Caracterización estructural de los metabolitos secundarios...
81
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS PROSGRADO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA Caracterización estructural de los metabolitos secundarios de Senecio polypodioides T e s i s Para obtener el grado de Maestro en Ciencias Quimicobiológicas Presenta: Claudia Villanueva Cañongo Director de tesis: Dr. Eleuterio Burgueño Tapia México D.F. Diciembre de 2010
Transcript of Caracterización estructural de los metabolitos secundarios...
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
PROSGRADO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA
Caracterización estructural de los metabolitos secundarios de Senecio
polypodioides
T e s i s Para obtener el grado de
Maestro en Ciencias Quimicobiológicas
Presenta: Claudia Villanueva Cañongo
Director de tesis: Dr. Eleuterio Burgueño Tapia
México D.F. Diciembre de 2010
El presente trabajo se llevó a cabo en el departamento de Química Orgánica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Eleuterio Burgueño Tapia, con el apoyo de la beca CONACyT 232536 y PIFI 20100709. Este trabajo forma parte del proyecto CONACyT “Estudio químico-biológico y por RMN de terpenoides, alcaloides y derivados del ácido shiquímico de origen vegetal” (62213) y del proyecto SIP 20100709.
v
A mi Madre y a mis hermanas: A mi Madre y a mis hermanas: A mi Madre y a mis hermanas: A mi Madre y a mis hermanas: A mi hermosa familia donde tuve el privilegio de nacer.
vi
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo de investigación no hubiera sido posible sin el apoyo de mucha gente.
Gracias al Dr. Eleuterio Burgueño Tapia, quien leyó mis numerosas revisiones y me
ayudó a dar sentido a la confusión. Gracias también a los miembros de mi comité de tesis.
Gracias a la Dra. Beatriz Hernández Carlos, por brindarme en todo momento su apoyo y
confianza. Gracias a mi Maestro Carlos Guillermo Hernández, por su enorme cariño, por
su apoyo incondicional. A mi maestra Paula Cecilia Guadarrama Mendoza por su
amoroso apoyo y cariño. Gracias a mi familia y mis amigos que me facilitaron el paso
por este camino ofreciéndome siempre apoyo y amor.
Me llevaría todas las hojas de este escrito en agradecer a todas y cada una de las personas
involucradas en este trabajo, por lo que me limito a agradecerles con mi pensamiento y
mi infinito cariño, ya que sin todas esas personas no hubiera logrado empezar, desarrollar
y finalizar este proceso. Gracias a todos, juntos hemos terminado y yo sólo lo escribí en
estas hojas.
vii
RESUMEN
El género Senecio, de la familia Asteraceae, se caracteriza por contener dentro de sus
metabolitos secundarios principales a alcaloides pirrolizidínicos, además de
eremofilanólidos y furanoeremofilanos. Algunos de estos compuestos han mostrado
cierta actividad biológica contra insectos y otros han mostrado actividad fitotóxica en
algunas especies vegetales y actividad citotóxica en líneas celulares. El género Senecio
cuenta con una amplia variedad de especies, se conocen alrededor de 1500 alrededor del
mundo. En México se conocen alrededor de 165 de esas especies, de las cuales la
mayoría no han sido estudiadas, su estudio es limitado o no tienen estudios químicos
relacionados con sus metabolitos secundarios. Un ejemplo de ello es Senecio
polypodioides que sólo cuenta con un estudio químico. Tomando en consideración lo
anterior, en este trabajo de investigación se decidió estudiar los metabolitos secundarios
presentes de esta especie de Senecio.
En el estudio químico de los extractos hexánico de la parte aérea y metanólico de la raíz
de Senecio polypodioides (Asteraceae) se aislaron por cromatografía en columna abierta,
el nuevo eudesmanoide (63) y a los alcaloides pirrolizidínicos ya descritos sarracina N-
óxido (60), sarracina (61) y 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62). Se presenta
la caracterización estructural de los compuestos aislados de los extractos hexánico de la
parte aérea y metanólico de la raíz de S. polypodioides. La asignación de los datos
espectroscópicos de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de 1H y 13C se hizo a través
del análisis de los experimentos en una y dos dimensiones (gCOSY, gHSQC, gHMBC,
NOE difference y NOESY 2D). Así como, su análisis conformacional llevado a cabo a
través del análisis de las constantes de acoplamiento (3JH-H) y métodos computacionales a
nivel B3LYP/6-31G*.
viii
ÍNDICE
Dedicatorias ............................................................................................................................... v
Agradecimientos ........................................................................................................................vi
Resumen .................................................................................................................................. vii
Índice .................................................................................................................................... viii
Índice de figuras ......................................................................................................................... x
Índice de cuadros ..................................................................................................................... xii
1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1
2. ANTECEDENTES ............................................................................................................. 2
2.1. Género Senecio ..................................................................................................... 2
2.2. Metabolitos secundarios en Senecio ....................................................................... 3
2.2.1. Alcaloides ............................................................................................... 3
2.2.2. Alcaloides pirrolizidínicos (APs) ............................................................ 5
2.2.3. Eremofilanos ........................................................................................... 9
2.3. Alcaloides pirrolizidínicos y eremofilanos aislados de especies de Senecio ........ 10
2.4. Actividad biológica ............................................................................................ 12
3. HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 14
4. OBJETIVOS .................................................................................................................... 14
4.1. Objetivo general .................................................................................................. 14
4.2. Objetivos específicos ........................................................................................... 14
5. METODOLOGÍA ........................................................................................................... 15
5.1. Colecta del material vegetal ................................................................................. 15
5.2. Extracción de la raíz de Senecio polypodioides .................................................... 15
5.3. Extracción de la parte aérea de Senecio polypodioides ......................................... 15
5.4. Aislamiento de los alcaloides pirrolizidínicos (APs) de la raíz de Senecio
polypodioides ............................................................................................................. 16
5.4.1. Cromatografía del extracto CHCl3 ......................................................... 16
5.4.2. Reducción de la sarracina N-óxido ....................................................... 16
5.4.3. Aislamiento del componente minoritario del extracto CHCl3 ................ 16
Página
ix
5.5. Aislamiento del componente mayoritario de la parte aérea de Senecio
polypodioides ............................................................................................................. 17
5.6. Análisis conformacional ...................................................................................... 17
5.7. Obtención de los datos espectroscópicos .............................................................. 18
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 19
6.1. Extractos ............................................................................................................. 19
6.2. Elucidación del compuesto mayoritario de la raíz de Senecio polypodiodes ......... 19
6.3. Reducción de la sarracina N-óxido ..................................................................... 24
6.4. Elucidación del compuesto minoritario de la raíz de Senecio polypodioides ......... 26
6.5. Análisis conformacional del compuesto minoritario de la raíz de Senecio
polypodioides ............................................................................................................. 34
6.6. Elucidación del compuesto mayoritario de la parte aérea de Senecio
polypodioides ............................................................................................................. 38
6.7. Análisis conformacional del compuesto mayoritario de la parte aérea de
Senecio polypodioides ................................................................................................ 51
7. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 53
8. ANEXO ............................................................................................................................ 54
9. LITERATURA CITADA .................................................................................................. 67
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
1. Parte aérea de Senecio polypodioides ..................................................................................... 3
2. Raíz de Senecio polypodioides ............................................................................................... 3
3. Compuestos reconocidos como alcaloides, que no entran en la definición de alcaloide
descrita por Winterstein y Trier. ............................................................................................ 4
4. Base necínica y ácidos nécicos más comunes en APs. ........................................................... 5
5. APs comúnmente presentes en la familia Senecioneae ............................................................ 5
6. Porcentajes (%) de distribución de 14C en S. vulgaris como una medida de biosíntesis
de senecionina N-óxido. ......................................................................................................... 6
7. Transformaciones de la senecionina N-óxido para dar lugar a la variedad de APs ................. 7
8. Biosíntesis de la base necínica de los APs ............................................................................ 8
9. Las cinco estructuras básicas de los alcaloides pirrolizidínicos. ............................................... 9
10. Sesquiterpenoides ................................................................................................................ 9
11. Esqueleto básico de los furanoeremofilanoides y eremofilanólidos...................................... 10
12. Iodantina aislada de las especies mexicanas, S. iodanthus y S. bracteatus ........................ 10
13. APs aislados de especies mexicanas del género Senecio ...................................................... 11
14. Eremofilanoides aislados de la especie mexicana de Senecio. S. mairentianus .................. 11
15. Eremofilanoides aislados de especie mexicana de Senecio. S. pericalia y S. sinuatus
Gilib .................................................................................................................................. 12
16. Eremofilanoides y APs con actividad inhibitoria de la alimentación (IA) ........................... 12
17. APs con actividad biológica: actividad IA, fitotóxica y citotóxica ....................................... 13
18. Eremofilanoides con actividad inhibitoria de la alimentación en insectos ............................ 13
19. Espectro de RMN 1H del extracto metanólico de S. polypodiodes en DMSO-d6 (500
MHz) .................................................................................................................................. 21
20. Espectro de RMN 1H de la sarracina N-O presente en la raíz de S. polypodiodes (60)
en CDCl3 (500 MHz). ........................................................................................................ 22
21. Espectro de RMN de 13C de la sarracina N-O presente en la raíz de S. polypodioides
(60) en CDCl3 (125 MHz). ................................................................................................... 23
Página
xi
22. Espectro de RMN 1H de la sarracina (61) como compuesto mayoritario de la raíz de
S. polypodioides en CDCl3 (500 MHz) ............................................................................... 25
23. Espectro de RMN de 1H de 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) presente
en la raíz de S. polypodioides en CDCl3 (500 MHz) ........................................................... 29
24. Espectro de RMN 13C de 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) presente en
la raíz de S. polypodioides en CDCl3 (125 MHz) ................................................................ 30
25. Experimento DEPT de 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) ............................ 31
26. Experimento RMN NOE difference 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) .......... 32
27. Espectro de RMN 1 H de 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) en CDCl3
después de filtrado en alúmina neutra (500 MHz) ............................................................... 33
28. Confórmeros de mínima energía DFT/B3LYP/6-31G* de 62 ............................................ 36
29. Confórmero de menor energía 62a y sobreposición de sus análogos 62c y 6co ................. 36
30. Espectro de RMN 1H del compuesto mayoritario 63 de la parte aérea de S.
polypodioides en CDCl3 (500 MHz). ................................................................................... 40
31. Espectro de RMN 13C del compuesto mayoritario 63 de la parte aérea de S.
polypodioides en CDCl3 (125 MHz) .................................................................................... 41
32. Sección del experimento gCOSY del compuesto 63 ........................................................... 42
33. Sección del experimento gHSQC del compuesto 63 ......................................................... 46
34. Sección del experimento gHSQC para la asignación de los metilenos del
compuesto 63. ..................................................................................................................... 47
35. Experimento gHMBC del compuesto 63 ............................................................................ 48
36. Sección del experimento gHMBC del compuesto 63. . ........................................................ 49
37. Experimento NOESY 2D del compuesto 63. ...................................................................... 50
38. Confórmero de mínima energía DFT/B3LYP/6-31G* de 63a y sobreposición de 63a-
c y 63e. ............................................................................................................................... 52
xii
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro
1. Datos de desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13 C de la sarracina N-óxido (60) y sarracina (61) ............................................................................................................. 26
2. Datos de desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13C de 7β-angeloiloxi-1-
metilen-8α-pirrolozidina (62) ............................................................................................. 34 3. Energía relativa (kcal/mol) y porcentaje de población conformacional de 62 al nivel de
cálculo MMFF94 y B3LYP/6-31G* .................................................................................... 35 4. Valores de las constantes de acoplamiento (J en Hz) calculadas y experimentales para
62 ........................................................................................................................................ 37 5. Datos de desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13C del compuesto
mayoritario de la parte aérea de S. polypodioides 63 ............................................................. 45 6. Energía relativa (kcal/mol) y porcentaje (%) de población conformacional de 63 al
nivel de cálculo MMFF94 y B3LYP/6-31G* ........................................................................ 51 7. Valores de las constantes de acoplamiento (J en Hz) calculadas y experimentales para
63. ........................................................................................................................................ 52
Página
1
1. INTRODUCCIÓN
El género Senecio cuenta con una amplia variedad de especies, se conocen alrededor de
1500 alrededor del todo el mundo (Christov et al., 2002), y en México se conocen
alrededor de 165 de esas especies (Romo de Vivar et al., 2007). Debido a su amplia
distribución en la naturaleza, algunas de estas especies no han sido estudiadas, su estudio
es limitado o no tienen estudios químicos relacionados con la elucidación estructural de
sus metabolitos secundarios.
El género Senecio se caracteriza por tener como metabolitos secundarios principales a
alcaloides pirrolizidínicos, además de eremofilanólidos y furanoeremofilanos (Bohlmann,
1977; Rizk, 1991; Reina M. et al., 2001; Burgueño-Tapia et al., 2003; 2004; 2007),
algunos de estos compuestos han demostrado cierta actividad biológica, relacionada con
la actividad inhibitoria de la alimentación sobre algunas larvas o insectos en su estado
adulto (Reina M. et al., 2001; Burgueño-Tapia et al., 2007), además se ha documentado
actividad fitotóxica en algunas especies vegetales, así como también actividad citotóxica
en líneas celulares (González-Coloma et al., 2008).
Tomando en cuenta lo anterior, en este trabajo de investigación se decidió estudiar los
metabolitos secundarios presentes en Senecio polypodioides.
2
2. ANTECEDENTES
2.1. Género Senecio
La familia de las Asteraceae cuenta con 13 tribus, siendo la más amplia la Senecioneae
que tiene alrededor de 3000 especies (Romo de Vivar et al., 2007). El género Senecio, es
el más importante de la tribu Senecioneae pues tiene alrededor de 1500 especies
distribuidas en todo el planeta (Christov et al., 2002).
En México y Centroamérica, la tribu Senecioneae está representada por 19 géneros con
aproximadamente 165 especies. En México se han descrito de 102 especies que
representan el 62% de las especies descritas en la región México- Centroamérica (Romo
de Vivar et al., 2007).
Las especies de Senecio del estado de Oaxaca que tienen estudio Químico son S.
polypodioides y S. callosus (Romo de Vivar et al., 2000, 2007) donde se aislaron los
alcaloides pirrolizidínicos conocidos como platifilina (1), 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-
pirrolozidina (2) así como los alcaloides pirrolizidínicos tipo platinecina (3) y (4).
N
AngO H
2
N
AngO H
3 R= 5-hidroxiAng4 R= 5-hidroxiTig
OR
N
Platifilina (1)
OOO
HOO
HO
Ang =
OTig =
Senecio polypodioides (Figuras 1 y 2), es una especie que se puede encontrar en el estado
de Oaxaca, cuenta con sólo un estudio químico (Romo de Vivar et al., 2000). S.
polypodioides crece en bosques de pino y encino alrededor de 1600 metros sobre el nivel
del mar (msnm).
3
Figura 1. Parte aérea de Senecio polypodioides. Figura 2. Raíz de Senecio polypodiodes.
2.2 Metabolitos secundarios en Senecio
Los alcaloides pirrolizidínicos, los eremofilanólidos y los furanoeremofilanos son los
metabolitos secundarios que con mayor frecuencia se han aislado de las especies del
género Senecio.
2.2.1 Alcaloides
El nombre de alcaloide fue descrito por primera vez por W. Meissner en 1819, haciendo
referencia a los productos naturales de origen vegetal que mostraban propiedades
similares a las bases inorgánicas (álcalis) (Aniszewski, 2007). El término “oide” del
griego ειδω (eidw) que siginifica “parecido”, sigue siendo utilizado hoy en día para
sugerir alguna similitud de estructura o actividad entre moléculas (Fattorusso, 2008), por
ejemplo, terpenoide, eremofilanoide, capsaicinoide, capsinoide, entre otros.
Winterstein y Trier en 1910, acuñaron el término de alcaloide verdadero a aquellos
productos naturales que además de presentar basicidad, tenían que cumplir con cuatro
características (Fattorusso, 2008):
1. El átomo de nitrógeno debe estar en un sistema heterocíclico
2. La estructura debe ser compleja
3. La actividad farmacológica debe ser potente
4. Su distribución debe ser restringida al reino vegetal.
4
Sin embargo, esta definición presenta varios problemas, por ejemplo, algunos
compuestos reconocidos como alcaloides no presentan propiedades básicas en el
nitrógeno como en la colchina (5), las sales de amonio como la sanguinarina (6) o las
aminas N-óxido como la indicina N-óxido (7). En cuanto a su exclusivo origen vegetal
también hay conflicto, Qu et al., 2006 menciona que la bufoteina (8) que originalmente
se aisló de un sapo (Bufo, bufo), y que después se aisló de plantas del género Piptadenia,
específicamente del hongo conocido como amanita mappa y que incluso se ha detectado
en orina humana, tampoco podría entrar en la anterior definición por sus diferentes
fuentes de aislamiento.
Una definición más reciente para el término alcaloide fue propuesta en 1984 por S.W.
Pelletier: “Un alcaloide es un compuesto que contiene nitrógeno en un nivel negativo de
oxidación (−3 para aminas, amidas y sales de amonio, −1 para aminas N-óxido)
caracterizándose por una distribución limitada en la naturaleza” (Pelletier, 1993). Con
esta definición se incluye a compuestos de diferentes fuentes naturales, y es
probablemente la definición más adecuada en términos de química de productos
naturales.
MeO
MeO
OMe
O
NH
MeO
O
N
O
O
OO
Me
N
HO O
OOH
HO
O
5 6
7
NH
HO
N
8 Figura 3. Compuestos reconocidos como alcaloides, que no entran en la definición de alcaloide descrita por Winterstein y Trier (Fattorusso, 2008).
5
2.2.2. Alcaloides pirrolizidínicos (APs)
Los APs son un grupo de productos naturales que contienen en su estructura uno de los
cuatro isómeros de la 1-hidroximetilpirrolozidina (9), lo que se conoce como necinas o
base necínica, dichas bases necínicas pueden tener un doble enlace en el carbono C-1, un
grupo hidroxilo (OH) en C-7 y la posición 2 y/o 6 puede estar oxidada. Los grupos OH
pueden estar esterificados por ácidos monocarboxílicos, como el ácido angélico (10) o
ácido tíglico (11), o por ácidos dicarboxílicos como el ácido senecionico (12) (Romo de
Vivar et al., 2007).
N
H OH1
2
3
6
5
7
9
9
CO2H
10
CO2H
11
CO2H
HO
CO2H
12 Figura 4. Base necínica y ácidos nécicos más comunes en APs.
Los APs que tienen en su esqueleto básico a la retronecina (13), otonecina (14) o a la
heliotridina (15) son altamente tóxicos, la toxicidad se incrementa cuando un éster cíclico
está presente como es el caso de la senecionina (16), que es el APs más común en la
familia Senecioneae (Romo de Vivar et al., 2007).
N
Retronecina (13)
OHHO H
N
OHHO O
Otonecina (14)
N
Heliotridina (15)
OHHO H
N
Senecionina (16)
OOO
HOO
H
Figura 5. APs comúnmente presentes en la familia Senecioneae.
Los APs generalmente se encuentran en varios géneros de la familia Astereacea,
particularmente en la tribu Senecioneae, género Senecio; tribu Eupatorieae, género
Eupatorium, así como en la tribu Boraginaceae (Heliotropium y Cynoglossum), y en
6
algunos géneros de las Fabaceae (Crotalaria), Apacynaceae (Parsonsia) y Orchidaceae
(Phalaenopsis).
En las especies de Senecio los APs se sintetizan en las raíces como N-óxidos y son
transportados por la ruta del floema hacia los sitios de almacenamiento como pueden ser
las inflorescencias (Hartmann et al., 1989). En la Figura 6, se muestran los resultados
obtenidos por Hartmann et al., 1989 con relación a la biosíntesis y almacenamiento de la
senecionina N-óxido en S. vulgaris. A esta especie se le suministró arginina, putrecina y
espermidina marcada isotópicamente con 14C in vitro, mostrando que en las raíces se
encontró la mayor proporción de la senecionina N-óxido, concluyendo así que, es este el
sitio de síntesis de los APs como N-óxidos para la mayoría de especies de Senecio.
Figura 6. Porcentajes (%) de distribución de 14C en S. vulgaris como una medida de biosíntesis de Senecionina N-óxido en A 20 horas y B 70 horas. En diferentes especies de Senecio el producto de biosíntesis común es la senecionina N-
óxido, la cual posteriormente sufre cambios estructurales a través de reacciones
específicas, dando lugar con ello a la diversificación de los APs (Figura 7) (Hartmann,
1995).
7
Figura 7. Transformaciones de la senecionina N-óxido para dar lugar a la variedad de APs.
Spenser en 1985 y Robins en 1989, demostraron que el esqueleto carbonado de la base
necínica se origina de la arginina y ornitina vía putrescina, se tiene evidencia de que la
homospermidina es un intermediario en la ruta de la biosíntesis de la retronecina (Figura
8); sin embargo, varios ácidos nécicos se forman también de aminoácidos como la
isoleucina (como en la senecionina), valina o leucina (Hartmann, 1995).
8
NH2
NH2
H2N
NH2
+N
NH2
NH2
H
sym-homospermidina
N
NH2
N
CHO
Iones iminium
CH2OHH
(-) trachelantamidina
CH2OHHRO
Éster de retronecina
putrescina putrescina
Figura 8. Biosíntesis de la base necínica de los APs.
Como se mencionó antes, los APs son alcaloides de éster que tienen una base de necina,
esterificada con ácido nécico. Se conocen APs en forma de diéster macrocíclicos, diéster
de cadena abierta o monoésteres. Hartmann (1995) ha clasificado en cinco estructuras
básicas a los APs: tipo senecionina (16) (característica de la tribu Senecioneae); tipo
triangularina (17) (tribu Senecioneae); tipo monocrotalina (18) (tribu Fabaceae); tipo
licopsamina (19) (tribu Eupatorieae y familias Botaginaceae y Apocinaneae) y tipo
falaenopsina (20) (Orchidaceae) (Figura 9).
9
N
OO
O
HO
O H
Senecionina (16)
N
OO
O
O H
Triangularina (17)
N
OO
O
O H
OHOH
Monocrotalina (18)
N
OH H
Licopsamina (19)
O
OOH OH
N
H
Falaenopsina (20)
O
OO
OHO
HO
Figura 9. Las cinco estructuras básicas de los alcaloides pirrolizidínicos.
2.2.3. Eremofilanos
Los eremofilanos son sesquiterpernos que derivan biogenéticamente de los eudesmanos
por migración del grupo metilo del C-10 al C-5 (Mann et al., 1994) (Figura 10).
1
2
34
8
510
6
11 12
9
7
13
1
2
34
8
510
6
11 12
9
7
13 1514
14
15
Esqueleto de los eremefilanos (22)Esqueleto de los eudesmanos (21) Figura 10. Sesquiterpenoides
Los eremofilanoides del género Senecio, contienen en su esqueleto básico a un sistema
decalina (23) y la gran mayoría se encuentran como furanoeremofilanos (24) o
eremofilanólidos (25) (Figura 11).
10
O OO
24 2523 Figura 11. Esqueleto básico de los furanoeremofilanoides (24) y eremofilanólidos (25).
2.3 Alcaloides pirrolizidínicos y eremofilanos aislados de especies de Senecio
Hasta el año de 1993, en la revisión hecha por Logie et al. (1994), se describen
alrededor de 350 APs en la literatura internacional.
En trabajos más recientes, descritos para las especies mexicanas de Senecio, Pérez-
Castorena et al. (1999) describe al nuevo AP de nombre iodantina (26) (Figura 12),
aislado de S. iodanthus y S. bracteatus, que muestra la característica del doble enlace C-
15 y C-16 con geometría Z. En ese mismo año, se realizó el estudio químico de cuatro
especies que para ese entonces no habían sido estudiadas; S. polypodioides, S. runcinatus,
S. madrensis y S. prionopterus (Liddell, 2001) donde se aislaron los APs platifilina (1),
senecionina (16), platifilina N-óxido (27), rosmarinina (28), rosmarinina N-óxido (29) y
retrorsina (30) (Figura 13).
N
O
OOH
OO
H
Iodantina (26)
14
Figura 12. Iodantina aislada de las especies mexicanas, S. iodanthus y S. bracteatus.
11
N
27 Platifilina N-óxido R1= H R2 = O28 Rosmarinina R1= OH R2 = . .29 Rosmarina N-óxido R1 =OH R2 = O
OOO
HOO
H
N
Retrorsina (30)
OOO
HOO
H
OH
R2
N
Integerrimina (31)
OO
H
O
HOO
H
R1
Figura 13. APs aislados de especies mexicanas del género Senecio.
Una revisión hecha por Romo de Vivar et al., 2007, de las especies mexicanas de la tribu
Senecioneae, muestra que los APs aislados de S. madrensis fueron (16 y 1); S.
mairentianus (16 y 31); S. prionopterus y S. procumbens (16 y 30) y los eremofilanoides
(32-35) aislados de S. mairentianus, así como (36 a-d, 37a-m, 38a-c) de S. pericalia.
OO
OO
O
R1OH
33 R1= OMe
OO
OHOH OHR1 O
32 34 35
Figura 14. Eremofilanoides aislados de la especie mexicana de Senecio. S. mairentianus (32-35)
O
36a 36b 36c 36d R= MeSen Ang Tig Sen
ROOH
O
R1OOH
O
R2R1= MeSen MeSen MeSen Tig TigR2= H OH OMe H OH
37a 37b 37c 37d 37e
37f 37g 37h 37i 37k
R1= Tig Sen Sen Sen AngR2= OMe H OH OMe OH
37l 37mR1= Ang H R2= OMe OMe
37
12
OO
39
AngOOH
H
OAng =
OSen =
OTig =
O
38a 38b 38c R=Ang Tig Sen
ROOH
O
Figura 15. Eremofilanoides aislados de S. Pericalia (36a-d, 37 a-m, 38 a-c) y S. sinuatus Gilib (39).
Burgueño-Tapia et al., 2007, menciona la presencia de un nuevo eremofilanólido en la
especie mexicana de S. sinuatus Gilib (39), además de 37b, 37d y 37k.
2.4. Actividad biológica
Recientemente se ha descrito que algunos APs y eremofilanoides muestran actividad
biológica en contra de algunos insectos herbívoros de interés agrícola. Reina M. et al., en
2001 mostraron que los eremofilanoides 40 y 41 y los APs integerrimina (31) y su N-
óxido (42) aislados de S. miser (Figura16), tuvieron actividad inhibitoria de la
alimentación (IA) sobre Myzus persicae y Lepinotarsa decemlineata, respectivamente.
Los APs aislados de S.bollei 12, 31, 43- 45 (Figura 17), han demostrado actividad IA en
larvas de Spodoptera Littoralis, L. decemlineata, M. persicae y Rhopalosiphum y efecto
fitotóxico en Latuca sativa, además de efecto citotóxico en células Sf9 de S. frugiperda
y células CHO de mamíferos (González-Coloma et al., 2008).
HO
O
R2R
R1
40 R= OAc; R1 = H; R2 = OMe41 R= OAng; R1 = OH; R2= OMe
N
Integerrimina N-óxido (42)
OO
H
O
HOO
H
O
Figura 16. Eremofilanoides y APs con actividad inhibitoria de la alimentación (IA).
13
N
Senecifilina (43)
OOO
HOO
H
N
Espartioidina (44)
OOO
HOO
H
N
OOO
HOO
H
H
H
Senecivernina (45) Figura 17. APs con actividad biológica: actividad IA y citotóxica (12), fitotóxica y citotóxica (31, 43-45).
Los eremofilanoides 46-57 han demostrado actividad IA en larvas de S. littoralis, L.
decemlineata y en insectos M. persicae (Burgueño-Tapia et al., 2007).
O
OR
O
OAc OAcO O
R2
O
R1
O
OR
46 R= Me47 R= Ac 48
49 R1= CH2O-iVal R2= H50 R1= CH=O R2= OH51 R1= CH=O R2= OAc
52 R= H53 R= Ac
OO
OR
OO
54 R= H55 R= Ac
56 R= H57 R= Ac
Figura 18. Eremofilanoides con actividad inhibitoria de la alimentación en insectos.
Con base en estos antecedentes y considerando la limitada información acerca de los
metabolitos secundarios presentes en S. polypodioides se decidió hacer el estudio
químico de esta especie con la finalidad de cubrir la necesidad de dicha información así
como la posibilidad de identificar novedosos metabolitos secundarios.
14
3. HIPÓTESIS
La extracción, aislamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en S.
polypodioides permitirá la obtención de alcaloides tipo pirrolizidínicos así como
sesquiterpenos tipo eremofilanoides.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Aislamiento, purificación y elucidación estructural de los metabolitos secundarios
presentes en los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico de S. polypodioides
y análisis conformacional de algunos compuestos seleccionados.
4.2. Objetivos específicos
• Recolección, secado y molienda de la planta de S. polypodioides.
• Obtención de los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico.
• Separación, purificación por técnicas cromatográficas y/o químicas de los
metabolitos secundarios presentes en dichos extractos.
• Obtención de sus propiedades físicas y espectroscópicas necesarias para la
elucidación estructural de estos metabolitos secundarios.
• Análisis conformacional a través de métodos computacionales y análisis
de las 3JH-H.
15
5. METODOLOGÍA
5.1. Colecta de material vegetal
La raíz y parte aérea de S. polypodioides, se colectó en San Miguel Suchixtepec,
Miahuatlan, Oaxaca, en marzo de 2009. Una especie se depositó para su identificación en
el herbario de la Universidad Autónoma de Chapingo (UACh), Texcoco, México. Las
especies destinadas para el trabajo químico se secaron a la sombra a temperatura
ambiente.
5.2 Extracción de la raíz de Senecio polypodiodes
La raíz seca de S. polypodioides (1.34 Kg), se extrajo a reflujo con 6 L de hexano (Hx)
durante seis horas (x 4), posteriormente con acetato de etilo (AcOEt) (x 4) y metanol
(MeOH) (x 4). Después de la evaporación de cada uno de los disolventes a presión
reducida, se obtuvieron 2.75 g (0.20%) de extracto hexánico, 11.88 g (0.88%) de extracto
de AcOEt y 118.03 g (8.8%) de extracto metanólico. Del extracto metanólico se obtuvo
un precipitado blanco 16.60 g (1.23%). 10.10 g de extracto metanólico, se disolvieron en
75 mL de agua y se extrajeron con 75 mL de cloroformo (CHCl3) (x 4), obteniendo 2.3 g
(22.78%) de la fracción soluble en cloroformo.
5.3. Extracción de la parte aérea de Senecio polypodiodes
1.08 Kg de la parte aérea de S. polypodioides se reflujó con 8 L de Hx durante seis horas
(x 4), posteriormente con AcOEt (x 4) y MeOH (x 4). Después de la evaporación de cada
uno de los disolventes a presión reducida, se obtuvieron 9.64 g (0.89%) de extracto
hexánico 15.30 g (1.42%) de extracto AcOEt y 80 g (7.42%) de extracto metanólico.
El extracto hexánico se disolvió en 100 mL de MeOH y se dejó precipitar a 0 °C, se filtró
a vacío y se eliminó el disolvente a precisión reducida, obteniendo así el extracto
hexánico 6.5 g (0.60%) con la menor cantidad de hidrocarburos, como ceras o ácidos
grasos inherentes a la parte aérea.
16
5.4. Aislamiento de los alcaloides pirrolizidínicos (APs) de la raíz de S. polypodiodes
5.4.1 Cromatografía del extracto CHCl3
1.0 g de extracto clorofórmico de la raíz seca, se empleó para su separación en una
columna empacada con sílica-gel (SiO2) (100-200 mallas, Natland International
Corporation), de 2.0 cm de diámetro y 30 cm de altura usando como fase móvil CH2Cl2-
MeOH con gradiente de elución. De acuerdo a la cromatografía en capa fina (CCF)
(sílica-gel 60F254, Merck) revelada con reactivo de Dragendorff, las fracciones (20 mL)
28 a 33 de la fase móvil CH2Cl2-MeOH (8:2) se reunieron y se precipitaron en una
mezcla de Hx-CHCl3 para dar 105 mg (10.5%) de un sólido blanco de p.f. = 119.6 a
120.4 °C como componente mayoritario que correspondió a la sarracina N-óxido (60).
5.4.2. Reducción de la sarracina N-óxido
30 mg del compuesto 60 se disolvieron en 2 mL de MeOH, se acidificó con 1.0 mL de
H2SO4 al 2.5%, se le agregó Zinc en polvo (10 mg) y se agitó por 9 horas para su
reducción. Al término de este tiempo se le adicionó NH4OH (2.5%) hasta pH 11, se le
agregaron 50 mL de agua y se procedió a la extracción con CHCl3 (3 x 50 mL), se
separó la fase orgánica y se eliminó el disolvente a presión reducida, obteniendo
directamente del crudo de reacción a la sarracina (61) (10 mg).
5.4.3. Aislamiento del componente minoritario del extracto CHCl3
De una segunda columna empacada con SiO2 (100-200 mallas, Natland International
Corporation) de 6.0 cm de diámetro y 30 cm de altura y con 3.0 g de extracto
clorofórmico de la raíz de S. polypodioides, se obtuvo la fracción 20 (50 mL) de la fase
móvil CH2Cl2-MeOH (93:7). Esta fracción se recromatografió en SiO2 (100-200 mallas,
Natland International Corporation) en una columna de 2.0 cm y 26 cm de altura,
obteniendo a las fracciones: 12 a 25 (10 mL) CH2Cl2-MeOH (97:3) y 1 a 29 (10 mL)
CH2Cl2-MeOH (96:4) que revelaron con el reactivo de Dragendorff, las fracciones
17
anteriores se volvieron a cromatografiar en CCF, placas de SiO2 de 5.0 x 3.0 cm (sílica –
gel 60 F254, Merck) utilizando como fase móvil CH2Cl2-MeOH (7:3), obteniendo así 18.5
mg (0.62%) de 62.
5.5. Aislamiento del componente mayoritario de la parte aérea de S. polypodiodes
3.5 g de extracto hexánico se sometieron a cromatografía en columna (CC) en SiO2 (200-
300 mallas, Natland International Corporation) de 6.0 cm de diámetro y 21 cm de altura y
utilizando como fase móvil mezclas de Hx:AOcEt con gradiente de elución.
De acuerdo a la CCF revelada con sulfato cérico (CeSO4) en solución de H2SO4 y calor,
las fracciones (10 mL) 14 a 28 de la fase móvil Hx-AcOEt (8:2) se reunieron para dar
193.1 mg (5.52%) de muestra, la cual se cromatografió por CCF en una placa de SiO2 de
20 x 20 cm (Sílica-gel, 1500 micrones, Analtech), usando como fase móvil una mezcla de
Hx-AcOEt (7:3). Revelando con luz ultravioleta (UV) con una longitud de onda de 254
nm se detectó y se raspó el compuesto, se extrajo con 50 mL de AcOEt y agitación por 15
minutos, se filtró a vacío y se recuperó el disolvente a presión reducida. Se obtuvieron así
67.6 mg (1.93%) del compuesto mayoritario del extracto Hexánico de la parte aérea de S.
polypodioides 63.
5.6. Análisis conformacional
El análisis conformacional de 62 y 63 se inició con un protocolo Monte Carlo a nivel de
Mecánica Molécular MMFF94 como se encuentra implementado en el programa
Spartan ´08. Los confórmeros que se obtuvieron en un ∆E de 10 kcal/mol fueron
sometidos a un cálculo usando Teoría de Funcionales de la Densidad (DFT) al nivel
B3LYP/6-31G*. Este cálculo se hizo sin considerar el efecto del disolvente. Las
constantes de acoplamiento (3JH-H) de los confórmeros se calcularon usando ecuaciones
tipo Karplus como se encuentran implementadas en el programa PCMODEL y
considerando la distribución de población de Boltzman.
18
5.7. Obtención de los datos espectroscópicos
Los datos espectroscópicos de RMN de 1H, 13C en 1D y 2D fueron obtenidos en un
equipo Varian System 500, usando CDCl3 como disolvente y TMS como referencia
interna. Las masas de alta resolución se determinó en un Espectrómetro de Masas Jeol
JCMateII a 70 eV.
19
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Extractos
Después del proceso de extracción de la raíz seca de S.polypodioides se obtuvieron 2.75
g (0.20%) de extracto Hx, 11.88 g (0.88%) de extracto AcOEt y 118.03 g (8.8%) de
extracto metanólico. En la CCF de los extractos Hx, AcOEt y MeOH de la raíz seca
dieron positivos a la prueba de Dragendorff, dicha prueba es un indicio de la presencia de
alcaloides. Los espectros de RMN 1H de los extractos de Hx, AcOEt y MeOH de la raíz
seca, mostraron señales de protones vinílicos alrededor de 6.0 partes por millón (ppm) y
señal de protón base de éster a 5.0 ppm (Figura 19). El análisis de las señales de RMN de 1H de cada uno de los extractos mostró que, a pesar de que Romo de Vivar et al., 2000
describen la presencia de platifilina (1), en el extracto metanólico de la parte aérea de S.
polypodiodes, en ninguno de los extractos obtenidos en este trabajo se observaron las
señales correspondientes a la platifilina descritas por Trigo et al. en 2004. Tomando en
cuenta este hecho se continúo con el proceso de separación y purificación de los
principales metabolitos secundarios.
6.2 Elucidación del compuesto mayoritario de la raíz de S. polypodioides
De la cromatografía del extracto clorofórmico de la raíz de S. polypodioides se obtuvo
principalmente un compuesto que después se hizo precipitar con una mezcla de Hx-
CHCl3 obteniendo un polvo blanco con punto de fusión 119.6 a 120.4 °C como
compuesto mayoritario 60.
El espectro de RMN de 1H (Figura 20) del sólido obtenido 60 mostró a las señales
características de un grupo angeloilo en 6.20 (1H, cc, J = 7.5, 1.5 Hz) y en δ 2.02 (3H,
dc, J = 7.5, 1.5 Hz) y δ 1.91 (3H, q, J = 1.5 Hz). Adicionalmente se observó la señal de
otro protón vinílico a δ 6.37 como una señal cuádruple de triples (1H, J = 7.0, 1.0 Hz),
que junto con la señal del metilo a δ 2.03 que se observó como una señal doble de triples
(3H, J = 7.0, 1.0 Hz) que junto con las señales del metileno base de oxígeno a δ 4.38
20
(1H, dd, J =11.0, 7.0 Hz) y 4.25 (1H, dd, J =11, 9.2 Hz) sugirieron la presencia del grupo
sarracinoiloxi. La sustitución de dos ésteres en O-7 y O-9 dado por las señales de H-7,
H-9b y H-9a con desplazamientos de 5.71 (1H, ddd, 5.5, 5.5, 1.4 Hz), 4.38 (1H, dd, J
=11.0, 7.0 Hz) y 4.25 ppm (1H, dd, J =11, 9.2 Hz), sugirió que el AP correspondía a una
base necínica saturada. Lo anterior, corresponde a un AP en forma de diéster acíclico, lo
que hizo pensar que el compuesto obtenido se trataba de la sarracina (Stermitz y Roby
1984) (61) (a = señal a campo alto, b= señal a campo bajo, c = cuartete, d = doblete, t =
triplete, q = quinteto).
Sin embargo, los desplazamientos químicos a campo bajo de los protones adyacentes al
nitrógeno de la base necínica, es decir, los protones H-3, H-5 y H-8, son característicos
para un N-óxido, del experimento gHSQC se asignó al C-8 con un desplazamiento
químico de 86.3 ppm que es una señal diagnóstico para un N-óxido (Roby y Stermitz,
1984). Además, tomando en cuenta su punto de fusión de 119.6 a 120.4 ° C, corresponde
con el descrito por Culvenor y Geissman (1961) de 125 a 126 °C para la sarracina N-
óxido hidratada. Del análisis de la masa de alta resolución del ión molecular se dedujo la
fórmula condensada C18H27NO6, lo cual mostró que el compuesto aislado se trataba de la
sarracina N-óxido.
El espectro de RMN de 13C (Figura 21) mostró las dos señales de grupo carbonilo de
éster a δ 166.5 (C-17) y 165.6 (C-11) y las cuatro señales de los carbonos vinílicos a δ
141.8 (C-19), 140.3 (C-13), 132.2 (C-12) y 125.8 (C-18) de los grupos angeloiloxi y
sarracinoiloxi. Por otro lado los carbonos base de heteroátomo se observaron en δ 86.3
(C-8), 73.7 (C-7), 70.1 (C-3), 68.1 (C-5), 63.7 (C-15) y 61.9 (C-9). Es importante
mencionar que los carbonos C-3, C-5 y C-8 muestran los desplazamientos químicos
característicos de pirrolizidina N-óxido, pues cuando se trata de amina libre se encuentran
desplazados hacia frecuencias más bajas. Finalmente, el grupo metino C-1 se observó en
δ 37.5, los metilenos C-6 y C-2 en δ 32.3 y 28.5, respectivamente. Los metilos se
observaron a δ 20.6 (C-21), 15.8 (C-14) y 15.6 (C-20).
21
Figu
ra 1
9. E
spec
tro
de R
MN
1 H d
el e
xtra
cto
met
anól
ico
de S
. p
oly
po
dio
des
en D
MSO
-d6 (
500
MH
z).
22
Figu
ra 2
0. E
spec
tro
de R
MN
1 H d
e la
sar
raci
na N
-O p
rese
nte
en la
raí
z de
S.
poly
po
dio
des
(60)
en
CD
Cl 3
(50
0 M
Hz)
.
N
O
O
H 60
3
11
17
141
3
7
12
86
5
1
2
182
1
20
O
O
O
HO
15
19
|
23
Figu
ra 2
1. E
spec
tro
de R
MN
de
13 C
de
la s
arra
cina
N-O
pre
sent
e en
la r
aíz
de S
. po
lyp
odio
ides
(60)
en
CD
Cl 3
(1
25 M
Hz)
.
3.8
5 m
3.7
4 m
4.1
6 d
d
3.7
8 m
N
O
O
H 60
3
11
17
141
3
7
12
86
5
1
2
182
1
20
O
O
O
HO
15
19
|
24
6.3 Reducción de la sarracina N-óxido
Para confirmar la presencia de la sarracina N-óxido (60) el compuesto fue reducido con
Zinc/H2SO4 para obtener a la sarracina (61) (Figura 22). Por su parte, las masas de alta
resolución del ión molecular mostraron una fórmula condensada de C18H27NO5. Los
datos de 1H y de 13C están de acuerdo con los descritos por Stermitz y Roby 1984 y Logie
et al., 1993 para la sarracina, con lo que se confirmó la presencia de la sarracina N-óxido
(60) como compuesto mayoritario del extracto clorofórmico de la raíz de S.
polypodioides. Esto concuerda con el hecho de que en las especies de Senecio los
alcaloides pirrolizidínicos se sintetizan en forma de N-óxidos en las raíces (Hartmann et
al., 1989). Tomando en cuenta que la fracción clorofórmica se obtuvo directamente desde
la partición por extracción del extracto metanólico, sin ser sometido a un tratamiento con
Zn/H+ como tradicionalmente se hace, es probable que se obtenga los APs como N-óxido.
Los desplazamientos químicos de 1H y 13C tanto para la sarracina como para su N-óxido
se describen en la Cuadro 1, donde se puede observar la diferencia en desplazamientos
químicos de los protones H-8, H-3b, H-3a, H-5b y H-5a de 0.55, 0.65, 0.95, 0.45 y 1.01
ppm, respectivamente, hacia frecuencias más altas en el N-óxido (60). Mientras que en la
RMN 13C el C-8 sufrió un desplazamiento de 17.5 ppm hacia frecuencias más altas en
(60). Cabe mencionar que en la literatura no se encuentran descritos ni asignados los
desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13C de la sarracina N-óxido y esta es la
primera vez que se describen la constantes de acoplamiento que se muestran en la Cuadro
1.
25
Figu
ra 2
2. E
spec
tro
de R
MN
1 H d
e la
sar
raci
na (
61)
com
o co
mpu
esto
may
orita
rio
de la
raí
z de
S.
poly
podio
ides
en C
DC
l 3 (
500
MH
z).
N
O
H 61
3
11
17
141
3
7
12
86
5
1
2
182
1
20
O
O
O
HO
15
19
26
6.4 Elucidación del compuesto minoritario de la raíz de S. polypodioides
De la cromatografía en columna del extracto clorofórmico de la raíz de S. polypodiodes,
y después de una cromatografía en CCF placas de SiO2 de 5.0 x 3.0 cm (sílica –gel 60
F254, Merck) utilizando como fase móvil CH2Cl2-MeOH (7:3), se obtuvieron 18.5 mg
(0.62%) del compuesto minoritario 62.
Cuadro 1. Datos de desplazamiento químicos RMN de 1H y de 13 C de la sarracina N-óxido (60) y sarracina (61) (J en Hz) a
60 61
Átomo 1H 13C
1H 13C
1 3.49 m 37.5
2.76 m
40.2 2b 2.49 dddd (12.6 7.9, 7.9, 4.8) 28.5
1.90 m
28.7
2a 1.98 m 28.5
1.83 m
28.7 3b 3.85 ddd (11.7, 8.7, 4.8) 70.1
3.20 ddd (9.4, 7.5, 7.5)
55.1
3a 3.74 ddd (11.7, 7.9, 7.9) 70.1
2.82 m
55.1 5b 3.78 m 68.1
3.33 ddd (9.4, 9.4, 1.1)
53.5
5a 3.78 m 68.1
2.77 m
53.5 6b 2.90 dddd (14.6, 9.2, 9.2, 5.5) 32.3
2.12 m
35.0
6a 2.08 m 32.3
2.08 m
35.0 7 5.71 ddd ( 5.5, 5.5, 1.4) 73.7
5.36 ta
75.1
8 4.16 dd (8.5, 5.5) 86.3
3.61 dd (8.1, 3.6)
68.8 9b 4.38 dd (11.0, 7.0) 61.9
4.41 dd (10.9, 7.6)
63.9
9a 4.25 dd (11.0, 9.2) 61.9
4.25 dd (10.9, 8.3)
63.9 11
165.6
166.8
12
132.2
131.9 13 6.37dc (7.0,1.0) 140.3
6.36 dc (7.0, 1.0)
140.2
14 2.03 dt (7.0,1.0) 15.8
2.05 dt (7.0, 1,0)
15.7
15 4.21t (1.0) 2H 63.7
4.23 sa (2H)
64.7
17
166.5
166.7 18
125.8
127.0
19 6.20 cc (7.5,1.5) 141.8
6.11 cc (7.5, 1.5)
139.7
20 2.02 dc (7.5, 1.5) 15.6
2.01 dc(7.5, 1.5)
15.6
21 1.91q (1.5) 20.6 1.91q (1.5) 20.7 a 1H a 5000 MHz y 13C a 125 MHz en CDCl3
27
El espectro de RMN de 1H de 62 (Figura 23) mostró a las señales características de un
grupo angeloilo en 6.14 (1H, cc, J = 7.5, 1.5 Hz), 1.99 (3H, dc, J = 7.5, 1.5 Hz) y 1.85
ppm (3H, q, J = 1.5 Hz). A diferencia de la sarracina N-O (60), no se observó la
presencia del grupo sarracinoiloxi; sin embargo, se observó la presencia de los protones
vinílicos H-9b y H-9a en δ 5.25 (1H, c, J = 2.0 Hz) y δ 5.07 (1H, c, J = 2.0 Hz), típicos
de un doble enlace exocíclico lo que indicaban que se trataba de un APs acíclico, se
observó también una señal en δ 4.82 (1H, da, J = 3.2 Hz) característico del átomo de
hidrógeno de la fusión del biciclo de pirrolizidína (H-8α), a campos más altos se
observaron señales del resto de los protones metilénicos de dicho biciclo.
El espectro de RMN de 13C del compuesto 62 (Figura 24), mostró señales para trece
átomos de carbonos, de los cuales según el experimento DEPT (Figura 25), tres
corresponden a metinos, uno de ellos con hibridación sp2 (C-13 a 140.4 ppm), mientras
que los otros dos corresponden a metinos con hibridación sp3 (C-7 a 72.9 y C-8 a 72.0
ppm). También se observó la presencia de cinco metilenos a 111.8 (C-9), 53.5 (C-3), 52.8
(C-5), 34.0 (C-6) y 33.0 (C-2) ppm. Finalmente, se observó la presencia de dos metilos a
20.4 (C-15) y 15.8 (C-14).
La asignación completa de los datos de RMN de 1H y de 13C del compuesto 62 (Cuadro
2) se llevó a cabo con la ayuda de los experimentos gCOSY, gHMQC y gHMBC (Anexo
3).
La estereoquímica relativa de los carbonos C-7 y C-8 se determinó a través del
experimento de RMN NOE difference (Figura 26). Asumiendo que H-8 está en posición
α, como es en la mayoría de los APs (Liddell y Logie, 1993), la asignación de la
estereoquímica relativa -α de H-7 se asignó después de observar que al saturar al H-7, la
señal correspondiente a H-8 mostró un incremento sustancial. De la misma forma se
asignó a los protones correspondientes del metileno vinílico como H-9b al que se
encuentra del mismo lado que el CH2-2 y H-9a al que está del lado opuesto. La
irradiación del grupo CH2-2 en el experimento NOE difference mostró un incremento en
la señal a δ 5.25, asignado así a H-9b (Anexo 3).
28
Cabe mencionar que para la asignación estructural del compuesto 62 se tuvo que
discernir entre otras señales presentes en los espectros de RMN de 1H (Figura 23) y de 13C (Figura 24). Como se mencionó anteriormente, la asignación se hizo con ayuda de
experimentos de RMN en 1D y 2D.
Durante el proceso de asignación de los datos de RMN de 62 se observó que, en una
segunda y tercera adquisición, los desplazamientos químicos de protón se movían a
campo más bajo con respecto a la primera adquisición de datos, por lo que se decidió
filtrar el CDCl3 en alúmina neutra (Al2O3, 70-230 mallas, Merck) y así utilizarlo para
disolver la muestra y obtener la RMN de 1H, además de filtrar también el compuesto 62
en alúmina. El espectro se muestra en la Figura 27. Con esta adquisición de RMN de 1H
se pudieron medir las contantes de acoplamiento para cada una de las señales de protón
(Cuadro 2). Probablemente la acidez generada en el CDCl3 durante su almacenamiento
sea la causa de este comportamiento en los desplazamientos químicos de 1H, y una vez
que el CDCl3 se filtró en alúmina neutra dejó de tener dicho efecto. Adicionalmente, las
señales del componente contaminante ya no se observaron, lo que hizo pensar que éste se
trataba del ácido angélico, que quedó atrapado en la alúmina.
Liddell y Logie (1993) describieron por primera vez al compuesto 62 como 7β-
angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina, aislado de S. chrysocoma, un segundo artículo
escrito por Romo del Vivar et al. en 1999 menciona su presencia en S. doratophyllus, en
ambos estudios se encontró al compuesto 62 además de los APs sarracina (61) o sarracina
N-óxido (60), lo que concuerda con el presente trabajo. Probablemente la presencia de
estos APs implique una relación biogenética a través de la liberación del N-óxido en 61
para generar el alcaloide libre 60, y posterior eliminación del ácido sarracinoico para
generar 62.
Por otra parte, en los trabajos de Liddell y Romo de Vivar no se describen las constantes
de acoplamiento para los diferentes protones, lo que en este trabajo se presenta en la
Cuadro 2.
29
Fig
ura
23. E
spec
tro
de R
MN
de
1 H d
e 7β
-ang
eloi
loxi
-1-m
etile
n-8α
-pir
rolo
zidi
na (
62)
pre
sent
e en
la r
aíz
de S
. poly
podio
ides
en C
DC
l 3 (
500
MH
z).
N
OH
3
11
78
65
1
2
1215
14
O
13
9
62
30
Figu
ra 2
4. E
spec
tro
de R
MN
13C
de
7β-a
ngel
oilo
xi-1
-met
ilen-
8α-p
irro
lozi
dina
(62
) pr
esen
te e
n la
raí
z de
S.
poly
podio
ides
en C
DC
l 3 (
125
MH
z)
N
OH
3
11
78
65
1
2
1215
14
O
13
9
62
31
Figu
ra 2
5. E
xper
imen
to D
EPT
de
7β-a
ngel
oilo
xi-1
-met
ilen-
8α-p
irro
lozi
dina
(62
) en
CD
Cl 3
N
OH
3
11
78
65
1
2
12
15
14
O
13
9
62
32
F
igur
a 26
. E
xper
imen
to R
MN
NO
E d
iffe
rence
de 7
β-a
ngel
oilo
xi-1
-met
ilen
-8α
-pir
rolo
zidi
na (
62),
se
obse
rva
la c
orre
laci
ón a
trav
és d
e es
paci
o de
l
pro
tón
H-7
con
H-8
N
OH
3
11
78
65
1
2
12
15
14
O
13
9
62
33
Figu
ra 2
7. E
spec
tro
de R
MN
1 H d
e 7β
-ang
eloi
loxi
-1-m
etile
n-8α
-pir
rolo
zidi
na (
62)
de r
aíz
en C
DC
l 3 d
espu
és d
e fi
ltrad
o en
alú
min
a ne
utra
(50
0 M
Hz)
.
N
OH
3
11
78
65
1
2
12
15
14
O
13
9
62
34
Cuadro 2. Datos de desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13C de7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) (J en Hz) a,b
Átomo 1H 13C HMBC
1 140.1 2α 2.78 mc 33.0 C-9
2β 2.77 mc 33.0 C-9 3α 3.67 ddd (9.7, 7.0, 5.8) 53.5 3β 3.08 ddd (9.7, 7.4, 7.4) 53.5 5α 3.95 ddd (10.3, 8.0, 2.5) 52.8 C-3 5β 3.10 ddd (10.3, 10.3, 6.7) 52.8 C-3 6α 2.47 dddd (13.5, 10.3, 8.0, 4.6) 34.0 6β 2.28 dddd (13.5, 6.7, 2.5, 1.5) 34.0 7α 5.75 ddd (4.6, 4.6, 1.5) 72.9 8α 4.82 da (4.6) 72.0 C-9, C-5 9b 5.25 cda (2.0, 0.5) 111.8 9a 5.07 ca (2.0) 111.8 11 165.8 12 126.5 13 6.14 cc (7.5,1.5) 140.4 C-15, C-14 14 1.99 dc (7.5, 1.5) 15.8 C-15 15 1.85 q (1.5) 20.4 C-14
a 1H a 500 MHz y 13C a 125 MHz en CDCl3
b Las constantes de acoplamiento fueron medidas desde el espectro de RMN de 1H obtenido con CDCl3 filtrado en alúmina
c Desplazamiento químico obtenido desde el experimento gHMQC. La asignación puede estar intercambiada.
6.5 Análisis conformacional del compuesto minoritario de la raíz de S. polypodioides
El análisis conformacional del compuesto 62, se inició con un protocolo Monte Carlo a
nivel de Mecánica Molécular (Chang et al., 1989) MMFF94 (Halgren T. 1996a, 1996b,
Halgren T. 1996c, Halgren T. y Nachbar R.B. 1996d, Halgren T. 1996e) como se
encuentra implementado en el programa Spartan ´08. Una vez eliminadas aquellas
estructuras que se duplicaron, se obtuvieron 27 confórmeros en un ∆E de 10 kcal/mol,
los cuales fueron sometidos a cálculos usando Teoría de Funcionales de la Densidad
35
(DFT) (Perdew, 1986) al nivel B3LYP/6-31G*. Así se obtuvieron 20 confórmeros en un
∆E de 5.0 kcal/mol, de los cuales únicamente 13 contribuyen a la distribución
poblacional (Cuadro 3).
Cuadro 3. Energía relativa (kcal/mol) y porcentaje de población conformacional de 62 al nivel de cálculo MMFF94 y B3LYP/6-31G*
Confórmero ∆E MMFF94a %b ∆E B3LYP/6-31G*
c %b 62ª 0.00 17.6 0.33 17.5 62b 0.11 14.7 d ---- 62c 0.24 11.8 0.45 14.4 62d 0.43 8.5 0.00 30.8 62e 0.51 7.4 1.61 2.0 62f 0.63 6.0 d ---- 62g 0.66 5.8 d ---- 62h 0.79 4.6 0.41 15.4 62i 0.93 3.7 2.16 0.8 62j 0.93 3.6 1.52 2.4 62k 0.99 3.3 d ---- 62l 1.05 3.0 1.85 1.4 62m 1.14 2.6 3.58 0.1 62n 1.24 2.2 d ---- 62ñ 1.32 1.9 1.63 2.0 62o 1.48 1.5 0.57 11.8 62p 1.55 1.3 2.20 0.7 62q 2.04 0.6 4.32 0.0 62r 2.85 0.1 2.16 0.8 62s 5.12 0.0 5.31 0.0 62t 5.55 0.0 d ---- 62u 6.22 0.0 d 0.0 62v 6.26 0.0 6.40 0.0 62w 7.66 0.0 5.70 0.0 62x 8.18 0.0 d ---- 62y 9.79 0.0 4.60 0.0 62z 9.84 0.0 5.73 0.0 a Con respecto a 62a EMMFF94 = 47.19 kcal/mol, calculado con el programa Spartan ´08 b Calculado considerando ∆G = - RTln K
c Con respescto a 62c B3LYP/6-31G* = - 446781.68 kcal/mol, calculado co el programa Spartan ´08
d Después de la optimización de la geometría al nivel B3LYP/6-31G* se observaron confórmeros idénticos que fueron eliminados
36
Los 5 confórmeros de mayor estabilidad 62a, 62c, 62d, 62h y 62o (Figura 28)
contribuyen con el 89.9% a la distribución conformacional, siendo el confórmero 62d el
de mayor estabilidad (EDFT = − 446781.68 kcal/mol, 30.8%). Se pudo observar que el
biciclo de pirrolozidina en los confórmeros 62d y 62h permanece prácticamente
constante, cambiando únicamente la conformación del grupo angeloiloxi. En el
confórmero 62a se observó una modificación en los ángulos diedros del anillo B (Figura
28, Anexo 4), lo mismo se observó para los confórmeros 62a, 62c y 62o. En la Figura 29
se muestra la sobreposición de los estos confórmeros, donde se puede observar que
esencialmente es el grupo angeloiloxi el que sufre modificaciones conformacionales.
Figura 28. Confórmeros de mínima energía DFT/B3LYP/6-31G* de 62.
Figura 29. Confórmero de menor energía 62a y sobreposición de sus análogos 62c y 62o.
Es importante mencionar que para el análisis conformacional del compuesto 62, se siguió
el protocolo Monte Carlo seguido de la optimización con DFT, en forma independiente,
37
para las dos configuraciones del átomo de nitrógeno. Sin embargo, para la segunda
configuración del nitrógeno, se observó que, al confórmero de mayor estabilidad le
corresponde un valor de EDFT = − 44777.37 kcal/mol, lo que muestra un ∆E de 4.3
kcal/mol entre el confórmero más estable de la primera optimización descrita y el
confórmero más estable de esta segunda optimización. En consecuencia, el confórmero
más estable de la segunda optimización no contribuye a la población conformacional de
62. Por lo anterior, se deduce que el nitrógeno del biciclo de 62 no sufre conversión de la
configuración.
Las constantes de acoplamiento de los confórmeros de mayor estabilidad de 62 se
calcularon usando ecuaciones tipo Karplus, y considerando la distribución de población
de Boltzmann. Las constantes de acoplamiento (3JH-H) calculadas desde los confórmeros
62a–62p mostraron una buena correlación con las observadas experimentalmente
(Cuadro 4), validando así el análisis conformacional que se llevó a cabo.
A través de las constantes de acoplamiento de los confórmeros se asignó la orientación
relativa de los protones α y β del biciclo de la pirrolozidina (Cuadro 2), observando una
tendencia de los protones α al par de electrones libres del átomo de nitrógeno por tener
un desplazamiento químico a campo más bajo, lo que concuerda con lo descrito por
Rivera et al. (2000), donde también se observó que los protones cis al par de electrones
del átomo de nitrógeno se desplazan a campos más bajos.
Cuadro 4. Valores de las constantes de acoplamiento (J en Hz) calculadas y experimentales para 62
J cal. J exp.
2α, 3α 7.1 7.0 2α, 3β 6.2 7.4 2β, 3α 5.5 5.8 2β, 3β 7.0 7.4 5α, 6α 7.0 8.0 5α, 6β 0.6 2.5 5β, 6α 11.4 10.3 5β, 6β 6.8 6.7 6α, 7α 4.3 4.6 6β, 7α 2.0 1.5 7α, 8α 4.8 4.6
38
6.6. Elucidación del compuesto mayoritario de la parte aérea de S. polypodiodes
Del extracto hexánico se obtuvo por CC en SiO2 (200-300 mallas, Natland International
Corporation) y utilizando como fase móvil mezclas de Hx:AOcEt con gradiente de
elución las fracciones 14 a 28 de la fase móvil Hx-AcOEt (8:2) para dar 193.1 mg
(5.52%) de muestra, la cual se cromatografió por CCF en una placa de SiO2 de 20 x 20
cm (Silica-gel, 1500 micrones, Analtech), usando como fase móvil una mezcla de Hx-
AcOEt (7:3). Se detectó y se raspó el compuesto y se extrajo con 50 mL de AcOEt. Se
obtuvieron así 67.6 mg (1.93%) del compuesto mayoritario del extracto hexánico de la
parte aérea de S. polypodioides 63.
El espectro de RMN de 1H del compuesto 63 (Figura 30) mostró señales de protones
vinílicos: uno de ellos, el protón H-19, δ 6.13 (1H, cc, J = 7.3, 1.5 Hz) que con dos
grupos metilo CH3-20, δ 2.01 (3H, dc, J = 7.3, 1.5 Hz), y CH3- 21, δ 1.90 (3H, q, J = 1.5
Hz) son señales características del grupo angeloiloxi; el otro protón vinílico H-8 se
observó a δ 5.53 (1H, dddd, J = 6.0, 2.5, 1.0, 1.0 Hz). Se observó un protón base de éster
H-1, δ 5.17 (1H, dd, J = 12.0, 4.2 Hz) así como también un protón base de grupo
hidroxilo H-9 δ 3.41 (1H, d, J = 6.0 Hz). A campos altos se observó el protón H-11 δ
2.24 (1H, hept, J = 6.0), una señal múltiple que integra para dos protones H-6 δ 2.18 a
2.04 (2H, m), H-5 δ 1.80 (1H, dd, J = 11.5, 6.0 Hz), una señal ddd de un protón H-3α δ
1.76 (1H, ddd,15.7, 5.1, 5.1 Hz), así como una señal múltiple que integra para dos
protones alrededor de 1.65 ppm que corresponde a los protones H-2α δ 1.67 (1H, m,) y
H-3β δ 1.64 (1H, m). En la región de los metilos, se observó una señal simple del CH3-15
δ 1.23 (3H, s), una señal triple CH3-12 y CH3-13 δ 1.05 (6H, t, J = 6.0 Hz) y el metilo
CH3-14 δ 0.94 (3H, s).
El espectro de RMN de 13C de 63 mostró la presencia de 20 carbonos (Figura 31) de los
cuales cinco corresponden a carbonos con hibridación sp2 y quince con hibridación sp3,
de éstos, tres están unidos a átomos de oxígeno.
39
El análisis de masas de alta resolución mostró al ión fragmento C20H30O3 (masa
calculada = 318.2195, masa medida = 318.2192) resultado de la pérdida de una molécula
de H2O, lo que permitió la deducción de la fórmula condensada C20H32O4 para el
compuesto 63.
La asignación de la conectividad del compuesto 63 se llevó a cabo con los experimentos
gCOSY, gHSQC, gHMBC y NOESY 2D.
En el experimento gCOSY de 63 (Figura 32), el protón vinílico H-8 en 5.53 ppm mostró
una correlación con el protón base del grupo hidroxilo H-9 (δ 3.41), mientras que el
protón base de éster H-1 (δ 5.17) mostró correlación con los protones H-2β (δ 2.16) y H-
2α (δ 1.67) , por su parte el H-11 (δ 2.24 ) mostró una correlación con los metilos CH3-
12 (δ 1.06) y CH3-13(δ 1.04) y para el protón H-5 (δ 1.80) se observó una correlación
con el metilo CH3-15 (δ 1.23).
40
Fig
ura
30.
Esp
ectr
o de
RM
N 1 H
del
com
pues
to m
ayor
itari
o 63
de
la p
arte
aér
ea d
e S.
po
lypodio
des
en C
DC
l 3 (
500
MH
z).
O
O
HO
H HO
H
7
12 3
45
6
89
10
1 1
1 2
13
14
15
1718
1920
2 1
63
41
F
igur
a 31
. E
spec
tro
de R
MN
13C
del
com
pues
to m
ayor
itari
o 63
de
la p
arte
aér
ea d
e S.
po
lyp
od
iodes
en C
DC
l 3 (
125
MH
z).
O
O
HO
H HO
H
7
12 3
45
6
89
10
1 1
1 2
13
14
15
1718
1920
2 1
63
42
Fig
ura
32.
Secc
ión
del e
xper
imen
to g
CO
SY d
el c
ompu
esto
63,
se
mue
stra
n la
s co
rrel
acio
nes
de H
-8 y
H-9
, H-1
y H
-2.
O
O
HO
H
HH
O
7
12 3
45
6
89
10
11
12
13
14
15
1718
1920
21
63
1
2
43
La asignación de las señales de RMN 13C de los átomos de carbonos protonados se hizo
con base al experimento gHSQC (Figura 33). De las correlaciones observadas en el
experimento gHSQC (C-H) para los protones de los metilos a campos bajos CH3-20 δ
2.01 y CH3-21 δ 1.90 mostraron correlación con las señales de 13C a δ 15.9 y 20.7
respectivamente, estos metilos corresponden al grupo angeloiloxi.
También se observó las correlaciones de los otros cuatro metilos a campos altos, es decir,
CH3-15 δ 1.23, CH3-12 δ 1.06, CH3-13 δ 1.04 y CH3-14 δ 0.94 mostraron correlación con
las señales de 13C a δ 29.7, 21.2, 21.6 y 12.4, asignando así a los carbonos 15, 12, 13 y
14, respectivamente.
Para las señales de los protones de los metilenos se observó que: H-2β δ 2.16 y H-2α
δ 1.67 correlacionaron con la señal de δ 23.5 asignando con ello al C-2, los protones H-
6β δ 2.12 y H-6α δ 2.09 por su parte mostraron correlación con la señal de 13C δ 23.9,
asignándose así al C-6, mientras que los protones H-3β δ 1.64 y H-3α δ 1.76 tuvieron
correlación con la señal de 13C δ 39.0 asignando con ello al C-3 (Figura 34).
Las señales de los metinos vinílicos en δ 6.13 y 5.53 correlacionaron con las señales de 13C δ 139.1 y 117.7, respectivamente, asignándose así a C-19 que corresponde al grupo
algeloiloxi y C-8 correspondiente al otro grupo metino vinílico. Por su parte, los metinos
base de oxígeno H-1 δ 5.17, H-9 δ 3.41 tuvieron correlación con la señal δ 74.8 y 69.7
respectivamente, asignándose los carbonos 1 y 9. La señal del metino H-5 que aparece
en δ 1.80 mostró correlación con la señal de 13C a δ 39.9 asignando así el C-5.
La asignación de los carbonos cuaternarios se realizó con la ayuda del experimento
gHMBC (C-H), a través de correlaciones a dos y tres enlaces (Figura 35). La asignación
del grupo carbonilo del grupo angelato se determinó por la correlación que mostraron los
protones H-1 (δ 5.17) y H-21 (δ 1.90), con la señal δ 169.1 asignado con ello al C-17,
mientras que para el carbono cuaternario de este angelato se observó las correlaciones de
los protones H-20 (δ 2.01) y H-21 (δ 1.90) con la señal de 13C δ 127.6, asignándose así al
C-18. Por su parte, los protones H-9 (δ 3.41), H-11 (δ 2.24), H-6β (δ 2.12), H-6α (δ 2.09)
y H-13 (δ 1.04) correlacionaron con la señal en δ 147.2 asignando con esto al C-7. La
asignación del C-4 se hizo por desplazamiento químico (δ 71.0) y su correlación a dos
enlaces con H-15 (δ 1.23). La señal H-8 (δ 5.53) y H-14 (δ 0.94) correlacionó con la
44
señal de 13C δ 69.7, asignando así al C-9, mientras que los protones H-1 (δ 5.179, H-5
(δ 1.80) y H-14 (δ 0.94) correlacionaron con la señal de 13C δ 41.8, asignado esta señal al
carbono cuaternario C-10 (Figura 36).
La estereoquímica relativa del compuesto 63 se estableció a través de las correlaciones
observadas en el experimento NOESY 2D (Figura 37) y tomando en cuenta
consideraciones biogenéticas para los eudesmanoides. Asumiendo así la orientación
relativa β para el Me-14. La estereoquímica relativa del grupo angeloiloxi se estableció a
través de la correlación mostrada por el protón base de éster a δ 5.17 (H-1) con la señal a
δ 1.80 (H-5). Por otro lado, se observó una correlación entre el Me-14 (δ 0.94) y el protón
base del grupo hidroxilo (H-9) en δ 3.41, asignado de esta manera la configuración
relativa β de H-9. De igual forma, la estereoquímica relativa del C-4 se asignó a través de
la correlación observada entre la señal correspondiente para el Me-15 (δ 1.23) y la señal
de H-5 (δ 1.80).
Una revisión de la literatura mostró que esta es la primera vez que se describe a 63.
45
Cuadro 5. Datos de desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13C del compuesto mayoritario de la parte aérea de S. polypodioides 63 (J en Hz) a.
Átomo 1H 13C HMBC
1α 5.17 dd (12.0, 4.2) 74.8 C-17, C-9, C-10, C-2 2β 2.16 m 23.5 2α 1.67 m 23.5 3β 1.76 ddd (17.6, 3.8, 3.8) 39.0 C-2 3α 1.64 ddd (17.6, 13.8, 3.8) 39.0 C-2 4 71.0
5α 1.80 dd (11.5, 5.8) 39.9 C-10, C-6, C-14 6β 2.12 m 23.9 C-7, C-8, C-10, C-5, C-11 6α 2.09 m 23.9 C-7, C-8, C-10, C-5, C-11 7 147.2 8 5.53 dddd (6.0, 2.0, 1.0, 1.0) 117.7 C-9, C-10, C-11, C-6
9β 3.41 d (6.0) 69.7 C-7, C-8, C-5 10 41.8 11 2.24 hept a (6.0) 34.8 C-13, C-8, C-5 12 1.06 d (6.0) 21.2 C-7, C-11 13 1.04 d (6.0) 21.6 C-7, C-11 14 0.94 s 12.4 C-1, C-9, C-10, C-5 15 1.23 s 29.7 C-4 17
169.1 18 127.6 19 6.13 cc (7.3, 1.5) 139.1 C-21, C-20 20 2.01 dc (7.3, 1.5) 15.9 C-19, C-18 21 1.90 q (1.5) 20.7 C-17, C-19, C-18
a 1H a 500 MHz y 13C a 125 MHz, en CDCl3.
46
F
igur
a 33
. Sec
ción
del
exp
erim
ento
gH
SQC
del
com
pues
to 6
3.
O
O
HO
H
HH
O
7
12 3
45
6
89
10
11
12
13
14
15
1718
1920
21
63
47
Fig
ura
34. S
ecci
ón d
el e
xper
imen
to g
HSQ
C p
ara
la a
sign
ació
n de
los
met
ileno
s de
l com
pues
to 6
3.
O
O
HO
H
HH
O
7
12 3
45
6
89
10
11
12
13
14
15
1718
1920
21
63
48
Fig
ura
35. S
ecci
ón d
el e
xper
imen
to g
HM
BC
del
com
pues
to 6
3.
O
O
HO
H
HH
O
7
12 3
45
6
89
10
11
12
13
14
15
1718
1920
21
63
49
Fig
ura
36. S
ecci
ón d
el e
xper
imen
to g
HM
BC
del
com
pues
to 6
3.
O
O
HO
H
HH
O
7
12 3
45
6
89
10
11
12
13
14
15
1718
1920
21
63
50
Fig
ura
37.
Exp
erim
ento
NO
ESY
2D
del
com
pues
to 6
3.
O
O
HO
H
HH
O
7
12 3
45
6
89
10
11
12
13
14
15
1718
1920
21
63
51
6.7. Análisis conformacional del compuesto mayoritario de la parte aérea de S.
polypodioides
El análisis conformacional del compuesto 63, se llevó a cabo de la misma forma que lo
descrito para 62. Una vez eliminadas aquellas estructuras que se duplicaron, se
obtuvieron 13 confórmeros en un ∆E de 10 kcal/mol, los cuales fueron sometidos a
cálculos de DFT desde donde se observaron 4 confórmeros en un ∆E de 5.0 kcal/mol
(Cuadro 6), que representaron el 100% de población conformacional.
Cuadro 6. Energía relativa (kcal/mol) y porcentaje de población conformacional de 63 al nivel de cálculo MMFF94 y B3LYP/6-31G*
Confórmero ∆E MMFF94a %b ∆E B3LYP/6-31G*
c
%b
63a 0 86.1 0.0 97.8 63b 1.33 9.1 2.5 1.4 63c 2.23 2.0 3.6 0.2 63d 2.39 1.5 D --- 63e 2.52 1.2 3.04 0.6 63f 7.49 0.0 8.38 0.0 63g 7.57 0.0 8.81 0.0 63h 7.97 0.0 8.83 0.0 63i 9.43 0.0 8.45 0.0 63j 9.64 0.0 9.26 0.0 63k 9.98 0.0 6.54 0.0 63l 9.99 0.0 10.29 0.0
63m 9.99 0.0 7.7 0.0 a Con respecto a 63a MMFF94 = 39.52 kcal/mol, calculado por el programa Spartan ´08 b Calculado considerando ∆G = −RTlnK
c Con respecto a 63a B3LYP/6-31G* = − 679145.42 kcal/mol, calculado con el programa Spartan '08 d Después de la optimización de la geometría al nivel B3LYP/6-31G* se observaron confórmeros idénticos que fueron eliminados.
El confórmero 63a corresponde a la conformación de mayor estabilidad (EDFT = –
679145.42 kcal/mol) y contribuye a la población conformacional con un 97.8%, seguido
de 63b (EDFT = – 679142.91 kcal/mol) con 1.4%, 63e (EDFT = – 679142.38 kcal/mol) con
0.6% y 63c (EDFT = – 679141.82 kcal/mol) con 0.2%. Se observó que el anillo de la
decalina es prácticamente rígido (Figura 38), con cambios conformacionales en los
52
sustituyentes. En 63a se observó que el carbonilo del grupo angeloiloxi se orienta de tal
forma con el grupo OH del C-9 que da lugar a una interacción tipo puente de hidrógeno,
lo cual posiblemente sea la razón de su mayor estabilidad relativa.
63a 63a, 63b, 63c y 63e
Figura 38. Confórmero de mínima energía DFT/ B3LYP/6-31G* 63a y sobreposición de 63a-c y 63e
Las constantes de acoplamiento calculadas (3JH-H) de los confórmeros 63a – 62c y 63e
mostraron una excelente correlación con los valores experimentales (Cuadro 7), lo que
confirmó la asignación de los protones α y β del biciclo de decalina asignados con el
experimento NOESY 2D (Cuadro 5). Por lo anterior, se puede decir que la
conformación en solución del compuesto 63 es similar a su comportamiento en estado
gaseoso.
Cuadro 7. Valores de las constantes de acoplamiento (J en Hz) calculadas y experimentales para 63
J calc. J exp.
1α, 2α 4.4 4.2 1α, 2β 11.3 12.0 2α, 3α 3.6 3.8 2α, 3β 3.1 3.8 2β, 3α 13.8 13.8 2β, 3β 3.3 3.8 5α, 6α 4.0 5.8 5α, 6β 12.0 11.5
53
7. CONCLUSIONES
En el estudio químico de los metabolitos secundarios de Senecio polypodioides, se
encontró que en el extracto metanólico de la raíz está presente como componente
mayoritario la sarracina N-óxido.
Se determinó que el compuesto 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina está presente
como componente minoritario en este mismo extracto.
Se hizo la asignación completa de los datos de RMN de 1H y de 13C de los compuestos
aislados.
Se describe al nuevo eudesmanoide 63 de la parte aérea de S. polypodioides.
El análisis conformacional de los compuestos 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolizidina
y el nuevo eudesmanoide se validó a través de la comparación de las constantes de
acoplamiento (3JH-H) teóricas y observadas experimentalmente, las cuales mostraron una
buena correlación.
54
Fig
ura
38.
Exp
erim
ento
gC
OSY
de
la s
arra
cina
N-O
(60
)
ANEXO 1
Espectros en 2D de la sarracina N-O (60) gCOSY
3.8
5 m
3.7
4 m
4.1
6 d
d
3.7
8 m
N
O
O
H 60
3
11
17
141
3
7
12
86
5
1
2
182
1
20
O
O
O
HO
15
19
|
55
Fig
ura
39.
Exp
erim
ento
gH
SQC
de
la s
arra
cina
N-O
(60
)
Experimento gHSQC de la sarracina N-O (60)
3.8
5 m
3.7
4 m
4.1
6 d
d
3.7
8 m
N
O
O
H 60
3
11
17
141
3
7
12
86
5
1
2
182
1
20
O
O
O
HO
15
19
|
56
Fig
ura
40.
Exp
erim
ento
gH
MB
C d
e la
sar
raci
na N
-O (
60)
Experimento gHMBC de la sarracina N-O (60)
3.8
5 m
3.7
4 m
4.1
6 d
d
3.7
8 m
N
O
O
H 60
3
11
17
141
3
7
12
86
5
1
2
182
1
20
O
O
O
HO
15
19
|
57
Fig
ura
41.
Exp
erim
ento
gC
OSY
de
la s
arra
cina
(61
)
ANEXO 2
Experimentos en 2D de sarracina gCOSY
N
O
H 61
3
11
17
141
3
7
12
86
5
1
2
182
1
20
O
O
O
HO
15
19
58
Fig
ura
42.
Exp
erim
ento
gH
SQC
de
la s
arra
cina
(61
)
Experimento gHSQC de la sarracina (61)
N
O
H 61
3
11
17
141
3
7
12
86
5
1
2
182
1
20
O
O
O
HO
15
19
59
Fig
ura
43.
Exp
erim
ento
gH
MB
C d
e la
sar
raci
na (
61)
Experimento gHMBC de la sarracina (61)
N
O
H 61
3
11
17
14
13
7
12
86
5
1
2
182
1
20
O
O
O
HO
15
19
60
Fig
ura
44.
Exp
erim
ento
gC
OSY
de
7β-a
ngel
oilo
xi-1
-met
ilen-
8α-p
irro
lozi
dina
(62
)
ANEXO 3
Experimentos en 2D de7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) gCOSY
N
OH
3
11
78
65
1
2
1215
14
O
13
9
62
61
Fig
ura
45.
Exp
erim
ento
gH
MQ
C d
e 7β
-ang
eloi
loxi
-1-m
etile
n-8α
-pir
rolo
zidi
na (
62)
Experimento gHMQC de 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62)
N
OH
3
11
78
65
1
2
1215
14
O
13
9
62
62
Fig
ura
46.
Exp
erim
ento
gH
MB
C d
e 7β
-ang
eloi
loxi
-1-m
etile
n-8α
-pir
rolo
zidi
na (
62)
Exerimento gHMBC de de7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62)
N
OH
3
11
78
65
1
2
1215
1 4
O
1 3
9
62
63
Fig
ura
47.
Exp
erim
ento
NO
E d
iffe
rence
de 7
β-a
ngel
oilo
xi-1
-met
ilen-
8α-p
irro
lozi
dina
(62
), s
e ob
serv
a la
cor
rela
ción
a
trav
és d
el e
spac
io d
e lo
s pr
oton
es d
el m
etile
no C
H2-
2 (δ
2.7
8) c
on e
l pro
tón
9H
-b (
δ 5.
25)
Experimento NOE difference de 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) para asignar a los protones del doble enlace exocíclico
N
OH
3
11
78
65
1
2
121
5
14
O
13
9
62
Hb
Ha
64
ANEXO 3
Ángulos diedros (φ) y contantes de acoplamiento (J) calculadas del compuesto 62
Continúa
65
Continuación Ángulos diedros (φ) y contantes de acoplamiento (J) calculadas del compuesto 62
66
Ángulos diedros (φ) y contantes de acoplamiento (J) calculadas del compuesto 63
67
LITERATURA CITADA Aniszewski Tadeusz, 2007, Alkaloids-Secrets of life. Alkaloid chemistry, biological
ecological, applications and ecological role. Primera edición, Elservier, Netherlands, páginas 1-2.
Bohlmann F., Knoll KH., Zdero C., Mahanta PK., Grenz M., Suwita A., Ehkers D., Le
Van N., Abraham WR., Natu AA.1997. Phytochemistry, 16, 965-985. Burgueño-Tapia E., Bucio A.M., Rivera A., y Joseph-Nathan P. 2001. Cacalolides from
Senecio madagascariensis. J. Nat. Prod. 64, 518-521. Burgueño-Tapia E., González-Coloma A., Martín-Benito D. y Joseph-Nathan P. 2007.
Antifeedant and phytotoxic activiy of cacalolides and eremophilanolides. Z.Naturforsch 62c, 362-366.
Burgueño-Tapia E., Hernández R.L., Reséndiz-Villalobos Y.A., y Joseph-Nathan P.
2004. Conformational evaluation and detailed 1H and 13C NMR assignments of eremophilanolides. Magn. Reson. Chem. 42, 887-892.
Burgueño-Tapia E., López-Escobedo S., González-Ledesma M. y Joseph-Nathan P.
2007. A new eremophilanolide from Senecio sinuatus Gilib. Magn. Reson.
Chem. 45, 457-462. Burgueño-Tapia E., y Joseph-Nathan P. 2003. Cacalolides from Senecio barba-johannis.
Magn. Reson. Chem. 41, 386-390. Chang G., Guida W.C., Still W.C. 1989. J Am. Chem. Soc. 111, 4379. Christov V., Mikhova B., Alexandra R.,Dimitrova D., Nikolova E. y Evstatieva L. 2002.
Alkaloids from roots of Senecio macedonicus Griseb. Z. Naturforsch, 57c, 780-784.
Culvenor C.C.T y Geissman T.A. 1961. The alkaloids of Senecio mikanioides otto.
Sarracine and sarracine N-oxide. JOC, 26, 9, 3043-3050. Fattorusso E. y Taglialatela-Scafati O., 2008. Moderns Alkaloids. Structure, isolation,
synthesis and biology. Primera edición, Wiley-VCH, Federal Republic of Germany, páginas 74-76.
González-Coloma A., Domínguez D.M., Reina M., Santos-Guerra A., Santana O., Agulló
T. y López-Balboa C.2008. Pyrrolizidine alkaloids from Canarian endemic plants and their biological effects. Biochem. Sys. Ecol. 36, 153-166.
Halgren T. 1996a. J. Comput. Chem. 17, 490.
68
Halgren T. 1996b. J. Comput. Chem. 17, 520. Halgren T. 1996c. J. Comput. Chem. 17, 553. Halgren T. 1996e. J. Comput. Chem. 17, 616. Halgren T. y Nachbar R.B. 1996d. J. Comput. Chem. 17, 587. Hartmann T. Ehmke A., Eilert U., Von Borstel K. y Theuring C. 1989. Sites of synthesis,
translocation and accumulation of pyrrolizidine alkaloid N-oxides in Senecio
vulgaris L. Planta, 177, 98-107.
Hartmann T., 1995. Pyrrolizidine alkaloids between plants and insects: a new chapter of an old story. Chemoecology, 6, 4, 139-146.
Liddell J.R. 2001. Pyrrolizidine alkaloids, Nat. Prod Rep. 18, 441-447. Liddell J.R. y Logie G. C. 1993, 7-angelyl-1-methylenepyrrolizidines from Senecio
chrysocoma. Phytochemistry, 34, 1198-1199. Logie C.G., Grue M.R. y Lidell J.R. 1994. Proton NMR spectroscopy of pyrrolizidine
alkaloids. Review. Phytochemistry, 37, 1, 43-109. Mann J., Dandson R.S., Hobss J.B., Banthorpe D.V. y Harbone V.B. 1994. Natural
Products. Their chemistry and biological significance. Prentice Hall. Pelletier S.W. 1993, Alkaloids: Chemical and biological perspectives, Wiley, New York,
páginas 1-31. Perdew J.P. 1986, Phys. Rev. B. 33, 8822 Pérez-Castorena A.L., Arciniegas A., Pérez R., Gutiérrez H., Toscano R.A., Villaseñor
J.L y De vivar R. A. 1999. Iodanthine, a pyrrolizidine alkaloid from Senecio
iodanthus and Senecio bracteus. J. Nat. Prod, 62. 1039. Qu S.J., Liu Q.W., Tan C.H., Jiang S.H., Zhu D.Y. 2006, Bufotenina is common in
rutaceus plants. Planta Medica, 72, 264-266. Reina M., González-Coloma A., Gutiérrez C., Cabrera R., Rodríguez L.M., Fajardo V. y
Villarroel L. 2001. Defensive Chemistry of Senecio miser. J. Nat. Prod. 64, 6-11.
Reina M., González-Coloma A., Gutiérrez C., Cabrera R., Rodríguez L. M., Fajardo V. y
Villarroel L. 2001. Defensive chemistry of Senecio miser. J. Nat. Prod. 64, 6-11.
69
Rivera A., León F.J., Rivera J., Parra E.C., Purmova J., Burgueño-Tapia E. y Joseph-Nathan P. 2000. Synthesis of 2t-substituted-1r,3c-bis (2´-hydroxy-5´-substituted-benzyl)-imidazolidines by reaction of 1,3- bis (2´-hidroxy-5´-sustituted-benzyl)-imidazolidines with aromatic aldehydes. Synth. commun. 30, 11, 2029-2040.
Rizk A.F.M. 1991. Naturally ocurring pyrrolizidines alkaloids. CRS Press: Boca Raton,
FL. Robins D.J. 1989, Biosynthesis of pyrrolizidine alkaloids. Chem. Soc. Rev. 18, 375-408. Romo de Vivar A., Pérez-Castorena A., Arciniegas A., Villaseñor L.J. 1999. Alkaloids
from three Senecio species. Biochem. Sys. Ecol. 27, 835-837. Romo de Vivar A., Pérez-Castorena A.L. Arciniegas A., Martinez F., Villaseñor J.L.
2000. Pyrrolizidine alkaloids from four Senecio species, Biochem. Sys. Ecol. 28, 279-282.
Romo del Vivar A. Pérez-Castorena A.L. Arciniegas A y Villaseñor J.L. 2007. Secondary
metabolites from Mexican species of the Tribe Senecioneae (Asteraceae), J.
Mex. Chem. Soc. 51, 3, 160-172. Spenser I.D. 1985, Stereochemical aspects of the biosynthetic routes leading to the
pyrrolizidine and quinolizidine alkaloids. Pure and Appl. Chem. 57, 453-470. Trigo J.R., Pavia A.J. y Barata S.E. 2004. Pyrrolizidine alkaloids in three Senecio species
from southern Brazil. Biochem.Sys.Ecol., 32, 1219-1222.
![Metabolitos Prim y Sec[1].](https://static.fdocuments.mx/doc/165x107/55cf8e2c550346703b8f4ff0/metabolitos-prim-y-sec1.jpg)
