CARACTERIZACIÓN DEL ESPECTRO MUTACIONAL DE LOS...

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CARACTERIZACIÓN DEL ESPECTRO MUTACIONAL DE LOS GENES HMLH1 Y HMSH2 POR

MEDIO DE LAS TECNICAS: MLPA, Y SECUENCIACIÓN, EN UN GRUPO DE FAMILIAS

COLOMBIANAS CON SOSPECHA DE CÁNCER COLORECTAL NO POLIPÓSICO

HEREDITARIO (SÍNDROME DE LYNCH)

DAVID SERRANO PÉREZ

Código 05599286

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA

MAESTRIA EN GÉNETICA HUMANA

BOGOTA D.C. 2017

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CARACTERIZACIÓN DEL ESPECTRO MUTACIONAL DE LOS GENES HMLH1 Y HMSH2 POR

MEDIO DE LAS TECNICAS: MLPA, Y SECUENCIACIÓN, EN UN GRUPO DE FAMILIAS

COLOMBIANAS CON SOSPECHA DE CÁNCER COLORECTAL NO POLIPÓSICO

HEREDITARIO (SÍNDROME DE LYNCH)


Código 05599286

Dirigido Por:

DOCTOR CLARA EUGENIA ARTEAGA

MD. MsC en Genética Humana , MsC en Bioética.

DOCTOR EDGAR GERMAN JUNCA BURGOS

MD. Cirujano Gastroenterólogo, Coloproctólogo

Asesor Técnico

DOCTOR JUAN JOSÉ YUNIS LONDOÑO MD. MsC Genética humana

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA

MAESTRIA EN GÉNETICA HUMANA

BOGOTA D.C. 2017

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CHARACTERIZATION OF THE MUTATIONAL SPECTRUM OF THE HMLH1 AND HMSH2

GENES THROUGH THE TECHNIQUES: MLPA, AND SEQUENCING, IN A GROUP OF

COLOMBIAN FAMILIES WITH SUSPECTED HEREDITARY NON-POLYPOSIC CANCER

(LYNCH SYNDROME)


Código 05599286

DIRECT BY:

DOCTOR CLARA EUGENIA ARTEAGA

MD. MsC human genetics , MsC en Bioethics.

DOCTOR EDGAR GERMAN JUNCA BURGOS

MD. Surgeon Gastroenterologist, Coloproctologist

Technical advisor

DOCTOR JUAN JOSÉ YUNIS LONDOÑO MD. MsC human Genetics

NATIONAL UNIVERSITY OF COLOMBIA

SCHOOL OF MEDICINE

DEPARTMENT OF MORPHOLOGY

MASTER IN HUMAN GÉNETICS

BOGOTA D.C. 2017

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AGRADECIMIENTOS

A mi esposa y mi familia por su gran apoyo en el proceso.

A los pacientes y sus familias

Al personal asistencial de las instituciones visitadas para la inclusión de los pacientes y

toma de muestras

A los diferentes especialistas tratantes de los pacientes, que los referenciaron para ser

incluidos en el estudio entre ellos el DR Lombana cirujano coloproctologo, hospital san

Ignacio, Dra Marcela Valencia medico genetista Universidad del Rosario , Dra Johana

Acosta Universidad Nacional de Colombia

Al Dr Juan Jose Yunis director de la maestría en genética, por su orientación en el tema

interpretación de secuencias.

Al laboratorio de la maestria por permitirme realizar la parte experimental

Al profesor Rey y a Diana Mayorga por su asesoramiento y apoyo en el laboratorio.

A mi compañera Johana Galvis, Samantha Martínez y Ángela Alonso, por sus consejos

para mejorar la parte experimental

A Mireya sarmiento, asistente de la Coordinación de Maestría, por su diligencia en materia

de lo administrativo

A mis compañeros de la maestría, Michael, Liliana, Laura, Jorge, Mauricio, Javier y Anyi

por su apoyo moral y técnico. A la Dra. Ángela Martin por su apoyo en la consecución de

una familia

A la directora de esta investigación profesora Clara Arteaga, por sus enseñanzas,

paciencia y compresión a lo largo del desarrollo de nuestro trabajo.

Al director profesor Edgar Junca por el apoyo en la consecución de las familias

A la división de investigación sede Bogotá (dib) por el apoyo en la financiación del trabajo

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TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN .................................................................................................................................. 10

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 13

JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................ 15

OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................... 16

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 16

1. MARCO TEORICO ................................................................................................................. 17

1.1 Reseña Histórica ................................................................................................................ 17

1.2 Definición: ...................................................................................................................... 17

1.3 Epidemiología ..................................................................................................................... 17

1.4 Características Clínicas ..................................................................................................... 18

1.5 Criterios clínicos de Clasificación ............................................................................ 19

1.5.1 Criterios de Ámsterdam I ............................................................................................ 19

1.5.2 Criterios de Ámsterdam II ............................................................................................ 19

1.5.3 Criterios revisados de Bethesda .................................................................................. 20

1.6 Sistema de Reparación en procariotas ...................................................................... 20

1.7 Sistema MMR en humanos........................................................................................... 21

1.8 El Gen MLH1 .................................................................................................................. 22

1.9 El Gen MSH2 .................................................................................................................. 23

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1.10 Inestabilidad Microsatelital (MSI).................................................................................... 23

1.11 Inestabilidad Microsatelital y HPNCC. ........................................................................... 25

1.12 Detección de mutaciones ................................................................................................ 26

2. METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 28

2.1 Tipo de estudio .............................................................................................................. 28

2.2 Pacientes ........................................................................................................................ 28

2.3 Muestra de Sangre ........................................................................................................ 28

2.4 Extracción de ADN ........................................................................................................ 29

2.5 Amplificación por PCR ................................................................................................. 29

2.6 Secuenciación ............................................................................................................... 33

2.8 Detección de grandes rearreglos genómicos .......................................................... 34

2.9 Análisis estadístico ........................................................................................................... 35

3. CONSIDERACIONES ÉTICAS .............................................................................................. 37

3.1 Dilemas Éticos .................................................................................................................... 37

3.2 Consentimiento Informado ................................................................................................ 37

3.3 Consideraciones de bioseguridad y riesgo ambiental .................................................. 37

4.2 Identificación de variantes por secuenciación directa ............................................. 55

Anexo 1. HOJA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO ......................................................... 73

7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 74

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LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Criterios de interpretación de inestabilidad microsatelital. (29). ........................................... 24

Tabla 2 Primers y condiciones de annealing para los exones del gen MLH1. ................................. 30

Tabla 3 Primers y condiciones de annealing para los exones del gen MSH2. ........................... 31

Tabla 4 Resumen condiciones para la PCR ................................................................................. 32

Tabla 5. Distribución de frecuencias de tipos de cáncer en la población analizada. ........................ 39

Tabla 6. Distribución por edad de los 3 tipos de casos de cáncer mas frecuentes en la

población estudiada. ....................................................................................................................... 41

Tabla 7. Distribución por sexo de los casos de cáncer de colon y gástrico en las familias

estudiadas. ....................................................................................................................................... 41

Tabla 8. Distribución de frecuencias de la localización anatómica de cáncer colorectal en los

casos índice de las familias analizadas ......................................................................................... 42

Tabla 9. Cambios de genotipificación detectados en este estudio ............................................ 55

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Condiciones para realizar el programa de PCR en el termociclador. ...................... 33

Figura 2. Flujograma de trabajo. .................................................................................................. 36

Figura 3. Distribución de frecuencias tipos de cáncer en la población analizada ..................... 40

Figura 4 Localización de tumores en los casos índices de cada familia analizada (imagen

tomada de www.A.D.A.M.com) ..................................................................................................... 43

Figura 5. Localización de variantes exonicas en los casos índices de cada familia analizada

(imagen tomada de www.A.D.A.M.com) ...................................................................................... 44

Figura 6. Localización de variantes intrónicas en los casos índices de cada familia

analizada (imagen tomada de www.A.D.A.M.com) ..................................................................... 45

Figura 7.Convenciones para analizar genealogía. Se utilizó el programa GenoPro ................. 46

Figura 8. Genealogía familia L1 ................................................................................................... 47

Figura 9. Genealogía familia L2 ....................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 10 Genealogía familia L3 ...................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 11. Genealogía familia L4 ................................................................................................. 50

Figura 12. Genealogía familia L5 ................................................................................................ 51

Figura 13. Genealogía familia L6. ................................................................................................ 52



Figura 16. Secuencia primer forward exón 16 gen MLH1 familia L1. .................................. 56

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Figura 17. Secuencia primer reverse exón 16 gen MLH1 familia L1 .................................... 57

Figura 18. Secuencia primer forward exón 7 gen MSH12 familia L5 ..................................... 57

Figura 19. Secuencia primer reverse exón 7 gen MSH2 familia L5 ........................................ 58

Figura 20. Secuencia primer forward exón 6 gen MSH2 familia L6 ...................................... 58

Figura 21. Secuencia primer reverse exón 6 gen MSH2 familia L6 ....................................... 59

Figura 22. Secuencia primer forward exón 8 gen MLH1 familia L8 ..................................... 59

Figura 23 Secuencia primer reverse exón 8 gen MLH1 familia L8 ........................................ 60

Figura 24. Secuencia primer forward región intrónica 0 y exón 1 del gen MLH1 familia

L1 ...................................................................................................................................................... 60

Figura 25. Secuencia primer reverse región intrónica 0 y exón 1 del gen MLH1 familia L1

.......................................................................................................................................................... 61

Figura 26. Secuencia primer forward región intron 14 del gen MLH1 familia L5 ............. 61

Figura 27. Secuencia primer reverse región intrón 14 del gen MLH1 familia L5 .................... 62

Figura 28. Secuencia primer forward región intron 10 del gen MSH2 familia L3 ............ 62

Figura 29. Secuencia primer reverse región intrón 10 del gen MSH2 familia L3 .............. 63

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RESUMEN

El cáncer colorectal es una enfermedad que causa gran impacto en términos de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. En Colombia representa el quinto lugar en incidencia y la cuarta causa de mortalidad por cáncer. Entre los diferentes tipos de cáncer de colon, el 5% corresponde a aquellos de carácter hereditario, siendo el cáncer colorectal no polipósico hereditario (HNPCC) o síndrome de Lynch el más frecuente entre los cánceres de colon hereditarios (3)

El síndrome de Lynch o (HNPCC) es una patología autosómica dominante con alta penetrancia, que puede afectar varios miembros de una familia en generaciones sucesivas tanto por cáncer colorrectal, como por otros tipos de tumores extracolónicos con aparición a una edad muy temprana.

El Síndrome de Lynch se encuentra relacionado con mutaciones en genes de reparación de malos apareamientos (MMR), entre ellos los genes hMLH1 y hMSH2, involucrados en la patogénesis de más del 90 % de los casos de la enfermedad.

Este trabajo analizó en un grupo de familias colombianas sugestivas de HNPCC a partir del cumplimiento de los criterios de Amsterdam II, la presencia de mutaciones puntuales y grandes rearreglos genómicos en los genes hMLH1 y hMSH2, mediante el uso de las técnicas MLPA y Secuenciación. Estos resultados nos permitieron establecer la eficiencia de los criterios clínicos para la detección de la mutación, paso previo indispensable para el asesoramiento genético a las familias a partir del caso índice, además de brindar un protocolo de abordaje en los casos con sospecha de síndrome de Lynch.

En este estudio se encontró una eficiencia del 25% para la detección de variantes patogénicas utilizando los criterios clínicos de Amsterdam II. Las variantes encontradas fueron una deleción de tres nucleótidos (C.1852_1854 del AAG) en el exón 16 del gen MLH1, y una deleción de dos nucleótidos (c.1226_1227delAG) en el exón 7 del gen MSH2. Adicionalmente se detectaron dos variantes de carácter benigno a nivel exónico, una sustitución de A>G en el exón 8 del gen MLH1 en el codón 219, y una sustitución de G>A en el exón 6 del gen MSH2 en el codón 322. Se detectaron también 3 variantes de carácter benigno nivel intrónico c.-93G>A, c.1668-19A>G, c.1661 +12 A>G.

En el presente estudio, pese a la utilización de la metodología MLPA, no se encontraron grandes rearreglos genómicos.

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Palabras Claves: Síndrome de Lynch, Cáncer colorectal no polipósico hereditario (HPNCC), mismatch repair genes (MMR), inestabilidad microsatelital, genes MLH1 y MSH2

ABSTRACT Colorectal cancer is a disease that causes great impact in terms of morbidity and mortality worldwide. In Colombia it occupy the fifth place in incidence and is the fourth cause of cancer mortality. Among the different types of colon cancer, 5% correspond to those of a hereditary nature, hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) or Lynch syndrome being the most frequent among hereditary colon cancers (3) Lynch syndrome (HNPCC) is an autosomal dominant condition with high penetrance, which can affect several members of a family in successive generations with colorectal cancer, as well as other types of extracolonic tumors that appear at a very early age.

Lynch Syndrome is related to mutations in mismatch gene repair (MMR) genes, including the hMLH1 and hMSH2 genes, involved in the pathogenesis of more than 90% of the disease cases. This work analyzed the presence of point variants and large genomic rearrangements in the hMLH1 and hMSH2 genes in a group of Colombian families suggestive of HNPCC using the MLPA and Sequencing techniques. These results allowed us to establish the efficiency of the clinical criteria for the detection of the mutation, an indispensable preliminary step for genetic counseling to families from the index case, in addition to providing a protocol for the treatment of cases with suspected Lynch syndrome. In this study we found an efficiency of 25% for the detection of pathogenic variants using the clinical criteria of Amsterdam II. The variants were a deletion of three nucleotides (C.1852_1854 from AAG) in exon 16 of the MLH1 gene, and a deletion of two nucleotides (c.1226_1227delAG) in exon 7 of the MSH2 gene. Two bening variants at the exonic level, a single base substitution A>G at exon 8 of the MLH1 gene at 219 codon, and a substitution of G> A were detected at exon 6 of the MSH2 gene at 322 Codon. Three benign variants were detected at intronic level c.-93G>A, c.1668-19A>G, c.1661 +12 A>G.

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In the present study, despite the use of the MLPA methodology, no large genomic rearrangements were found.

Keywors: Lynch syndrome, hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC), mismatch repair genes (MMR), microsatellite instability, MLH1 and MSH2 genes

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INTRODUCCIÓN

El cáncer colorectal es una neoplasia maligna frecuente, representando la segunda causa de muerte por cáncer en los países desarrollados, mientras que en los países en vía de desarrollo es la sexta causa. En Colombia representa la cuarta causa de mortalidad y se estima que aproximadamente 1500 individuos mueren anualmente por esta causa. Aproximadamente el 80% de los casos son esporádicos, entre el 10-15% presentan antecedentes familiares y el 5-8 % son cánceres de carácter hereditario (1, 2, 3).El síndrome de Lynch o cáncer colorrectal no polipósico hereditario (HNPCC) es el tipo más frecuente entre los cánceres de colon hereditarios, constituyéndose en una enfermedad genética frecuente.

El HNPCC presenta una herencia autosómica dominante con alta penetrancia, por lo que en el análisis del árbol genealógico se pueden encontrar miembros de una familia afectados en varias generaciones, presentándose característicamente a una edad de inicio temprana y con susceptibilidad para desarrollar otros tipos de cánceres extracolónicos (4).

Este síndrome se encuentra asociado con mutaciones en la línea germinal de genes de reparación de malos apareamientos (MMR), que incluyen hMLH1, hMSH2, hMSH6, hPMS2, hPMS1, hMLH3; cerca del 90% de las mutaciones son registradas en hMLH1 y hMSH2, y un 6% en hMSH6. En la actualidad cerca de 400 mutaciones se han identificado en este grupo de genes (5,6).

El gran tamaño de los genes hMLH1 y hMSH2, determina que realizar la secuenciación completa de ambos genes en un grupo de personas en estudio sea una labor intensa y costosa. La mayoría de las mutaciones reportadas en estos genes son del tipo nonsense, missense, frameshift o cambios en el sitio del splicing. Se han utilizado métodos convencionales para la detección de estas mutaciones como el análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple(SSCP), electroforesis en gel de gradiente denaturante (DGGE), conformación sensible en gel de electroforesis(CSGE) y DHPLC: cromatografía liquida denaturalizante de alto rendimiento. Sin embargo, en diferentes poblaciones se observa que una proporción de mutaciones patogénicas es debida a grandes rearreglos genómicos, por lo cual recientemente se ha introducido en varios estudios a nivel mundial el uso de MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification), un método que permite valorar semicuantitativamente el número de cambio de copias en una región específica del gen (7,8,9).

Las pruebas genéticas para el análisis de mutaciones en línea germinal en los genes reparadores de malos apareamientos, pueden permitir la identificación de familias con HNPCC, lo cual es fundamental para realizar un adecuado diagnóstico, asesoría, tratamiento y seguimiento tanto de los casos como de los miembros asintomáticos que portan la mutación en la línea germinal, en quienes se puedan instaurar medidas antes del desarrollo de las características clínicas propias de la enfermedad.

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En el presente trabajo se analizaron 8 familias, que cumplieron estrictamente con los criterios de Amsterdam II, para mutaciones en los genes MLH1 y MSH2 por técnicas de secuenciación y MLPA, con el propósito de establecer la eficiencia de los criterios clínicos y proponer un abordaje para familias sospechosas de síndrome de Lynch.

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JUSTIFICACIÓN

El cáncer colorrectal es una neoplasia frecuente a nivel mundial, con alta mortalidad y morbilidad, con importante disminución de la expectativa de vida con una tasa de sobrevida a los 5 años del 40 a 50%. Además representa una enfermedad de alto costo tanto para el sistema de salud como para el grupo familiar del paciente (5,6).

El HNPCC, es un síndrome con herencia autosómica dominante con alta penetrancia, siendo la causa más frecuente de cáncer colorrectal hereditario, con una edad de inicio temprano (antes de los 50 años) y con susceptibilidad para presentar cánceres extracolónicos como cáncer de endometrio, de estómago, de tracto urinario e intestino delgado, principalmente (4).

En el análisis del árbol genealógico de las familias se pueden encontrar individuos afectados en varias generaciones, pero además, hay otra proporción de individuos que heredan el alelo mutante, que son asintomáticos o no han manifestado el fenotipo de la enfermedad. Por lo tanto se requiere la implementación de métodos de diagnóstico y de detección molecular que permitan la identificación tanto de individuos afectados como de individuos asintomáticos portadores de la mutación, con el propósito de instaurar un adecuado seguimiento clínico, manejo preventivo y asesoramiento genético en las familias con HNPCC.

Este síndrome está relacionado con mutaciones en la línea germinal en genes de reparación de malos apareamientos; dentro de estos los genes hMLH1 y hMSH2 se encuentran involucrados en su patogénesis en más del 90% de los casos. La tasa de detección de mutación en estos genes en individuos con sospecha clínica, varía según la población en estudio entre un 20 a 60%. En un estudio previo realizado en nuestro país para la detección de mutaciones en genes MLH1 y MSH2 en familias colombianas (10), la tasa de detección de mutaciones en estos dos genes fue del 35% de las familias analizadas.

Este trabajo analizó en un grupo de familias colombianas sugestivas de HNPCC que cumplieron los criterios de Amsterdam II, las mutaciones y grandes rearreglos genómicos en los genes hMLH1 y hMSH2, mediante el uso de MLPA y secuenciación que permitieron caracterizar molecularmente a nuevas familias, captando familias analizadas del estudio previo realizado en el instituto de genética en 2003 (10) en quienes no se detectaron mutaciones. En este estudio la eficiencia fue del 25%; a pesar del empleo de la técnica MLPA en este estudio no se identificaron grandes rearreglos, se identificaron variantes patogénicas ya reportadas en la literatura y otras variantes de significado benigno.

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OBJETIVO GENERAL

Analizar el espectro mutacional (mutaciones puntuales y grandes rearreglos) y frecuencias de las mutaciones en línea germinal en los genes MLH1 y MSH2 del sistema de mal apareamiento de bases en un grupo de familias colombianas que cumplieran criterios para HNPCC.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Identificar las familias sugestivas de HNPCC mediante la aplicación de criterios de Amsterdam II.

2. Establecer las frecuencias de las mutaciones de los genes MLH1 y MSH2 encontradas en un grupo de familias colombianas sospechosas de HNPCC.

3. Describir los grandes rearreglos genómicos detectados en los genes MLH1

y MSH2.

4. Determinar la presencia de mutaciones no reportadas previamente en la literatura de los genes MLH1 y MSH2.

5. Analizar la posible concordancia entre la historia natural de la enfermedad

y los hallazgos moleculares

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1. MARCO TEORICO

1.1 Reseña Histórica

La primera familia con el síndrome de Lynch fue descrita por Warthin en 1913. Henry Lynch y Ana Krush retoman la misma familia casi 60 años después. En los siguientes 25 años, Henry Lynch fue casi el único investigador que siguió describiendo el síndrome de Lynch en numerosos informes y siguió pidiendo atención a la importancia de este síndrome. A mitad de los años ochenta, los investigadores finlandeses, holandeses e italianos notificaron la importancia de estos estudios y se inició una búsqueda de las familias con el síndrome en sus respectivos países. En 1990, el Grupo Colaborativo Internacional fue creado para promover la investigación internacional sobre esta enfermedad. Debido a las actividades de este grupo en las grandes redes internacionales de grupos de investigación se establecieron los criterios de Amsterdam para el diagnóstico clínico del Síndrome de Lynch. Esta colaboración en todo el mundo llevó un tiempo relativamente corto para la identificación de los genes responsables del síndrome (4).

1.2 Definición:

El Cáncer colorectal no polipósico hereditario (HNPCC) también conocido como síndrome de Lynch, es un síndrome con herencia autosómica dominante con alta penetrancia (80% -85%) y es la causa más frecuente de cáncer colorectal hereditario. El trastorno se caracteriza por una edad de inicio temprana y una mayor susceptibilidad para presentar otros tipos de cáncer (4,11,12).

1.3 Epidemiología

El Cáncer colorectal (CRC) ocupa la primera o segunda causa de muerte relacionada con cáncer en países desarrollados, mientras que en países subdesarrollados es la sexta causa (1,2). Se estima que HNPCC representa entre el 5-8 % de todos los canceres colorrectales en todo el mundo (14). El cancer de colon es la tercera causa de cáncer en hombres y la segunda en mujeres. En

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Colombia la incidencia era de 10,6 por cada 100.000 habitantes, con una mortalidad de 6 por cada 100.000 habitantes según globocan 2008 y una incidencia de 11 por cada 100.000 habitantes, con una mortalidad de 6.7 por cada 100.000 habitantes según globocan de 2012 (3), con lo cual se observa un aumento en estos indicadores en el trascurso de 4 años. En colombia en 1997 se estimó que el cáncer colorectal ocupaba la cuarta causa de muerte por cáncer (13). Los hombres tienen mayor riesgo para carcinoma colorectal (razón de incidencia estandarizada [SIR] = 83) que las mujeres (SIR = 48) (14).

La localización de los tumores predomina en 2/3 de los casos en la región proximal del colon. El HPNCC está asociado con mutaciones en linea germinal en los genes de reparación de malos apareamientos que incluyen hMLH1y hMSH2, hMSH6, hPMS2, hPMS1, hMLH3. Por lo anterior, se encuentra inestabilidad microsatelital en más del 90% de los casos de HPNCC. Cerca del 90% de las mutaciones identificadas en este grupo de genes se encuentran en hMLH1 y hMSH2 (50% y 40% respectivamente) (12).

1.4 Características Clínicas

El síndrome de Lynch presenta un patrón de herencia autosómico dominante. Entre el 20-60% de las familias que cumplen con los criterios clínicos para HNPCC presentan mutaciones en los genes MMR. El riesgo de desarrollar cáncer entre los portadores de la mutación es del 80% a los 70 años de edad. La edad promedio de aparición de una lesión neoplásica ya sea de colon o extracolónica es a los 45 años, mucho más temprano que en el cáncer esporádico (4).

Desde el punto de vista anatomo-patológico los adenocarcinomas en este síndrome se caracterizan por ser sólidos, pobremente diferenciados, de tipo mucoide, con células en anillo de sello, con infiltrado linfocitario peritumoral (semejante a la infiltración observada en enfermedad de Crohn) el cual es un marcador de pronóstico. La localización más frecuente de las lesiones es a nivel de colon proximal. El número de adenomas varía, pero por lo general la cantidad es pequeña, el incremento de la proporción de adenomas aumenta con el crecimiento velloso (4,) 15). Los canceres extracolónicos que se presentan más frecuentemente en el síndrome HPNCC son: cáncer de estómago, endometrio, ovario, uréter, pelvis renal, cerebro, intestino delgado, vía hepatobiliar y piel (adenoma sebáceo). Este tipo de tumores se pueden presentar de forma sincrónica o metacrónica. En países occidentales predomina el cáncer de endometrio, mientras que en países orientales predomina el cáncer gástrico (8). Además también se han reportado casos de cáncer de mama dentro del fenotipo del síndrome de Lynch (16).

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La identificación de los individuos con predisposición a cáncer colorrectal es importante, ya que estos individuos deben ser el objetivo de medidas eficaces de prevención y seguimiento.

1.5 Criterios clínicos de Clasificación

En la práctica clínica el diagnóstico de síndrome de Lynch está basado principalmente en los criterios de Amsterdam. La selección de las familias usando estos criterios logra una tasa de detección de mutación de aproximadamente el 20-60% de los casos. Estos criterios se utilizan para seleccionar a las familias para la vigilancia intensiva y análisis de la mutación (11).

1.5.1 Criterios de Ámsterdam I

Por lo menos tres miembros de la familia deben estar afectados con cáncer colorectal y deben cumplirse los siguientes criterios:

Existir una relación de primer grado en al menos 2 miembros afectados.

Por lo menos dos generaciones consecutivas deben estar afectadas

Por lo menos un caso de cáncer colorectal debe haberse diagnosticado antes de cumplir los 50 años

La Poliposis Adenomatosa Familiar ha sido excluida.

Los Tumores deben ser verificados por pruebas de patología (17).

1.5.2 Criterios de Ámsterdam II

Por lo menos tres miembros de la familia con un tipo de cáncer asociado con cáncer colorectal no polipósico hereditario (cáncer colorectal, cáncer de endometrio, cáncer de intestino delgado, uréter o pelvis renal).

Existir una relación de primer grado en al menos 2 miembros afectados.

Por lo menos dos generaciones consecutivas deben estar afectadas.

Por lo menos un caso de cáncer colorectal o asociado debe haberse diagnosticado antes de cumplir los 50 años

La Poliposis Adenomatosa Familiar ha sido excluida en el caso de cáncer colorectal

Los tumores deben ser verificados por pruebas de histopatología.

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Los criterios de Ámsterdam II se plantearon en 1999 debido a que en la primera clasificación no se incluían a los tumores extracolónicos, los cuales hacen parte del fenotipo del HNPCC (17).

1.5.3 Criterios revisados de Bethesda

También se tienen en cuenta los criterios revisados de Bethesda (18,54), establecidos por el Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos, que permiten la selección de pacientes mediante la utilización de inestabilidad microsatelital. Estos son: Los tumores de individuos deben ser tamizados para inestabilidad microsatelital en las siguientes situaciones:

Cáncer colorectal diagnosticado en un paciente antes de los 50 años de edad

Presencia de tumor colorectal sincrónico, metacrónico u otros tumores asociados con HNPCC, independiente de la edad del individuo.

Cáncer colorectal con alta inestabilidad microsatelital (MSI-H) diagnosticado en un paciente antes de los 60 años de edad.

Cáncer colorectal en uno o más familiares de primer grado afectados con HNPCC o un tumor relacionado con HNPCC y que fueron diagnosticados antes de los 50 años de edad.

Cáncer colorectal diagnosticado en dos o más familiares de primero o segundo grado con tumor relacionado con HNPCC, independiente de la edad.

1.6 Sistema de Reparación en procariotas

Los Sistemas de reparación son cruciales para mantener la integridad del genoma. El Sistema de reparación de malos apareamientos (MMR) aumenta la fidelidad de la replicación en un factor de 1000 corrigiendo los errores generados durante este proceso. El proceso se caracteriza por el reconocimiento de la alteración del ADN y posteriormente la reparación del defecto. Los malos apareamientos se producen por errores durante replicación y la recombinación, por la generación de pequeñas

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inserciones o deleciones, o por daño físico del ADN ocasionado por desaminación o metilación de citosinas (19,20,21,22). El sistema mejor estudiado es el MutHLS en Escherichia coli. El proceso inicia con el reconocimiento de sitios de metilación transitoria en adenina, este sistema requiere de los genes mutH, mutL, mutS, y uvrD. El gen mutL fue el primero identificado en Salmonella typhimurium LT7 como un gen mutador (19,20,21,22). El proceso en E. coli inicia con el reconocimiento del mal apareamiento realizado por la proteína MutS que posee función ATPasa, que se traslada a lo largo del ADN; cuando MutS identifica la lesión sufre un cambio de conformación en presencia de ATP y luego recluta a MutL, juntas estimulan la actividad endonucleolítica de MutH. El ADN bacteriano se encuentra normalmente metilado, como mecanismo de defensa contra las DNAsas. Las Dam metilasas reconocen una secuencia GATC y metilan en la posición N6 todas las adeninas de esta secuencia. Durante la replicación bacteriana, la hebra naciente no contiene los sitios metilados mencionados y esta hebra es reconocida por MutH la cual inicia la reparación mediante la escisión sobre la cadena no modificada y por medio de exonucleasas como Exo I y Exo X, se remueve el fragmento de ADN que contiene el mal apareamiento, y finalmente es resintetizado por medio de ADN polimerasa III. Posteriormente se realiza la unión de los extremos por ADN ligasas. Este mecanismo de reparación parece ser exclusivo de gramnegativos, pero en eucariotas y grampositivas se encuentran mecanismos homólogos (19,20,21,22).

1.7 Sistema MMR en humanos

El MMR ha evolucionado para corregir los errores de las ADN polimerasas que escapan a su actividad de corrección exonuclesa 3’ → 5’. El proceso de MMR comienza con el reconocimiento del mal apareamiento (mismatch) por la unión del heterodímero hMSH2/hMSH6, también denominado como hMutS, este complejo se somete a un cambio conformacional impulsado por ATP que lo convierte en una pinza que se puede desplazar a través de la cadena de ADN in vitro, posteriormente recluta al heterodímero hMLH1/hPMS2 también conocido como hMuLtα en un segundo paso dependiente de ATP. Este complejo ternario se puede trasladar en cualquier dirección a lo largo del ADN y cuando se encuentra con la cadena discontinua, que está sujeta al PCNA el cual carga una exonucleasa 5’→ 3’ ( EXO1), se inicia la degradación de la hebra hacia el sitio donde se encuentra el mal apareamiento. La cadena que no se degrada, se estabiliza por la proteína de replicación A (RPA) impidiendo la acción de EXO1 sobre ésta. Cuando la lesión es removida, la región degradada es nuevamente sintetizada por la ADN polimerasa δ y luego los extremos son unidos por la acción de ADN ligasa (23,24).

22

Existe otro factor menos abundante, el hMSH2/hMSH3 (hMutSβ), que puede iniciar la reparación de algunos loops extrahélice, pero este complejo tiene menor relevancia en el sistema de reparación (23,24).

1.8 El Gen MLH1

El gen MLH1 se encuentra localizado en la región cromosómica 3p21.3, tiene una longitud de 2752 pb y contiene 19 exones. Este gen codifica una proteína de 756 aminoácidos, contiene una región conservada de 300 aminoácidos en su extremo N-terminal y tiene 27 variantes del splicing. La localización de la proteína es intranuclear (25). El gen de hMLH1 pertenece a la familia MutL. Esta familia está conservada a través de la evolución; en eucariotas se han identificado 4 homólogos: MLH1, MLH2, MLH3, y PMS1. En el humano el homólogo (hMLH1) se encuentra más estrechamente relacionado con MLH1 de levadura, y el homólogo hPMS2 está relacionado con PMS1 de levadura (20). MutL y hMLH1 son miembros de la superfamilia GHKL de ATPasas que incluye girasa, topoisomerasa tipo II, Hsp90, histidina kinasa. Esta proteína tiene 3 dominios de importancia: un dominio ATPasa en la región N- terminal que es altamente conservado (NTD) y es capaz de dimerizarse cuando interactúa con ATP. El segundo dominio de interacción con MutS, presenta otra región de enlace, flexible y pobremente conservada y por último un dominio en la región C- terminal (CTD) que participa en la homo-y heterodimerización (20). La estructura secundaria de la proteína indica que proteínas MutL de las bacterias y los eucariotas tienen una estructura similar para la región carboxiterminal (CTD). La proteína forma heterodímeros con las proteínas hPMS2 formando el complejo MutLα y con hMLH3 formando el complejo MutLβ e interactúa con el PCNA (26). La proteína hMLH1 hace parte del complejo de vigilancia del genoma conocido como BASC el cual incluye a las proteínas BRCA1, BLM, ATM, el complejo RAD50-MRE-NBS1, por ultimo MSH2, MSH6 y MLH1. Todas estas proteínas actúan en metabolismo y reparación del ADN varias de estas intervienen como puntos de control durante el ciclo celular en presencia de daño del ADN (26).

23

1.9 El Gen MSH2

El gen MSH2 se encuentra localizado en la región cromosómica 2p21, tiene una longitud de 3307 pb y contiene 16 exones. Este gen codifica una proteína de 934 aminoácidos y tiene 13 variantes del splicing. La localización de la proteína es intranuclear (27). Esta proteína contiene 5 dominios: el primer dominio de unión al ADN, el dominio II el cual interactúa con el hMSH3 y hMSH6, el dominio III de unión a ATP, el dominio IV de interacción con homólogos MutL y el dominio V de función ATPasa (27). La proteína forma dos heterodímeros, el MutSα conformado por MSH2/MSH6 que está más involucrado en el proceso de reparación y el complejo MutSβ conformado por MSH2/MSH3. Como se mencionó previamente, la proteína MSH2 también hace parte del complejo de vigilancia del genoma. Además el heterodímero MSH2/MSH6 no solo interviene en reparación de malos apareamientos, también tiene afinidad por las uniones holliday, por lo tanto actúa como un potencial sensor de daño en recombinación y replicación (26).

1.10 Inestabilidad Microsatelital (MSI)

Los microsatélites corresponden a secuencias repetitivitas cortas de 2-5 nucleótidos, generalmente adyacentes a regiones codificantes; también son conocidos como repeticiones cortas en tandem (STR). La inestabilidad microsatelital se define como un cambio en la longitud en las unidades de repetición debido a una inserción/deleción de una o más unidades de repetición. Esto puede ocurrir en un microsatélite dentro de un tumor, cuando se compara con el tejido normal del mismo paciente (28). Al presentarse un daño en el sistema de reparación de malos apareamientos, los microsatélites del ADN de un paciente tienden a cambiar el número de repeticiones. Cerca del 70-90% de los casos de HNPCC exhiben inestabilidad microsatelital positiva. La MSI no solo está confinada al colon si no que puede afectar tumores epiteliales de otros órganos como estómago y ovario (29). Un total de 85 a 90% de los pacientes HNPCC muestran MSI y esta proporción es aún mayor en familias positivas para mutación en cualquiera de los genes MMR, mientras que en tumores colorrectales esporádicos sólo se observa en 10-15% de los casos. Por lo tanto la inestabilidad es un marcador relativamente sensible pero no específico para HNPCC (28,54).

24

En 1998 El workshop del Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos de Norteamérica propuso un panel de 5 marcadores de referencia que se utiliza en el análisis de MSI: repeticiones de mononucleótido (BAT25 y BAT26), repeticiones dinucleótido (D2S123, D5S346, y D17S250). Se determina si un tumor presenta alta inestabilidad microsatelital (MSI-H) si dos o más marcadores se encuentran alterados, inestabilidad microsatelital leve o baja (MSI-L) si solo un marcador se encuentra alterado y tumor estable (MSS) si no presenta alterado ninguno de los marcadores, (ver tabla1) (28).

Tabla 1 Criterios de interpretación de inestabilidad microsatelital (28).

Numero de Marcadores Inestables

Porcentaje de marcadores con

inestabilidad Interpretación

2 o mas >40% MSI-H

1 20% MSI-L

0 0% MSS

BAT26 tiene algunas ventajas sobre muchos otros marcadores del análisis del MSI. Es extremadamente sensible en la detección de tumores con inestabilidad y muestra una variación de tamaño insignificante, ya sea entre dos alelos de un individuo o entre individuos (28). Los tumores colorrectales con MSI-H se encuentran predominantemente en el colon proximal, tienen característica histopatológica de aspecto mucinoso y pueden ser resistentes a la citotoxicidad inducida por agentes quimioterapéuticos. La inestabilidad microsatelital varía desde el cambio de adenoma a adenocarcinoma y de este a la presencia de metástasis (29). Las pruebas de MSI presentan una sensibilidad entre 80-91% entre los pacientes que tienen mutaciones en el gen MLH1 o MSH2, mientras que presentan una sensibilidad de 55-77% de entre los pacientes que tienen mutaciones en los genes MSH6 o PMS2. La especificidad que se encuentra en el 90%, es del mismo valor en ambos grupos de genes (30).

25

1.11 Inestabilidad Microsatelital y HPNCC.

Los genes reparadores de malos apareamientos (MMR) tienen su función en el mantenimiento del genoma. Con el establecimiento de una mutación en algunos de estos genes principalmente en MLH1 o en MSH2, se desencadena una cascada de eventos mutacionales que afecta a genes que tiene en su secuencia repeticiones en tándem. Las secuencias repetitivas como microsatélites, son altamente susceptibles a un mal alineamiento durante el proceso de replicación, lo que resulta en un aumento de 100 veces en su tasa de mutación (22). Las secuencias repetitivas se encuentran dispersas a través del genoma, un gran número de genes humanos poseen repeticiones de mononucleótidos, por lo tanto, son posibles blancos para que durante la replicación surjan mutaciones de cambio en el marco de lectura (frameshift), lo que conduce a la generación de proteínas truncadas. Este tipo de genes por lo general están involucrados en señales de transducción (TGFβ-RII, IGFIIR, PTEN), apoptosis e inflamación (BAX, caspasa-5), regulación de transcripción (E2F4, TCF-4) y de reparación incluidos los genes MMR, MED-1 y RAD50 (22). Entre los principales genes susceptibles a mutaciones se encuentra el gen TGFβ-RII (receptor II del factor de crecimiento transformante β), el cual contiene un tracto de repetición de adeninas (A) 10. Las mutaciones en este gen ocurren entre el 75-90% de los pacientes en quienes se evidencia inestabilidad microsatelital tanto para HNPCC como para el cáncer de colon esporádicos, siendo las mutaciones más frecuentes en este gen del tipo frameshift. Si la inactivación de uno de los receptores ocurre, las células pierden su capacidad de respuesta a TGF-β y como consecuencia se presenta pérdida en la inhibición del crecimiento celular, lo que representa un paso importante en la tumorigénesis de varios tipos de cáncer incluyendo estómago, cuello y próstata; en cáncer de colon es un evento que ocurre tempranamente somáticamente durante la transición entre adenoma a carcinoma. La inactivación de TGF β -RII ocurre con frecuencia en los tumores gástricos MSI +, pero es poco frecuente en tumores de endometrio MSI + (22). Las mutaciones de Inserción / deleción en regiones de mononucleótidos repetitivos, se han localizado en genes BAX (G8), TCF-4 (A9), IGFIIR (G8), y hMSH6 (C8). Este tipo de mutaciones también se producen a un ritmo significativo en tumores colorrectales MSI + (22). Otros genes, como la caspasa-5 (A10), hMSH3 (A8), y RAD50 (A9) son inactivados con menor frecuencia en tumores primarios, pero muestran una alta incidencia de mutaciones frameshift en las líneas celulares de CRC (22).

26

En la actualidad se discute si mutaciones en estos genes susceptibles juegan un papel en la iniciación o progresión del tumor, o son solo reflejo de una alta tasa de mutación asociada con defectos en el sistema MMR (22). En un estudio Yamaguchi, et al en 2006, que incluyó 23 pacientes con HNPCC, la frecuencia de mutaciones frameshift en genes de ACVR2 (receptor 2 de activina) y TGFβ-RII se encontró entre el 70-95% de los casos. Se observó en estadíos tempranos de la progresión del tumor y al menos uno de estos dos genes estaba mutado en todos los casos analizados. La vía de señalización del TGF-β corriente abajo incluye a proteínas Smad 2, 3, y 4, con la subsecuente inhibición del crecimiento celular; esta vía de señalización puede ser interrumpida por mutaciones en gen ACVR2. Otra vía afectada es la de Wnt, por disrupción causada por mutaciones en el gen de APC. Otros genes afectados con menor frecuencia son PTHLH, MARCKS, hMSH3, TCF4, CASP5, RIZ y RAD50, pero se observó que también están afectados en estadios tempranos del desarrollo del tumor (31). Otro gen importante que se ha estudiado en la progresión de la tumorigénesis es el gen BAX. El producto de este gen es un factor proapoptótico, que es directamente transactivado por p53. Las mutaciones en el gen p53 contribuyen en la conversión de adenoma en carcinoma y en la progresión del tumor en el cáncer de colon esporádico, puesto que la mutación en este gen es infrecuente en HNPCC, la alteración del gen BAX probablemente tenga un rol más importante en la progresión del cáncer en los casos con HNPCC (31).

1.12 Detección de mutaciones

Se han realizado estudios en todo el mundo para determinar la presencia de mutaciones que predisponen a HNPCC, Hasta la fecha se han identificado cerca de 400 mutaciones en todos los genes MMR, de estas el 90% se encuentran entre los genes MLH1 Y MSH2. La tasa de detección de mutaciones en pacientes utilizando los criterios de Ámsterdam II varía ampliamente entre estudios dependiendo de la población, oscilando entre un 20-60% de los casos analizados (8.33, 34). Las mutaciones más frecuentes en ambos genes son nonsense, missense, frameshift, y cambios en el sitio del splicing. mientras que la proporción de rearreglos genómicos varía en cada población en promedio desde 5-20%, hay poblaciones en que la frecuencia es baja como del 1,5% como en un estudio de población española (33) y en otras la frecuencia es más elevada debido a un efecto fundador (8.33, 34).

27

Se han utilizado métodos convencionales para la detección de estas mutaciones como el análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple(SCPP), electroforesis en gel de gradiente denaturante (DGGE), conformación sensible en gel de electroforesis(CSGE), DHPLC: cromatografía líquida denaturalizante de alto rendimiento, y secuenciación directa del gen . Puesto que los grandes rearreglos genómicos no se detectan por estos métodos, se utiliza el análisis por MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) un método que permite valorar semicuantitativamente el número de cambio de copias en una región especifica del gen. La combinación de técnicas permite una mejor caracterización del espectro mutacional en una población a estudio (7,8,9,35,36,37).

28

2. METODOLOGÍA

2.1 Tipo de estudio

Estudio Descriptivo, transversal

2.2 Pacientes

Se estudiaron alrededor de 20 familias, de las cuales se seleccionaron 8 familias que cumplían estrictamente con los criterios de Amsterdam II, en quienes se estudió el caso índice. Se monitorizaron grandes rearreglos genómicos y mutaciones puntuales en los genes MLH1 y MSH2. Los casos seleccionados eran provenientes de diferentes instituciones de la ciudad de Bogotá como el hospital San Ignacio (3 casos) y referenciados de la consulta instituto genética de la universidad nacional (2 casos), 2 referenciados por casos de genetistas externos y un caso referenciado por Dr Junca médico coloproctólogo director del proyecto quien también realiza el enlace con coloproctólogo de hospital San Ignacio.

Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado antes de ser incluidos dentro del estudio y se diligenció un formulario de recolección de datos con resumen de historia clínica.

2.3 Muestra de Sangre

Posterior a que el paciente aceptara el ingreso al estudio y previa asepsia y antisepsia, se procedió a tomar una única de muestra de sangre periférica de vena braquial, 10 ml en tubo de color lila, con anticoagulante EDTA.

29

2.4 Extracción de ADN

La extracción de ADN genómico se realizó con QIAamp DNA Blood Minikit (QUIAGEN,

Germany) a partir de una muestra de 200 µl de sangre, según las instrucciones del fabricante.

La concentración del ADN obtenido se cuantificó en un espectrofotometro nanovue plus 28924402 de general electric healthcare. Se correlacionó este dato con la visualización del ADN total al realizar electroforesis en geles de agarosa al 1.4 % utilizando una muestra de 2 a 3 microlitros del ADN extraído.

2.5 Amplificación por PCR

Se amplificaron los 19 exones del gen MLH1 y los 16 exones del Gen MSH2 de acuerdo a la secuencia de primers descritos por Beck et al (38) y Grzegorz Kurzawski et al (39) ver tabla 2 y 3. Para los exones 1 y 9 para el gen MLH1 y los exones 2,7,8,14,15 del gen MSH2 se diseñan los oligonucleótidos utilizando el programa primer 3 (40) para garantizar la amplificación de los limites exón -intron de las regiones exónicas. La PCR se llevó a cabo utilizando 4μl de ADN. Las condiciones de estandarización se realizaron de acuerdo a las características de cada primer. El producto de la amplificación se verificó por electroforesis en un gel de agarosa al 1.4 % , se aplicaron las condiciones de 90 voltios durante 30 minutos , se utilizó el marcador de peso molecular mass ruler ®DNA ladder low range , y para visualizar el resultado en el gel se utilizó el agente intercalante SYBR safe®. En este estudio no se evaluaron los segmentos 5 UTR ni 3 UTR, ni alteraciones en la metilación del promotor del gen, debido a limitaciones de presupuesto.

30

Tabla 2 Primers y condiciones de annealing para los exones del gen MLH1.

Exon Primer Secuencia Fuente Tamaño del amplificado

(bp)

Temperatura Annealing ( C)

MgCl2 (mM)

exon 1

F1 CAATAGGAAGAGCGGACAGC

Diseñado en programa primer 3

332 61 1.5

R1 GTTCACCACTGTCTCGTCCA


exon2 F2 TGATTTGCCAGTTTAGATGCA Beck et al 1997

154 58.5

1.5 R2 TGACTCTTCCATGAAGCGC Beck et al 1997

exon 3 F3 GAGATTTGGAAAAATGAGTAACA Beck et al 1997

197 53

1.5 R3 CACAGGAGGATATTTTACACA Beck et al 1997

exon 4 F4 CCCAGCAGTGAGTTTTTCTTT Beck et al 1997

140 55

1.5 R4 AAAAGAAGTCAGCACTATACCT Beck et al 1997

exon 5 F5 TTCTCTTTTCCCCTTGGGAT Beck et al 1997

150 59

1.5 R5 ATTCTTACCGTGATCTGGGTCC Beck et al 1997

exon 6 F6 GACATCTTGGGTTTTATTTTCA Beck et al 1997

197 55

1.5 R6 GACAAATCTCAGAGACCCAC Beck et al 1997

exon 7 F7 TAGTGTGTGTTTTTGGCAACTC Beck et al 1997

120 60

1.5 R7 CATCCCCCATAAACCAAGAAC Beck et al 1997

exon 8

F8 CTCAGCCATGAGACAATAAATCC

Grzegorz Kurzawski et al 2002

217 58

1.5 R8

GGTTCCAAAATAATGTGATGG Grzegorz Kurzawski et al 2002

exon 9

F9 TGGGAAGGAACCTTGTGTTT


237 60.5

1.5 R9

GTGGATTTCCCATGTGGTTC Diseñado en programa primer 3

exon 10

F10 CATGACTTTGTGTGAATGTACACC


239 59

1.5 R10

GAGGAGAGCCTGATAGAACATCTG Grzegorz Kurzawski et al 2002

exon 11 F11 TCTAAGGTAATTGTTCTCTCTTA Beck et al 1997

216 54.5

1.5 R11 AAGTAGCTGGATGAGAAGCG Beck et al 1997

exon 12 F12 TTAATACAGACTTTGCTACCAG Beck et al 1997

423 57

1.5 R12 CAGAATAAAGGAGGTAGGCTGTACTT Beck et al 1997

exon 13 F13 GGTTCATTCACAGCTCTGTAG Beck et al 1997

293 58

1.5 R13 CACAGCGTTTACGTACCCTCA Beck et al 1997

exon 14 F14 AAGTGGGGTTGGTAGGATTCT Beck et al 1997

225 58

1.5 R14 CTCCCTGGACCATTGTTGTAG Beck et al 1997

31

exon15 F15 ATTTTGTCCCAACTGGTTGTATCTC Beck et al 1997

270 59

2 R15 ATCATACAATACAGCAACTATCCT Beck et al 1997

exon 16 F16 GCTTGCTCCTTCATGTTCTTG Beck et al 1997

256 61

2 R16 CACCCGGCTGGAAATTTTAT Beck et al 1997

exon 17 F17 TGTCCTTTTTCCTGCAAGC Beck et al 1997

171 59

2 R17 TTTCCCTCCAGCACACATG Beck et al 1997

exon 18 F18 AGGTATTGAATTTCTTTGGACC Beck et al 1997

157 55

1.5 R18 GTGTGCATCACCACTGTACC Beck et al 1997

exon 19 F19 TGCAAACAGGGAGGCTTATG Beck et al 1997

259 59

1.5 R19 TCGGAATACAGAGAAAGAAGAACA Beck et al 1997

Tabla 3 Primers y condiciones de annealing para los exones del gen MSH2.

Exon Primer Secuencia Fuente Tamaño del amplificado

(bp)

Temperatura Annealing (

C)

MgCl2 (mM)

exon 1 F1 CTTCAACCAGGAGGTGAGGAGGT Beck et al 1997

301 66 1.5

R1 GAAAGGAGCCGCGCCACAAG Beck et al 1997

exon2 F2 TGAACATGTAATATCTCAAATCTG


323 56 1.5

R2 AGTGTCTCAAACCATTCTACTATCA Diseñado en programa primer 3

exon 3 F3 TGTTCAAGAGTTTGTTAAATTTTT Beck et al 1997

359 55 1.5

R3 TGGAATCTCCTCTATCACTAGACT Beck et al 1997

exon 4 F4 TTCCTTTTCTCATAGTAGTTTAAA


217 55 1.5

R4 TTGTAATTCACATTTATAATCCATG Grzegorz Kurzawski et al 2002

exon 5 F5 CCAGTGGTATAGAAATCTTCG


242 54.5 1.5

R5 CCATTCAACATTTTTAACCCTT Grzegorz Kurzawski et al 2002

exon 6 F6 ATGAGCTTGCCATTCTTTCTA Beck et al 1997

219 58.5 1.5

R6 TGCAGGTTACATAAAACTAACGAA Beck et al 1997

exon 7 F7 TGAGACTTACGTGCTTAGTTGA


351 58.5 1.5

R7 TATGAGGACAGCACATTGCC Diseñado en programa primer 3

exon 8 F8 ACTTTGGAGACCTGCTGTACT


360 60 1.5

R8 TCCACTGTCCACAAAGGTGC


exon 9 F9 GGATTTTGTCACTTTGTTCTGTT


178 60 1.5

32

R9 TCCAACCTCCAATGACCCAT Grzegorz Kurzawski et al 2002

exon 10 F10 TGGAATACTTTTTCTTTTCTTCTT


235 57 1.5

R10 GCATTTAGGGAATTAATAAAGGG Grzegorz Kurzawski et al 2002

exon 11 F11 ATAAAACTGTTATTTCGATTTGCA


164 58.5 1.5

R11 CCAGGTGACATTCAGAACATT Grzegorz Kurzawski et al 2002

exon 12 F12 TTATTATTCAGTATTCCTGTGTACA


325 57 1.5

R12 CCCACAAAGCCCAAAAACC Grzegorz Kurzawski et al 2002

exon 13 F13 AATCTTGCTTTCTGATATAATTTGT Beck et al 1997

271 57 1.5

R13 TTTCTATCTTCAAGGGACTAGGAG


exon 14 F14 TGTTTGTGGCATATCCTTCCCA


411 63 1.5

R14 AGGGTAGTAAGTTTCCCATTACCA


exon15 F15

CACGCTTCCCCAAATTTCT Diseñado en programa primer 3

274 58 1.5

R15 TAAACAGGACACTAAGATGAAGGT Diseñado en programa primer 3

exon 16 F16 AATGGGACATTCACATGTGTT


306 60 1.5

R16 CCATGGGCACTGACAGTTAA Grzegorz Kurzawski et al 2002

Tabla 4 Resumen condiciones para la PCR

Ciclo1

(1X) Denaturación inicial 95 0C X 5 min

Ciclo 2

(30X)

Denaturación 95 C X 30 segundos

Annealing Tm de acuerdo a cada par

de primer según exon x

30 segundos

Extensión 72 C X 45 segundos

Ciclo 3

(1X) Extensión final 72 C X 10 minutos

33

Figura 1. Condiciones para realizar el programa de PCR en el termociclador.

2.6 Secuenciación

Los productos de amplificación de PCR fueron enviados a Macrogen para la realización de la secuenciación tipo Sanger. Los productos fueron inicialmente purificados mediante protocolo de purificación XTerminator™ según protocolo del fabricante, posteriormente las muestras fueron resuspendidas en agua destilada y sometidas a electroforesis en un secuenciador ABI 3730xl (Applied Biosystems), utilizando un Kit secuenciación ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kits. Se secuenciaron los productos de los 19 exones para MLH1 y 16 exones para MSH2 en ambas direcciones (forward y reverse). Se utilizó para el análisis de las secuencias el programa Bioedit secuence aligment editor.

34

2.7 Descripción de las variables

Se describieron 8 familias, se analizaron los casos índice que cumplieron con criterios de Amsterdam II y posteriormente se realizó secuenciación tipo Sanger en ambas direcciones (forward y reverse), utilizando un Kit Secuenciación ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kits, el secuenciaciador utilizado es ABI PRISM® 3730XL Analyzer (tipo 96 capillares).

Todas las variantes se confirmaron por duplicado y se secuenció en ambas direcciones. La secuencia obtenida se comparó con bases de datos insight-group.org (5), y MMR Genes Variant Database (6).

2.8 Detección de grandes rearreglos genómicos

Para la detección de grandes rearreglos genómicos(deleciones , duplicaciones) de los genes MLH1 Y MHS2 , se utilizó la técnica Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA), utilizando el kit SALSA MLPA KIT P003-B1 MLH1/MSH2 (MRC-Holland,Netherlands) , el cual contiene sondas para el gen MLH1 y sondas para el MSH2 e incluye sondas para el gen EMPCAM, sondas de referencia y sondas control de calidad. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA), se realizó con kit SALSA MLPA KIT P003-B1 MLH1/MSH2 (MRC-Holland,Netherlands) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El análisis de los fragmentos se realizó utilizando ABI Prism310 Genetic Analyzer, que establece que si se observa una disminución de 35-50% en el pico con respecto a la muestra de control se considera deleción, mientras que un aumento entre el 30-50% se considera una duplicación del exón correspondiente. Los resultados del MLPA fueron confirmados en por lo menos un experimento independiente adicional. Protocolo MLPA Día 1: Fase de denaturación e hibridización

Se adicionaron 5 µl de la muestra de ADN (50-250 ng de ADN) en un tubo de 0.2 ml, este procedimiento se realizó con cada muestra, y a un tubo 5 µl de agua destilada para la muestra de control. Posteriormente se colocaron los tubos en un termociclador y se inició el programa, desnaturalización por 5 minutos a 98 0C y luego se enfrió hasta 25 0C.

Preparación de la master mix, cada reacción contiene 1.5 µl MLPA buffer y 1.5 µl MLPA probe mix (sondas).

35

A la muestra de ADN que se encontraba a 25 0C se adicionaron 3 µl de la master mix (volumen final 8 µl).

Se continuó el proceso en el termociclador incubando durante 1 minuto a 95 0C y luego se continuó el programa a 60 0C durante 18 horas.

Día 2

Reacción de ligamiento

Se preparó el master mix ligasa: cada reacción contenía 3 µl buffer A, 3 µl buffer B, 25 µl de agua destilada, y 1 µl de ligasa-65.

Se continuó el programa en el termociclador, se llevaron las muestras a de 54 0C, cuando la muestra alcanzó esta temperatura se adicionaron 32 µl de la master mix ligasa a cada tubo (volumen final 40 µl).

Se continuó con el programa por 15 minutos a 54 0C, para realizar la reacción de ligamiento, posteriormente a 98 0C por 5 minutos para inactivar la ligasa, luego se llevaron las muestras al termociclador a 20 0C.

Reacción en cadena de la polimerasa

Se preparó el master mix para PCR: 7.5 µl de agua destilada, 2 µl SALSA PCR primer mix (contiene primers marcados con fluorocromo FAM) y 0.5 µl SALSA polimerasa.

A temperatura ambiente se adicionaron 10 µl de la master mix para PCR (volumen final 50 µl).

Se continuó el programa termociclador, el cual consistió de 35 ciclos a 95 0C por 30 segundos, 600C por 30 segundos, 720C por un minuto, extensión final a 72 0C por 10 minutos , y pausa a 15 0C.

Al finalizar la reacción los tubos se retiraron del termociclador , se almacenaron a 40C durante máximo 7 días , protegidos de la luz (fluorescencia en el producto es sensible a la luz) luego se enfrió hasta 25 0C.

2.9 Análisis estadístico

Se realizó análisis con estadística descriptiva: Utilizando porcentajes, distribución de frecuencias. El tipo de mutación es una variable categórica y se definió como (missense, nonsense, frameshift, delecion, duplicación, cambio en el sitio del splicing).

36

El tamaño de muestra de este estudio fue por conveniencia , pues busca conocer mutaciones de los genes MLH1, y MSH2 en un determinado grupo de familias, sin un propósito inferencial a la población.

2.10 Flujograma

Figura 2. Flujograma de trabajo.

Consecución de pacientes

Toma única de muestra de sangre periférica de vena

braquialExtracción de DNA :

MLPA

Confirmación , por segundo análisis de MLPA

ABI Prism 310 GeneticAnalyzer

PCR

Secuenciación:ABI Prism 310 Genetic

Analyzer

Confirmación : reamplificación y resecuenciación

Comparación con base de datos y bioinformatica

37

3. CONSIDERACIONES ÉTICAS

El presente estudio de investigación se consideró como de riesgo mínimo de acuerdo al artículo 11 del capítulo 1 del título II de la resolución número 008430 de 1993 del Ministerio de Salud, puesto que el registro de datos se realizó por medio de un formato de entrevista, el cual incluyó examen físico diagnóstico y a los pacientes contactados se les realizó extracción de sangre por punción venosa con un volumen no mayor de 10 ml para realizar la extracción de ADN, por lo cual se diseñó un formato de consentimiento informado con la respectiva autorización para disposición futura de la muestra.

3.1 Dilemas Éticos

Este proyecto no supone ningún dilema ético por cuanto el respeto de la autonomía del paciente se materializó con la firma del consentimiento informado, por otra parte no se puso en riesgo la vida ni la integridad de los sujetos de investigación, no se generó omisión en el actuar médico por parte de los investigadores y los exámenes médicos, de laboratorio y el manejo de la información se hizo de acuerdo con la relevancia médica en cada caso y en conjunto con los médicos tratantes.

3.2 Consentimiento Informado

El ingreso a este estudio fue totalmente voluntario. Se les explicó verbalmente los objetivos generales y específicos de este protocolo de investigación y se les comentaron las ventajas, riesgos y beneficios de participar en este proyecto. Posteriormente se entregó el consentimiento informado, el cual fue leído por parte del investigador al paciente, se aclararon las dudas y se procedió a la firma del mismo de acuerdo a la voluntad autónoma del paciente.

3.3 Consideraciones de bioseguridad y riesgo ambiental

En el presente estudio se realizó una toma de muestra de sangre periférica a los pacientes. La recolección de la muestra y los productos derivados de la toma, además del procesamiento de la misma se descartaron bajo normas de bioseguridad, la toma de la muestra se realizó bajo condiciones de asepsia y antisepsia, las agujas fueron descartadas en contenedores rígidos de paredes imperforables “guardianes”; guantes ,tubos de vidrio y residuos con material biológico fueron recolectados en bolsas rojas de material biológico, según las indicaciones establecidas por el Ministerio de Salud, para finalmente ser

38

descartados por la empresa contratada por la Universidad o el Hospital para dicha actividad.

Como producto de la genotipificación de los pacientes se generaron puntas y microtubos marcados con SYBR SAFE, que es un revelador de DNA no radioactivo, no mutagénico y no carcinogénico. Estos productos fueron descartados en recipientes de plástico de sellado hermético, para posteriormente ser entregados a la empresa contratada por la universidad para el manejo de residuos contaminados, dando a conocer a la empresa el tipo de residuos que se entrega.

Por lo tanto este proyecto tuvo mínimo impacto ambiental, que se generó de forma indirecta por la realización de actividades que produjeron como cualquier actividad humana, residuos que son desechados de acuerdo a las normas vigentes.

39

4. RESULTADOS

4.1 Características clínicas de los pacientes

Se analizaron 8 familias con diagnóstico clínico de síndrome de Lynch de acuerdo con los criterios clínicos Amsterdam II a las que se les realizó la búsqueda de mutación germinal a un caso índice de cada familia. En toda la muestra se observaron 50 casos de cáncer en diferentes localizaciones anatómicas, su distribución se muestra en la siguiente tabla

Tabla 5. Distribución de frecuencias de tipos de cáncer en la población analizada.

Cáncer

Familia L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 Total

Cáncer de colon 8 1 3 3 2 3 5 5 31

Cáncer de endometrio 1 1 1 3

Cáncer gástrico 3 1 1 2 7

Cáncer de ovario 1 1

Cáncer de pulmón 1 1

Cáncer de tiroides 1 1

Cáncer de cérvix uterino 1 1

Cáncer de piel 1 1

Cáncer a nivel óseo? 1 1

Cáncer sin foco conocido 2 1 3

40

Figura 3. Distribución de frecuencias tipos de cáncer en la población analizada

De acuerdo a esta tabla los tres tipos de cáncer más comunes son el de colon (64% de los casos), gástrico (14%de los casos) y endometrio (6 %de los casos), en 14 casos el diagnóstico de cáncer de colon se realizó antes de los 50 años de edad.

Con respecto a los casos de cáncer de colon el promedio de la edad de inicio fue de 48 años, la distribución se observa en la tabla 6, Con respecto los hallazgos moleculares encontrados en este estudio el promedio de edad de los casos con cáncer colon en las dos familias afectadas que presentaron variantes patogénicas fue de 45 años de edad. La edad media de aparición del cáncer en los pacientes estudiados (8 casos índice) fue 47 años y en los 2 pacientes que presentaron la variante patogénica fue de 39 años. Se detectó un caso de cáncer de endometrio en tres familias, dos de las cuales presentaron variante patogénica.

La proporción por sexo en los casos fue de 14 pacientes de sexo femenino y 17 de sexo masculino lo que corresponde a una relación de F/M 1:1.21, como se observa en la tabla 7.

31

3

7

1 1 1 1 1 13

0

5

10

15

20

25

30

35

41

Tabla 6. Distribución por edad de los 3 tipos de casos de cáncer más frecuentes en la población estudiada.

Cáncer de colon Cáncer gástrico Cáncer

endometrio

Familia <50 años >50 años Sin dato <50 años >50 años Sin dato Sin dato

L1 3 1 5 0 0 0 1

L2 1 0 0 0 0 3 1

L3 2 0 1 0 0 1 0

L4 2 1 0 0 0 0 0

L5 1 1 0 0 0 0 1

L6 1 2 0 0 1 0 0

L7 2 2 1 0 0 0 0

L8 2 1 2 0 2 0 0

Tabla 7. Distribución por sexo de los casos de cáncer de colon y gástrico en las familias estudiadas.

Cáncer de colon Cáncer gástrico

Familia Sexo Masculino Femenino Masculino Femenino

L1 5 4 0 0

L2 1 0 1 2

L3 1 2 1 0

L4 2 1 0 0

L5 1 1 0 0

L6 1 2 1 0

L7 4 1 0 0

L8 2 3 2 0

En el caso de los tumores a nivel colónico, la histología de los casos índice mostraba adenocarcinoma moderadamente diferenciado en 7, en los cuales se realizó hemicolectomía y un caso con adenocarcinoma pobremente diferenciado de alto grado en un paciente a quien se le realizó colectomía total.

42

Solo se identificó en 3 familias más de una patología tumoral, 2 pacientes cursando sincrónico con cáncer de colon y endometrio, y una paciente con cáncer de colon y colangiocarcinoma. En el resto de los casos solo se observó un tumor único primario. No se encontraron tumores metacrónicos.

La localización del tumor predominante en los casos índices de cada familia analizada fue en colon derecho, y en todos los casos índice, la histología del tumor tuvo características de adenocarcinoma moderadamente diferenciado, solo en el caso índice de la familia L2 el tipo de adenocarcinoma fue pobremente diferenciado de alto grado.

A todos los casos índice se les realizó resección del tumor con colectomía y recibieron tratamiento con quimioterapia adyuvante con adecuada respuesta, sin recidiva del cáncer hasta el momento en que ingresaron al estudio.

Tabla 8. Distribución de frecuencias de la localización anatómica de cáncer colo rectal en los casos índice de las familias analizadas

Localizacion del tumor

Angulo hepático 2

Angulo hepático y colón transverso 1

colon transverso 2

Sigmoide 1

Colon ascendente 2

43

Figura 4 Localización de tumores en los casos índices de cada familia analizada (imagen tomada de www.A.D.A.M.com (41) )

http://www.a.d.a.m.com/

44

Con respecto a la localización anatómica y las variantes patogénicas detectadas a nivel exónico, se observó que una variante se relacionaba con un tumor en colon transverso (c.1852_1854 del AAG), y la otra en ángulo hepático (c.1226_1227 delAG). Dos variantes exónicas de carácter no patogénico una se evidenció asociada a cáncer en colon trasverso (c.655 A>G), mientras que la otra (c.965 G>A) se encontró en las dos localizaciones de colon transverso ángulo hepático.

Figura 5. Localización de tumores en relación con variantes exónicas en los casos índices de cada familia analizada (imagen tomada de www.A.D.A.M.com (41))


45

Las variantes intrónicas (c.-93G>A, c.1668-19A>G, c.1661 +12 A>G) detectadas en

el estudio se asociaron con una distribución anatómica de los tumores en los casos índice de las familias observándose en colon derecho, ángulo hepático, colon transverso y colon descendente.

Figura 6. Localización de tumores en relación con variantes intrónicas en los casos índices de cada familia analizada (imagen tomada de www.A.D.A.M.com (41))


46

A continuación se anexan los gráficos de los árboles genealógicos de las familias en estudio

Figura 7.Convenciones para analizar genealogía. Se utilizó el programa GenoPro

47

Figura 8. Genealogía familia L1

48


49

Figura 10 Genealogía familia L3

50


51


52

Figura 13. Genealogía familia L6.

53


54


55

4.2 Identificación de variantes por secuenciación directa

Utilizando los primers descritos en la tabla 1 se realizó la secuenciación de los 19 exones del gen MLH1 y de los 16 del gen MSH2 , en total se identificaron 2 familias con variantes patogénicas , 2 con variantes benignas a nivel exónico y 3 con variantes en regiones intrónicas de significado benigno. Estas fueron verificadas en las bases de datos Insight (5) y MMR human variant, en donde se identificó si correspondían a una variante patogénica o una variante benigna o una variante de significado indeterminado. . Los tumores colorrectales que se diagnosticaron en los pacientes con variante patogénica germinal eran adenocarcinomas sin ningún tipo de diferenciación especial.

En familias L2, L3, L4, L7 no se detectó anormalidad en las pruebas realizadas por MLPA., ni en las secuencias de los exones y regiones flanqueantes.

Tabla 9. Cambios de genotipificación detectados en este estudio

Familia Gen Ubicación (exon -intron)

Region del gen Cambio

nucleotido Cambio en proteina

Consecuencia

L1 MLH1

Exon 16 1852_1854 del AAG p.Lys618del Proteína no

funcional

intron 0 -93 G>A ninguna variante benigna

L2 MLH1 intron 0 -93 G>A ninguna variante benigna


MHS2 intron 11 1661 +12 A>G ninguna variante benigna


MLH1 intron 14 1668-19A A>G ninguna variante benigna

56

MSH2 intron 11 1661 +12 A>G ninguna variante benigna

L5 MSH2 Exon 7 1226_1227 del AG p.Gln409Argfs Proteína truncada

MLH1 intron 0 -93 G>A ninguna variante benigna

L6

MSH2 Exon 6 965 G>A p.Gly322Asp variante benigna


MLH1 intron 14 1668-19A A>G ninguna variante benigna


L7 MLH1 intron 14 1668-19A A>G ninguna variante benigna


L8 MLH1 Exon 8 655 A>G p.Ile219Val variante benigna


4.2. Variantes encontrados en el estudio

4.2.1 Variantes Patogénicas

En la Familia L1 se encontró una deleción de tres nucleótidos en el exón 16 del

gen MLH1, llevando a pérdida del aminoácido lisina en la posición 618 de la

proteína. Variante descrita como patogénica (5,6, 58,59,60,61)

Figura 16. Secuencia primer forward exón 16 gen MLH1 familia L1.

57

Figura 17. Secuencia primer reverse exón 16 gen MLH1 familia L1

En la Familia L5 se encontró una deleción de dos nucleótidos en el exón 7 del

gen MSH2, llevando al corrimiento del marco de lectura desde el aminoácido

glutamina en la posición 409 de la proteína. Variante descrita como patogénica

(5,14,42,62,63,64,65,66).

Figura 18. Secuencia primer forward exón 7 gen MSH12 familia L5

58

Figura 19. Secuencia primer reverse exón 7 gen MSH2 familia L5

En la Familia L6 se encontró una variante que corresponde a un cambio de Guanina por adenina (G>A) en el exón 6 del gen MSH2, llevando al cambio del aminoácido glicina por ácido aspártico en la posición 322 de la proteína. Este cambio ha sido descrito en la literatura como una variante no patogénica. (5, 66, 68, 69).

Figura 20. Secuencia primer forward exón 6 gen MSH2 familia L6

59

Figura 21. Secuencia primer reverse exón 6 gen MSH2 familia L6

En la Familia L8 se encontró el cambio de una Adenina por una Guanina (A>G) en el exón 8 del gen MLH1, llevando al cambio del aminoácido isoleucina por valina en la posición 219 de la proteína. Esta variante ha sido descrita en la literatura como una variante no patogénica (5,67, 69).

Figura 22. Secuencia primer forward exón 8 gen MLH1 familia L8

60

Figura 23 Secuencia primer reverse exón 8 gen MLH1 familia L8

4.2.2 Variantes intrónicas.

En 7 de los 8 individuos se detectó una variante en las familias L1, L2, L3, L4, L5, L6, L8, localizada en la región intrónica 5´ del exón 1 del gen MLH1 , reportada en la literatura como una variante no patogénica (5,71).

Figura 24. Secuencia primer forward región intrónica 0 y exón 1 del gen MLH1 familia L1

61

Figura 25. Secuencia primer reverse región intrónica 0 y exón 1 del gen MLH1 familia L1

Se detectó una variante en los casos L4, L6 y L7 localizada en el intrón 14 del gen MLH1, reportada en la literatura como una variante no patogénica (5,39, 73,74,75,76,77,81)

Figura 26. Secuencia primer forward región intron 14 del gen MLH1 familia L5

62

Figura 27. Secuencia primer reverse región intrón 14 del gen MLH1 familia L5

Se detectó una variante en los casos índice de las familias L3, L4, L6, L7 localizada en el intrón 10 del gen MSH2, reportada en la literatura como una variante no patogénica (5,39,74,75,78,79,80,81)

Figura 28. Secuencia primer forward región intron 11 del gen MSH2 familia L3

63

Figura 29. Secuencia primer reverse región intrón 11 del gen MSH2 familia L3

64

5. DISCUSION

La selección de las familias basada en los criterios de Amsterdam II persiste como el gold standar para la detección de mutaciones con una eficiencia hasta del 60% (42) mientras que con el uso de los criterios de detección de Bethesada la tasa de detección es del 30% ; sin embargo, este porcentaje varía en los estudios realizados en diferentes poblaciones entre 20-92%, como se observó en los estudios mencionados en latinoamérica y como se observa en el estudio de Taiwan (8) en el cual se encontraron variantes patogénicas en 61 de 93 casos que correspondieron a un 66% (18 MSH 2 y 42 en MLH1), otro estudio en USA mostró una tasa de detección del 80% (39 de 49 casos) (43). En un estudio llevado a cabo en España-con población vasca (44) se encontró variantes patogénicas en 5 de 21casos identificados a partir de los criterios de Amsterdam II (8 en MSH2 y 7 en MLH1), en Grecia (7) 70% 12 de 17 casos (7 MSH2 y 5 MLH1).

El cáncer colorectal fue el tipo de neoplasia más frecuente entre las familias analizadas (31 tumores de 50 lo que corresponde a un 62 % de los casos con cáncer) que se correlaciona con lo descrito en la literatura , el segundo y tercer tipo de cáncer en frecuencia corresponde al cáncer gástrico y endometrio con un 14% y 6% de los casos. Este hallazgo es importante puesto que el cáncer gástrico también se describe como el cáncer extracolónico con mayor frecuencia en población asiática con HPNCC (8, 45,46,47,48), mientras que en la población occidental es el cáncer de endometrio. Actualmente no hay estudios suficientes en la población latinoamericana para correlacionar la frecuencia de estos dos tipos de cáncer extracolónicos en pacientes con síndrome de Lynch en esta población.

El cáncer de endometrio relacionado con mutaciones en los genes de reparación mistmatch representa solo 1% del total neoplasia endometriales (49), el gen que se relaciona con mayor frecuencia a este tipo de neoplasia en el síndrome de Lynch es el gen MSH6, según el estudio de Hendriks et al (49); el riesgo es el doble con respecto a mutaciones MLH1 y MSH2 (50 51). En las pacientes que presentan cáncer de endometrio el riesgo de desarrollar un segundo tipo de cáncer en otro tejido relacionado con el síndrome es del 25% a los 10 años y 50% a los 15 años; 50% de los casos de cáncer de endometrio se presentan antes de la aparición de la enfermedad localizada a nivel de colon (50). En el presente estudio en 2 de las 3 familias en las que se presentó cáncer de endometrio se identificó una variante patogénica. En el caso índice de la familia L5 una deleción de dos pares de bases en el exón 7 del gen MSH2 y en la familia L1 una deleción de 3 pares de bases en el exón 16 en el gen MLH1. En la familia L2 se observó un caso de esta neoplasia, pero no se detectó mutación en los 2 genes estudiados por lo cual se puede plantear búsqueda de mutación en otros genes MMR principalmente MSH6 de acuerdo a lo que se describió anteriormente. El tamaño de la muestra de este estudio no permite realizar inferencia con respecto a la población Colombiana.

65

En este estudio se realizó la secuenciación directa de todos los exones de los genes MLH1 y MSH2 de las familias que cumplieron los criterios clinicos de Amsterdam II para ingresar al mismo, se les realizó además la técnica de MLPA a todos los casos. Se incluyeron 8 familias colombianas para el análisis del ADN genómico de los genes hMLH1 y hMSH2. Este estudio mostró una eficiencia para la detección de mutacion de un 25% , en .la literatura la tasa de deteccion en diferentes estudios mostrada es de 20-60%. De las 2 variantes patogénicas halladas, una se encontró en MLH1 y otra en MSH2.

De acuerdo con la base de datos InSIGHT (5) aproximadamente el 50% y 40% de las mutaciones relacionadas con el síndrome de Lynch han sido descritas para los genes MLH1 and MSH2 respectivamente. De acuerdo con los resultados del presente estudio se identificaron 2 variantes patogénicas, 2 variantes a nivel exónico de significado clínico benigno, y 3 variantes a nivel intrónico de significado clínico benigno.

En los estudios realizados en Latinoamérica se incluye un artículo que se realizó en Chile se estudiaron 4 hermanos de una familia con cáncer colorectal en donde el análisis de inestabilidad microsatelital, inmunohistoquimica y la detección mutacional con SSCP encontró una mutación c.1731+3A>T en el intrón 15, que condujo a una alteración en el splicing con la subsecuente pérdida completa del exón 15 del gen MLH1 (53). Un artículo realizado en Porto alegre Brasil con pacientes con una cohorte de 212 casos de cáncer colorectal, se identificaron en el 10% que cumplieron criterios de Amsterdam II, lo cual es mayor con lo descrito en la población de Brasil (1.3% de caso de cáncer colorectal), en esta investigación no se describieron hallazgos moleculares(54). En un estudio en Uruguay con 461 pacientes con cáncer colorectal solo 12 cumplieron criterios de Amsterdam II para HNPCC, y de estos solo detectaron 2 mutaciones en una familia del tipo frameshift en el gen MLH1 , y el otro caso presentaba una mutación nosense en el gen MSH2 y no se encontraron mutaciones por MLPA ni en el gen MSH6 (55). En el estudio previo realizado en el instituto de genética de la universidad Nacional de Colombia (13) en el cual se utilizó la técnica de SSCP y secuenciación del fragmento con patrón de migración alterado , de 17 familias se detectaron seis variantes (5 en gen MLH1 y 1 en MSH2), de estas una causó daño en el splicing, 3 fueron del tipo missense , y una con delecion de 2 nucleótidos , todas excepto una familia cumplían con los criterios Amsterdam II

En otro estudio realizado en Colombia en la universidad de Antioquia (56) se evaluaron 9 pacientes que cumplían los criterios de Ámsterdam y 31 los criterios de Bethesda; se encontraron 10 pacientes con alta inestabilidad microsatelital, pero no se encontró ninguna variante patogénica.

66

Por otra parte un trabajo en donde se estudiaron dos familia procedentes de Antioquia que cumplieron criterios de Amsterdam II con varios miembros afectados , en la cual se aplicó estudio molecular con MLPA y se identificó en el gen MLH1 una duplicación (c.1039–8T_1558 _ 896Tdup) que afecta los exones 12 and 13 (57). Con respecto a las variantes detectadas en el presente estudio la mutación que se observó en la familia L1 corresponde a C.1852_1854 del AAG la cual se encuentra descrita previamente en la literatura como patogénica y reportada en la base de datos InSIGHT (5). y MMR variants (6).Esta variante produce una deleción del aminoácido lisina en la posición 618 de la proteína MLH1, que se caracteriza por presentar 3 aminoácidos de lisina (aminoácidos con carga) entre la posición 616 a 618 , residuos los cuales están bien conservados evolutivamente en los mamíferos. Posiblemente las tres lisinas funcionen como un espaciador estructural, y su deleción puede llevar a consecuencias negativas sobre la estabilidad de la conformación funcional del polipéptido MLH1 o podría alterar la unión entre la proteína MLH1 Y PMS2. (58)

Esta deleción AAG se ha reportado en estudios previos como el de Hamilton et (59) al en una familia con historia familiar de síndrome de Turcot (tumor cerebral primario y múltiples adenomas colorectales). En el estudio de Liu et al (60) en donde también se encontró la variante pero no se presentaban manifestaciones extracolónicas. Se describe la misma deleción en una familia con síndrome de Muir-Torre variante del síndrome de Lynch que incluye predisposición a tumores de piel, tumor a nivel colorectal y adenomas sebáseos (61). En todos los estudios se menciona que esta deleción se asocia con alta inestabilidad microsatelital.

La segunda variante patogénica observada en el presente estudio detectada en la familia L5 corresponde a c.1226_1227delAG, la cual se encuentra descrita previamente en la literatura como patogénica y reportada en la base de datos InSIGHT y MMR variants (5). Esta mutación produce una deleción de dos nucleótidos en el exón 7 del gen MSH2 , la consecuencia es el corrimiento del marco de lectura desde el aminoácido glutamina en la posición número 409 de la proteína con una cambio por arginina y se produce un codón de parada corriente abajo en la posición 415 de la proteína lo que produce una proteína truncada (62). Esta mutación se menciona en varios estudios previos en diferentes ocasiones, en los cuales se observa que se asocia con tumores con alta inestabilidad microsatelital (14,42,63,64,65,66).

En cuanto a las variantes exónicas de características no patogénicas, la variante en G322D en el gen hMSH2 detectada en la familia L6 se identificó entre el 1-6% de casos de cánceres esporádicos y en controles, sugiriendo que esta puede comportarse como una variante que se cosegrega con otra mutación en familias con HPNCC, lo cual sugiere que podría corresponder a una variante de baja penetrancia.(67).

67

En estudio in vivo de la variante Gly322Asp realizado en levadura, en donde se mostraba que el cambio de nucleótido es equivalente a G317D, en este experimento, el alelo fue funcional ya que la frecuencia de mutación se redujo 100 veces cuando la variante se expresó en el mutante msh2 nulo, aunque la variante mostró una eficiencia ligeramente reducida de reparación de mismatch comparada con el wild type. Estos resultados indican que el alelo presenta una leve disminución de la eficiencia in vivo. (67). En el estudio de Ollila et al (68) la variante de proteína G322D, era estable y mostraba sólo una ligera reducción en la liberación del mismatch, se demostró que presentaba proficiencia en ensayo de MMR in vitro. En varios estudios G322D se observa que está presente en individuos sanos y no causa pérdida de expresión de la proteína MSH2. En cuanto a la variante c.655 A>G (p I219V) detectada en la familia L8 se describe como no patogénica. Se observa el cambio de un residuo isoleucina por uno de valina, con una incidencia en la población de 31-83%. La alta incidencia en la población puede indicar que sea una variante benigna (66). En estudios in vivo en las levaduras el gen MLH1 contiene en su forma nativa el aminoácido Valina (V216), al presentar el cambio la proteína retiene la función de reparación de malos apareamientos, a pesar de que es un residuo conservado, el cambio de aminoácido no cambia la polaridad; in vitro se observa actividad de la proteína proficiente lo que confirma que la variante funciona como una variante benigna (67,69).

Al ser analizadas las dos variantes exónicas en sillico en los programas PMUT Neutral, SIFT Tolerated, PolyPhen se encontraron con comportamiento benigno. Más del 30% de las variantes partogénicas en MLH1 asociadas con HNPCC son del tipo missense. En los casos en el que el cambio de un nucleótido con la consecuencia de cambio de un solo aminoácido y se comporte como una variante benigna , se puede explicar porque el cambio puede no dañar la función de la proteína o puede realizar una inactivación parcial o ligera de su función (70).

En este estudio se detectó la variante benigna c.-93G>A (rs1800734) en el gen MLH1en 7 de los 8 casos analizados (L1,L2,L3,L4,L5,L6,L8) que consistió en un cambio de G por A en el primer intrón del gen , esta variante se ha descrito asociada con un incremento en el desarrollo de cáncer colorectal esporádico, en el estudio realizado por Funck, et al (71) se detectó la variante en 49 pacientes utilizando PCR–RFLP, y se investigó la expresión de MLH1 mediante PCR real-time cuantitativa, se observó una disminución de la expresión de MLH1 en las muestras tumorales vs tejido normal, lo que puede indicar que altera la expresión

68

de MLH1 de una forma alelo especifica. También se ha descrito asociada con incremento de cáncer gástrico y tumores con inestabilidad microsatelital (72) sin embargo, esta variante es reportada la base de datos insight (5) en donde se clasifica como una variante clase 1 no patogénica o de bajo significado clínico. Sin embargo, podría ser considerada también como variante de baja penetrancia.

Las otra variante polimórfica intrónica corresponde a c.1668-19 A>G (c.1668 -19 A>G), reportado en la base NCBI con significancia clínica benigna (73). También reportada en base de datos insght ( 5) en donde se clasifica clase 1 no patogénica o de bajo significado clinico. Esta variante se ha encontrado en varios estudios clinicos en donde se ha descrito como un polimorfismo (39,74,75,76,77).

La variante (c.1661 +12 A>G), descrita inicialmente por Wijnen et al en 1994, es reportada en la base NCBI (73) con significancia clínica benigna. También reportada en la base de datos insght ( 5) en donde se clasifica como una variante clase 1 no patogénica o de bajo significado clinico. Esta variante se ha encontrado en otros estudios clínicos en donde se ha descrito como un polimorfismo (39,74,77,79,80).

Estas dos últimas variantes descritas dentro de las más frecuentes en los genes MLH1 y MSH2, se utilizaron en el estudio de Bujalkova,et al (81) como marcadores SNP (single nucleotide polymorphism), para determinar la pérdida de heterocigocidad en tumores de pacientes con sindrome de Lynch con inestabilidad microsatelital y mutacion conocida, utilizando genotipificacion por snapshot multiplex y electroforesis capilar.

Se realizó el estudio de grandes reordenamientos en los genes MLH1, MSH2 por MLPA en las 8 familias. No se detectaron alteraciones en el MLPA. Varios métodos moleculares se han utilizado previamente para la detección de grandes rearreglos genómicos como son la hibridación fluorescente in vitro (FISH), Southern blotting y protocolos de PCR semicuantitativa, los dos primeros métodos requieren mayor tiempo para su ejecución, el Southern blotting requiere grandes cantidades de ADN y puede arrojar resultados falsos negativos. Mientras que el MLPA pertenece al grupo de protocolos de PCR semicuantitativa, tiene actualmente la ventaja de que se encuentran kits para su realización y en el caso del síndrome de Lynch se cuenta con el kit SALSA MLPA kit P003 MSH2/MLH1, su uso es más sencillo y requiere menor concentración de ADN para su empleo, es una técnica robusta para medir la dosificación génica (82). Rearreglos genómicos detectados en MSH2 y MLH1 mediante MLPA se han reportado con diferentes proporciones en estudios en varias poblaciones como en España en donde de se detectan en 9,8% de los casos (82), 14% en estudio realizado en Taiwan (8), 27% en norte américa (43) , 4% estudio realizado en Italia (83) en donde se analizaron pacientes que ya se les había descartado mutación

69

puntual en los genes en estudio . La mayoría de las mutaciones relacionadas con grandes rearreglos se correlacionan con alta inestabilidad microsatelital y con alteración en la expresión en la inmunohistoquimica. Teniendo en cuenta estos datos la proporción de deleciones en otras publicaciones varía entre 10-55% de los casos dependiendo de localización geográfica y presencia de mutación fundadora y de los métodos de detección de las mismas. En el estudio presente no se detectaron alteraciones en los picos de la muestra de los pacientes con respecto a los de los 6 casos de control utilizados. En Colombia no se ha descrito previamente la frecuencia de grandes rearreglos, y es posible que el tamaño de la muestra en el presente estudio no haya permitido encontrarlas.

En los 4 pacientes en los que no se detectaron variantes en los 2 genes analizados, se deben analizar otros genes que también están involucrados en la patogénesis del síndrome pero con menor frecuencia ( el 10% de las causas restante), los genes MMR tal como, HMSH6, HMSH3, hPMS 1, PMS2, GTEP, EXO1 (23,50).

Otras posibilidades para explicar los casos en los que no se pudieron detectar mutaciones germinales en los genes analizados o en los otros genes MMR, aunque son muy poco frecuentes (menos del 1%) podrían ser mecanismos genéticos o epigenéticos y mutaciones en otros genes que están directa o indirectamente involucrados con la función de reparación de mismatch tal como SETD2 cuyo mecanismo epigenético con el marcador de histona es H3K36me3 es requerido en el proceso de reparación de mismatch que está involucrado en el reclutamiento de la proteina hMutSα (hMSH2-hMSH6) y que facilita la localización de esta proteína en la cromatina. Las células con pérdida de proteína H3K36 trimetiltransferase SETD2 muestran inestabilidad microsatelital y se incrementa la frecuencia de mutación (84). También mutaciones en polimerasas como POLE y POLD1 (85).

Debido a la mortalidad y morbilidad que causa el cáncer colorectal tanto en países desarrollados y países en vía de desarrollo, se han realizado esfuerzos para la investigación de las causas moleculares de esta patología; en el caso del HNPCC es importante la búsqueda de la causa molecular en los casos índice y posteriormente en otros miembros de la familia , tanto en familiares con patología neoplásica relacionada con el síndrome como en los familiares sanos, en este último grupo para determinar si son portadores de la mutación y realizar un seguimiento clínico estricto, como lo descrito en estudios en pacientes con HPNCC y portadores sanos en los que se realiza seguimiento colonoscópico y ha demostrado la reducción del riesgo de muerte (54,85). Así mismo, buscar en los pacientes con cánceres extracolónicos en donde se deben realizar estudios como biopsia de endometrio (buscando cáncer de endometrio) , endoscopia de vías digestivas ( buscando cáncer de gástrico) , ecografía abdominal (buscando signos

70

de masas renal, hepática), ecografía pélvica transvaginal ( buscando cáncer de ovario), y a largo plazo significaría disminución de costos en salud.

En nuestro medio no se ha estandarizado un procedimiento para la detección molecular en HPNCC. Con el presente estudio y el realizado en 2003 por Giraldo et al (13) también en el instituto de genética en este último se plasma una aproximación para realizar un procedimiento diagnóstico molecular de la enfermedad, teniendo en cuenta que se obtuvieron en ambos estudios resultados positivos en la detección de mutaciones .

Sin embargo en ambos estudios no se planteó la investigación de genes como MSH6 , MSH3 , PMS 1, PMS2, EPCAM, involucrados aunque con menor frecuencia pueden representar la causa molecular.

71

6. CONCLUSIONES

Se estudiaron 8 familias que cumplieron los criterios de Amsterdam II, el cáncer más frecuente en estas familias fue el cáncer colorrectal, seguido del cáncer de estómago y de endometrio .La localización anatómica más frecuente fue en colon derecho (ángulo hepático, ascendente y transverso) y el reporte anatomopatológico en el grupo analizado fue del tipo adenocarcinoma moderadamente diferenciado.

En este estudio se encontró una eficiencia del 25% para la detección de variantes patogénicas utilizando los criterios clínicos de Amsterdam II, que aunque insuficientes, son la mejor herramienta predictiva y se encuentra dentro del rango mostrado en la literatura. Las variantes encontradas fueron una deleción de tres nucleótidos (C.1852_1854 del AAG) en el exón 16 del gen MLH1, y una deleción de dos nucleótidos (c.1226_1227delAG) en el exón 7 del gen MSH2.

Se detectaron dos variantes de carácter benigno a nivel exónico en el 25% de los casos, una sustitución una sola base A>G en el exón 8 del gen MLH1 en el codón 219, y una sustitución de G>A en el exón 6 del gen MSH2 en el codón 322. Se detectaron 3 variantes de carácter benigno nivel intrónico c.-93G>A, c.1668-19A>G, c.1661 +12 A>G.

Aunque las variantes p.Gly322Asp y p.Ile219Val son consideradas con comportamiento benigno algunos estudios realizados in vivo en levadura muestran disminución leve de la proficiencia de la proteína , por lo cual consideró que no se puedan descartar como alelos de baja penentrancia.

No se evidenciaron resultados con la técnica MLPA, aunque la frecuencia de grandes rearreglos en diferentes poblaciones varia de un 10 hasta un 55%, no se conoce su frecuencia en población colombiana.

Aunque dado el tamaño de la muestra no fue posible demostrar asociación entre características clínicas y la presencia de la variante patogénica, llamó la atención que en ambos casos en donde se encontró, se identificó la presencia de cáncer endometrial y de colón.

72

PERSPECTIVAS

A pesar de haberse realizado Secuenciación y MLPA en búsqueda de variantes en los genes MLH1 y MSH2 no se encontraron variantes patogénicas en algunas familias; por lo que es necesario la secuenciación de la totalidad de las regiones intrónicas y región promotora de los genes estudiados y el estudio en otros genes que están asociados con HNPCC como lo son MLH3, PMS 1, PMS2, MSH6.

Se sugiere realizar inestabilidad microsatelital a los pacientes pertenecientes a familias que cumplan con criterios de Amsterdam II para HPNCC previo al análisis molecular completo de todos los genes MMR, lo cual disminuiría el número de individuos para secuenciación pero aumentaría la profundidad del estudio.

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Anexo 1. HOJA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO

Bogotá D.C. Fecha: _______________

Yo______________________________________________ Identificado(a) con

_______ No ____________________ de ___________________, a nombre propio o

en calidad de representante legal del paciente __________________________________,

autorizo (en cumplimiento de los artículos 11 y 15 de la resolución 008430 de 1993, expedida

por la Dirección de Desarrollo científico y Tecnológico del Ministerio de Salud) participar

en la investigación denominada CARACTERIZACIÓN DEL ESPECTRO

MUTACIONAL DE LOS GENES HMLH1 Y HMSH2 POR MEDIO DE LAS

TECNICAS: SSCP, MLPA, Y SECUENCIACIÓN, EN UN GRUPO DE FAMILIAS

COLOMBIANAS CON SOSPECHA DE CÁNCER COLORECTAL NO

POLIPÓSICO HEREDITARIO (SÍNDROME DE LYNCH), la cual tiene como

propósito estudiar las mutaciones en los genes HMLH1 Y HMSH2 en familias en las cuales

se sospecha el Síndrome de Lynch, como es mi caso. Para este efecto acepto que sea tomada

una muestra de 10 cc de sangre venosa de mi antebrazo por personal calificado en el Instituto

de Genética de la Universidad Nacional de Colombia para posterior análisis de DNA.

Comprendo que mi participación en esta investigación tendrá un interés inmediato, puesto

que el encontrar o no una mutación en alguno de esos genes podrá ser de utilidad para

establecer el riesgo de padecer cáncer de colon en mí o en otros miembros de la familia. Por

esta razón, los resultados de esta investigación me serán entregados personalmente y por su

importancia para el seguimiento, a mi médico tratante. Adicionalmente con los resultados

recibiré asesoramiento con el médico genetista

Igualmente se me ha informado la garantía de confidencialidad y la reserva de mi identidad

y que no recibiré beneficios económicos, ni de otro tipo y que puedo retirarme del estudio

cuando lo desee, sin que esto tenga ninguna consecuencia sobre el manejo para mí.

Nombre Del paciente

___________________________________

_____________________________

Firma Del Paciente o representante Legal. C.C

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