y Magdalena; el tomate de árbol, cuenta una

producción de 112.000 Tn/año en un área de 7.300 ha, distribuidas

principalmente en los departamentos de Antioquia y Cundinamarca; la

producción de granadilla, esta localizada en los departamentos de Antioquia ,

Valle y el área de cultivo alcanza las 21.000 ha. A su vez, la mora y el lulo,

son alternativas de cultivo de gran importancia económica dentro de la

producción agrícola de muchos departamentos del país. El lulo es producido

principalmente en el Huila, seguido por el departamento de Cundinamarca,

se producen alrededor de 40.000 tn/año en un área de 4.790 ha. La zona de

producción de mora es de 8.000 ha con un volumen de 54.000 Toneladas, el

departamento de Cundinamarca produce más de la tercera parte de esta

fruta seguido por los departamentos de Santander y Antioquia. Debido a que

son productos de gran demanda representan grandes extensiones de tierra

cultivada y teniendo en cuenta la biodiversidad y variedad climática del país

existe la posibilidad de extender y aumentar la producción de estas y otras

13

frutas con el fin de ofrecer en el mercado internacional diversidad de

productos con excelente calidad.

La expansión de este tipo de cultivos favorece la aparición de enfermedades

que deterioran la calidad de los frutos y/o disminuyen los rendimientos de los

cultivos. La antracnosis es una de las enfermedades que se presenta en la

fase productiva de la planta y durante la poscosecha, razón por la cual se

considera una de las más importantes en nuestro país ya que en algunas

zonas la enfermedad ha causado pérdidas en la totalidad de los cultivos

cuando no es controlada; la antracnosis es producida por el hongo

Colletotrichum spp, que afecta los frutos y también puede causar lesiones en

otras partes de la planta.

Debido a la importancia económica de la enfermedad para la producción

frutícola en el país y a la reducida disponibilidad de información acerca de la

biología, patogenicidad y epidemiología del agente causal en Colombia, los

estudios de caracterización microbiológica y morfológica a nivel macro y

microscópico, junto con el conocimiento de los procesos de infección cruzada

en frutos de lulo, mango, granadilla, tomate de árbol y tallos de mora,

pueden ser de utilidad en procura de generar alternativas de solución, como

herramientas para formular estrategias de manejo que permitan reducir la

incidencia, la severidad de enfermedad y a su vez mejoren la productividad

de los cultivos junto con la condición social y económica de los productores.

14

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Aislar, caracterizar microbiológicamente y realizar pruebas de patogenicidad

cruzada entre los aislamientos de Colletotrichum spp. obtenidos de frutos de

lulo (Solanum quitoense Lam), tomate de árbol (Solanum betacea Sendt),

granadilla (Passiflora ligularis Juss), y tallos de mora (Rubus glaucus Benth)

con síntomas de antracnosis.

2.2. Objetivos específicos

Aislar el patógeno causante de la antracnosis en frutos de lulo, mango,

granadilla, tomate de árbol, y tallos de mora a partir de tejido de los

mismos que manifiesten síntomas iniciales de la enfermedad.

Caracterizar microbiológicamente los diferentes aislamientos obtenidos a

partir de los frutos de lulo, mango, granadilla, tomate de árbol y tallos de

mora.

Establecer si existe patogenicidad cruzada entre los diferentes

aislamientos de Colletotrichum spp. obtenidos a partir de los frutos de

lulo, granadilla, mango, tomate de árbol, y tallos de mora.

Conocer las diferencias existentes a nivel macro y microscópico entre los

agentes causales de la antracnosis en mora, lulo, mango, granadilla y

tomate de árbol.

15

3. REVISIÓN DE LITERATURA

3.1. Granadilla (Passiflora ligularis Juss)

Las pasifloras son trepadoras perennes, con zarcillos largos y alternos. La

familia Pasiflorácea es nativa de los trópicos y subtrópicos. A ella pertenecen

enredaderas, árboles y arbustos (Heywood y Moore 1987), muchas son

cultivadas por sus frutos comestibles, mientras que otras son usadas como

plantas ornamentales. La familia comprende 18 géneros y 630 especies

(Vanderplank 1996). El género Passiflora ha sido considerado como el más

amplio e importante de esta familia, ya que incluye aproximadamente 465

especies y está subdividido en 24 subgéneros (Vanderplank 1996). Killip

(1938) subdividió el género Passiflora en 22 subgéneros, a partir de su

morfología floral, y realizó la clasificación taxonómica de más de 350

especies americanas dentro del mismo.

3.1.1. Botánica y descripción de la planta

Su posición taxonómica es:

Reino: Vegetal

División: Angiosperma

Clase: Magnoliopsida

Subclase: Dilleniidae

Orden: Malpighiales

Familia: Passifloraceae

Género: Passiflora

Especie: P. ligularis

http://es.wikipedia.org/wiki/Reino_%28biolog%C3%ADa%29

http://es.wikipedia.org/wiki/Plantae

http://es.wikipedia.org/wiki/Divisi%C3%B3n_%28biolog%C3%ADa%29

http://es.wikipedia.org/wiki/Angiospermae

http://es.wikipedia.org/wiki/Clase_%28biolog%C3%ADa%29

http://es.wikipedia.org/wiki/Magnoliopsida

http://es.wikipedia.org/wiki/Subclase

http://es.wikipedia.org/wiki/Dilleniidae

http://es.wikipedia.org/wiki/Orden_%28biolog%C3%ADa%29

http://es.wikipedia.org/wiki/Malpighiales

http://es.wikipedia.org/wiki/Familia_%28biolog%C3%ADa%29

http://es.wikipedia.org/wiki/Passifloraceae

http://es.wikipedia.org/wiki/G%C3%A9nero

http://es.wikipedia.org/wiki/Passiflora

http://es.wikipedia.org/wiki/Especie

16

La planta es enredadera de ramas largas, hojas acorazonadas, raíz radiada

con nudos cada 12 a 15 cm, con tallos redondos. En cada nudo se

encuentran dos estipulas y dos yemas florales, un zarcillo, una yema

vegetativa y una hoja acorazonada grande. La base del pecíolo de la hoja

esta provista de 4 a 6 glándulas alargadas llamadas lígulas. Las hojas de 8-

14 cm. de largo presentan lámina acorazonada, con el margen liso, es de

color verde a azulado. El pecíolo tiene tres aristas, pedúnculo solitario en las

axilas de 1.5-3.0 cm. de largo, tres brácteas verdosas, tubo del cáliz

brevemente acampanado; sépalos aovado-oblongos de 2.5 a 3.5 cm de largo

y de 1 a 1.5 cm de ancho, agudos. La flor mide de 6 a 8 cm. tiene forma de

campana verdosa exterior y blanca en su interior formada por dos series de 5

sépalos cada una. Los pétalos son tubulares, 1 a 3 cm de largo y 8 a 10 mm

de ancho de color blanco y lila, forman una corola de dos series con 43

pétalos al exterior y al interior. El fruto es una baya grande, ovoide de 6 a 12

cm de diámetro; con cáscara dura, amarilla con lenticelas en forma de

puntos blancos, pulpa gruesa, esponjosa, jugosa, dulce, de color blanco. En

el interior de la fruta las semillas se agrupan en tres placentas longitudinales

situadas en las paredes de la fruta. Las semillas son planas elípticas, negras,

rodeadas de un arilo transparente que es la parte comestible. Este arilo se

compone de un parénquima que contiene azúcares y principios ácidos que

determinan un sabor muy agradable (Avilan et al, 1988). La granadilla es

consumida principalmente como fruta fresca.

3.1.2. Condiciones agroecológicas

Se desarrolla muy bien en un clima cálido y húmedo con temperaturas entre

los 12 y 20ºC, precipitaciones de 1.500 a 2.000 mm, humedad relativa del 70

al 85%, condiciones que se presentan en las zonas comprendidas entre los

1500-1900 m.s.n.m. En relación a suelos, le favorecen aquellos de textura

17

media con buen drenaje, ya que no soporta los encharcamientos, la fertilidad

requerida puede ser de mediana a alta, y el pH de 5.5-7.7 (Avilan et al,

1988).

3.1.3. Plagas

Entre las principales plagas se han reportado el chinche de hoja (Leptoglosus

zonatus) y gusano defoliador (Dione juno juno). En las enfermedades

fungosas se ha reportado a Alternaria spp., que ataca directamente al fruto,

causando manchas circulares necróticas que penetran al fruto causando su

pudrición; Cladosporium herbarum , Fusarium oxysporum y la antracnosis

que es altamente limitante, producida por el hongo Colletotrichum spp, el cual

se caracteriza por atacar hojas, ramas y frutos, produciendo lesiones o

manchas de coloración oscura, las cuales gradualmente se van tornando

negruzcas y aumentan de tamaño hasta destruirlo completamente. La

severidad de la enfermedad se ve favorecido por condiciones climáticas

relacionadas con alta humedad relativa y bajas temperaturas (Ríos & Torres,

1976).

3.2. Lulo (Solanum quitoense Lam)

El lulo no tiene un origen definido y exacto, sin embargo, los autores

coinciden en señalar al Ecuador y al sur de Colombia, como las zonas en

donde probablemente se origino. Es una planta típica del trópico de

fotoperíodo corto, por esto su cultivo se acostumbra en lugares frescos y

sombreados, aunque también puede cultivarse en lugares sin la última

aracterística, en estos casos el clima de la zona debe ser

predominantemente nublado durante todo el año.

18


Su posición taxonómica:

Reino: Vegetal

Subreino: Espermatophyta.

Division: Angiosperma.

Subdivisión: Dicotiledónea.

Clase: Simpetala.

Subclase: Pentaciclica.

Orden: Tubiflorales.

Género: Solanum

Especie : S. quitoense Lam

La naranjilla se utiliza principalmente por el jugo, que se emplea en la

preparación de refrescos y licores, a los que da un sabor ácido y un aroma

muy agradable. La naranjilla es un arbusto de 1 a 2 m. de alto, los tallos

cilíndricos, duros y muy ramificados, lisos o espinudos, cubiertos como el

resto de la planta de una pubescencia blanca y harinosa. Este indumento

está constituido por dos tipos de pelos; los más frecuentes son blancos y en

forma de estrella. Los segundos aparentemente simples, pues tienen solo

ramificaciones muy cortas en la base, están llenos de un líquido morado que

da un tiente característico a las hojas nuevas. En las hojas desarrolladas

estos pelos morados solo se hallan en los bordes y nervios del lado inferior

de la hoja. Las hojas oblongadas a ovadas, muy grandes, miden de 30 a 40

cm. de largo por 20 a 35 cm. de ancho; tienen el borde marcadamente

sinuoso, con lobos triangulares cortos. Las flores nacen en las axilas

terminales, solas o en grupos de 2 a 6; sus pedúnculos son cortos y

gruesos. El cáliz, que es permanente, es de forma estrellada, muy

pubescente en el lado externo. La corola blanca, mide hasta 4 cm. de

19

diámetro y está dividida en 5 lobos triangulares. El centro de la flor lo ocupan

los estambres y el pistilo; los primeros tienen anteras erectas y amarillas, por

entre las que sobresale el estilo (Mejía & Betancur, 1994).

El fruto de S. quitoense tiene por forma un lejano parecido con la naranja. Es

una baya globosa, de 3 a 5 cm de diámetro, amarilla en la madurez, cubierta

de una pubescencia blancuzca que se remueve fácilmente. La cáscara es

dura y las 4 ó 5 celdas están rellenas de una sustancia mucilaginosa, verde

amarillenta, de típico sabor acido entre la que se hallan numerosas semillas.

El fruto no se come en fresco, sino que se prepara en jugo o en pasta (León,

1968).


El lulo crece mejor en terrenos con pendientes moderadas o fuertes. La

altitud más adecuada para el cultivo se encuentra entre los 1700 a 2200

metros sobre el nivel del mar y a una temperatura que oscila de los 16 a

22°C; si la temperatura supera los 29°C la productividad disminuye, el lulo no

soporta bajas temperaturas, como las que se presentan en zonas donde

ocurren heladas y granizadas. El tipo de suelo preferiblemente debe ser rico

en materia orgánica, de textura liviana, profundos, medianamente ácidos (pH

5-5.8), también se puede cultivar en suelos francos, franco-arenosos o franco

arcillosos con buen drenaje. La precipitación debe encontrarse entre los

1500-2500 mm (Pardo, 1990).

3.2.3. Plagas

Dentro de las plagas que afectan la calidad de los frutos se encuentran

Anastrepha spp cuya larva se desarrolla dentro de los frutos, siendo los más

20

atacados, los frutos "pintones" o en proceso de madurez y sobremaduros.

Esta larva consume el tejido carnoso del fruto causando, con sus

excrementos, acompañada de una descomposición interna lenta y continua;

como consecuencia del ataque los frutos jóvenes se caen, sin embargo los

frutos bien desarrollados permanecen en la planta donde se maduran

prematuramente y se descomponen. Hasta hoy, otra plaga similar, Ceratitis

capitata conocida como mosca del mediterráneo no se ha reportado en

Caldas. Otra de las plagas es Neuleucinodes elegantalis. Dentro de las

enfermedades fungosas se encuentra la antracnosis la cual produce lesiones

tanto en el tallo como en los frutos. La enfermedad es endémica al cultivo en

las zonas productoras de los departamentos de Caldas, Cauca, Antioquia,

Boyacá, Cundinamarca, Huila, Tolima y Valle del Cauca (Tamayo et al.,

2003; López, 1980)

3.3. Mango (Mangífera indica L.)

El mango es un árbol frutal que esta muy diseminado por todo el mundo y su

fruta, según muchos autores se consume en los países de la zona tropical.

Es originario de la India, donde se cultiva hace 4000 años. Colombia posee

grandes extensiones de tierra ecológicamente aptas para su cultivo,

principalmente la Costa Atlántica y regiones más cálidas del interior del país

como los Valles de los departamentos del Tolima, Huila y los Llanos

Orientales.


Su posición taxonómica:

Reino: Vegetal

Clase: Dicotiledóneas

21

Subclase: Rosidae

Orden: Sapindales

Suborden: Anacardiineae

Familia: Anacardiaceae

Género: Mangifera

Especie: M. indica L

Los árboles de mango llegan a alcanzar un gran porte; se conocen

ejemplares de más de 40 metros de altura. Su forma depende del tipo de

propagación; árboles de semilla son erectos y altos; los injertados más bajos

y de ramificación escasa y abierta. El mango es una de las especies

tropicales que alcanza un mayor desarrollo radical. Las raíces principales

penetran hasta 6 a 8 metros, mientras que las superficiales se extienden en

un radio hasta de 10 m. del tronco. Esta distribución le permite resistir las

condiciones de baja humedad. El tronco principal es cilíndrico o irregular con

la corteza grisácea, rica en canales de resina. En esta especie hay uno o

varios períodos al año de desarrollo de ramillas nuevas, con hojas que al

principio son verdes o rosadas según el cultivar. El primer brote en la

mayoría de las variedades, sale de aquellas ramillas formadas el año anterior

que no florecieron. Estos primeros brotes, si el árbol no tiene frutos crecen y

se alargan y de ellos salen las inflorescencias que se abrirán en la estación

siguiente, por lo común un año después de iniciado su desarrollo. Después

pueden presentarse uno o más períodos de brotación sin que las ramillas

brotadas lleguen a dar flores. Es de estos brotes sin embargo, de donde

saldrán las ramillas floríferas. El factor que determina que una brotación

llegue a formar flores, es la presencia de frutos. Cuando hay cosecha

abundante el árbol agota sus reservas, de modo que en ese año el número

de brotes nuevos se reduce al mínimo. De esto resulta que un año de altas

cosechas es seguido por 1 ó 2 de bajo rendimiento.

22

Los pecíolos hinchados en la base, tienen un canal en lado superior y miden

de 5 a 25 mm. de largo. La lámina es por lo general oblongada o

lanceolada, con la base y el ápice agudos, rara vez elípticos. Su tamaño

varía de 5 a 35 cm. de largo por 2 a 10 cm. de ancho. Los bordes por lo

común son ondulados; el nervio central y los 15 a 30 nervios laterales son

muy prominentes. La cara superior es dura y brillante, de color verde oscuro,

mientras que la inferior es amarillo verdosa. Las hojas del mango contienen

canales de resina que se hallan en el floema de las venas. La inflorescencia

es una panícula que brota al final de una ramilla. Las flores tienen un

pedúnculo muy corto: El cáliz se forma de 5 sépalos libres, verdosos,

pubescentes en la cara externa de 2 a 4 mm. de largo y de 1 a 2 mm. de

ancho. Los pétalos, también libres y caedizos miden de 3 a 6 mm. de largo

por 1 a 2 mm. de ancho y tienen el ápice agudo y curvo.

El fruto es una drupa aplanada, cuya forma, tamaño y color varían mucho

según las variedades. La base en ciertos cultivares tiene un lado comprimido;

el cuerpo del fruto es desigual de perfil, con el lado dorsal convexo y el

ventral con una concavidad hacia el ápice, en la que se halla una

prominencia cónica o “pico”. El tono básico del fruto es amarillo en la fruta

madura, uniforme o con áreas rojas o verdes. El color uniforme es

interrumpido por círculos pequeños más claros llamados glándulas. La pulpa

del fruto es amarilla o naranja y jugosa, con fibrosidades, salvo en las

variedades mejoradas (León, 1968).


En la Costa Atlántica, los suelos cultivados con mango son franco-arcillosos,

arcillosos y arcillosos-limosos, profundos con un pH de 6.0 a 6.5 y fertilidad

que va de mediana a alta. Por otro lado, los suelos del Huila y Tolima,

23

sembrados con esta fruta, son arenosos, tienen un pH que oscila entre 6.5 y

7.2 y su fertilidad es medianamente alta. En la Costa Atlántica cuya altura va

de 0 a 30 m.s.n.m, goza de una temperatura media de 28ºC, una humedad

relativa de 78% y ciclos de lluvia de 1200 y 1400 mm anuales. En el Huila y

en el Valle del Tolima, regiones ubicadas entre los 380 y 600 m.s.n.m. la

temperatura media es de 28ºC y la humedad relativa de 68%; el promedio de

lluvias fluctúa en 1000 y 1300 mm anuales. En los Llanos Orientales, los

suelos aunque arcillosos, funcionan como arenosos por sus excelentes

condiciones físicas que los hacen muy permeables y son además profundos,

con un pH que oscila entre 3.8 y 4.5 y la fertilidad baja. La temperatura

promedio es de 26ºC, con precipitaciones entre 2000 y 2500 mm (Cartagena,

2001).

3.3.3. Plagas

Dentro de las plagas que afectan las plantaciones de mango se encuentra la

mosca de las frutas Anastrepha spp, el falso piojo blanco Aulacaspis

tubercularis, la escama articulada Selenaspidus articulatus. Dentro de las

enfermedades fungosas se encuentra la antracnosis, ocasionada por

C.gloeosporioides; Oidium mangiferae y Diplodia theobromae que ocasiona

secamiento descendente y pudrición del fruto ( Ríos &Torres,1976;

Cartagena, 2001).

3.4. Mora de castilla (Rubus glaucus Benth)

El género Rubus se encuentra distribuido en la mayor parte del mundo. La

mora de castilla tiene como centro de origen las zonas altas tropicales de

América principalmente en Ecuador, Colombia, Panamá, Salvador,

24

Honduras, Guatemala, México e inclusive los Estados Unidos. En Colombia

se cultiva principalmente en la zona andina y las estribaciones de la

Cordillera Occidental, Departamentos de Nariño, Cauca, Huila, Tolima, Valle,

Caldas, Quindío, Risaralda, Antioquia, Cundinamarca, Santanderes y

algunos sectores del Meta, se calcula un área aproximada a las 4.500

hectáreas para 1996, con un rendimiento nacional que oscila entre las 8 y 10

toneladas por hectárea. El nombre de mora de castilla se originó en la época

de la colonia, donde las familias nobles que se daban el lujo de consumir

frutas, entre ellas la mora creían que procedían de Castilla España

(ERAZO,1998). Fue descubierta por Hartw y descrita por Benth, llamada

rubus, en latín rojo y glaucus, que en latín significa blanquecina, debido al

color del envés de sus hojas (ACERO, 1989).


Su posición taxonómica es

Reino: Vegetal

Clase: Angiospermae

Subclase: Dicotyledónea

Orden: Rosae

Familia: Rosaceae

Genero: Rubus

Especie: R.glaucus

La mora es una planta perenne, de porte arbustivo, semi erecta, tallos

bienales, espinudos, cubiertos de un polvo blancuzco, rastreros o semi

erguidos, forman macollas, lampiños, con aguijones que se extienden hasta

los pecíolos y la nervadura central del envés de las hojas; emite

constantemente brotes básales de longitud variable y que se pueden

25

ramificar. Hojas alternas con tres folíolos oval - lanceolados de 5 a 9 cm. de

largo, dos básales y uno terminal, bordes aserrados, de color verde en el haz

y blanquecino en el envés. Las ramas florecen en racimos terminales que

caducan una vez ocurrida la fructificación, algunas ramas se hacen

procumbentes cayendo al suelo y produciendo enraizamiento de los ápices.

Las flores son hermafroditas y actinomorfas de corola blanca, de 2 a 2.5 cm.

de diámetro, cáliz con cinco sépalos verdes agudos y persistentes, corola

con cinco pétalos blancos, rojos o lila, caedizos, periantio inserto en un

receptáculo o hipantio, con estambres en su base y cárpelos de 1 a 150 y

ovario supero; la flor terminal de la inflorescencia es generalmente de mayor

tamaño, la que se fecunda primero y desarrolla fruto más temprano. Los

frutos esféricos o elipsoidales, miden de 1 a 2.5 cm. de longitud; son de color

rojo oscuro en la madurez, con sabor ácido y aromáticos. Las semillas son

pequeñas y suaves de forma ligeramente cuneiforme, superficie reticulada y

tamaño variable, en general mide 5 milímetros de largo y 2 de ancho; su

germinación es lenta debido a la dureza e impermeabilidad del endocarpo.

Este es posiblemente el mejor de los Rubus de los trópicos americanos; de

esta especie se conocen varios cultivares. El fruto es agregado, constituido

por un conjunto de drupas suculentas (multidrupas) con una semilla en su

interior; pueden ser circulares, cónicos o elípticos, su tamaño puede ser

grande, mediano o pequeño, maduración dispareja debido a la posición en el

racimo, presentan fructificación continua aunque se observan picos de

producción a intervalos de 5 a 6 meses (Zapata, 2003)


El mejor desarrollo de la planta se presenta entre 1.800 y 2.400 metros de

altura sobre el nivel del mar. Después de los 2400 metros los rendimientos

son menores y disminuyen la calidad y tamaño de los frutos. Por debajo de

1800 metros se presenta también disminución severa del rendimiento por

26

problemas de plagas y enfermedades, principalmente. El cultivo posee un

mejor desarrollo con humedades relativas entre 70 y 80%, y Temperaturas

promedio entre los 15 y 19 °C, la humedad es un factor que se encuentra

ligado directamente al ataque por hongos cuando la humedad es superior a

80%. (Zapata, 2003).

Las regiones que tienen precipitaciones (lluvias) entre 1500 y 2500

milímetros son las ideales para el cultivo de la mora, esta precipitación debe

ser bien distribuida. Los periodos de menor lluvia coinciden con las épocas

de producción y los de exceso de lluvia propician al ataque de hongos que

afectan la producción. (Landazuri, 2000).

El suelo ideal para el cultivo de la mora es el de textura franca rico en materia

orgánica, que puede retener humedad, pero que no se encharque. La mora

crece en suelos ácidos (pH ácido), pero se desarrolla mejor en suelos

neutros de pH cercano al valor 7; la planta requiere suelos profundos, y es

exigente en nitrógeno, fósforo, potasio, calcio y magnesio. (Landazuri, 2000).

Una de las enfermedades mas limitantes dentro de este cultivo, es la

antracnosis, enfermedad causada por Colletotrichum sp. En las plantas

afectadas se observan manchas oscuras en ramas y tallos, que en su interior

se tornan de color café claro o café rojizo, Luego se produce el secamiento y

la muerte de la rama. La enfermedad puede atacar botones florales, brotes

tiernos, pedúnculos y frutos que se deshidratan y pudren. La importancia de

esta patogeno, radica en que no importa el grado de desarrollo en que se

encuentre la planta, de igual manera es susceptible al ataque del hongo.

(Cedeño et al, 1992).

27

3.4.3. Plagas

Dentro de la plagas se encuentran áfidos o pulgones Aphis sp , los cuales

chupan gran cantidad de savia y transmiten virus , debilitan las plantas y

propician la deformación de los frutos. La arañita roja Tetranychus sp, que

ataca el follaje y se localizan en el envés de la hoja, Anastrepha sp.,el

barrenador del tallo Epialus sp. Dentro de la enfermedades fungosas se

encuentra la pudrición del fruto causada por Botrytis cinerea; la muerte

descendente causada por C. gloeosporioides Penz y la marchitez por

Verticillium sp. (Tamayo, 2001)

3.5. Tomate de árbol (Solanum betaceum cav Sendt)

El tomate de árbol S. betaceum es una planta de tipo arbustivo originaria de

los bosques andinos de América, propia de clima templado, se encuentra

aun de forma silvestre en los bosques de varios países de Sudamérica, entre

otros: Colombia, Perú, Ecuador y Bolivia. Aunque el origen del tomate de

árbol es aún muy controvertido. Según Kramer y Zoom (1988), el tomate de

árbol era el único producido en las montañas de Java. También se cree que

la planta es originaria de Colombia, pero hay quienes consideran que su

origen es peruano y que se encuentra en forma silvestre en zonas de clima

frío moderado en la cordillera de los Andes y Brasil (Girard & Lobo, 1977).

En Colombia se cultiva en zonas de clima frío moderado principalmente en

los departamentos de Cundinamarca, Valle del Cauca, Caldas, Tolima,

Antioquia, Santander y Huila, en los cuales la producción es considerable

aunque no a gran escala (Federación Nacional de Cafeteros 1998). Hoy en

día esta fruta se produce con éxito en países como Nueva Zelandia,

28

Australia, Estados Unidos y otros países europeos donde es conocida como

"Tamarillo", Colombia se destaca en la producción y comercialización de

semillas y en el desarrollo de tecnologías para el cultivo de la fruta que han

sido introducidas a Europa y Norte América. Igualmente, existen importantes

perspectivas para la comercialización de la fruta con países como Japón y

Brasil (Lebn 1996).


El tomate de árbol es un arbusto que alcanza una altura de 2 a 3 metros. Su

posición taxonómica es la siguiente:

Reino: Vegetal

División: Angiosperma

Clase: Dicotyledónea

Orden: Tulifloras

Familia: Solanaceae

Genero: Solanum

Especie: S. betacea (Cav) Sendt.

Esta solanácea arbórea tiene un tallo semileñoso, poco ramificado, que crece

simpodialmente por yemas axilares, formando un tronco en zigzag; en la

parte más jóven alcanza buen desarrollo bajo condiciones favorables,

encontrándose plantas hasta de 5 metros de altura. Se propaga por semillas

o estacas de raíz; cuando la reproducción se hace por semilla, las raíces son

profundas y ramificadas, cuando se propaga por estaca, las raíces son

superficiales y bastante ramificadas. Al inicio el tallo es suculento, tomando

luego una consistencia leñosa, que se ramifica naturalmente entre los 8 y 10

meses de edad, a una altura que puede estar entre 1.80 y 2.40 metros,

29

formando ángulo de 90º o más entre el tronco y las ramas; las ramas

continúan ramificándose en forma casi plagiotrópica al suelo (León, 1968).

.

Las primeras hojas son de gran tamaño, de 15 a 30 cm y pueden alcanzar

hasta 60 cm de largo por unos 30 ó 40 cm de ancho, acorazonadas, enteras,

de consistencia cariácea, y verde brillante muy atractivo. Las hojas nuevas

son de color marrón, las cuales van distribuidas en forma de espiral, poseen

un pecíolo redondo y fuerte de 6 a 10 cm de largo que une la lámina con el

tallo; sus hojas son de larga duración, sobre todo cuando la planta no ha

empezado a producir, se ha visto que prevalecen aún después de las

cosechas, según el manejo que se la haya dado al cultivo ( Bernal y Lobo

1988).

Las inflorescencias aparecen como cimas curvas en las axilas de las hojas

superiores. Las flores son de pétalos blancos, tienen pedúnculos cortos y

finos; el cáliz, es verde-morado se forma de una base en forma de campana

y 5 dientes agudos. La corola de 5 pétalos largos y rosados, unidos por la

base, mide 12 a 16 mm. de diámetro. Las anteras y el pistilo, ocupan el

centro de la flor. Las anteras son biloculares y de color amarillo; el ovario es

de color crema, con forma de globo ovoide y con estilo robusto; el estigma

presenta tonalidades amarillas unidas (León, 1968).

Los frutos tienen forma ovalada y alargada, pasando por diferentes

tonalidades desde rosado pálido hasta purpúreo dependiendo de su etapa de

desarrollo; están suspendidos en pedúnculos largos, alcanzan a medir unos

10 cm de largo y 5cm de ancho; su pulpa es de color crema amarilla,

anaranjada o roja oscura, con un olor agradable y bastante jugosa. Las

semillas son pequeñas, semiplanas y de color blanco o crema. La cáscara

lisa y dura, de sabor amargo, se remueve al cocinar la fruta. Los frutos se

comen crudos y se preparan en dulces o conservas. El tomate de árbol tiene

30

cualidades físicas, nutritivas y organolépticas (Alto contenido de proteína y

vitamina A, calcio, fibra y azucares, entre otros) comparables a las mejores

frutas que actualmente se consumen y tienen un gran potencial exportador.

Pese a sus características sobresalientes no se le da la importancia que

merece dentro de la alimentación humana (Feicán et. al. 1999).


Crece en zonas con altitudes que varían de 1600 a 2400 metros sobre el

nivel del mar. Es una planta de climas templados y fríos. Su temperatura esta

entre 13° a 24° C siendo la óptima entre 16° y 19° C, pero puede resistir

temperaturas hasta de 0°C sin sufrir daños graves. No tolera vientos fuertes,

ya que se produce la caída de las flores, rotura de las ramas y destrucción de

las hojas.No necesita gran humedad atmosférica, razón por la cual, se cultiva

frecuentemente en zonas altas de clima seco (Feicán et. al. 1999). La

precipitación oscila entre los 1500-1600 mm anuales bien distribuidos. El

exceso de agua puede causar pudrición radical si los suelos tienen mal

drenaje. La falta de agua afecta el desarrollo y crecimiento del tomate de

árbol e influye sobre la formación del fruto. Este cultivo requiere suelos

sueltos, profundos, con un buen contenido de materia orgánica y bien

drenados. Preferiblemente deben ser suelos francos o franco-arenosos

(Tamayo, 1984; Bernal & Lobo, 1988)

3.5.3. Plagas

Dentro de los principales microorganismos reportados como agentes

causales de enfermedad en el tomate de árbol son: Colletotrichum sp.,

Phytophthora sp., Alternaria sp., Sclerotinia sp., Botrytis sp., Oidium sp.,

31

Pseudomonas solanacearum, Cercospora sp, Phoma sp; además de varias

plagas, virus y nematodos ya reportados. Una de las enfermedades mas

limitantes es la Antracnosis producida por Colletotrichum gloeosporioides y

recientemente se ha encontado C.acutatum, en la cual el hongo, ataca

hojas y frutos. En el follaje se presentan manchas de color oscuro, en los

frutos, se producen lesiones que afectan a la epidermis. Esta enfermedad

toma gran importancia al presentarse cuando las plantas se encuentran en

pleno desarrollo vegetativo, la humedad ambiental alcanza un 95% y la

temperatura es superior a 17 'C. Además cabe mencionar que esta

enfermedad produce perdidas de hasta el 90% (Parra, 1991; Tamayo, 2001)

3.6. Agente causal de la antracnosis

Una de los problemas de precosecha y poscosecha más limitantes en los

cultivos de frutas tropicales como el mango, el lulo, la mora, granadilla,

tomate de árbol es la antracnosis, que de acuerdo con los registros

bibliográficos es ocasionada por el hongo Colletotrichum spp, estado

anamorfo de Glomerella spp, estado telomorfo. El género Colletotrichum fue

establecido por Corda (1831), como un hongo que se caracteriza por

presentar conidias hialinas, curvadas y fusiformes y un acérvulo setoso. El

género Colletotrichum presenta un número diverso de especies que incluyen

los patógenos y los saprofitos. Las especies de este género son

consideradas como las más exitosas dentro de los hongos patógenos de

plantas y se presentan tanto en zonas templadas como tropicales. Este

patógeno puede afectar gran parte de los tejidos, órganos de la planta en

desarrollo, y frutos. Su capacidad para causar infecciones latentes o

quiescentes lo ubican dentro de los patógenos de poscosecha más

importantes (Jeffries et al.,1990).

32

3.6.1. Posición taxonómica

3.6.1.1. Estado anamorfo

REINO Fungi

SUBDIVISION Deuteromycotina

CLASE Deuteromycetes

ORDEN Melanconiales

GENERO Colletotrichum

3.6.1.2. Estado telomorfo

REINO Fungi

SUBDIVISION Acomycotina

CLASE Pyrenomycetos

ORDEN Sphaeriales

GENERO Glomerella

3.6.2. Generalidades del patógeno

Colletotrichum presenta un micelio enramado inmerso, septado que toma

coloración hialina hasta castaño pálido. Acérvulos, separados o confluentes

en forma de disco o de cojín, ceroso, subepidermal, epidermal y subcuticular

típicamente con setas o espinas negras en los bordes o entre los

conidióforos, formado de pseudoparénquima con paredes delgadas o

gruesas; conidióforos simples, elongados; conidias hialinas, ovoides u

oblongadas (Barnett 1960, Holliday 1995).

33

Las setas presentes o ausentes, originadas irregularmente desde el

pseudoparénquima, más o menos fuertes, no ramificadas, con un ápice

agudo u obtuso, suaves y con una pared gruesa septada en algunos casos.

Los conidióforos septados, ramificados sobre la base de color castaño claro o

hialina, formados de la parte superior de las células del pseudoparénquima

son simples, cortos, erectos. Las conidias también son hialinas, aseptadas

de forma cilíndrica, fusiforme, de una sola célula, que durante la germinación

se torna de color castaño pálido, se septan y forman el apresorio. A menudo

las esporas son tan numerosas que pueden formar masas brillantes de color

rosado (Blanchard, 1992; Holliday 1995).

Las formas de Colletotrichum tiene diferentes modelos de comportamiento en

la naturaleza, variando de saprofito a cepas parasíticas especializadas con

un estrecho rango de hospederos. Los conidios son producidos en masas

mucilaginosas, a menudo rosadas, bastante conspicuas y típicamente

hundidas, con un contorno irregular en las lesiones necróticas (denominada

antracnosis) sobre frutos, hojas y tejidos.

Algunas lesiones sobre frutos en desarrollo llegan a presentarse en relieve;

como chancros, costras, cicatrices, o con forma de verruga en apariencia.

Algunas especies causan infecciones latentes sobre los frutos, que se

desarrollan en lesiones de antracnosis durante la fase de maduración. Dichas

lesiones, estudiadas en C. musae; surgen de una penetración directa de la

cutícula desde el apresorio característico del género. Pero algunas lesiones

surgen sin la presencia de un estado latente, cuando la infección toma lugar

a través de una herida en el tejido del hospedero. La muerte descendente de

las ramas es frecuentemente causada, pero una infección en la raíz es

menos común. Las especies, generalmente sobreviven por largos periodos

de tiempo sobre los desechos vegetales o sobre o dentro del suelo. El

patógeno más común en los trópicos es Colletotrichum gloeosporioides (=G.

34

cingulata) especie en la cual se han descrito algunas diferencias junto con

otras especies de Colletotrichum (Holliday 1995).

3.6.2.1. Desarrollo de la enfermedad

3.6.2.1.1 Germinación y formación del apresorio.

El proceso de infección de Colletotrichum spp involucra una secuencia

común de eventos (Dodd et al, 1989). En la mayoría de los casos el inoculo

llega a los hospederos por medio del agua o dispersión de los conidios los

cuales se adhieren a la cutícula de la planta, germinan en un periodo entre

las siguientes 12-24 h; se produce el tubo germinal, el cual crece usualmente

una distancia corta (10-20 µm), antes de formar el apresorio terminal, que

penetra la cutícula directamente. Las dos fuentes de inoculo son los conidios

producidos en acérvulos, y las ascosporas, producidos y liberados de los

peritecios. Las especies de Colletotrichum utilizan dos fuentes principales

de infección: colonización intracelular o la colonización intramural

subcuticular (Figura 1).

Después de la deposición en la superficie de las plantas, las conidias y las

ascosporas germinaran experimentando una diferenciación compleja que

requiere de síntesis de proteínas para formar apresorios, los cuales son

esenciales para la infección. Durante la germinación una septa es producida

por la mayoría de las especies de Colletotrichum. Los apresorios a menudo

son sésiles, pero pueden formar diferentes tubos germinativos y algunas

veces son producidos en la punta del micelio ramificado. Los apresorios

pueden formarse rápidamente en ausencia del hospedero, por ejemplo

cuando la conidia germina en una superficie dura como una lámina de vidrio

o una membrana de nitrocelulosa (Bailey 1992).

35

La formación del apresorio es un prerrequisito para la penetración directa de

la superficie del hospedero; el apresorio juega un papel importante para que

el patógeno pueda sobrevivir. La germinación de las conidias, formación del

apresorio, y la formación de hifas infectivas son tres procesos

independientes que interactúan como estimuladores o inhibidores presentes

en exudados vegetales. Los apresorios pueden ser globosos, subglobosos

con o sin lóbulos, y pueden diferir en el tamaño, como por ejemplo, el

apresorio globoso de C. lindemithianum tiene un diámetro de 5 a 7 µm,

mientras el de C. graminicola tiene de 10 a 12 µm; los apresorios de C.

gloeosporioides miden entre 6-20 µm x 4-12 µm y los apresorios de C.

acutatum miden entre 8.5-10 µm x 4.5-6 µm; pero tienen muchas

características en común, como las paredes, las cuales tienen dos o tres

capas compuestas de distintos carbohidratos y melanina. La melanina

requiere síntesis de proteínas y es la encargada de darle al apresorio su

típica apariencia oscura; esta puede proteger al apresorio de la irradiación,

pero especialmente está involucrada en los procesos de penetración (Bailey

1992).

A diferencia de la poca información que existe sobre la adhesión de las

conidias a la superficie de las plantas se ha demostrado la adhesión de los

apresorios a las plantas y otras superficies. La adhesión de los apresorios, no

solo garantiza que el patógeno permanezca en contacto con el hospedero el

tiempo que sea necesario para que ocurra la penetración enzimática o

mecánica. La formación del apresorio está acompañada por la secreción de

material mucilaginosos a su alrededor, que junto con la matriz de esporas

están comprometidos en la protección del apresorio, especialmente durante

la adhesión a la superficie de la planta (Bailey 1992).

36

Figura 1. Ciclo de la enfermedad de la antracnosis causado por Glomerella cingulata y Colletotrichum o Gloeosporium sp. Tomado de Agrios 2002.

3.6.2.1.2. Formas de penetración

Dentro de las formas de penetración de las especies de Colletotrichum a la

superficie de las plantas tenemos: a través de aberturas naturales como los

estomas, lenticelas; a través de heridas y penetración directa de la barrera

cuticular, siendo esta la forma más común. La infección a través de heridas

no es común, debido a que las heridas no facilitan la infección. La mayoría de

las enfermedades de las frutas tropicales se presentan después de un

periodo de latencia. Después de una penetración exitosa de las especies de

Colletotrichum sobre la superficie de los frutos, el crecimiento del hongo se

restringe en la capa epidérmica. Solo después de la maduración de los

frutos, los cuales producen tejidos que promueven la reactivación del

patógeno el microorganismo es capaz de producir la enfermedad.

37

3.6.2.1.3. Infección y colonización de tejidos vegetales

Cuando las lesiones de Colletotrichum son examinadas con microscopia

electrónica, las hifas se encuentran a través de los tejidos, donde las células

están muertas y a menudo descoloridas, presentándose la degradación de la

pared celular del hospedero. Las hifas pueden presentarse por dentro de las

células, dentro de la pared celular y en espacios intercelulares, la gran

cantidad de patógeno y de tejido destruido es evidencia de la gran eficacia

de este microorganismo. Pese a su naturaleza destructiva, su éxito como

patógeno es casi exclusivamente determinado por las formas en las cuales

inicia la infección y coloniza los tejidos vegetales. Muchas especies de

Colletotrichum presentan un proceso infectivo de dos fases; involucrando una

fase asintomática inicial, durante la cual el patógeno se establece en los

tejidos del hospedero, seguido por una fase destructiva visible. Durante la

fase asintomática, algunos de estos patógenos invaden las células sin

matarlas, es sobre esta base que muchas especies de Colletotrichum han

sido consideradas como hemibiotróficas. Este hongo es conocido como un

“patógeno intracelular hemibiotrófico”, donde se hace énfasis no solo en su

naturaleza biotrófica sino en su capacidad para penetrar la pared celular y

crecer dentro de la lumena. Para otras especies de Colletotrichum la

penetración de la cutícula es seguida por un crecimiento bajo la cutícula,

donde, a diferencia de otros patógenos subcuticulares, como Venturia

inaequalis, disuelve extensamente la matriz pectica de la pared de las células

epidermales (Bailey 1992). Algunas especies como C. acutatum como se

puede observar en la figura 2 pueden presentar varias estrategias de

infección como el crecimiento biotrófico; el desarrollo necrotrófico intramural y

subcuticular y un desarrollo intra e intercelular y hemibiotrófico subcuticular

(Adaskaveg et al., 2005).

38

3.6.2.1.3.1. Patógenos hemibiotróficos

El inicio de la fase biotrófica en especies hemibiotróficas de Colletotrichum

es seguida de una fase necrotrófica, la cual inicia con la aparición de una hifa

secundaria. Esta hifa se ramifica a través del tejido hospedero de forma inter

e intracelularmente. En este estado algunas especies como C.

lindemuthianum, las células hospederas son muertas rápidamente en el

avance de la infección y las paredes celulares son degradadas por enzimas

fúngicas despolimerizadoras. Durante la fase biotrófica de interacción, se

diferencia entre la producción de un micelio inicial “primario” y la transición a

un “micelio secundario”, las hifas de penetración aumentan, se hinchan para

formar vesículas de infección; la membrana plasmática vegetal se invagina

alrededor de la vesícula infectiva. Los protoplastos permanecen vivos

durante el estado biotrófico de interacción. Las hifas primarias colonizan

progresivamente nuevas células epidermales y mesófilas, llegando a

constreñirlas con su paso a través de las células. La matriz interfacial que

separa la membrana plasmática de la planta de la pared celular fúngica se

mantiene y nuevamente infecta las células que permanecen viables por algún

tiempo (Adaskaveg et al., 2005; Whatton et al.,2004 ).

Aproximadamente 48 horas después de la penetración inicial, la hifa

necrotrófica se forma, dicha hifa no esta rodeada por una capa matricial. En

células que contienen hifas primarias y secundarias la membrana plasmática

y la matriz alrededor de la hifa primaria se desintegran. La hifa secundaria

secreta enzimas que degradan la pared celular en su avance, se dispersan y

se expanden rápidamente generando lesiones necróticas. Los procesos

hemibiotróficos son estrategias empleadas por muchas especies de

Colletotrichum, por ejemplo se ha reportado infección vesicular dentro de

tejidos de pepino infectados con C. lagenarium, y se ha hecho énfasis en la

39

invaginación de la membrana plasmática de células de mandarina alrededor

de la hifa de infección de C. gloeosporioides (Mendgen, K. & Hahn, M. 2002).

3.6.2.1.3.2. Patógenos subcuticulares intramurales

Durante el estado inicial de la infección, otras especies de Colletotrichum

crecen exclusivamente bajo la cutícula y dentro de la pared periclinal de las

células epidérmicas, como es el caso de C. circinas en cebolla y C. capsici

en algodón. En este tipo de infección, después de la germinación de las

esporas se forma el apresorio melanizado, desde el cual se desarrolla la hifa

de penetración. La cutícula del hospedero es penetrada y las hifas del hongo

se diseminan subcuticularmente dentro de las paredes de las células

epidérmicas del hospedero, causando la disolución de la estructura de la

pared, seguido por la muerte celular. Durante los últimos estados de

infección, las hifas penetran células epidérmicas y mesófilas causando la

posteriormente la muerte a las células hospederas (Whatton et al.,2004)..

Durante las primeras 24 horas después de la penetración no hay evidencia

visible de la infección, algo que, como en el estado inicial de la infección

hemibiotrófica ocurre con ausencia de síntomas. Después del crecimiento

hifal dentro de la pared anticlinal de la capa de las células epidérmicas y

dentro de las paredes de las células corticales, se produce una red

intramural a través del tejido de hifas, en los dos días siguientes. Algunas

especies de Colletotrichum pueden emplear los dos tipos de estrategias

infectivas, como por ejemplo la infección producida por C. gloeosporioides en

Stylosanthes spp (Whatton et al.,2004; Mendgen et al., 2002).

Hay pocos estudios sobre la colonización de tejidos hospederos por C.

acutatum. Estos estudios indican que la estrategia de infección adoptada por

40

C. acutatum depende del hospedero a ser colonizado. Sobre los estolones y

hojas de fresa, C. acutatum actúa como subcuticular, intramural necrótrofo

sin un estado biótrofo detectable, mientras en arándano y almendro, el hongo

adopta ambas formas de infección. Este hongo puede cambiar la forma de

infección cuando coloniza diferentes tejidos hospederos sobre cultivos. Por

ejemplo, se observa un comportamiento diferente cuando infecta pétalos y

tejidos de las hojas. En arándano, C. acutatum presenta una forma

infecciosa como un hemibiótrofo intracelular cuando infecta frutos maduros

de cultivos susceptibles. Sin embargo, cuando infecta frutos de cultivos

resistentes de arándano, conocidos como “Elliott” se observa que actúa

como subcuticular, necrotrófico intramural. Además, en cultivos susceptibles,

el modo de colonización hemibiotrófico del tejido del fruto conduce a la

formación de un acérvulo pulvinado por 108 horas posteriores a la

inoculación. En cultivos resistentes de la variedad “Elliott” presenta un modo

de crecimiento subcuticular, intramural necrotrófico, el acérvulo no se

presenta hasta 192 horas despues de la inoculación y entonces aparece muy

pequeño y no contiene muchas conidias (Whatton et al.,2004).

3.6.2.1.3.3. Desarrollo y reproducción necrotrófica

Cuando los tejidos de la planta son colonizados exitosamente por

Colletotrichum, por medio de infección hemibiotrófica y/o intramural, el

patógeno crece activando una comportamiento necrotrófico clásico. La fase

necrotrófica es responsable de los síntomas de la antracnosis y añublos que

son enfermedades típicas causadas por especies de Colletotrichum. Durante

este estado el patógeno crece extensamente a través del tejido hospedero,

dentro de las células, en las paredes, a través de las paredes y en espacios

intercelulares (Mendgen et al., 2002).

41

Pese a la dispersión y la destrucción de los tejidos, otro aspecto importante y

raramente conocido de la fase de crecimiento necrotrófica es que las

cutículas de los frutos afectados permanece intacta, sugiriendo que las

cutinasas están involucradas en la penetración inicial de la superficie de la

planta, entonces la subsecuente síntesis y/o actividad de estas enzimas debe

ser inhibido. Una cutícula intacta puede tener varias funciones. Esta puede

actuar para mantener el patógeno dentro del tejido infectado, pero es de

mayor importancia, el papel aún no definido en la reproducción de

Colletotrichum. La producción tanto del acérvulo como del peritecio sobre la

superficie de la planta requiere una cutícula intacta (Mendgen et al., 2002).

Figura 2. Estrategias de infección de Colletotrichum acutatum. A, crecimiento biotrófico. B, desarrollo necrotrófico intramural, subcuticular. C, Interacción hemibiotrófica D, Desarrollo intra e intercelular y hemibiotrófico subcuticular. Cn = conidia; Gt = tubo germinal; Ap = appresorio; Iv = vesícula infección; Ph = hifa primaria; Sh = hifa secundaria; Sc = conidia secundaria. Las células muertas se representan con líneas diagonales. Ilustraciones de J. E. Adaskaveg, 2005.

3.6.2.2. Fuentes de inóculo y dispersión

Las mayores fuentes de inóculo son las conidias en acérvulos y las

ascosporas liberadas del peritecio, que cuando jóvenes, se encuentran

dentro de un material húmedo mucilaginoso conocido matriz de esporas, la

cual es una mezcla compleja, que comprende principalmente polisacáridos y

42

glucoproteínas con varios componentes menores que incluyen varias

enzimas (Bailey 1992). La matriz cumple funciones importantes, algunos

estudios han mostrado que pueden inhibir la germinación de esporas, para

asegurar la distribución del inoculo (Louis y Cooke 1985). Hay evidencia que

la matriz mantiene la viabilidad de las esporas bajo condiciones de baja

humedad dentro de los acérvulos secos o dentro de la masa de esporas

seca, además protege las esporas de temperaturas extremas, la luz

ultravioleta y de los metabolitos tóxicos de las plantas. Esto es de particular

significancia ecológica en clima tropical donde las conidias son distribuidas

sobre la superficie de los frutos tropicales en el campo y están expuestos a

fluctuaciones diurnas marcadas de humedad relativa. (Nicholson y Morales,

1980). (Bailey 1992).

Las conidias producidas en acérvulos se dispersan por el salpique de las

lluvias, lo cual indica que hay separación y transporte del patógeno por el

impacto de las gotas, siendo estos dos aspectos esenciales para los

procesos físicos en el ciclo de la enfermedad; por lo tanto la lluvia y la

intensidad de ella, juegan un papel importante en la dispersión de esporas y

posiblemente tenga el mismo efecto en todas las especies de Colletotrichum

(Bailey 1992). Además de este factor de dispersión, también pueden hacerlo

los insectos de los órdenes Díptera, Coleóptera y Homóptera ya que

transportan las esporas adheridas a su cuerpo a partir de los frutos que se

encuentran en el árbol o el suelo. Una vez transportadas las conidias, el éxito

de la patogénesis depende de la unión del propágalo, a la superficie de la

planta.

43

3.6.2.3. Infección quiescente y latente

La infección quiescente en el contexto de enfermedades poscosecha

involucra la inhibición del desarrollo del patógeno a través de condiciones

fisiológicas impuestas por el hospedero hasta que se lleva a cabo el estado

de maduración. Una vez el hongo penetra la capa exterior de la fruta, este

permanece allí en estado de dormancia o “quiescencia” hasta que ocurren

cambios en la superficie del fruto los cuales proporcionan las condiciones

adecuadas para la permitir una infección. Los cambios bioquímicos que se

presentan durante la maduración del fruto, se piensa que son los que

permiten el curso de la infección. En aguacate, los cambios en los

compuestos antifúngicos llamados “dienes”, son importantes en la regulación

de la quiescencia en la antracnosis (Prusky, 1996). En frutas inmaduras los

niveles de dienes disminuyen, permitiendo que el hongo reactive su

crecimiento. Según Swimburne (1983), un organismo se puede tornar

quiescente en cualquiera de las siguientes etapas de su vida: en

germinación, elongación del tubo germinativo, formación del apresorio,

penetración y colonización. Las esporas de Colletotrichum germinan al

producir un melanizado, con una gruesa pared resistente del apresorio el

cual es firmemente anclado al hospedero. Un punto de infección se

desarrolla al penetrar la cutícula del huésped y la pared celular con la

asistencia de enzimas cutinasas y celulolíticas. La fase inicial de la

colonización del huésped es biotrófica y sólo después de un largo tiempo la

típica lesión de antracnosis se desarrolla. Esta fase latente puede ser tan

corta y presentarse en pocos días como ocurre en la mayoría de

enfermedades de floración, dos o tres semanas, o varios meses después,

cuando la infección quiescente ocurre en la fruta (Bailey, 1992).

Swimburne (1983), menciona que las siguientes condiciones pueden

promover la quiescencia: Condiciones fisiológicas y físicas adversas

44

impuestas temporalmente por hospedante sobre el patógeno, modificación

de la capacidad patogénica del organismo y resistencia temporal del

hospedante. Además este tipo de infecciones ocurren en floración, o

permanecer en frutos inmaduros hasta su maduración y activarse en los

períodos de poscosecha; sin embargo, existen otras circunstancias que

pueden activar estas infecciones, como condiciones inapropiadas de

almacenamiento de los frutos, daños físicos, mecánicos o plagas, estrés o

cambios bruscos de las condiciones climáticas en el campo; cambios

fisiológicos en la maduración de la fruta y deficiente nutrición. Las infecciones

quiescentes son comunes en una amplia variedad de frutas, vegetales y

cosechas de flores; son causadas tanto por bacterias como hongos.

C. gloeosporioides ha sido asociado con infecciones quiescentes y

enfermedades en poscosecha sobre frutos tales como el aguacate, mango,

papaya, maracuyá, guayaba, granadilla, cítricos, manzana, uva. C. acutatum

ha sido reportado sobre hospederos de frutas cultivadas en zonas templadas

y subtropicales incluyendo manzana, uva, melocotón, almendra, kivi. Bajo

condiciones tropicales, C. acutatum se ha reportado causando pérdidas en

poscosecha en guayaba. Se han reportado numerosos casos de reportes

sobre varias especies de Colletotrichum asociadas a un solo hospedero; por

ejemplo, la fresa puede ser infectada por C. acutatum, C. fragariae y C.

gloeosporioides. Los cítricos pueden ser afectados por C. gloeosporioides y

C. acutatum causando tres enfermedades diferentes. En los últimos años

muchos documentos han descrito diferencias entre C. gloeosporioides y C.

acutatum y su infección sobre frutas de zonas templadas (Peres, 2002)

Los costos económicos de las infecciones quiescentes causadas por

Colletotrichum son proporcionalmente mayores que las perdidas en campo,

debido a los costos generados durante la cosecha, transporte,

almacenamiento y empaque. Desafortunadamente las infecciones

45

quiescentes no son visibles o predecibles en el momento de la cosecha y el

periodo de quiescencia puede ser prolongado así como ocurre en la

antracnosis en banano (Musa spp).

Las infecciones latentes de las plantas por patógenos han sido reconocidas

por muchos años y a menudo son consideradas uno de los más grandes

niveles de parasitismo, aunque el hospedero y el parásito coexisten con un

daño mínimo hacia el hospedero. Verhoeff (1974) afirma que una infección

latente verdadera debe involucrar una relación parasítica que eventualmente

induce síntomas. Agrios define la infección latente como el estado en el cual

un hospedero es infectado con un patógeno pero no muestra los síntomas.

Las infecciones latentes persisten hasta que los síntomas son inducidos a

aparecer por condiciones ambientales y nutricionales o por el estado de

madurez del hospedero o el patógeno. Las infecciones latentes pueden ser

consideradas como un tipo de tolerancia o resistencia a ciertos patógenos,

donde el parásito encuentra el ambiente interno inadecuado para su

crecimiento y multiplicación. La compresión de las infecciones latentes

contribuyen al desarrollo de medidas efectivas de control, así como la

comprensión de la penetración, colonización, expresión de la enfermedad y

pérdidas en campo (Sinclair, 1991).

Colletotrichum spp., agente causal de la antracnosis, tiene un periodo de

latencia en muchos hospederos. Muchos de los síntomas se desarrollan

después de prolongados períodos de tiempo de alta humedad, así como en

plantas senescentes o aquellas que llegan a estresarse. Esta fase latente

puede ser corta, de unos pocos días como en la mayoría de las

florescencias, o varios meses como ocurre en las infecciones quiescentes de

las frutas. El daño del tejido por procesos fisiológicos o mecánicos

invariablemente resulta en la activación de infecciones quiescentes para

roducir infecciones necróticas (Waller, 1992).

46

3.6.2.4. Síntomas y rango de hospederos

Las enfermedades causadas por Colletotrichum spp se presentan en un

amplio rango de plantas hospederas distribuidas a nivel mundial

registrándose tanto en precosecha como en poscosecha. Los problemas

causados en poscosecha son particularmente prevalentes en los trópicos

donde a menudo son un factor limitante en la calidad de exportación

ocasionando serias pérdidas en los cultivos de frutas. La mayoría de las

enfermedades de poscosecha exhiben el fenómeno de quiescencia siendo

las especies de Colletotrichum o Glomerella, patógenos que presentan dicho

tipo de infección.

En plantas de P. ligularis, la antracnosis se presenta en ramas, pecíolos de

las hojas, en los frutos antes de la cosecha y posteriormente es limitante en

poscosecha. Si la infección en el pecíolo es severa, las hojas pueden

desprenderse y producirse una defoliación de la planta. Las infecciones

ocurren en el envés de las hojas a lo largo de las venas, produciendo una

coloración oscura, color ladrillo o púrpura, la cual se torna pardo oscura o

casi negra. En los frutos se forman manchas circulares en la cáscara, de

color pardo oscura y algo hendidas. Si el ataque es temprano, durante el

desarrollo del fruto, éste cae prematuramente o se queda pequeño y

totalmente deformado. Cuando existe alta humedad en el ambiente, el hongo

produce abundantes esporas, las cuales son diseminadas por el viento.

Estas esporas son depositadas en las ramas y frutos donde germinan y

producen áreas necróticas (ICA, 1996)

En plantas de mora de castilla R. glaucus, la enfermedad se presenta como

manchas oscuras en ramas y tallos; en el interior de estos tejidos, se

observa una coloración café claro a café rojizo, posteriormente, las ramas se

secan y mueren. Esta enfermedad también puede atacar botones florales,

47

brotes tiernos, pedúnculos y frutos los cuales se deshidratan y pudren.

Cuando este cultivo se siembra en zonas de alta humedad, la enfermedad

ataca la base de los tallos, a diferencia de otras especies de frutales el

patógeno no es frecuente en estructuras florales y reproductivas. Con el

progreso de la enfermedad las manchas se agrandan, el centro toma una

coloración grisácea con bordes oscuros; luego aparecen las estructuras

reproductivas del patógeno, constituidas por acérvulos y masas de conidias

de color salmón. Uno de los síntomas más frecuentes se presenta en las

ramas o tallos cortados o heridos durante las labores de cultivos, sitios por

donde el microorganismo puede penetrar, ocasionando lesiones de color

oscuro y bordes definidos que van colonizando en forma rápida todo el

tejido, causando en el primer caso muerte descendente de la rama y en el

segundo, muerte desde la base del tallo hacia las ramas superiores. Con

alguna frecuencia la enfermedad también se manifiesta en las yemas

produciendo a su alrededor manchas oscuras con bordes bien definidos, en

algunos casos el patógeno puede avanzar en forma ascendente y necrosar

la rama recién formada. Los frutos producidos sobre las ramas y pecíolos no

maduran en forma uniforme. Los tejidos de mayor lignificación son los más

susceptibles para el desarrollo de la enfermedad, esta enfermedad puede

afectar entre el 50 y 70% de los tallos de las plantas cultivadas (FORERO de

La Rotta, 2001).

En tomate de árbol S. betacea el hongo afecta las hojas, ramas y

especialmente los frutos en cualquier estado de desarrollo y ocasiona

pérdidas que oscilan entre el 10 al 25% de los frutos cosechados. En los

frutos los síntomas iniciales aparecen 6 días después de la inoculación, como

pequeñas lesiones aceitosas que gradualmente se vuelven negras,

aumentando de tamaño y cubriendo total o parcialmente el fruto; las lesiones

tienen bordes definidos y el centro deprimido, que se cubre de una masa de

color rosa-salmón correspondiente a las estructuras fructíferas del hongo,

48

cuando las condiciones climáticas son favorables. Posteriormente los frutos

se secan y se momifican cayendo al suelo o permaneciendo adheridos a la

rama (Tamayo, 2001).

En mango M. indica , las lesiones primero aparecen en las panículas florales

como pequeñas manchas de color café o negras, las cuales se agrandan , se

unen y pueden causar ennegrecimiento total de la inflorescencia y

marchitamiento antes que el fruto inicie su formación. Posteriormente las

infecciones producen lesiones hundidas en frutos jóvenes, los cuales por lo

general se caen. Cuando la infección ocurre en frutos grandes (4-5cm),

usualmente la lesión no se desarrolla, pero el microorganismo permanece en

estado de quiescencia hasta que los frutos maduran y aparecen lesiones

hundidas de color oscuro. En todos los casos el desarrollo de la lesión está

acompañado de masas rosadas como consecuencia de la maduración del

acérvulo. La infección en la flor o la fruta pueden dar lugar a una baja

producción, la fase mas perjudicial de la enfermedad se inicia como una

infección quiescente. El crecimiento del patógeno se retoma después de la

cosecha cuando la fruta inicia su proceso de maduración y se desarrolla la

antracnosis. El efecto del hongo en el rendimiento radica en el hecho de

afectar frutos en todos los estados de desarrollo, los cuales se desechan

para la comercialización al momento de la cosecha y selección para el

empaque (Cartagena & Vega, 2001)

En cultivos de lulo, la antracnosis se manifiesta en los frutos como lesiones

redondas de apariencia café, que en condiciones de alta humedad relativa se

tornan negruzcas. La lesión es hundida en el centro y aumenta de tamaño en

forma rápida, formando anillos concéntricos que cubren el fruto hasta

deformarlo, momificarlo y producir su caída. Aunque las manchas en los

frutos debida a la antracnosis, se presenta sobre la epidermis, es frecuente

que la enfermedad se extienda a la pulpa del fruto y le proporcione un sabor

49

desagradable o amargo. Algunas cepas del hongo ocasionan una pudrición

blanda que propicia la caída de los frutos. Así mismo es frecuente que otros

hongos invadan al fruto a través de lesiones de antracnosis y aceleren la

velocidad de descomposición. Los frutos demasiado maduros son

particularmente susceptibles a la infección. Las pérdidas por esta

enfermedad alcanzan un 40% de la producción (Tamayo, 2001).

3.6.2.5. Consideraciones epidemiológicas

La epidemiología de la enfermedad causada por antracnosis ha sido

estudiada en varios estados de desarrollo del cultivo. En mango, la

enfermedad es particularmente severa sobre las hojas jóvenes y si se

presentan climas húmedos durante la floración, la enfermedad sobre los

frutos se puede prevenir. La infección ocurre durante el desarrollo de los

frutos especialmente en periodos de cosecha pero usualmente permanece

en estado de quiescencia hasta la maduración de la fruta. En plantaciones de

mango el desarrollo del microorganismo se ve favorecido sobre un amplio

rango de condiciones ambientales (10-30ºC, >95% humedad relativa)

ocasionando lesiones sobre las hojas, ramas terminales defoliadas,

inflorescencias momificadas, y en la flor donde probablemente se disemina

con el transcurso de los años (Bailey, 1992)

Cuando el patógeno se encuentra fuera del hospedero, el desarrollo de las

enfermedades se ve restringido por el requerimiento de agua durante todas

las fases del ciclo de la enfermedad. La esporulación no solo requiere altas

humedades sino que la liberación y dispersión de las esporas es dependiente

del agua libre (usualmente la lluvia) y se requiere por lo menos unas cuatro

horas más de humedad a las temperaturas óptimas de 20-25ºC para la

germinación e infección de las mismas. La dependencia de la disponibilidad

de agua durante todas las fases del ciclo de la enfermedad por fuera del

50

hospedero, permite que se identifiquen unos patrones temporales y

espaciales para su desarrollo. Sin embargo, la ubicuidad de las fuentes de

inóculo tiende a sobrepasar cualquier restricción en el desarrollo de la

enfermedad que la dispersión de esporas por agua puede imponer.

El período latente característico de las enfermedades ocasionadas por

Colletotrichum en las fases activas de los tejidos susceptibles, permite un

ciclo epidémico rápido, de tal forma que los niveles de enfermedad crecen

aceleradamente durante los breves períodos cuando las fases susceptibles

del cultivo coinciden con las condiciones de humedad. La variabilidad de

latencia del patógeno representa una adaptación muy importante a las

condiciones de la fisiología del tejido y de los patrones climáticos que ocurren

durante el ciclo de cultivos perennes. Asimismo, esta variabilidad, se

convierte en un impedimento hacia la aplicación de medidas de control

exitosas, las cuales deben tener en cuenta epidemias cortas y severas en

flores y la separación temporal o larga, entre la infección y el desarrollo de la

enfermedad en el fruto (Waller, 1992).

Álvarez (1996); Páez y Zuluaga (1998), muestran una marcada correlación

de la enfermedad con la precipitación a través de todo el año, demostrando

que el hongo es dependiente la precipitación tanto para su germinación como

para su dispersión y desarrollo de la epidemia. Los estudios sobre la

infección y epidemia de la enfermedad, realizados por Rondón (1998)

determinaron con claridad que las hojas, los pedúnculos, las ramas jóvenes,

los racimos, botones, flores, sépalos de la flor y los frutos en cualquier

estado, son tejidos potencialmente susceptibles al hongo; razón por la que

las alternativas de manejo, deben concebir alternativas integrales en el

manejo del inoculo.

51

En cuanto a la dinámica del inoculo, el agua principalmente y en segundo

lugar, los insectos de los ordenes Díptera, Coleóptero y Homóptera juegan

un papel básico para la epidemia; la primera como diseminador de esporas

por salpique y lavado de espora, y los insectos en el transporte de esporas a

partir especialmente de frutos esporulados, ya sea en el árbol o en el suelo.

Estos componentes del patosistema en su conjunto deberán ser objeto de

mayor interpretación y análisis, buscando a su vez optimizar las estrategias

para su manejo y control, pues inocules sin un medio de transmisión tampoco

constituyen epidemias (Rondón, 1998).

3.6.2.6. Métodos diagnósticos

Aunque los métodos tradicionales no nos permiten diferenciar entre las

especies y subespecies de Colletotrichum, las herramientas moleculares han

ganado popularidad la última década, siendo empleados exitosamente para

diferenciar entre las poblaciones de Colletotrichum de muchos hospederos.

La sensibilidad al benomyl ha sido empleada principalmente para estimar el

potencial de tales compuestos (benzimidazoles) en el control químico. Este

método sencillo puede ser utilizado para una caracterización adicional de

poblaciones locales de Colletotrichum asociadas con enfermedades

particulares de antracnosis (Freeman et al., 1998). Aunque esta prueba

permite diferenciar entre C. acutatum y C. gloeosporioides debe ser

complementada con otro tipo de pruebas moleculares debido a que se puede

presentar resistencia a los productos químicos. La prueba cualitativa de la

proteasa (Martín & García-Figueres, 1999) es una prueba rápida que

permite diferenciar entre C. acutatum y C. gloeosporioides por la producción

de enzimas extracelulares donde se generan halos de 3 a 4 mm de diámetro

sobre el medio de cultivo, esta prueba debe ser complementada con

52

herramientas moleculares para establecer la presencia de biotipos o

variaciones del genero.

Dentro de las técnicas moleculares empleadas se encuentran: el análisis

DNA (rRNA) ribosomal; primers específicos han sido designados

principalmente deacuerdo con las disimilitudes en la secuencia de las

regiones ITS de diferentes aislamientos de Colletotrichum., dichos primers

se han usado para diferenciar entre C. acutatum y C. gloeosporioides por

medio de la amplificación de fragmentos con PCR; análisis de polimorfismo

en DNA nuclear, empleando (RFLP) y análisis de enriquecimiento de A+T–

rich DNA asociado con (mt) DNA.

Los análisis de rDNA son métodos empleados para la identificación

taxonómica de las especies, mientras que los análisis usando GcpR1 y otros

elementos repetitivos de DNA, A+T-rich, DNA RFLPs, and ap-PCR son

métodos empleados para determinar diversidad de las subpoblaciones entre

las especies (Freeman et al., 1998). Los métodos moleculares son usados

para la caracterización de las especies responsables de la antracnosis de

diferentes cultivos debido a que las descripciones morfológicas no son

confiables para la identificación del patógeno. La diversidad genética de las

diferentes poblaciones además es valorada de cada población derivada del

hospedero.

3.6.2.7. Control de la enfermedad

Se ha planteado un programa de soqueo y manejo integrado de la

enfermedad (Tamayo 1995); siendo favorable desde el punto de vista

productivo y en rendimiento. Dentro de las prácticas recomendadas se

requiere mantener distancias de siembra entre los 3 y 4 m entre plantas,

53

deshoje y eliminación del inóculo potencial, permitir la aireación del cultivo y

mejor visualización para la detección y remoción de frutos enfermos,

aplicación de fungicidas con adherentes cada ocho días en invierno y cada

quince días en verano y la rotación de fungicidas para evitar crear resistencia

en el hongo. El control químico se realiza basado en fungicidas, sistémicos y

protestantes en rotación. Aplicar productos como Captan y a base de cobre

durante la época de floración proporcionan un buen control de la

enfermedad. Desinfectar las bodegas aplicando en las paredes una lechada

de cal viva con hipoclorito de sodio al 5%. Los empaques deben se lavados

con detergente y desinfectados con una solución de yodo o hipoclorito de

sodio al 3-5%. Las frutas pueden asperjarse o sumergirse en una solución de

Tiabendazol a 2500 ppm o Perchloraz a 500 ppm. En los puntos de venta

desinfectar las vitrinas exhibidoras y constantemente retirar frutos enfermos.

54

4. MATERIALES Y MÉTODOS:

4.1 Tipo de estudio

El tipo de investigación realizada fue exploratoria debido a que durante la

revisión de literatura se encontró que se han realizado estudios similares con

respecto a la caracterización del agente causal de la antracnosis

(Colletotrichum spp.) en otros lugares del mundo y sobre huéspedes

diferentes a los utilizados en este estudio; adicionalmente, aunque se han

realizado estudios de patogenicidad cruzada utilizando este microorganismo

en otros países del mundo no se ha realizado en Colombia utilizando los

huéspedes descritos originarios de la zona andina y comparándolos con una

de las enfermedades mas estudiadas en mango, especie que prefiere

condiciones diferentes para su cultivo. Por lo tanto, la investigación examinó

el tema a nivel colombiano.

Al mismo tiempo, la investigación fue evaluativa y descriptiva debido a que el

propósito de este estudio fue decir cómo son y cómo se manifiestan macro y

microscópicamente las estructuras características del patógeno

Colletotrichum spp. a partir de los aislamientos obtenidos de los cinco

huéspedes, a través de la medición y observación de las mismas con la

mayor precisión posible y si se presentaba alguna variación en la expresión

de los síntomas al inocular los aislamientos procedentes de los otros

huéspedes. El estudio se realizó en el laboratorio de fitopatología de la

Universidad Nacional, sede Bogotá.

55

4.2 Recolección de muestras

Los aislamientos se colectaron a partir de frutos de lulo (Solanum quitoense

Lam), tomate de árbol (Solanum betacea Sendt), granadilla (Passiflora

ligularis Juss), mango (Mangifera indica L) y tallos de mora (Rubus glaucus

Benth), con síntomas iniciales de antracnosis adquiridos en el mercado local

y en zonas productoras de los frutos como en Fusagasuga, Granada, Puente

Nacional, para frutos de clima frío moderado y de Ibagué en el caso de los

frutos de mango (Figura 3). Se realizaron varios muestreos para cada uno

de los frutos de interés con el fin de obtener patógenos con orígenes

diferentes y poder observar diversidad genética.

Figura 3. Síntomas de antracnosis. A. Mango. B, Lulo. C, Granadilla. D, Tallos de mora. E, F Tomate de árbol (Foto C. A. Contreras).

4.3 Aislamientos

Al iniciar el procedimiento, la superficie de los frutos se lavó con agua y jabón

y se secó con una toalla de papel estéril (Bernstein, et al., 1995). El tejido de

interés se obtuvo con la ayuda de un bisturí estéril cortando fragmentos de

tejido infectado y sano de aproximadamente 5x5 mm desde la periferia de las

lesiones, los cuales se manipulan con pinzas estériles y se sumergen durante

56

5 minutos en una caja de Petri con hipoclorito de sodio a una concentración

de 0.525% con el fin de eliminar la flora normal presente en el tejido

(Cedeño, et al., 1993; Dhingra, et al., 1995). Transcurrido el periodo de

desinfestacion, los fragmentos de tejido se enjuagaron 3 veces

sumergiéndolos en agua destilada estéril para eliminar los residuos de

desinfestante que pudiesen interferir con el desarrollo normal del patógeno.

Posteriormente bajo condiciones asépticas, se secaron los fragmentos de

tejido utilizando una toalla de papel estéril, para eliminar los excesos de

humedad que contribuyeran con la contaminación del aislamiento.

Finalmente, los fragmentos de tejido se sembraron en cajas de Petri con

papa-dextrosa-agar, se realizaron 3 repeticiones por fruto (ANEXO 1)

enterrando cuatro fragmentos de tejido en posición equidistante en la placa

de agar a través de manipulación con pinzas (Cedeño, et al., 1993; Dhingra,

et al., 1995).

Las placas de agar sembradas se incubaron a temperatura ambiente (±20°C)

durante 8 días, cada uno de los aislamientos obtenidos fueron resembrados

en placas de PDA por separado con el fin de purificar el hongo; así mismo,

se realizaron observaciones microscópicas (10 y 40X) coloreadas con azul

de lactofenol (100 ml de lactofenol, 1 ml de azul de algodón al 1% y 20 ml de

ácido acético glacial) con el fin de verificar la naturaleza del patógeno y

familiarizarse con la morfología de las conidias, el micelio y otro tipo de

estructuras típicas del microorganismo (Byrne, et al., 1997). La verificación

de la naturaleza del hongo se realizó con base en la clave para la

identificación de hongos imperfectos de Barnett (1999).

57

4.4. Conservación de los aislamientos

Una vez confirmado que los aislamientos obtenidos pertenecían al

microorganismo en estudio, se realizaron cultivos monospóricos para obtener

colonias puras. Para este fin se tomó una caja de petri de cada uno de los

aislamientos de 8 días de crecimiento, a los cuales se les agregó 10 ml de

agua destilada estéril con Tween 20 a una concentración de 100μl/l y con la

ayuda de un pincel estéril se barrió la superficie de las colonias. La

suspensión obtenida se filtró para recuperar las conidias. Finalmente, la

suspensión conidial se sembró en forma masiva y se incubó a 25ºC durante

las primeras 12 horas, para observar la germinación de las conidias a partir

de las cuales se recuperaron las colonias monospóricas que posteriormente

se sembraron de forma individual en cajas de Petri con PDA y se incubaron a

25º C.

Los cultivos monospóricos derivados de cada aislamiento fueron

almacenados en tubos con PDA en pico de flauta a 4°C, con el propósito de

limitar su crecimiento, hasta su utilización durante el desarrollo de este

trabajo. Con el fin de mantener colonias jóvenes se realizaron subcultivos

periódicamente en PDA, inoculando el medio con cuadros de agar con el

hongo de 5x5mm, los cuales fueron incubados durante 7 días a temperatura

ambiente (±20ºC).

4.5. Caracterización macroscópica

La descripción macroscópica comprende aspectos como el color de las

colonias, el tipo de micelio y la tasa de crecimiento, estos aspectos han sido

empleados para realizar y dar a conocer una descripción morfológica del

hongo Colletotrichum.

58

4.5.1. Color de las colonias

Los métodos de identificación tradicionales, han empleado el color de las

colonias como criterio de clasificación de las especies del género

Colletotrichum; en el caso de C. gloeosporioides, las colonias son grises y las

de C. acutatum de color salmón o rosado. El color de las colonias se

determinó examinando la masa conidial y micelial sobre una superficie

blanca. La observación de los cultivos se realizó a partir de cepas de 8 días

de incubación a (±20ºC) en cajas de Petri con PDA a partir de un cultivo

monospórico (Smith and Black, 1990).

Mediante este criterio establecimos dos grupos de aislamientos los

asilamientos de color gris fueron denominamos como GRAN-CG, LULO-CG,

MANGO-CG, MORA-CG, TOAM-CG, TOMR-CG; aislamientos de granadilla,

lulo, mango, mora, tomate de árbol amarillo y tomate rojo respectivamente.

Los aislamientos de color salmón, rosado fueron designados como GRAN-

CA, LULO-CA, MANGO-CA, MORA-CA, TOAM-CA, TOMR-CA.

4.5.2. Tipo de micelio

El tipo de micelio se determinó mediante la observación directa, teniendo en

cuenta los siguientes criterios: micelio algodonoso, esponjoso, velloso y si el

crecimiento del micelio se extendía por la superficie del agar, si penetraba el

medio y la presencia de micelio aéreo.

59

4.5.3. Crecimiento radial diario en PDA

El crecimiento radial de cada uno de los aislamientos se evalúo en cajas de

Petri con 18 ml de PDA, sembradas con trozos de agar de 5x5 mm con el

crecimiento del hongo que procedían de cultivos de 3-4 días, mantenidos a

temperatura ambiente (± 20°C ). El crecimiento radial se determinó

midiendo el diámetro de la colonia a intervalos de 24 horas durante 7 días,

incubando a 20, 25 y 28 o C y realizando 3 repeticiones por tratamiento

(Bernstein, et al., 1995).

Para determinar las tasas de crecimiento se empleó la hoja de cálculo

EXCEL 2003, mediante el procedimiento de regresión lineal, empleando, el

promedio de las pendientes lineales de tres repeticiones. El análisis

estadístico comprendió un ANOVA de dos factores (Aislamiento y

temperatura) para 3 repeticiones, con la prueba de Tukey donde se evalúo si

se presentaban diferencias en los tratamientos, para este procedimiento se

empleó el programa STATGRAPHICS Plus versión 5.1.

4.6. Caracterización microscópica

Los microorganismos aislados se identificaron mediante observaciones

microscópicas y con la ayuda de claves taxonómicas con el objetivo de

reconocer el hongo Colletotrichum y con el fin de determinar si los

aislamientos correspondían a una o varias especies, dentro de los aspectos

que se tuvieron en cuenta se encontraban la forma y tamaño de las conidias

que han sido criterios empleados por los sistemas tradicionales de

identificación.

60

4.6.1. Conidias

4.6.1.1. Forma y tamaño de las conidias

A partir de cada uno de los aislamientos incubados durante 9-12 días a 20,

25 y 28ºC se preparó una suspensión conidial en agua destilada estéril y se

determinó la forma de las conidias por observación de 50 conidias escogidas

al azar; de esta manera se ubicaron en tres categorías establecidas para la

forma de este género: 1). Fusiformes, (F) lados ahusados en ambos

extremos, 2) Cilíndricas, (C1) conidias con lados rectos y extremos redondos

a ambos lados y 3). Cilíndricas, (C2) conidias con lados rectos, un extremo

puntudo y el otro redondo. La forma y el tamaño de las conidias se determinó

utilizando microscopía de luz (Smith and Black, 1990).

El tamaño conidial de cada aislamiento se determinó midiendo el largo y el

ancho de 50 conidias escogidas al azar y expresado como un rango de

medias. El tamaño de las conidias se determinó por medio de un micrómetro

ocular el cual se calibró utilizando un micrómetro de platina, para determinar

la distancia lineal que representa cada unidad o valor micrométrico en un

aumento de 40X. Los micrómetros de platina son similares a una lámina

portaobjeto y tienen grabadas escalas que representan medidas exactas y

convencionales. (Smith and Black, 1990).

Para observar la variación de la forma y el tamaño de las conidias en cada

una de las temperaturas evaluadas se realizó un ANOVA de dos factores

(para el tamaño: Largo o ancho, temperatura y para la forma: el tipo de forma

y la temperatura), para establecer diferencias significativas entre los

tratamientos. La prueba de tukey se realizó para determinar las medias que

son significativamente diferentes unas de otras. Se empleó el programa

STATGRAPHICS Plus versión 5.1.

61

4.7. Sensibilidad al Benomyl

Una de las pruebas mediante las que se logra establecer si los aislamientos

de Colletotrichum pertenecen a las especies C. gloeosporioides y C

.acutatum es la sensibilidad de los aislamientos al Benomyl, por lo cual se

preparó una suspensión conidial de 1 x 105 conidias/ ml de cada uno de los

aislamientos (Freeman, et al., 1998). Luego se impregnaron discos de papel

filtro de 1 cm de diámetro en cuyo centro se practicaron perforaciones

circulares, con el producto Benlate en la dosis comercial de 1g/L y una dosis

superior de 1,5g/L; los discos se dejaron secar a temperatura ambiente en

una cámara de flujo laminar. Posteriormente se colocaron los discos en cajas

de petri con PDA y se inoculó 10 µL con la suspensión conidial en el centro

del disco. El control consistió en discos impregnados con agua destilada

estéril inoculadas. La evaluación se realizó asignando valores de cero si no

se presentó crecimiento sobre los discos y de uno y hubo crecimiento. El

montaje se realizó con tres repeticiones por dosis evaluada, las lecturas se

realizaron en 7 días y se incubó a (±20ºC).

4.8. Prueba de la proteasa

La prueba de la proteasa ha sido empleada para diferenciar las especies C.

gloeosporioides y C .acutatum. El medio para evaluar la producción de la

protesa (ANEXO 2), nos permitió establecer dos tipos de reacción una (+) y

otra (-); las cajas se sembraron con ayuda de un sacabocado de 5 mm de

diámetro, tomado bloques de agar son crecimiento micelial de cada

aislamiento, se realizaron 5 repeticiones (Martín & García-Figueres, 1999).

El principio de la prueba (prueba +) se basa en la producción de la enzima

proteasa fuera de las células (como una exoenzima), alrededor del medio,

catalizando el rompimiento de las proteínas de la leche, principalmente la

62

caseína, en aminoácidos y péptidos. Esta reacción ocasiona que en el agar,

normalmente opaco por la leche se observen zonas transparentes alrededor

de la zona de crecimiento del microorganismo

4.9. Pruebas de patogenicidad cruzada

Esta prueba se realizó con el fin de observar la capacidad patogénica que

tienen los aislamientos de un fruto específico en generar síntomas de

antracnosis sobre frutos sanos en estado de maduración de lulo (S.

quitoense), tomate de árbol (S. betacea ), granadilla (P. ligularis), mango (M.

indica) y tallos de mora (R. glaucus). Se emplearon 3 frutos por aislamiento

y dos como controles, los cuales fueron previamente lavados con agua y

jabón para remover residuos de fungicidas y elementos contaminantes.

Posteriormente, su superficie se sometió durante dos minutos en una

solución de hipoclorito de sodio a una concentración de 0.525%, para

desinfectarlos y luego se enjuagaron en agua destilada estéril (Bernstein, et

al., 1995).

A cada uno de los frutos y los tallos se les realizó 4 círculos con un lápiz de

cera, indicando los siguientes tratamientos, cumpliendo con un diseño

completamente aleatorio: 1. Agar con crecimiento micelial sobre una herida

realizada e el fruto o tallo; 2. Inóculo de conidias aplicado sobre el fruto o tallo

sin realizar heridas; 3. Inóculo de conidias sobre heridas; 4. Agar con

crecimiento micelial sobre el fruto o tallo sin realizar heridas. Los controles

consistieron en frutos o tallos sobre los cuales se colocaron bloques de agar

sin crecimiento micelial e inoculaciones con agua destilada estéril, para el

control negativo. El control positivo consistió en inocular la cepa sobre el

hospedero del cual fue aislado. Las heridas se realizaron con una aguja de

disección estéril. Inmediatamente después de la inoculación todos los

63

materiales se colocan en cámara húmeda (90-100%), y diariamente se

revisan para observar el desarrollo de la enfermedad. Las cámaras húmedas

se mantuvieron a una temperatura de (±20ºC), por un período de tiempo de

10 días para los frutos y 15 días para los tallos de mora. De los tejidos

finalmente infectados se realizan aislamientos para comprobar los postulados

de Koch (Cedeño et al., 1993).

4.9.1. Preparación del inóculo

Como inóculo se usan cuadros de agar de 5x5 mm con el patógeno,

extraídos de colonias de 7 días de crecimiento en agar PDA y gotas de

suspensión conidial (1x105 conidias/ml). La suspensión conidial se recolectó

mediante el cepillado de la superficie de la colonia con un pincel estéril,

agregando 10 ml de agua destilada estéril, que posteriormente se filtró para

separar el micelio y obtener las conidias (Manandhar et al., 1995).

64

5. RESULTADOS Y DISCUSION

5.1 Descripción macroscópica

5.1.1. Características de la colonia.

El crecimiento de todos los aislamientos se presentó de forma radial; el

aspecto micelial predominante fue algodonoso. La presencia de micelio

aéreo se describió como superficial en el 83.33% de los casos y con

presencia de micelio aéreo denso, 16.67% para las cepas MANGO-CG,

MORA-CG (ANEXO 3) (Fig 4). Esta característica morfológica ha sido

descrita por Katan en Colletotrichum gloeosporioides aislado de aguacate

(Freeman et al., 1998) quien propone varias pautas como las del tipo

conidial: con masas de conidias y sin micelio aéreo; el tipo conidial - micelial,

con micelio aéreo denso y masas de conidias; el tipo micelial -superficial,

con poco micelio aéreo o conidias; el tipo micelial con micelio aéreo denso el

tipo protoperitecial y peritecial. Estas pautas demuestran la variabilidad

existente dentro de las especies y que es un criterio limitante en la

clasificación taxonómica, pese a que aporta otra serie de características en la

descripción del hongo (Freeman, et al., 1998).

TIPO DE MICELIO

16,67%

83,33%

Micelio aereo densoMicelio aereo superficial

Figura 4. Tipo de micelio predominante en los aislamientos

65

Respecto al color de las colonias, el gris se observó en el 41.67% de las

colonias, comprendiendo los aislamientos de LULO-CG, MANGO-CG,

MORA-CG, TOAM-CG y TOMR-CG; el 33.33% de las colonias presentó

color salmón, correspondiente a las cepas GRAN-CA, LULO-CA, MORA-CA,

TOMR-CA; los aislamientos GRAN-CG y MAN-CA presentaron color blanco,

y representaron el 16,67%; finalmente el 8.33% que correspondió al

aislamiento TOAM-CA, presentó color rosado (Figura 5 y 6), (ANEXO 3).

COLOR DE LAS COLONIAS

16,67%

41,67%8,33%

33,33%BLANCOGRISROSADOSALMON

Figura 5. Color de la colonia predominante en los diferentes asilamientos

El micelio de los hongos inicialmente fue blanco y se tornó salmón o rosado

debido a la producción de masas de esporas con la edad, característica que

se presenta en asilamientos de C. acutatum, mientras que las colonias de C.

gloeosporioides posteriormente presentan tonalidades grisáceas. El color de

las colonias fue característico del género Colletotrichum y de acuerdo a la

descripción realizada por Simmonds 1965 para C. acutatum y por Arx 1957,

1981; Morgue, 1971; Sutton, 1980, Baxter 1983; Holliday, 1989 para C.

gloeosporioides se presumió la presencia de al menos estas dos especies

(Freeman et al., 1998; Sutton, 1992), sin embargo, la morfología de la colonia

del género Colletotrichum varia entre y dentro de las especies, además esta

sujeto a variaciones por características como el medio, el sustrato y los

cambios de la temperatura entre otros (Adaskaveg & Hartin 1997; Freeman

66

et al.,1998). Se han demostrado incongruencias entre las descripciones

morfológicas y los estudios moleculares para la identificación de especies de

Colletotrichum (Afanador et al.,2003)

5.2. Curva de Crecimiento a 20,25 y 28ºC

La temperatura óptima de crecimiento para las cepas GRAN-CA, GRAN-CG,

LULO-CA, LULO-CG, MORA-CA, MORA-CG, TOAM-CA, TOAM-CG, se

presentó a los 20ºC, mientras que a los 25 y 28ºC disminuyó. En las cepas

MANGO-CG y MANGO-CA hubo un crecimiento óptimo a los 28ºC y su

menor crecimiento fue a los 20ºC,

Figura 6. Variación en el color de las colonias. A, aislamiento de mora MORA-CG, colonia gris. B, lulo LULO-CA, colonias color salmon. C, tomate de árbol TOAM-CA, colonias color rosado. D, mango MANGO-CG, colonias color gris oscuro.

Se puede observar un efecto significativo de la temperatura (p< 0.05), del

tipo de aislamiento (p< 0.05), y del efecto de estos dos factores sobre el

crecimiento de las colonias (p< 0.05), (ANEXO 4). Dado que los aislamientos

de granadilla, lulo, mora, tomate de árbol crecen mejor a una temperatura de

20ºC y los de mango a 28ºC, probablemente haya una relación con las

67

condiciones donde se desarrollan los hospederos; en este caso hablamos de

plantas de clima frío moderado donde las temperaturas ideales para su

desarrollo oscilan entre los 16 y 18ºC, para granadilla; en lulo de 18-20ºC;

mora 14-18ºC; tomate de árbol, 14-20ºC; mientras para mango, fruto de clima

caliente, su temperatura de desarrollo oscila entre los 26-28ºC; dicha relación

se puede apreciar en la figura 7. Además los factores genéticos, biológicos y

fisiológicos existentes dentro y entre las especies de Colletotrichum permiten

el desarrollo y adaptabilidad de las especies bajo ciertas condiciones

(Wheeler & McGahen, 1952).

Swart (1999), reporta una temperatura óptima de 25ºC para aislamientos de

C. gloeosporioides en mango realizados en Sudáfrica y establece diferencias

significativas de la temperatura en respuesta al crecimiento, de acuerdo con

la zona de origen de los aislamientos. Peres et al. (2002), trabajó con

aislamientos de Colletotrichum en maracayá, mango, papaya, guayaba,

banano, fresa, aguacate los cuales presentaron un crecimiento óptimo a los

28ºC, lo cual corrobora el resultado de este estudio en los aislamientos de

mango. Aislamientos obtenidos a partir de durazno y fresa tienen un

comportamiento similiar cuando son incubados a una temperatura de 25ºC

(Adaskaveg & Hartin, 1997).

Según Agrios (1998), el efecto de la temperatura sobre el desarrollo de una

enfermedad particular después de la infección, depende de la interacción

entre el patógeno y el hospedero. El desarrollo rápido de la enfermedad

(tiempo mínimo requerido para completar el ciclo), usualmente se presenta

cuando la temperatura es óptima para el desarrollo del patógeno, pero está

sobre o bajo la temperatura óptima del desarrollo del hospedero. A

temperaturas más bajas o más altas con relación a la temperatura óptima del

patógeno, o cercanas a la temperatura óptima del hospedero, el desarrollo de

la enfermedad es más lento. Si la temperatura mínima, óptima y máxima para

68

el patógeno, el hospedero y la enfermedad son las mismas, el efecto de la

temperatura en el desarrollo de la enfermedad es aparentemente a través de

la influencia sobre el patógeno, el cual es activado a la temperatura óptima

del hospedero aún cuando no presente su tasa de crecimiento óptima. En

muchos casos la temperatura óptima para el desarrollo de la enfermedad

muestra ser diferente a la temperatura óptima del patógeno como del

hospedero, como sucede en el hongo Thielaviopsis basicota en tabaco.

0102030405060708090

100

20 25 28Temperatura (ºC)

Crecimiento (mm)

MANGO-CGMANGO-CAGRAN-CGGRAN-CAMORA-CGMORA-CALULO-CGLULO-CATOMR-CGTOMR-CATOAM-CGTOAM-CA

Figura 7. Curva de crecimiento del hongo Colletotrichum spp en frutos de granadilla, lulo, mango, tomate de árbol y tallos de mora bajo temperaturas de 20, 25 y 28ºC

5.2.1 Tasa de Crecimiento a 20, 25 y 28ºC

La tasa de crecimiento vario deacuerdo con las temperaturas evaluadas. En

los aislamientos de clima frío moderado se observó que fue mayor a los 20ºC

y menor a los 25 y 28ºC; de modo opuesto sucedió para los aislamientos de

mango donde disminuyó a los 25 y 20ºC, siendo óptima a los 28ºC. La tasa

de crecimiento promedio de las cepas GRAN-CA, LULO-CA, MANGO-CA,

MORA-CA, TOAM-CA, TOMR-CA fueron menores bajo las tres temperaturas

en comparación con las cepas GRAN-CG, LULO-CG, MANGO-CG, MORA-

CG, TOAM-CG y TOMR-CG (ANEXO 5).

69

La tasa de crecimiento y las relaciones de temperatura han sido usados para

diferenciar entre C. gloeosporioides y C. acutatum. Varios reportes sugieren

que los aislamientos de C. acutatum crecen a una tasa significativamente

menor que la de C. gloeosporioides, lo cual podría explicar la diferencia entre

las tasas de crecimiento entre este grupo de aislamientos (Bernstein et

al.,1995; Smith & Black, 1990).

Aunque algunos autores establecen que la tasa promedio de crecimiento

para C. gloeosporioides es de 13 a 14 mm/día (Gunnell ,1992); mientras para

C. acutatum es de 8 a 9 mm/día (Dyko, 1989) esta tasa varía de acuerdo al

tipo de hospedero y las condiciones de origen. En frutos de almendro en

California y en Israel la tasa promedio de crecimiento para las especies de C.

gloeosporioides es de 2.2 (1.6-2.8) y para C. acutatum de 7.7 (4.9-9.9) en

frutos inmaduros (Freeman et al.,1998). En fresa se ha descrito a C.

gloeosporioides como un microorganismo de rápido crecimiento a

temperaturas de 32ºC, mientras C. acutatum presenta crecimiento mas bajo

(Smith & Black, 1990).

5.2.1. Características de las conidias a 20, 25 y 28ºC

Forma

La forma predominante en las cepas GRAN-CA, LULO-CA, MANGO-CA,

MORA-CA fue del tipo fusiforme, alrededor de un 50-60% y de un 80-100%

para TOAM-CA y TOMR-CA, estas cepas también presentaban conidias del

tipo C1 y C2. Las cepas de GRAN-CG, presentaron forma cilíndrica del tipo

C1 en un 80%, mientras en los aislamientos LULO-CG, MANGO-CG, MORA-

CG, TOAM-CG y TOMR-CG, se observó el tipo de conidias C2 en un 60-

80%. En este estudio también se observó una forma de conidia en forma de

70

pesas, que ha sido reportada como ocasional (Tamayo, 2001). La figura 8

nos muestra, el tipo de formas conidiales que se presentaron durante la

caracterización de los aislamientos y en la figura 9, se puede apreciar que

en la mayoría de los aislamientos se presentó al menos dos tipos de forma

conidial, que en forma general comprendió las de tipo C1 y C2, aún cuando

fueron sometidos al tratamiento de las tres temperaturas.

La forma de las conidias no varió significativamente en ninguna de las

temperaturas evaluadas (p>0.05), ni bajo el efecto de interacción entre la

temperatura y tipo de aislamiento (p>0.05), sin embargo, se presentó una

diferencia significativa en cuanto a aislamientos (p< 0,05), siendo muy

marcado entre los aislamientos de LULO-CG, MANGO-CG, MORA-CG,

TOAM-CG y TOMR-CG y GRAN-CG frente a los aislamientos LULO-CA,

MANGO-CA, MORA-CG, TOAM-CA, TOMR-CA y GRAN-CA ,(ANEXO 6).

Fig 8. Forma de las conidias. A, Conidias con forma fusiforme, con ambos extremos terminados en punta (F). B, Conidias con forma cilíndrica, con ambos extremos redondos (C1). C, Conidias cilíndricas, con un extremo redondo y otro agudo (C2). D, Conidias en forma de pesa (P). (Foto C.A. Contreras) La variación en la forma de las conidias entre aislamientos de Colletotrichum,

morfológicamente se ha empleado como un método tradicional de

clasificación y en términos generales se ha descrito que las conidias de C.

gloeosporioides, son de forma cilíndrica y las de C. acutatum son fusiformes

71

respectivamente. Muchos autores indican una gran variación en la forma de

la espora dentro de ambos taxa (Smith & Black, 1990; Walker, Nikandrow &

Millar, 1991, Lardener et al.., 1999).

Lardener (1999) menciona que las conidias de C. acutatum, pueden ser

cilíndricas con uno a ambos lados agudos o con un extremo terminado en

punta como las características que presenta las C2. También se ha

documentado la producción de conidias secundarias – fialoconidias formadas

en medios de cultivo poco después de la germinación de la espora

especialmente en C. acutatum (Stoneman, 1898; Baxter, Van der Westhuizen

& Ricker 1983, Buddie et al., 1999), este tipo de conidia es generalmente

mas pequeña y mas variable en forma que las producidas en los cuerpos

fructíferos.

Sin embargo, este criterio no es consistente para discernir entre ambas y

otras especies ya que hay muchas cepas de Colletotrichum que presentan,

morfología y tamaños conidiales intermedios, además de mostrar una

amplia variación en características de su colonia.

A

0

10

20

30

40

50

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

GRANCA

GRANCG

LULOCA

LULOCG

MANGOCA

MORA-CA

MORACG

TOAM-CA

TOAM-CG

TOMR-CA

TOMR -CG

Aislamientos

Nº Conidias

C1

C2

FP

72

B

0

10

20

30

40

50

60

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

C1

C2 F P

GRAN-CA

GRAN-CG

LULOCA

LULOCG

MANGO-

MANGOCG

MORA-CA

MORACG

TOAM-CA

TOAM-CG

TOMR-CA

TOMR-CG

Aislamientos

Nº Conidias

P

F

C2

C1

C

0

10

20

30

40

50

60

C1

C2 F C1

C2 F C1

C2 F C1

C2 F C1

C2 F C1

C2 F C1

C2 F C1

C2 F C1

C2 F C1

C2 F C1

C2 F C1

C2 F

GRANCA

GRANCG

LULOCA

LULOCG

MANGOCA

MANGOCG

MORACA

MORACG

TOAMCA

TOAMCG

TOMRCA

TOMRCG

Aislamientos

Nº ConiidasF

C2

C1

Figura 9. Efecto de la temperatura sobre la forma de las conidias. A 20ºC. B, 25ºC y C,

28ºC

73

5.2.1. Tamaño de las conidias

El largo de las conidias no varió significativamente a los 20, 25 y 28ºC;

(p>0.05), ni se presentó una variación conjunta influenciada por los factores

temperatura y aislamiento (p>0,05). El ancho de las conidias varió

significativamente respecto a la temperatura y los aislamientos evaluados (p<

0,05), pero, la interacción entre los factores asilamientos y temperatura no es

significativa (p>0,05) (ANEXO 7y 8). En la figura 10, se pueden observar las

variaciones en cuanto al ancho y largo de las conidias cuando los

asilamientos fueron sometidos a las tres temperaturas. La tabla 1, muestra

los aislamientos que presentaron los mayores tamaños conidiales.

Fruto Aislamientos Tamaño (µm)

Granadilla GRAN-CA 17.5 x 7.5

Granadilla GRAN-CG 17.5 x 7.5

Lulo LULO-CA 17.5 x 2.5

Lulo LULO-CG 17.5 x 2.5

Mango MANGO-CA 15 x 2.5

Mango MANGO-CG 17.5 x 2.5

Mora MORA-CA 15 x 2.5

Mora MORA-CG 25 x 2.5

Tomate amarillo TOAM-CA 25 x2.5

Tomate amarillo TOAM-CG 17.5 x 2.5

Tomate rojo TOMR-CA 15 x 2.5

Tomate rojo TOMR-CG 17.5 x 2.5

Tabla 1. Tamaño de las conidias.

74

Según los sistemas de clasificación tradicionales, el tamaño de las conidias

para C. gloeosporioides varia entre 12-17 x 3.5- 6 µm y las de C. acutatum

8.5-16.5 x 2.5-4 µm, Sutton (1992) y aunque en este estudio algunos

tamaños exceden los rangos propuestos y otros tamaños se encuentran

dentro de los establecidos para C. gloeosporioides y C. acutatum se

considera que este criterio no es el mas adecuado para diferenciar entre

dichas especies.

En estudios realizados en Colombia sobre diferentes frutos, se ha podido

determinar que el tamaño de las conidias vario entre 13-18 x 4.4-6.6 µm

para Colletotrichum sp y de 10.3-18.7 x 3.7-5.6 µm para Colletotrichum

acutatum aislado de Tamarillo; en Passiflora, 12-16 x 5-7 µm para

Colletotrichum sp y en Mango de 12-14.5 x 5-7 µm para Colletotrichum

gloeosporioides (Afanador et al., 2003). En lulo el tamaño vario entre 9.52-

22.25 x 3.17-9.52 para especies de C. gloeosporioides y C. acutatum

(Cerón, 2004), en mora de castilla 11-13.3 x 3.1 µm para C. gloeosporioides

(Gonzáles & Perilla, 2001) y en tomate de árbol 8.49-18.2 x 2.5- 3.97 para C.

gloeosporioides (Romero, 1999).

Sanders & Korsten (2003) encontraron variaciones considerables en la

longitud de las conidias de C. gloeosporioides pero el ancho permaneció

constante, contrario a lo que se reporta en este trabajo, donde se encontró

diferencia en el ancho y no en la longitud de las conidias. Estos autores

establecen que no hay una correlación evidente entre el radio ancho/largo y

la virulencia de los aislamientos cuando se inoculan frutos de mango y de

aguacate.

Pese a que C. acutatum es conocido por producir conidias directamente

sobre el micelio y no necesariamente en los acérvulos, tanto en cultivos

puros como en inoculaciones artificiales, las dimensiones de las esporas

75

producidas en substratos naturales pueden diferir de las presentes en

cultivos artificiales (Buddie et al., 1999).

B

Figura 10. Efecto de la temperatura sobre el tamaño de las conidias. A, efecto sobre el ancho de las conidias. B, efecto sobre el largo de las conidias

A

Temperatura

AISLAMIENTO GRAN-CA GRAN-CG LULO-CA LULO-CG MANGO-CAMANGO-CGMORA-CA MORA-CG TOAM-CA TOAM-CG TOMR-CA TOMR-CG

2,6

3,1

3,6

4,1

4,6

5,1

20ºC 25ºC 28ºC

Ancho

(µm)

Temperatura

LARGO (µm)

AISLA GRAN-CAGRAN-CGLULO-CALULO-CGMANGO-CAMANGO-CGMORA-CAMORA-CGTOAM-CATOAM-CGTOMR-CATOMR-CG

11

12

13

14

15

20ºC 25º 28ºC

76

5.3. Prueba de Benomyl

En el tratamiento con benomyl, se observó que las dos dosis utilizadas (1 y

1.5 g Benlate/ L) inhibieron el crecimiento de las cepas GRAN-CG, LULO-CA,

MANGO-CG, MORA-CG y TOAM-CG, contrario a lo que ocurrió con las

demás cepas donde hubo crecimiento micelial sobre los discos impregnados

con benomyl. Los controles presentaron crecimiento normal sobre los discos

impregnados con agua destilada (ANEXO 10).

Esta prueba se utiliza para diferenciar entre las especies C. gloeosporioides

y C. acutatum (Freeman et al., 1998; Bernstein, 1995), por lo cual los

aislamientos que fueron sensibles al benomyl se considera que pertenecen a

la especie C. gloeosporioides, mientras que a aquellos que no son sensibles

pertenecen a C. acutatum como se puede observar en la figura 11.

De la Isla (1994), menciona que el mecanismo de acción de los

benzimidazoles se centra en inhibir el proceso mitótico fungoso, bloqueando

a la vez la síntesis de ácido desoxirribonucleico. El benomyl y la mayoría de

fungicidas sistémicos son convertidos en la superficie de las plantas al

compuesto metil benzimidazol carbamato (MCB, carbendazim), el cual

interfiere en la división nuclear de los hongos que son sensibles (Agrios

1999).

El Benomyl (Benlate), empleado como control químico de la antracnosis, ha

demostrado ser efectivo en un 59-80%, en frecuencias de aspersión de 8–15

días con dosis de 0,5 g/L y de 1g/L. Con los resultados obtenidos se puede

apreciar que concentraciones superiores y las concentraciones son efectivas

en el control de la enfermedad cuando el agente causal es C.

gloeosporioides, mientras que para el control C. acutatum, se debe pensar en

una alternativa ya que es un hongo más agresivo y no es controlado con

77

dicho producto. Además ambos hongos se pueden presentar generando

lesiones, en diferentes lugares del fruto o del tallo, así como en una misma

lesión; por lo cual la aplicación del producto solo estaría controlando una

parte del problema.

Figura 11. Prueba de Benomyl. Crecimiento de la cepa TOAM-CA sobre los discos impregnados con benomyl en dosis de 1g/L y 1.5 g/L (foto C. A. Contreras)

5.4. Prueba de Proteasa

En esta prueba las cepas positivas fueron GRAN-CA, LULO-CG, MANGO-

CA, MORA-CA, TOAM-CA, TOMR-CA, TOMR-CG, las cuales pertenecen a

C. acutatum (ANEXO 11). La prueba de la proteasa ha mostrado ser una

forma rápida y un test útil para diferenciar C. gloeosporioides de C. acutatum

(Martín & García-Figueres, 1999). En la prueba positiva se observó la

aparición de un halo transparente de 3-5 mm alrededor del sitio de contacto

del hongo con el agar debido a la degradación de las proteínas a peptonas

como se puede observar en la figura 12; en la prueba negativa se observó

crecimiento micelial sin que hubiese cambio alguno en el medio.

78

Figura 12. Halo producido por la prueba positiva de la proteasa.

Las especies de Colletotrichum son conocidas por producir un amplio rango

de enzimas capaces de destruir los componentes estructurales de los tejidos

vegetales y ocasionar muerte celular. Las enzimas frecuentemente

encontradas son aquellas que degradan los carbohidratos, aquellas,

disuelven la pared celular y las que hidrolizan la cutícula. Las enzimas que

degradan la pared celular como las poligalacturonidasas, pectin liasas y las

proteasas son consideradas de gran importancia en el proceso de

establecimiento, infección y maceración del tejido (Bailey et al., 1992).

Específicamente en el caso de las proteasas, cuando el patógeno secreta

estas enzimas, inactiva los componentes proteínicos de respuesta de

defensa de las plantas tales como las quitinas y la β-1,3 glucanasa. Se ha

demostrado la producción de enzimas como poligalacturonidasas y pectin

liasas (Fernando et al., 1994) en medio de cultivo a partir de de tejido de

hojas afectadas por C. acutatum en plantas de caucho (Hevea brasilensis) y

la producción de la enzima proteasa sobre medio (CMH) medio hidrólisis de

la caseína para diferenciar entre C. acutatum y C. gloeosporioides

(Paterson & Bridge 1994).

79

5.5 Pruebas de Patogenicidad cruzada

De los frutos y tallos evaluados el 73,61%, empleando bloques de agar con

micelio del microorganismo y el 70.83%, de los frutos inoculados con

suspensión conidial, mostraron la sintomatología de antracnosis en los

tratamientos sobre los cuales se realizaron heridas con la aguja disección. En

los frutos y tallos sobre los cuales no se practicaron heridas, el 13,89%

inoculado con suspensión conidial y el 20,83% con bloques de agar

manifestaron los síntomas.

Los aislamientos caracterizados por las pruebas de benomyl y proteasa

como C. acutatum se observó el potencial de patogenicidad cruzada,

encontrándose que la cepa GRAN-CA obtenida de granadilla, ocasionó

síntomas característicos de antracnosis en frutos de lulo, mango, tallos de

mora, tomate amarillo y tomate rojo. El aislamiento de mango MANGO-CA,

presentó patogenicidad en tallos de mora y en tomate amarillo; la cepa de

mora MORA-CA, infectó granadilla, mango, tomate amarillo y tomate rojo;

mientras las cepas TOAM-CA, aislamiento de tomate amarillo y TOMR-CA,

aislamiento de tomate rojo; mostraron síntomas en mango, tomate amarillo y

rojo respectivamente. La cepa TOMR-CG recuperada de tomate rojo produjo

síntomas en granadilla, lulo, mango y tomate amarillo. El aislamiento de lulo

LULO-CG fue patogénico sobre frutos de granadilla, mango y ambas

variedades de tomate (ANEXO 12).

Dentro de las cepas identificadas como C. gloeosporioides; la cepa GRAN-

CG mostró sintomatología en frutos de mango, tomate de árbol amarillo y

rojo. LULO-CA, cepa recuperada de lulo afectó los frutos de granadilla,

mango, las dos variedades de tomate y tallos de mora. El aislamiento de

80

mango MANGO-CG ocasionó síntomas en frutos de lulo, tomate de árbol

amarillo y rojo. La cepa de mora MORA-CG fue patogénica para mango,

tomate de árbol rojo y amarillo y el aislamiento TOAM-CG presentó

patogenicidad sobre frutos de tomate de árbol rojo, granadilla, lulo y mango

(ANEXO 11).

El fruto mas susceptible al ataque de las dos especies de Colletotrichum fue

el mango en el cual se presentaron lesiones, tanto en heridas provocadas

con aguja de disección así como en los tratamientos sin heridas, la

patogenicidad se manifestó en forma generalizada con la producción de

síntomas sobre heridas abiertas. Las lesiones iniciales se presentaron en los

frutos control de una forma más rápida, mientras que cuando se realizaron

las inoculaciones con las cepas provenientes de otros frutos, las lesiones

demoraron más días en formarse (ANEXO 12). Los primeros síntomas se

identificaron como puntos necróticos pequeños y superficiales de color café a

negro, que en algunos casos ocasionó un posterior hundimiento suave y

primario. En algunos frutos y tallos el avance de la lesión al cabo de unos 7 a

9 días después de la inoculación generó lesiones bien definidas que

demuestran la colonización del tejido por parte del patógeno, tal como se

puede apreciar en la figura 13 y 14. El posterior re-aislamiento del patógeno

a partir de los frutos con síntomas confirmó la presencia del mismo.

El potencial de infección cruzada ha sido reportado entre diferentes especies

de Colletotrichum y genotipos de C. gloeosporioides y de sobre una gran

variedad de frutas tropicales, subtropicales y templadas bajo condiciones

artificiales de inoculación. Se ha demostrado que aislamientos de C.

acutatum y C. gloeosporioides son capaces de infectar manzana, nuez y

durazno (Bernstein et al., 1995), en estudios realizados en Israel se

demostró que la antracnosis causada en aguacate por subespecies de C.

gloeosporioides es la misma que causa de la antracnosis en almendro, aún

81

cuando los surcos de almendro se encontraban sembrados a lo largo de las

plantaciones de aguacate.

Feeman et al.,(1998) mostró que C. gloeosporioides aislado de almendro,

manzana, aguacate y mango, así como asilamientos de C. acutatum aislado

de anémona, manzana y durazno, infectan frutos de otros hospederos,

incluyendo manzano (dos variedades), aguacate, almendro, mango y

nectarina (fruta cítrica). Esto demuestra el potencial de infección cruzada

entre ambas especies, sin embargo, dadas las condiciones de laboratorio

que se manejan en el experimento, es necesario realizar estudios a nivel de

campo para demostrar y establecer evidencia que el potencial de infección

cruzada se presente bajo estas condiciones.

La aplicación de herramientas moleculares y de patogenicidad nos permiten

establecer las variaciones dentro y entre las especies del género

Colletotrichum ya que se observó variación morfológica y además se

necesitan como un soporte de las pruebas de Benomyl y proteasa. Las

variaciones entre y dentro de especies, han sido documentadas en cultivos

fríjol, entre otros, con Colletotrichum lindemuthianum en el cual se han

reconocido diferentes razas. Seis ( alfa, beta, gamma, delta, lambda y

epsilon) y siete (con kappa junto con las ya mencionadas) razas fueron

reportadas en Norteamérica y Europa; nueve razas fueron reportadas en

brasil y otras mas en Méjico y Suramérica (Tu, 1992).

82

Figura 13. Pruebas de patogenicidad cruzada. A, Cepa GRAN-CA. B, Cepa LULO-CA. C,

Cepa MANGO-CG. D, Cepa TOMR-CA. E, Cepa MORA-CA. F, Cepa TOAM-CG. E. Cepa

TOMR-CG.

A

B

C

D

D

B

B

Control

F

E

A G

A D

B

A E

83

Figura 14. Pruebas de patogenicidad cruzada en tallos de mora. A. MORA-CG. B. GRAN-CA. C. LULO-CA

A. Control

B

C

C

84

6. CONCLUSIONES

La forma típica de las colonias en medio PDA fue radial, el color de las

colonias y el tipo de micelio fueron aspectos característicos del género.

Se pueden presentar varias formas de conidias en los aislamientos del

género Colletotrichum y variaciones en el tamaño que evidencian de alguna

manera heterogeneidad entre y dentro del género.

El efecto de la temperatura no fue significativo sobre la forma de las conidias

y sobre el tamaño de las conidias solo hubo diferencias significativas en

cuanto al ancho de las conidias.

De acuerdo con este estudio los sistemas tradicionales de clasificación con

base en las características morfológicas, no deben tomarse como un criterio

de clasificación de especies dentro del genero y deben ser complementados

con otras pruebas.

Los aislamientos, las pruebas de Benomyl y de la proteasa realizadas en

este estudio permitieron establecer las presencia de dos especies, C.

acutatum y C. gloeosporioides causantes de antracnosis en frutos de mango,

lulo, granadilla, tomate de árbol y tallos de mora.

Se demostró el potencial de infección cruzada entre los aislamientos de

frutos de granadilla, lulo, mango, mora y tomate de árbol, lo cual permite

sugerir a los productores la implementación de nuevas estrategias de manejo

dado el potencial permanente de inoculo en los ecosistemas donde se

cultivan las especies de clima frío moderado.

85

7. RECOMENDACIONES

Complementar este tipo de estudios con pruebas de caracterización

molecular que permitan identificar variaciones en la secuencia de ácidos

nucleicos, proteínas y bases nitrogenadas, entre y dentro de las especies

investigadas.

Realizar evaluaciones de campo que permitan confirmar los resultados

obtenidos en este estudio.

86

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98

9. ANEXOS

ANEXO 1. Preparación del agar PDA.

* Infusión de papa 200 g/L

D(+) glucosa 20g/L

Agar-Agar 15g/L

Ajustar el pH a 5,6 ± 0,2 a 25ºC

Calentar por un minuto y esterilizar a 121°C a 15 lbs. por 15 minutos.

*Infusión de papa: preparada a partir de 200 g de papa por litro,

99

ANEXO 2. Medio para evaluar la reacción de la proteasa producida por Colletotrichum acutatum.

KH2PO4 1,0 g

KCL 0,5 g

CaCl2.2H2O 0,2 g

Glucosa 10,0 g

Agar-Agar 12,0 g

Agua destilada 975 ml

*Leche desnaturalizada 15 % 25 ml

Ajustar el pH a 5,4 con Ácido Clorhídrico y posteriormente autoclavar a

121ºC, 20 min. 15 lb presión.

*Preparar una solución de leche al 15% ( Pesar 15 g de leche

desnaturalizada y diluirlos en 100 ml de agua destilada), someter a agitación

y tomar el volumen requerido para completar el litro (25 ml)

Recomendación: El volumen de agua (975 ml) debe estar bajo agitación

constante y luego comenzar a agregar cada compuesto en el orden

establecido

100

ANEXO 3. Características morfológicas de los aislamientos

AISLAMIENTOS COLOR DE LAS

COLONIAS

CRECIMIENTO DE LAS

COLONIAS

TIPO DE MICELIO ASPECTO

MICELIO

GRAN CA Salmón Radial Micelio aéreo

superficial

Algodonoso

GRAN CG Blanco Radial Micelio aéreo

superficial

Algodonoso

LULO CA Salmón Radial Micelio aéreo

superficial

Algodonoso

LULO CG Gris Radial Micelio aéreo

superficial

Algodonoso

MANGO CA Blanco Radial Micelio aéreo

superficial

Algodonoso

MANGO CG Gris oscuro Radial Micelio aéreo

denso

Algodonoso

MORA CA Salmón Radial Micelio aéreo

superficial

Algodonoso

MORA CG Gris Radial Micelio aéreo

denso

Algodonoso

TOAM CA Rosado Radial Micelio aéreo

superficial

Algodonoso

TOAM CG Gris Radial Micelio aéreo

superficial

Algodonoso

TOMR CA Salmón Radial Micelio aéreo

superficial

Algodonoso

TOMR CG Gris Radial Micelio aéreo

superficial

Algodonoso

101

ANEXO 4. Análisis estadístico para crecimiento radial

Anova: Two-Factor With Replication Curva crecimiento

ANOVA

Source of Variation SS Df MS F P-value F crit

Aislamientos 36574,92 11,00 3324,99 120,67 0,000 1,92

Temperaturas 5554,17 2,00 2777,08 100,78 0,000 3,12

Interacción 16899,83 22,00 768,17 27,88 0,000 1,69

Residuos 1984,00 72,00 27,56

Total 61012,92 107

Contraste Múltiple de Rangos para DIAMETRO según TEMP -------------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey TEMP Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- 28ºC 36 29,9167 0,87489 X 25ºC 36 42,0 0,87489 X 20ºC 36 47,0 0,87489 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- 20ºC – 25ºC *5,0 2,96111 20ºC – 28ºC *17,0833 2,96111 25ºC – 28ºC *12,0833 2,96111 ---------------------------------------------------------------------------

• indica una diferencia significativa.

Contraste Múltiple de Rangos para DIAMETRO según AISLAMIENTO ----------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey AISLAMIENTO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- MANGO-CA 9 17,6667 1,74978 X LULO-CA 9 26,0 1,74978 XX GRAN-CA 9 27,3333 1,74978 XX LULO-CG 9 29,3333 1,74978 XXX TOAM-CG 9 31,0 1,74978 XXX TOAM-CA 9 33,0 1,74978 XXXX TOMR-CA 9 35,0 1,74978 XXX MANGO-CG 9 36,6667 1,74978 XX GRAN-CG 9 40,6667 1,74978 X TOMR-CG 9 52,3333 1,74978 X MORA-CA 9 56,6667 1,74978 X

102

MORA-CG 9 90,0 1,74978 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- GRAN-CA - GRAN-CG *-13,3333 8,35847 GRAN-CA - MANGO-CA *9,66667 8,35847 GRAN-CA - MANGO-CG *-9,33333 8,35847 GRAN-CA - MORA-CA *-29,3333 8,35847 GRAN-CA - MORA-CG *-62,6667 8,35847 GRAN-CA - TOMR-CG *-25,0 8,35847 GRAN-CG - LULO-CA *14,6667 8,35847 GRAN-CG - LULO-CG *11,3333 8,35847 GRAN-CG - MANGO-CA *23,0 8,35847 GRAN-CG - MORA-CA *-16,0 8,35847 GRAN-CG - MORA-CG *-49,3333 8,35847 GRAN-CG - TOAM-CG *9,66667 8,35847 GRAN-CG - TOMR-CG *-11,6667 8,35847 LULO-CA - MANGO-CG *-10,6667 8,35847 LULO-CA - MORA-CA *-30,6667 8,35847 LULO-CA - MORA-CG *-64,0 8,35847 LULO-CA - TOMR-CA *-9,0 8,35847 LULO-CA - TOMR-CG *-26,3333 8,35847 LULO-CG - MANGO-CA *11,6667 8,35847 LULO-CG - MORA-CA *-27,3333 8,35847 LULO-CG - MORA-CG *-60,6667 8,35847 LULO-CG - TOMR-CG *-23,0 8,35847 MANGO-CA - MANGO-CG *-19,0 8,35847 MANGO-CA - MORA-CA *-39,0 8,35847 MANGO-CA - MORA-CG *-72,3333 8,35847 MANGO-CA - TOAM-CA *-15,3333 8,35847 MANGO-CA - TOAM-CG *-13,3333 8,35847 MANGO-CA - TOMR-CA *-17,3333 8,35847 MANGO-CA - TOMR-CG *-34,6667 8,35847 MANGO-CG - MORA-CA *-20,0 8,35847 MANGO-CG - MORA-CG *-53,3333 8,35847 MANGO-CG - TOMR-CG *-15,6667 8,35847 MORA-CA - MORA-CG *-33,3333 8,35847 MORA-CA - TOAM-CA *23,6667 8,35847 MORA-CA - TOAM-CG *25,6667 8,35847 MORA-CA - TOMR-CA *21,6667 8,35847 MORA-CG - TOAM-CA *57,0 8,35847 MORA-CG - TOAM-CG *59,0 8,35847 MORA-CG - TOMR-CA *55,0 8,35847 MORA-CG - TOMR-CG *37,6667 8,35847 TOAM-CA - TOMR-CG *-19,3333 8,35847 TOAM-CG - TOMR-CG *-21,3333 8,35847 TOMR-CA - TOMR-CG *-17,3333 8,35847 --------------------------------------------------------------------------------

* indica una diferencia significativa.

103

ANEXO 5. Tasa de crecimiento para los diferentes aislamientos bajo 20, 25 y 28ºC

20ºC

(mm/día)

25ºC

(mm/día)

28ºC

(mm/día)

GRAN-CG 8,67 6,3 5,33

GRAN-CA 5,67 4,67 3,33

LULO-CG 6,33 5,33 2

LULO-CA 6,33 3,67 1,83

MANGO-CG 11,33 12,67 15

MANGO-CA 4,33 7,33 11,67

MORA-CG 8,67 3,83 3,33

MORA-CA 4,5 3,83 1,67

TOAM-CG 7,5 6,33 1,67

TOAM-CA 6,67 5,67 4,17

TOMR-CG 13,33 11,33 1,5

TOMR-CA 7,67 6 3,33

104

ANEXO 6. Forma de las conidias

Análisis de la Varianza para FORMA - Sumas de Cuadrados de Tipo III -------------------------------------------------------------------------------- Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor -------------------------------------------------------------------------------- EFECTOS PRINCIPALES A:TEMP 0,760924 2 0,380462 1,39 0,2499 B:AISLAMIENTOS 478,439 11 43,4945 158,66 0,0000 INTERACCIONES AB 8,46766 22 0,384894 1,40 0,1006 RESIDUOS 444,916 1624 0,274132 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORREGIDO) 936,177 1659 -------------------------------------------------------------------------------- Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.

Contraste Múltiple de Rangos para FORMA según TEMP -------------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey TEMP Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- 3 548 2,1411 0,0231729 X 1 562 2,16162 0,0225464 X 2 549 2,19514 0,0231562 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -0,0335173 0,0758125 1 - 3 0,0205218 0,0758407 2 - 3 0,0540391 0,076845 -------------------------------------------------------------------------------- * indica una diferencia significativa.

Contraste Múltiple de Rangos para FORMA según AISLAMIENTOS -------------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey AISLAMIENTOS Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- GRAN-CG 150 1,20667 0,0427498 X MORA-CG 85 1,55593 0,0579783 X MANGO-CG 75 1,58667 0,0604574 X TOAM-CG 150 1,88667 0,0427498 X LULO-CG 150 1,89333 0,0427498 X TOMR-CG 150 1,90667 0,0427498 X MORA-CA 149 2,38218 0,042895 X GRAN-CA 150 2,52 0,0427498 XX LULO-CA 150 2,56667 0,0427498 XX MANGO-CA 150 2,65333 0,0427498 XX TOAM-CA 150 2,84 0,0427498 XX TOMR-CA 150 2,99333 0,0427498 X ------------------------------------------------------------------------ Contraste Diferencias +/- Límites ---------------------------------------------------------------------------- GRAN-CA - GRAN-CG *1,31333 0,197869 GRAN-CA - LULO-CG *0,626667 0,197869 GRAN-CA - MANGO-CG *0,933333 0,242339 GRAN-CA - MORA-CG *0,964069 0,23576

105

GRAN-CA - TOAM-CA *-0,32 0,197869 GRAN-CA - TOAM-CG *0,633333 0,197869 GRAN-CA - TOMR-CA *-0,473333 0,197869 GRAN-CA - TOMR-CG *0,613333 0,197869 GRAN-CG - LULO-CA *-1,36 0,197869 GRAN-CG - LULO-CG *-0,686667 0,197869 GRAN-CG - MANGO-CA *-1,44667 0,197869 GRAN-CG - MANGO-CG *-0,38 0,242339 GRAN-CG - MORA-CA *-1,17551 0,198205 GRAN-CG - MORA-CG *-0,349264 0,23576 GRAN-CG - TOAM-CA *-1,63333 0,197869 GRAN-CG - TOAM-CG *-0,68 0,197869 GRAN-CG - TOMR-CA *-1,78667 0,197869 GRAN-CG - TOMR-CG *-0,7 0,197869 LULO-CA - LULO-CG *0,673333 0,197869 LULO-CA - MANGO-CG *0,98 0,242339 LULO-CA - MORA-CG *1,01074 0,23576 LULO-CA - TOAM-CA *-0,273333 0,197869 LULO-CA - TOAM-CG *0,68 0,197869 LULO-CA - TOMR-CA *-0,426667 0,197869 LULO-CA - TOMR-CG *0,66 0,197869 LULO-CG - MANGO-CA *-0,76 0,197869 LULO-CG - MANGO-CG *0,306667 0,242339 LULO-CG - MORA-CA *-0,488844 0,198205 LULO-CG - MORA-CG *0,337402 0,23576 LULO-CG - TOAM-CA *-0,946667 0,197869 LULO-CG - TOMR-CA *-1,1 0,197869 MANGO-CA - MANGO-CG *1,06667 0,242339 MANGO-CA - MORA-CA *0,271156 0,198205 MANGO-CA - MORA-CG *1,0974 0,23576 MANGO-CA - TOAM-CG *0,766667 0,197869 MANGO-CA - TOMR-CA *-0,34 0,197869 MANGO-CA - TOMR-CG *0,746667 0,197869 MANGO-CG - MORA-CA *-0,79551 0,242613 MANGO-CG - TOAM-CA *-1,25333 0,242339 MANGO-CG - TOAM-CG *-0,3 0,242339 MANGO-CG - TOMR-CA *-1,40667 0,242339 MANGO-CG - TOMR-CG *-0,32 0,242339 MORA-CA - MORA-CG *0,826246 0,236043 MORA-CA - TOAM-CA *-0,457823 0,198205 MORA-CA - TOAM-CG *0,49551 0,198205 MORA-CA - TOMR-CA *-0,611156 0,198205 MORA-CA - TOMR-CG *0,47551 0,198205 MORA-CG - TOAM-CA *-1,28407 0,23576 MORA-CG - TOAM-CG *-0,330736 0,23576 MORA-CG - TOMR-CA *-1,4374 0,23576 MORA-CG - TOMR-CG *-0,350736 0,23576 TOAM-CA - TOAM-CG *0,953333 0,197869 TOAM-CA - TOMR-CG *0,933333 0,197869 TOAM-CG - TOMR-CA *-1,10667 0,197869 TOMR-CA - TOMR-CG *1,08667 0,197869 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.

106

ANEXO 7. Estadística para el largo de las conidias Análisis de la Varianza para LARGO - Sumas de Cuadrados de Tipo III -------------------------------------------------------------------------------- Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor -------------------------------------------------------------------------------- EFECTOS PRINCIPALES A:AISLA 700,098 11 63,6453 12,86 0,0000 B:TEMP 3,86223 2 1,93111 0,39 0,6770 INTERACCIONES AB 126,337 22 5,74257 1,16 0,2747 RESIDUOS 8038,91 1624 4,95007 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORREGIDO) 8869,17 1659

Contraste Múltiple de Rangos para LARGO según TEMP -------------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey TEMP Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- 1 562 12,5463 0,0958081 X 3 549 12,5542 0,0983993 X 2 549 12,6559 0,0983993 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -0,109619 0,322156 1 - 3 -0,00795233 0,322156 2 - 3 0,101667 0,326425 -------------------------------------------------------------------------------- * indica una diferencia significativa.

Contraste Múltiple de Rangos para LARGO según AISLA -------------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey AISLA Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- GRAN-CA 150 11,4833 0,18166 X MANGO-CA 150 11,7167 0,18166 XX TOMR-CA 150 12,1667 0,18166 XXX TOMR-CG 150 12,2467 0,18166 XXX TOAM-CG 150 12,2633 0,18166 XXX TOAM-CA 150 12,3167 0,18166 XXX LULO-CA 150 12,5333 0,18166 XXX LULO-CG 150 12,6 0,18166 XX MORA-CG 85 12,9824 0,246372 XXX MORA-CA 150 13,3 0,18166 XX GRAN-CG 150 13,45 0,18166 X MANGO-CG 75 13,9667 0,256906 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- GRAN-CA - GRAN-CG *-1,96667 0,840819 GRAN-CA - LULO-CA *-1,05 0,840819 GRAN-CA - LULO-CG *-1,11667 0,840819 GRAN-CA - MANGO-CG *-2,48333 1,02979 GRAN-CA - MORA-CA *-1,81667 0,840819

107

GRAN-CG - LULO-CA *0,916667 0,840819 GRAN-CG - LULO-CG *0,85 0,840819 GRAN-CG - MANGO-CA *1,73333 0,840819 GRAN-CG - TOAM-CA *1,13333 0,840819 GRAN-CG - TOAM-CG *1,18667 0,840819 GRAN-CG - TOMR-CA *1,28333 0,840819 GRAN-CG - TOMR-CG *1,20333 0,840819 LULO-CA - MANGO-CG *-1,43333 1,02979 LULO-CG - MANGO-CA *0,883333 0,840819 LULO-CG - MANGO-CG *-1,36667 1,02979 MANGO-CA - MANGO-CG *-2,25 1,02979 MANGO-CA - MORA-CA *-1,58333 0,840819 MANGO-CA - MORA-CG *-1,26569 1,00183 MANGO-CG - TOAM-CA *1,65 1,02979 MANGO-CG - TOAM-CG *1,70333 1,02979 MANGO-CG - TOMR-CA *1,8 1,02979 MANGO-CG - TOMR-CG *1,72 1,02979 MORA-CA - TOAM-CA *0,983333 0,840819 MORA-CA - TOAM-CG *1,03667 0,840819 MORA-CA - TOMR-CA *1,13333 0,840819 MORA-CA - TOMR-CG *1,05333 0,840819 -------------------------------------------------------------------------------- * indica una diferencia significativa.

108

ANEXO 8. Estadística para el ancho de las conidias Análisis de la Varianza para ANCHO - Sumas de Cuadrados de Tipo III -------------------------------------------------------------------------------- Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor -------------------------------------------------------------------------------- EFECTOS PRINCIPALES A:AISLAMIENTO 766,361 11 69,6692 63,82 0,0000 B:TEMPERATURA 16,1943 2 8,09714 7,42 0,0006 INTERACCIONES AB 25,9127 22 1,17785 1,08 0,3625 RESIDUOS 1772,75 1624 1,09159 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORREGIDO) 2585,64 1659

Contraste Múltiple de Rangos para ANCHO según TEMPERATURA --------------------------------------------------------------------------------

Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey TEMPERATURA Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- 3 549 3,61074 0,046208 X 1 562 3,62506 0,0449911 X 2 549 3,83474 0,046208 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *-0,209673 0,151283 1 - 3 0,014327 0,151283 2 - 3 *0,224 0,153288 --------------------------------------------------------------------------------


Contraste Múltiple de Rangos para ANCHO según AISLAMIENTO ----------------------------------------------------------------------------

-

Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey

AISLAMIENTO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

----------------------------------------------------------------------------

----

MORA-CA 150 2,73333 0,0853071 X GRAN-CA 150 2,97 0,0853071 XX LULO-CA 150 2,98333 0,0853071 XX MANGO-CA 150 3,2 0,0853071 XX TOMR-CA 150 3,3 0,0853071 XX LULO-CG 150 3,43333 0,0853071 XX TOAM-CA 150 3,7 0,0853071 XX TOAM-CG 150 3,86667 0,0853071 XX TOMR-CG 150 3,9 0,0853071 XX MORA-CG 85 4,26614 0,115695 X MANGO-CG 75 4,89733 0,120642 X GRAN-CG 150 5,032 0,0853071 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites

109

-------------------------------------------------------------------------------- GRAN-CA - GRAN-CG *-2,062 0,394846 GRAN-CA - LULO-CG *-0,463333 0,394846 GRAN-CA - MANGO-CG *-1,92733 0,483585 GRAN-CA - MORA-CG *-1,29614 0,470458 GRAN-CA - TOAM-CA *-0,73 0,394846 GRAN-CA - TOAM-CG *-0,896667 0,394846 GRAN-CA - TOMR-CG *-0,93 0,394846 GRAN-CG - LULO-CA *2,04867 0,394846 GRAN-CG - LULO-CG *1,59867 0,394846 GRAN-CG - MANGO-CA *1,832 0,394846 GRAN-CG - MORA-CA *2,29867 0,394846 GRAN-CG - MORA-CG *0,765859 0,470458 GRAN-CG - TOAM-CA *1,332 0,394846 GRAN-CG - TOAM-CG *1,16533 0,394846 GRAN-CG - TOMR-CA *1,732 0,394846 GRAN-CG - TOMR-CG *1,132 0,394846 LULO-CA - LULO-CG *-0,45 0,394846 LULO-CA - MANGO-CG *-1,914 0,483585 LULO-CA - MORA-CG *-1,28281 0,470458 LULO-CA - TOAM-CA *-0,716667 0,394846 LULO-CA - TOAM-CG *-0,883333 0,394846 LULO-CA - TOMR-CG *-0,916667 0,394846 LULO-CG - MANGO-CG *-1,464 0,483585 LULO-CG - MORA-CA *0,7 0,394846 LULO-CG - MORA-CG *-0,832808 0,470458 LULO-CG - TOAM-CG *-0,433333 0,394846 LULO-CG - TOMR-CG *-0,466667 0,394846 MANGO-CA - MANGO-CG *-1,69733 0,483585 MANGO-CA - MORA-CA *0,466667 0,394846 MANGO-CA - MORA-CG *-1,06614 0,470458 MANGO-CA - TOAM-CA *-0,5 0,394846 MANGO-CA - TOAM-CG *-0,666667 0,394846 MANGO-CA - TOMR-CG *-0,7 0,394846 MANGO-CG - MORA-CA *2,164 0,483585 MANGO-CG - MORA-CG *0,631192 0,547067 MANGO-CG - TOAM-CA *1,19733 0,483585 MANGO-CG - TOAM-CG *1,03067 0,483585 MANGO-CG - TOMR-CA *1,59733 0,483585 MANGO-CG - TOMR-CG *0,997333 0,483585 MORA-CA - MORA-CG *-1,53281 0,470458 MORA-CA - TOAM-CA *-0,966667 0,394846 MORA-CA - TOAM-CG *-1,13333 0,394846 MORA-CA - TOMR-CA *-0,566667 0,394846 MORA-CA - TOMR-CG *-1,16667 0,394846 MORA-CG - TOAM-CA *0,566141 0,470458 MORA-CG - TOMR-CA *0,966141 0,470458 TOAM-CA - TOMR-CA *0,4 0,394846 TOAM-CG - TOMR-CA *0,566667 0,394846 TOMR-CA - TOMR-CG *-0,6 0,394846 ----------------------------------------------------------------------------


110

ANEXO 9. Tamaño de las conidias en temperaturas de 20, 25 y 28ºC

20ºC 25ºC 28ºC

Aislamientos Largo (µm) Ancho (µm) Largo (µm) Ancho (µm) Largo (µm) Ancho (µm)

GRAN-CA 17,5-10 2,5-5 17,5-10 2,5-5 17,5-10 2,5-5

GRAN-CG 15-12,5 5 17,5-10 7,5-5 15-10 5

LULO-CA 15-12,5 2,5-5 17,5-10 2,5-5 17,5-10 2,5-5

LULO-CG 15-12,5 2,5-5 17,5-10 2,5-5 15-10 2,5-5

MANGO-CA 15-7,5 2,5-5 15 -10 2,5-5 15 - 10 2,5-5

MANGO-CG 15-12,5 2,5-5 15-12,5 5 17,5-12,5 2,5-5

MORA-CA 15-10 2,5-5 15 -10 2,5-5 15 -10 2,5-5

MORA-CG 17,5-10 2,5-5 25-10 2,5-5 17,5 -10 2,5-5

TOAM-CA 15-10 2,5-5 20 -10 2,5-5 25 -10 2,5-5

TOAM-CG 15-10 2,5-5 16 -10 2,5-5 17,5 -7,5 2,5-5

TOMR-CA 12,5-10 2,5-5 12,5-10 2,5-5 15 -10 2,5-5

TOMR-CG 15-10 2,5-5 17,5-10 2,5-5 17,5-7,5 2,5-5

111

ANEXO 10. Prueba de Benomyl para diferenciar entre C. acutatum y C.gloeosporioides

CONTROL 1g/L 1,5g/L

GRAN-CG 1 0 0

GRAN-CA 1 1 1

LULO-CG 1 1 1

LULO-CA 1 0 0

MANGO-CG 1 0 0

MANGO-CA 1 1 1

MORA-CG 1 0 0

MORA-CA 1 1 0

TOAM-CG 1 0 0

TOAM-CA 1 1 1

TOMR-CG 1 1 1

TOMR-CA 1 1 1

0 : Inhibición en el crecimiento micelial

1: Crecimiento del microorganismo

112

ANEXO 11. Prueba de la proteasa en 5 repeticiones

AISLAMIENTOS 1 2 3 4 5

GRAN-CG - - - - -

GRAN-CA + + + + +

LULO-CG + + + + +

LULO-CA - - - - -

MANGO-CG - - - - -

MANGO-CA + + + + +

MORA-CG - - - - -

MORA-CA + + + + -

TOAM-CG - - - - -

TOAM-CA + + + + +

TOMR-CG + + + + -

TOMR-CA + + + + +

La respuesta positiva es una característica que presenta C. acutatum

La respuesta negativa es una característica de C.gloeosporioides

113

ANEXO 12. Pruebas de potencial de patogenicidad cruzada

1. Agar con crecimiento micelial sobre herida

2. Inóculo de conidias aplicado sobre el fruto sin realizar heridas

3. Inóculo de conidias sobre heridas

4. Agar con crecimiento micelial sobre el fruto sin realizar heridas

AISLAMIENTOS

GRANADILLA LULO

TALLOS

MORA MANGO

TOMATE

AMARILLO

TOMATE

ROJO

GRAN-CG 1-3 X X 1-4 1-3 1-3

GRAN-CA 1-3 1-3-4 1-3 1-2-3-4 1-3 1-3

LULO-CG 1-3-4 1-3 X 1-3-4 1-3 1-3

LULO-CA 1-3-4 1-3 1-3 1-2-3-4 1-3 1-3

MANGO-CG X 1 X 1-2-3-4 1-3 1

MANGO-CA X X 1-3 1-2-3-4 1-3 X

MORA-CG X X 1-3 1-2-3-4 1-3 1-3

MORA-CA 1-3 X 1-3 1-2-3-4 1-3 1-3

TOAM-CG 1-3 1-3 X 1-2-3-4 1-3 1-3

TOAM-CA X X x 1-2-3-4 1-3 1-3

TOMR-CG 1-3 1-3 X 1-2-3-4 1-3 1-3

TOMR-CA X x x 1-2-3-4 1-3 1-3

114

ANEXO 13. Presencia de síntomas iniciales de antracnosis en los tratamientos de patogenicidad cruzada.

1. Agar con crecimiento micelial sobre heridas ocasionadas con aguja de

disección

2. Inóculo de conidias aplicado sobre el fruto sin realizar heridas

AISLAMIENTOS GRANADILLA LULO

TALLOS

MORA MANGO

TOMATE

AMARILLO

TOMATE

ROJO

GRAN-CG 7 días X X X 8 día 7 día

GRAN-CA 7 días 4 día 11 día 4 día 5 día 9 día

LULO-CG 8 día 7 día X 5 día 7 día 10 día

LULO-CA 9 días 7 día 11 día 5 día 10 día 8 día

MANGO-CG X X X 4 día 9 día X

MANGO-CA X 8 día 13 día 4 día 8 día X

MORA-CG X X 10 día 6 día 10 día 9 día

MORA-CA 10 días X 10 día 5 día 9 día 10 día

TOAM-CG 8 días 10 día X 4 día 7 día 8 día

TOAM-CA X X 4 día 7 día 8 día

TOMR-CG 9 días 8 día X 6 día 7 día 8 día

TOMR-CA X x X 5 día 6 día 7 día


TALLOS

MORA MANGO

TOMATE

AMARILLO

TOMATE

ROJO

GRAN-CG 8 días X X 5 día 8 día 8 día

GRAN-CA 7 días 5 día 10 día 5 día 8 día 9 día

LULO-CG 8 día 8 día X 4 día 8 día 10 día

LULO-CA 9 días 7 día 12 día 5 día 8 día 8 día

MANGO-CG X 10 día X 4 día 8 día 10 día

MANGO-CA X 9 día 13 día 4 día 8 día X

MORA-CG X X 11 día 5 día 10 día 9 día

MORA-CA 10 días X 10 día 5 día 9 día 10 día

TOAM-CG 10 días 10 día X 4 día 6 día 8 día

TOAM-CA X X 4 día 7 día 7 día

TOMR-CG 9 días 8 día X 6 día 8 día 8 día

TOMR-CA X x X 5 día 8 día 7 día

115

3. Inóculo de conidias sobre heridas.

4. Agar con crecimiento micelial sobre el fruto sin realizar heridas


TALLOS

MORA MANGO

TOMATE

AMARILLO

TOMATE

ROJO

GRAN-CG X X X X X X

GRAN-CA X 9 día X 6 día X X

LULO-CG 9 día X X X X X

LULO-CA 10 día X X 7 día X X

MANGO-CG X X X 6 día X X

MANGO-CA X X X 6 día X X

MORA-CG X X X 6 día X X

MORA-CA X X X 5 día X X

TOAM-CG X X X 5 día X X

TOAM-CA X X X 5 día X X

TOMR-CG X X X 6 día X X

TOMR-CA X X X 5 día X X


TALLOS

MORA MANGO

TOMATE

AMARILLO

TOMATE

ROJO

GRAN-CG X X X X X X

GRAN-CA X X X 6 día X X

LULO-CG X X X 6 día X X

LULO-CA X X X 7 día X X

MANGO-CG X X X 7 día X X

MANGO-CA X X X 7 día X X

MORA-CG X X X 6 día X X

MORA-CA X X X 4 día X X

TOAM-CG X X X 5 día X X

TOAM-CA X X X 6 día X X

TOMR-CG X X X 6 día X X

TOMR-CA X X X 5 día X X

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