1

Caracterización morfológica, fisiológica y molecular de aislamientos de amebas de

vida libre (Acanthamoeba) obtenidas del medio ambiente y de pacientes con

queratitis amebiana.

Laconte M Laura 1, Rivero Fernando

2, Lujan Hugo

2, Casero Rodolfo

1

1 Departamento de Parasitología Hospital de Clínicas. Facultad de Ciencias Médicas.

Santa Rosa 1564 (5008).Universidad Nacional de Córdoba. 2 Laboratorio de Biología

Molecular de Parásitos. Facultad de Medicina. Universidad Católica de Córdoba.

rodaca@argentina.com

TE de contacto 3516073378

2

RESUMEN

Las amebas de vida libre (AVL) son protozoos ubicuos que a menudo se comportan

como agentes infecciosos para humanos. Para conocer si AVL obtenidas del ambiente

(CA) presentan características similares a cepas clínicas (CC), evaluamos la morfología,

la termo/osmotolerancia y caracterización molecular de estos aislamientos. De un total

de muestras (n=142, CC n=134, CA n=8), la frecuencia de aislamiento de AVL en CC

(3/134) fue del 2,2%. Trofozoítos recuperados de CC revelaron mayor crecimiento a

37º C comparados con los de CA, en relación a la osmotolerancia, el 87,5% de las cepas

crecieron bajo diferentes concentraciones de manitol (0,5-1,5M). La caracterización

molecular por PCR reveló amplicones compatibles con género Acanthamoeba, en el

100% de las CC y el 20% de las CA, dato que permitió reclasificarlas dentro del Grupo

II de Pussard y Pons. Las diferencias fenotípicas y genotípicas entre CC y CA podrían

reflejar rasgos patogénicos de cada aislamiento.

Palabras clave: Acanthamoeba, queratitis, tipificación molecular, osmo-

termotolerancia, exflagelación.

Abreviaturas: AVL: amebas de vida libre, CC: cepas clínicas, CA: cepas de ambiente;

QA: queratitis amebiana, ANNE: agar no nutritivo enriquecido, PAGE: sol de

electrolitos según PAGE, PYG: proteosa, levadura, glucosa, ASA.S1: Acanthamoeba-

specific amplimer” S1.

3

INTRODUCCIÓN

Las amebas de vida libre (AVL) son protozoos amfizoicos que se encuentran

ampliamente distribuidas en el medio ambiente, habitando en una variedad de

ecosistemas como el aire, suelo, aguas (dulces, saladas, residuales, agua mineral

embotellada, piletas de natación), productos alimenticios, materia fecal, tracto

respiratorio, etc (1,2). El ciclo de vida de las AVL está compuesto por dos diferentes

biotipos: los trofozoítos, formas tróficas y reproductivas, y los quistes o estadío de

resistencia, capaces de permanecer viables durante años en el medio ambiente, por lo

que la exposición humana a estos protozoos ubicuos resulta muy frecuente. No obstante,

especies de estas amebas pertenecientes a los géneros Acanthamoeba, Balamuthia,

Naegleria y Sappinia no sólo son de patogenicidad reconocida para los humanos y

animales, sino que al transportar en forma simbiótica bacterias en sus citoplasmas

podrían desempeñarse como potenciales vectores de otras enfermedades infecciosas

(3,4). Las patologías ocasionadas por estas amebas oportunistas incluyen infecciones

diseminadas (dermatitis, neumonitis, encefalitis, meningoencefalitis) o localizadas

como en el caso de la queratitis amebiana (QA), infección del tejido corneal producida

por especies del género Acanthamoeba (5,6). Si bien los mecanismos potenciales que

ponen en marcha estos parásitos para colonizar e infectar huéspedes permanecen aún en

estudio, numerosos reportes demuestran que especies de AVL obtenidas de nichos

naturales poseen morfotipos y mecanismos de virulencia similares a los que se

describen en cepas aisladas de tejidos humanos. Pussard y Pons (7) clasificaron estas

amebas en base a la estructura de sus quistes en grupos I, II y III (GI, GII, GIII) y

posteriormente se asociaron AVL pertenecientes a los GII y GIII con infecciones en

humanos, principalmente queratitis y encefalitis. Uno de estos marcadores de

patogenicidad es la termo-osmotolerancia, capacidad que poseen ciertas amebas para

sobrevivir al estrés y que esta fuertemente asociada con la virulencia de cepas aisladas

tanto de nichos naturales como de tejidos humanos (8). El propósito de este trabajo fue

aislar en nuestro medio cepas de AVL de pacientes con QA y del ambiente a fin de

estudiar comparativamente sus aspectos morfológicos, fisiológicos y moleculares, con

el objetivo de determinar si existen patrones de comportamiento similares entres los

aislamientos y poder establecer una probable asociación entre cepas ambientales y

patología en humanos.

4

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de las muestras

Entre Enero de 2009 y Diciembre de 2012 se realizó la pesquisa de cepas de AVL en

muestras provenientes del medio ambiente (CA): aguas de ríos (n=3, Ríos Quilpo,

Suquía y San Marcos, Provincia de Córdoba, Argentina), aguas estancadas de fuentes

(n=2), de soluciones salinas de hisopados anales efectuados en pacientes pediátricos

(n=3) y de muestras clínicas (CC): líquidos de lentes de contacto de pacientes con

úlceras de córnea ( n=17), epitelio corneal de pacientes con queratitis amebiana

(n=117). Del total de muestras recolectadas (n=142), 8 arrojaron cultivos positivos para

algún tipo de AVL: a) aguas de fuentes (n=2), b) proveniente del líquido conservante de

lentes de contacto (n=1), c) epitelio corneal de pacientes con queratitis amebiana (n=2),

d) solución salinas de escobillados anales con AVL (n=3) , las que fueron incluidas

dentro de las CA debido al hallazgo reiterado de estos protozoos como contaminantes

de soluciones salinas y en particular en muestras provenientes de escobillados anales.

Para el análisis de las muestras de ríos, se recolectaron 500ml de agua de cada fuente

natural en frascos estériles, los que fueron filtrados en gasa doble, centrifugados 10 min

a 3000rpm y posteriormente 50µl del sedimento fueron sembrados en medio de cultivo

para AVL. Las muestras clínicas se obtuvieron de pacientes con queratitis y/o úlcera

corneal que acudieron a la consulta al Servicio de Oftalmología del Hospital de

Clínicas. Tras la observación de la lesión bajo lámpara de hendidura, y previa anestesia

de la córnea, las muestras fueron extraídas con aguja hipodérmica e inmediatamente

sembradas en medio de cultivo. Para el estudio de las soluciones conservadoras de las

lentes de contacto, el contenido líquido de los estuches fue centrifugado por 10 min a

3000rpm y 50 µl del sedimento sembrado en medio de cultivo para AVL. Las muestras

salinas de escobillados anales conteniendo sus hisopos fueron homogeneizadas por

agitación durante 2 min, centrifugadas durante 10 min a 3000 rpm, y posteriormente

50µl del sedimento fue sembrado en placas con medio de cultivo para AVL.

Aislamiento de AVL

El aislamiento de las cepas se realizó en placas con medio de cultivo ANNE, base de

agar no nutritivo en solución salina PAGE enriquecido con una suspensión de

Escherichia coli ATCC 25922 (9). Las muestras fueron incubadas entre 7 y 15 días a

28° C y examinadas cada 24hs en microscopio de luz invertida para evaluar su

crecimiento. Posteriormente fueron mantenidas in vitro a partir de repiques realizados

5

mediante la extracción de fragmentos de agar obtenidos de cultivos tardíos (15 días), los

que fueron transferidos sucesivamente a nuevas placas de ANNE y conservados a

temperatura ambiente hasta su uso.

Identificación molecular

La extracción del ADN de las cepas se realizó a partir de suspensiones de 105

– 106

quistes /ml provenientes de cultivos en ANNE de 7 días, según protocolo de Schroeder

y col (10). Los primers género-específico que se utilizaron para desarrollar la PCR,

fueron JDP1 (5’GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA) y reverso JDP2

(5’TCTCSCAAGCTGCTAGGGGAGTCA), los que amplifican una región específica

del ADN ribosomal (18S rDNA). El producto de la PCR de acuerdo a este protocolo

presenta un amplicon entre 423 a 551 pb, denominado ASA.S1 (Acanthamoeba-

specific amplimer” S1) (11).

Caracterización morfológica de quistes y trofozoítos

Los quistes provenientes de cultivos en ANNE de 7 días fueron removidos del agar

mediante 3 lavados sucesivos con 2,5 ml de solución salina de PAGE, el volumen final

fue centrifugado durante 5 min a 2500 rpm y del pellet se tomaron 20 µl y tras la

observación de 10 campos con micrómetro ocular, se evaluaron sus tamaños y

morfotipos para clasificarlos en GI, GII o GIII según criterios de Pussard y Pons (7,

12). Paralelamente para comprobar su viabilidad se tomaron alícuotas de 20 µl de

quistes centrifugados y se mezclaron con igual volumen de solución de Azul de Tripan

0,7%. La caracterización morfológica de los trofozoítos se realizó con amebas

provenientes de cultivos tempranos (48 hs) en ANNE y resuspendidas en PAGE. Para

evaluar la presencia de formas flageladas (exflagelación), suspensiones de trofozoítos

en 2ml agua destilada (grado 1,0 Mc Farland) fueron incubados durante 3 horas a 37ºC,

y posteriormente observados al microscopio óptico y de contraste de fase (13).

Crecimiento in Vitro, ensayos de termotolerancia y osmotolerancia

Quistes y trofozoítos mantenidos en medio ANNE fueron removidos del agar como se

indicó mas arriba, y fueron ajustados a una concentración de 103

-104

cel/ ml mediante

recuento en hemocitómetro de Neubauer. Para determinar la termotolerancia de cada

6

cepa, 50µl de cada suspensión fueron transferidos a placas policubetas conteniendo 2ml

de medio de cultivo axénico de PYG ( proteosa peptona, extracto de levadura, glucosa)

con antibióticos e incubados a 28º C, 37º C y 42º C durante 5 días (14,15). Todos los

ensayos de crecimiento in vitro (cultivos ANNE en placa de Petri y PYG en

policubeta), como los recuentos de quistes y trofozoítos fueron realizados por

duplicado. Para evaluar la osmotolerancia, quistes y trofozoítos mantenidos en medio

ANNE fueron removidos del agar, ajustados a una concentración de 105

cel/ ml como se

indicó anteriormente y 50µl de cada suspensión fueron transferidos a placas de ANNE

conteniendo manitol 0,5-1,0 y 1,5M respectivamente, e incubados a 28º C durante 7

días.

Análisis estadístico.

Para determinar la asociación entre parámetros de crecimiento, termotolerancia y

osmotolerancia entre diferentes cepas, se utilizó el test de chi cuadrado desde el

programa MedCal Version 10.0.2.

RESULTADOS

Del total de muestras recolectadas (CA+CC, n=142), aquellas que arrojaron cultivos

positivos para AVL (n=8) fueron seleccionadas para este estudio (Fig.1), siendo que del

total de CC (n=134) provenientes de abscesos corneales y del líquido conservante para

lentes de contacto, el aislamiento de AVL (3/134) arrojó una frecuencia del 2,2%. El

análisis morfológico de los trofozoítos de cultivo en ANNE, permitió observar la

presencia de acantopodios polidireccionales, formación de vacuolas contráctiles y

tamaño promedio entre 10-22,3 µm y la generación de formas flageladas (exflagelación)

solo se observó en una muestra proveniente de aguas. El morfotipo de los quistes se

determinó acorde a la presencia de núcleos visibles, endoquistes estrellados o

redondeados y ectoquistes arrugados o lisos, permitiendo su clasificación dentro de los

GII (n=6) y GIII (n=2) (Tabla1)(Fig.2). Si bien todas las cepas demostraron crecimiento

a las distintas temperaturas ensayadas, los trofozoítos recuperados de córnea CC 01 y

CC 79, axenizados en medio líquido PYG, revelaron a 37º C mayores patrones de

crecimiento comparados con las AVL aisladas de aguas y de escobillado anal

(p=<0,0001). En general las CA reflejaron mejor crecimiento a 28º y 42º C, mientras

que las CC a 28º C se desarrollaron en forma aletargada (p<0,05) (Gráfico I). En

7

relación a la osmotolerancia, el 87,5% (n=7) de las cepas estudiadas soportaron

concentraciones crecientes de manitol, dentro de las cuales todos los aislamientos

clasificados dentro GII proliferaron en medios con mayor estrés osmótico (Tabla 2). La

caracterización molecular por PCR reveló que el 50% (4/8) de nuestros aislamientos

correspondieron a amplicones ASA.S1 compatibles con género Acanthamoeba, y dentro

de las mismas el 75% (3/4) correspondió a CC y el 25% (1/4) a CA, dato que permitió

su posterior reclasificación morfotípica dentro del Grupo II según Pussard y Pons. El

análisis de los amplicones obtenidos del DNA extraído separadamente de trofozoítos y

de quistes no reveló diferencias en sus patrones de amplificación (Fig. 3).

DISCUSIÓN

Las amebas de vida libre han ganado creciente atención en la comunidad científica y

cada vez son más numerosos los estudios publicados vinculados con su biología celular,

fisiología, bioquímica y relación huésped-parásito (16,17). Estos microorganismos

amfizoicos de localización ubicua, tras miles de años de evolución desarrollaron

mecanismos adaptativos para sobrevivir al estrés del medio ambiente y junto a sus

huéspedes lograron sobrepasar el sistema inmune para comportarse como parásitos

oportunistas y causar diferentes patologías. Dado el incremento de casos de pacientes

con úlceras corneales compatibles con queratitis amebiana es que enfocamos nuestro

estudio al aislamiento de cepas de Acanthamoeba recuperadas tanto de muestras clínicas

como de cepas salvajes a fin de investigar paralelamente sus características biológicas,

fisiológicas y moleculares. Nuestros hallazgos evidenciaron que del total de muestras

oculares (n=134) provenientes de abscesos corneales y del líquido conservante para

lentes de contacto, el aislamiento de AVL (3/134) arrojó una frecuencia del 2,2%

ubicándose este dato por debajo de lo reportado por otros autores quienes describen una

frecuencia entre el 4 y 8% de este protozoo como causal de patología ocular (6).

Asimismo nuestros resultados en relación a la clasificación feno-genotípicamente,

permitieron ubicar a nuestros aislamientos como cepas de Acanthamoeba, los que

coinciden con las tipificaciones realizados en otros centros, donde se describe a este

género de AVL como el más detectado en infecciones corneales(16). Por otra parte

consideramos que el aislamiento de una cepa de Acanthamoeba proveniente de una

muestra ambiental (EA7) que fue clasificada dentro del GII, indicaría un potencial rol

patógeno en nuestro medio, tal como lo demuestran estudios realizados en los que se

aislaron en diferentes ambientes cepas de estas amebas oportunistas pertenecientes a

genotipos patogénicos(17). De igual manera en este estudio incluimos como CA a

8

muestras aisladas de soluciones salinas de hisopados anales ya que consideramos su

presencia en estos materiales como resultado de contaminaciones ambientales, lo que

refleja su capacidad de sobrevida en fomites y medios adversos. Los ensayos de

osmotolerancia reflejaron comportamiento similar en más del 80% de nuestros

aislamientos, a diferencia de otros reportes donde las cepas analizadas demostraron

mayor variabilidad para soportar el estrés osmótico. Estas características desarrolladas

por las AVL para soportar cambios del medio, han sido explicadas como el resultado de

modificaciones del citoesqueleto y en especial en la composición lipídica de sus

membranas, haciendo posible que trofozoítos termofílicos y quistes se mantengan

viables mediante procesos de enquistamiento y/o desenquistamiento (8, 18,19). Esta

adaptabilidad a variaciones abruptas de osmolaridad y salinidad, explicaría la

recuperación de cepas en tejidos humanos las que a su vez demostraron mejor

adaptación para crecer a 37º C. Si bien el análisis molecular nos permitió clasificar estas

AVL solo a nivel de género, en un futuro su genotipificación resultará de utilidad dado

que actualmente se conoce que distintos genotipos pueden producir distintas patologías

(T3 y T1 asociados a queratitis y encefalitis), a la vez que dentro de un mismo genotipo

pueden coexistir parásitos con distinta patogenicidad (20, 21, 22). Además luego de

evaluar las características de las cepas clínicas vs las de ambiente, este trabajo demostró

diversidad en los patrones moleculares como en algunos de los aspectos fisiológicos

analizados, datos que podrían reflejar no solo rasgos propios de cada especie, sino

además un potencial patogénico propio de cada asilamiento. Finalmente conocer más en

profundidad sobre la biología de estos protozoos, será de utilidad para evitar la

patología irreversible que a veces ocasionan, y al mismo tiempo facilitaría el hallazgo

de compuestos que pudieran ser utilizados para reforzar la terapia amebicida utilizada

en la actualidad.

9

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11

Tablas, Gráficos y Figuras

aguas de rios

aguas de fuentes

escobillado anal

liquido lentes de

contacto

cornea

cornea

escobillado anal

aguas

lentes de contacto

Figura1. a) Procedencia de las muestras analizadas, b) Cepas de AVL incluidas en el

estudio

Gráfico 1. Ensayo de termotolerancia a 28º,37º y 42º C de trofozoítos en medio axénico

PYG.

Tabla 2. Ensayo de osmotolerancia de trofozoítos frente a concentraciones

hiperosmóticas de manitol. Crecimiento (+) sin crecimiento (-)

Cepa

Manitol

01

GII

79

GII

48

GII

A5

GIII

A6

GII

EA7

GII

EA8

GIII

EA11

GII

0,5M + + + + + + - +

1,0M + + + + + + - +

1,5M + + + + + + - +

n=117

n=17

n=2 n=3 n=3

n=2

n=3

n=1

n=2

A B

12

Figura 3. Análisis por PCR de aislamientos de Acanthamoeba provenientes de CC y

CA: a) DNA extraído de trofozoítos (línea1) y quistes CC( línea2), b) cepas de CC y de

CA; línea 1, cepa control Acanthamoeba spp; línea 2, CA EA7 (Escobillado anal, DNA

degradado); línea 3, CA EA8 (Escobillado anal); línea 4,CC OI (córnea); línea 5, CC

48 (líquido de lente de contacto); línea 6, CC 79 (córnea); c) línea 1, Escherichia coli

ATCC 25922; línea 2, cepa control Acanthamoeba spp; línea 3, CC 01(córnea); línea 4

CA A5(agua de fuente); línea 5, CA A6 (agua de fuente); línea 6, CA EA7 (escobillado

anal ); línea 7, CAEA11( escobillado anal).

1000 pb

a 1 2 1

b c 2 3 4 5 6 2 1 3 4 5 6 7

13

Tabla 1. Características fenotípicas y morfo-métricas de quistes (Q) y trofozoítos (T)

Abreviaturas: Acant (acantopodios); Exf (exflagelacion). C: Córnea; L: líquido de lentes

de contacto; F: fuentes; H: Hisopado anal.

Cepa Origen Morfología Q / T

Tamaño

Quistes /

Trofozoítos

(µm)

Acant Exf Clasif.

de

quistes

(Pussard

y Pons)

01 CC

C Q: Endoquiste definido,

oval, redondo, poligonal.

Ectoquiste irregular,

aspecto arrugado.

Núcleo No visible. T:

Redondeados, ameboides

7,5 -17,5/

7,5 -22

Si

No

GII

79 CC

C

Q: Endoquiste estrellado,

ovalado. Ectoquiste

arrugado Núcleo No

visible. T: Redondeados,

ameboides

12,5 – 15 /

12,5 - 20

Si

No

G II

48 CC

L

Q: Endoquiste redondo y

poligonal. Ectoquiste

arrugado. Núcleo No

visible. T: Ameboides,

redondeados, ovales

10-17,5/

10- 25

Si

No

G II

A5

CA

F Q: Endoquiste redondo,

ligeramente anular, sin

Ectoquiste aparente. Núcleo

No visible. T: Alargados,

ameboides

5 - 7,5 /

7,5 -10

No

Si

GIII

A6

CA

F Q: Endoquiste estrellado,

poligonal, ameboide.

Ectoquiste liso No visible.

Núcleo visible T:

Redondeados, ameboides

10 - 13,7/

10 - 15

Si

No

GII

EA7

CA

H Q: Endoquiste poligonal,

ovalado, estrellados,

ameboide. Ectoquiste liso.

T: Redondeados,

ameboides

10 -17,5 /

10 - 15

Si

No

G II

EA8

CA

H Q: Endoquiste redondeado,

ovalado. Ectoquiste

ligeramente arrugado,

débilmente marcado.

Núcleo visible. T:

Redondeados, ameboides,

poligonales

10 -13,7 /

10 - 15

No

No

GIII

EA11

CA

H Q: Endoquiste poligonal,

estrellado, redondeado.

Ectoquiste Reticulado

débilmente marcado.

Núcleo no visible. T:

Redondeados, ameboides

10 - 15 /

7,5 - 15

Si

No

GII

14

Figura 2. Fenotipos de quistes y trofozoítos provenientes de cultivos en ANNE: a –b)

morfotipo de quistes y trofozoitos Gupo III, cepas de aguas; c-j) morfotipo de quistes y

trofozoítos Grupo II, cepas oculares: c) quistes con doble membrana; d-e) trofozoítos

con acantopodios expuestos; f-g) trofozoitos binucleados y uninucleados mostrando

vacuola contráctil (microscopía de contraste de fase); h-i) trofozoítos uninucleados y

quistes con endo y exoquistes evidentes (microscopía de campo oscuro); j) ensayo de

viabilidad de quistes (coloración con azul de tripan); k) formas flageladas cepas de

agua(col. de Giemsa).

A B C

E F G

H

I

D

J k