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CARACTERIZACIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Peperomia
subspathulata (PIPERACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD COMO AGENTE
ANTIMICROBIANO
LUZ MERY FAJARDO RAMOS
27.436.162
RUBEN FERNANDO NAVARRO CARRASCAL
1.091.663.248
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES (U.D.C.A)
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
BOGOTÁ D.C.
2017
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CARACTERIZACIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Peperomia
subspathulata (PIPERACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD COMO AGENTE
ANTIMICROBIANO
LUZ MERY FAJARDO RAMOS
27.436.162
RUBEN FERNANDO NAVARRO CARRASCAL
1.091.663.248
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO
Director de tesis
Oca. MSc. DORIS GUTIERREZ HERNANDEZ
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES (U.D.C.A)
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
BOGOTÁ D.C.
2017
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Agradecimientos
Al finalizar un proceso de aprendizaje arduo y lleno de dificultades, como lo es el desarrollo de
la tesis de grado, es un verdadero placer para nosotros reconocer el acompañamiento, aportes y
participaciones de personas que nos facilitaron las cosas para que este trabajo llegue a un feliz
término.
Queremos agradecer a Dios, por guiarnos, fortalecernos espiritualmente y por poner a todas las
personas e instituciones como apoyo en nuestra formación. Debemos agradecer de manera
especial y sincera el apoyo, aporte y acompañamiento a nuestro tutor de proyecto Doris
Gutiérrez, quien con su conocimiento y su guía fue una pieza clave para que pudiéramos gestar
cada etapa de este trabajo, Pero también en nuestra formación como investigadores, con las ideas
propias, siempre enmarcadas en su orientación y rigurosidad.
Muchas gracias a los profesores Wilman Delgado por su colaboración en la parte práctica de la
extracción y caracterización del AE, Andrea Naranjo en la actividad antimicrobiana y Rubén
Torrenegra por apoyarnos con su aporte para la realización del proyecto.
Un agradecimiento, sincero, especial y afectuoso a nuestra familia por sus consejos y apoyo
incondicional y permanente, convirtiéndose en el motor de arranque y nuestra constante
motivación, muchas gracias por su paciencia y comprensión, y sobre todo por su amor.
No cabe duda de que su participación ha enriquecido el trabajo realizado y además ha significado
el surgimiento de un sólido compañerismo. A todos les agradecemos y les dedicamos nuestra
tesis.
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TABLA DE CONTENIDO
Contenido
Listado de tablas ..................................................................................................................................... 6
Listado de Graficas ................................................................................................................................. 7
Lista De Abreviaturas ............................................................................................................................. 8
Resumen ................................................................................................................................................. 10
1. Introducción .................................................................................................................................. 11
2. Objetivos ........................................................................................................................................ 13
2.1. Objetivo general ........................................................................................................................ 13
2.2. Objetivos específicos ................................................................................................................. 13
3. Estado del arte .................................................................................................................................... 14
3.1. Generalidades de la familia Piperaceae .......................................................................................... 14
3.2. Generalidades del género Peperomia ....................................................................................... 14
3.3. Estudios fitoquímicos de especies del género Peperomia .............................................................. 17
3.4. Estudios de actividad biológica de especies del género Peperomia ....................................... 18
3.5. Peperomia subspathulata Yunck..................................................................................................... 20
3.6. Métodos de obtención y análisis de los compuestos aislados en aceites esenciales .............. 22
3.5.1. Obtención de AEs por destilación de arrastre con vapor ................................................................. 23
3.5.2. Método de análisis e identificación de los componentes de los AEs ............................................... 24
3.5.2.1. Cromatografía de gases de alta resolución (GC) ............................................................................ 24
3.5.2.2. Cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas (GC-MS) ...................................... 25
3.5.2.3 Identificación de los componentes presentes en un aceite esencial ......................................... 26
3.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales ............................................... 27
3.6.1. Difusión en agar ................................................................................................................................ 27
3.6.2 Dilución en caldo ................................................................................................................................ 28
3.7. Escherichia coli E .......................................................................................................................... 28
4. Metodología ................................................................................................................................... 30
4.1. Material vegetal .............................................................................................................................. 31
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4.2. Obtención del aceite esencial de Peperomia subsphatulata por destilación de arrastre con
vapor ...................................................................................................................................................... 31
4.3. Análisis de la composición del AE por cromatografía de gases de alta resolución acoplada a
espectrometría de masas (GC- MS) ..................................................................................................... 33
4.4. Evaluación de la actividad biológica del aceite esencial ............................................................. 34
4.4.1. Determinación de la sensibilidad del AE frente a Escherichia Coli ........................................ 34
4.4.2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria de aceite esencial (CMI) en dilución
en caldo .................................................................................................................................................. 36
5. Resultados y análisis de resultados. ............................................................................................. 37
5.1. Determinación taxonómica del material vegetal............................................................................ 37
5.2 Extracción y caracterización química del aceite esencial. ........................................................... 37
5.2. Actividad antimicrobiana del aceite esencial....................................................................................... 43
6. Conclusiones ....................................................................................................................................... 51
7. Recomendaciones ............................................................................................................................. 52
8. Bibliografía ........................................................................................................................................ 53
9. Anexos. .................................................................................................................................................... 60
9.1. Anexo 1. Espectros de masas de la identificación tentativa de la especie Peperomia Subsphatulata 60
9.2. Anexo 2. Actividad antimicrobiana con las diferentes concentraciones del AE frente a E. coli .......... 76
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Listado de tablas
Tabla 1. Usos tradicionales de Peperomias .................................................................................. 16
Tabla 2. Estudios de actividad biológica de especies de género Peperomia. ............................... 19
Tabla 3. Volumen aplicado del stock de AE e Hidrolato en sus respectivos pozos. .................... 35
Tabla 4. Determinación taxonómica de la especie Peperomia subspathulata. ............................ 37
Tabla 5. Masa, densidad y rendimiento del AE e hidrolato obtenidas por destilación de arrastre
con vapor. ...................................................................................................................................... 38
Tabla 6. Identificación tentativa de los compuestos presentes en el AE e hidrolato de Peperomia
subsphatulata. ............................................................................................................................... 39
Tabla 7. Porcentaje de inhibición del AE de la especie Peperomia subsphatulata frente
Escherichia coli mediante método de difusión en agar a 35 °C 24 horas. ................................... 44
Tabla 8. Porcentaje de inhibición del hidrolato de la especie Peperomia subsphatulata frente
Escherichia coli mediante método de difusión en agar a 35 °C 24 horas. ................................... 44
Tabla 9. Resultados prueba t comparación efecto inhibitorio del aceite e hidrolato .................... 46
Tabla 10. Evaluación de la CMI del AE de la Peperomia subsphatulata frente a Escherichia coli
a 35 °C 24 horas. ........................................................................................................................... 47
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Listado de Figuras
Figura 1. Distribución geográfica del género Peperomia a nivel mundial. ................................................ 16
Figura 2. Estructuras de compuestos químicos presentes en los aceites esenciales de peperomias. .......... 18
Figura 3. Características morfológicas de la especie Peperomia subspathulata. .................................. 22
Figura 4. Diagrama de un sistema convencional de CG-MS (Grob, & Barry, 2004). ........................ 26
Figura 5. Diagrama de la metodología. ...................................................................................................... 30
Figura 6. Destilador de arrastre con vapor empleado para la obtención del aceite esencial de Peperomia
subsphatulata .............................................................................................................................................. 32
Figura 7. Perfiles cromatográficos del aceite esencial (a) e hidrolato (b) de la Peperomia subsphatulata
utilizando una columna DB-FFAP de 25 m de largo. ................................................................................. 41
Figura 8. Perfiles cromatográficos del aceite esencial (a) e hidrolato (b) de Peperomia subsphatulata
utilizando una columna DB- FFAP de 25 m de largo. ........................................................................... 41
Listado de Graficas
Grafica 1. Comparación de % inhibición bacteriana del AE e Hidrolato de la especie Peperomia
subsphatulata frente a Escherichia coli a 35 °C 24 horas……………………………………...46
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Lista De Abreviaturas
Abreviatura Término
µm micrómetros
AE Aceite esencial
CMI Concentración mínima inhibitoria
CV Coeficiente de varianza
DMSO Dimetilsulfóxido
GC-MS Cromatografía de gases de alta resolución acoplada a
espectrometría de masas
Ik Índices de Retención de Kovats
mL mililitros
mm milímetro
MS Espectros de Masas
nm nanómetros
ºC Grados centígrados
S Desviación estándar
ufc Unidades formadoras de colonias
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μg microgramo
μL Microlitro
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Resumen
El género Peperomia perteneciente a la familia Piperácea se caracteriza por presentar un amplio
espectro de actividades biológicas, en Colombia existen muchas especies de este género a las
cuales no se le han realizado estudios investigativos, tal es el caso de la Peperomia subspathulata
la cual es utilizada por la población para el tratamiento de enfermedades como dolor de cabeza
estómago, ansiedad entre otras. Además, posee un agradable aroma es por ello que se obtuvo su
aceite esencial el cual se caracterizó mediante CG-MS y se evaluó frente a la bacteria
Escherichia coli con el propósito de establecer su potencial como agente antimicrobiano. Los
compuestos mayoritarios identificados fueron safrol (69,48%), α-bisabolol (16,13%), miristicina
(3,65%) y xantoxilina (1,01%) en el aceite esencial y safrol (37,95%), α-bisabolol (34,56%),
miristicina (5,77%) y xantoxilina (7,45%) en el hidrolato. El aceite esencial mostró que no tiene
un efecto inhibitorio frente a Escherichia coli y según la CMI la bacteria presenta resistencia al
efecto antimicrobiano del aceite esencial.
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1. Introducción
Colombia es uno de los países más biodiversos del mundo, cuenta con 27.887 especies vegetales
de las cuales 2.404 son de uso medicinal y cerca de 1.656 son especies nativas (Bernal, García,
Quevedo, 2001; Moncada, Tamayo, Cardona, 2016). Este recurso natural ha sido utilizado con
diversos fines por la población como fuente de alimento, para la construcción de vivienda y
algunas son usadas tradicionalmente para el tratamiento de dolencias o enfermedades (Tofiño, et
al., 2016). De estas 1.656 especies, solo el 12,5% tienen estudios químicos y/o biológicos que
permitan conocer sus componentes químicos y/o sus efectos farmacológicos que validen sus usos
medicinales (Bernal, et al., 2001).
La familia Piperaceae la conforman 5 géneros de los cuales Piper, Peperomia son los más
representativos (Wanke, et al., 2006) por poseer mayor cantidad de especies. Las especies
Peperomias se caracterizan por sus aceites esenciales de naturaleza terpénica y presencia de
fenilpropanoides los cuales han mostrado propiedades antimicrobianas, antioxidantes,
antinflamatorias (Mora, et al., 2011; Pinheiro, et al., 2011).
Por lo tanto, los aceites esenciales producidos por estas especies son utilizados como materias
primas en la industria de alimentos, cosméticos e inclusive en la industria farmacéutica
(Delgado, Kato, Vásquez, Minchala & Rojas, 2012).
De acuerdo con lo anterior, este proyecto pretende contribuir con el conocimiento químico de la
especie Peperomia subsphatulata con el análisis de la composición química del aceite esencial y
evaluar el potencial antimicrobiano frente a la bacteria Escherichia coli ya que este
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microorganismo es responsable de infecciones en el ser humano y ha mostrado resistencia a los
medicamentos usados para su control.
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2. Objetivos
2.1. Objetivo general
Caracterizar el aceite esencial de la especie Peperomia sp (Piperaceae) y evaluar su actividad
antimicrobiana.
2.2.Objetivos específicos
Aislar el aceite esencial de la especie Peperomia sp por destilación de arrastre con vapor.
Identificar y cuantificar los componentes presentes en el aceite esencial con base en el
índice de retención y los espectros de masas de los compuestos individuales obtenidos
por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.
Evaluar la capacidad del aceite esencial de la especie Peperomia sp como agente
antimicrobiano mediante bioensayos con la bacteria Escherichia coli ATCC® 8739.
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3. Estado del arte
3.1.Generalidades de la familia Piperaceae
La familia Piperaceae se distribuye en la región pantropical (Trujillo, & Posada, 2015) y en
Latinoamérica es abundante en los bosques andinos de mediana a baja elevación y en menor
proporción se encuentran especies en la selva tropical de la Amazonía. Comprende plantas
herbáceas arbustivas, algunas veces trepadoras y árboles. Piper nigrum o ¨pimienta negra¨ es la
especie más representativa de la familia cuyas semillas son utilizadas como condimento en la
preparación de alimentos y por esto actualmente es la de mayor importancia económica
(Delgado, et al., 2012).
La familia Piperaceae está constituida por cinco géneros, a saber, Piper, Peperomia, Verhuellia,
Zeppelia y Manekia (Wanke, et al., 2006) y cuenta con 3500 especies. Esta se divide en dos
subfamilias Piperae (especies cuyos pistilos poseen tres estigmas) y Peperomiae (especies cuyos
pistilos poseen un solo estigma). A éstas subfamilia pertenecen las especies de Piper y
Peperomia, respectivamente. En Colombia encontramos los géneros Piper, Peperomia y
Manekia (Trujillo, & Posada, 2015) y algunas de ellas son usadas tradicionalmente para el
tratamiento del dolor de estómago, cabeza, vaginitis, trastornos intestinales, la ansiedad y como
repelente de insectos (Scott, Jensen, philogene, &arnason,2008).
3.2. Generalidades del género Peperomia
El género Peperomia es el segundo más biodiverso en la familia Piperaceae con 1600 especies
(Melo, Guimarães, & Alves, 2016) que se caracterizan por ser suculentas, epífitas y geófitos
(Gutierrez, et al., 2016). Los rasgos morfológicos de las Peperomias son bastante variables y
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hacen que la identificación taxonómica sea compleja; las plantas se caracterizan por poseer flores
pequeñas, apétaladas, pediceladas, con los pistilos parcialmente inmersos en el raquis, el estigma
fimbriado, solitario, lateral o terminal. Sus frutos son ovoides o cilíndricos con un pericarpio
víscido y a menudo verrugoso. Sus hojas son alternas, opuestas o verticiladas con puntos
glandulares rojos, amarillos o marrón (Martínez, Engleman, & Koch, 2006; Melo, et al., 2016;
Guillermo, 2002; Carvajal & Quintero, 2012).
El género Peperomia tiene distribución pantropical; su mayor diversidad en el neotropico (1420
especies) (Guillermo,2002), seguido por Asia (alrededor de 100 especies), África (alrededor de
20 especies), Madagascar (Alrededor de 40 especies), y Australia y Nueva Zelanda (menos De
20 especies) (Wanke, et al., 2006).
En Colombia según datos del sistema de información sobre biodiversidad de Colombia SIB, el
género Peperomia se distribuye en los departamentos de Cundinamarca, Nariño, Putumayo,
Tolima, Choco, Valle del Cauca, Huila, Meta, Caldas, Risaralda, Quindío, Antioquia, Boyacá,
Santander, Magdalena, Caquetá, Guaviare en mayor proporción y en la zona Córdoba, Sucre,
Atlántica, Casanare y Vaupés se han reportado algunas especies. Son comunes en altitudes
desde los 2600 m.s.n.m.
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Figura 1. Distribución geográfica del género Peperomia a nivel mundial.
Fuente. (Judd, et al.,2007).
Las especies del género Peperomia se han caracterizado por sus aplicaciones en la medicina
tradicional para calmar el dolor de cabeza, estómago, otitis, asma y convulsiones. En la Tabla 1
se mencionan algunos de los usos etnobotánicos de las especies de este género:
Tabla 1.
Usos tradicionales de Peperomias.
ESPECIES
PARTE QUE
SE UTILIZA
DE LA
PLANTA
FORMA
DE USO
USO TRADICONAL
Peperomia pellucida.
(Hartati, Angelina,
Dewiyanti &
Meilawati, 2015)
Planta entera o
partes de la
planta
Decocción
para la
aplicación
tópica
Tratar dolores artríticos, úlceras
gástricas y arritmia cardiaca, asma,
tos, inflamación, infecciones
urinarias.
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Peperomia
subsphatulata
(Lagos, 2007)
Planta entera Infusión Tratar dolor de estómago, cabeza,
muela, nervios, golpes, y
quemaduras.
Peperomia
subsphatulata
(Angulo, Rosero &
Gonzales, 2012
Planta entera
Emplastos e
Infusión
Aliviar golpes y heridas.
Purga para las mujeres para
postparto.
Peperomia
ineaqualifolia Ruiz &
Pav.
(Carvajal &
Quintero, 2012)
Hojas y tallo
Zumo de
las hojas y
tallos
Infusión de
las hojas
Tratar dolor de oído y la sordera.
Afecciones del corazón estimulante
cardiaco y dolor de cabeza,
combatir la esterilidad.
Peperomia tetraphylla
(Nishanthi, et al.,
2012)
Planta entera
Jugo
Tratar convulsiones, infecciones
microbianas del riñón, la piel y para
la tos.
3.3.Estudios fitoquímicos de especies del género Peperomia
De las especies del género Peperomia se han encontrado metabolitos secundarios como lignanos,
policétidos, flavonoides, amidas y taninos (Mbah, et al., 2012, Batista, et al., 2009, Batista, et al.,
2012; Felippe, al.,2008; Guillermo, R. 2002). Las Peperomias se caracterizan por tener aceites
esenciales de tipo terpénico y con presencia de fenilpropanos entre los que se puede mencionar
pinenos, elemeno, biciclogermacreno, viridiflorol (Verma, Padalia, Goswami, & Chauhan, 2015;
Yang, et al.,2014¸ Pinheiro, et al.,2011), el safrol, eugenol, miristicina, (Rivera, et al., 2015).
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Figura 2. Estructuras de compuestos químicos presentes en los aceites esenciales de
peperomias.
3.4. Estudios de actividad biológica de especies del género Peperomia
Especies del género Peperomia han sido evaluados por ser responsables de actividades
antiinflamatorios, insecticidas, antivirales, antimicrobianos, antifúngicas, anticonceptivo (Tabla
2).
ϒ-ELEMENO VIRIDIFLOROL Β-ELEMENO EUGENOL
SAFROL
MIRISTICINA
5-DEMETILLTANGERETINA
ESTIGMASTEROL
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Tabla 2.
Estudios de actividad biológica de especies de género Peperomia.
ESPECIES
PARTE
EMPLEADA Y
COMPUESTOS
ACTIVIDAD
BIOLOGICA
RESULTADO
Peperomia
Ineaqualifolia.
(Rivera, et al., 2015)
Aceite esencial de
hojas frescas.
Safrol, 11-αH-
himachal-4-en-1-β-ol,
elemicina, viridiflorol
Antimicrobianas
frente a
Estafilococos
áureos,
Streptococcus
mutans
Actividad
antimicótica
frente a Candida.
albicans y
tropicalis
Demostró alta actividad
antimicrobiana y
antimicótica con
respecto al control
positivo aceite esencial
tomillo (T. vulgaris)
Peperomia sui
(Yang, et al.,2014)
Extracto etanólico
planta entera.
Sesamina, sitosterol,
ácido vanílico.
Antiviral frente a
virus H6N1
invitro
Demostró potencial
antiviral.
Peperomia serpens
Pinheiro, et al.,2011).
Aceite esencial toda la
planta.
a-humuleno, (E) –
cariofileo (E) -
nerolidol y (Z) acetato
-nerolidol
Antiinflamatorio
en ensayo
abdominal
inducida por
ácido acético
y
anticonceptiva en
prueba de la
formalina en
ratones
Demostró actividad
significativa
antinflamatoria
y
importante y periférica
anticonceptiva con
respecto a los controles
positivos indometacina
y morfina
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Peperomia acuminata
(Mora, et al., 2016).
Aceite esencial de las
hojas
2-E-dodecenal,
dodecanal y
tetradecanal
Antimicrobiana
frente a Gram
positivas
Staphylococcus
aureus
y
Enterococcus
faecalis
Demostró alta actividad
antimicrobiana con
respecto al control
positivo Eritromicina
Y
Vancomicina
Peperomia pellucida
(L.) HBK
(Arrigoni-Blank et
al.,2004).
Extracto acuoso parte
aérea secas
Antiinflamatorio
en ensayo
inducido por
carragenina de
edema de pata de
rata y
retorcimiento
abdominal (n=10)
utilizando ácido
acético.
Demostró actividad
significativa
antiinflamatoria y
analgésica con respecto
a los controles positivos
indometacina y morfina
Peperomia pellucida
(L.) HBK.
(Akinnibosun,
Akinnibosun, German,
2008
Extracto acuoso y
etanólico de hojas
secas
Antimicrobiana
frente a E. coli, P.
mirabilis y P.
aeruginosa
Demostró alta actividad
antimicrobiana en
extracto acuoso E. coli
y en extracto etanol P.
mirabilis y P.
aeruginosa
3.5. Peperomia subspathulata Yunck
Es un arbusto de tallos erectos, carnosos, de color verde y morado, anillados, débiles, olorosos.
Las hojas son simples, verticiladas, en número de cinco, sin estípulas ni exudado, espatuladas,
emarginadas, carnosas, olorosas, gruesas y uninervadas; pueden llegar a medir 3 a 1.2 cm. La
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inflorescencia es terminal de color verde amarillo, carnosa, con flores diminutas y un pedúnculo
corto. Crece hasta 12 por 0.3 cm (Mahecha,G (s.f)).
La especie Peperomia subspathulata es originaria de Colombia y Ecuador (Bernal, Gradstein
Celis, 2015). En Colombia se encuentran en los departamentos en Bogotá D.C, Risaralda,
Boyacá, Tolima, Cundinamarca (Herbario Nacional y el Jardín Botánico José Celestino Mutis de
Bogotá) y es conocida comúnmente como canelón.
Es utilizada en la medicina tradicional para tratar dolor de estómago, infección urinaria, cabeza,
muela, ansiedad, nervios, golpes y quemaduras (Lagos, 2007).
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Figura 3. Características morfológicas de la especie Peperomia subspathulata.
3.6.Métodos de obtención y análisis de los compuestos aislados en aceites esenciales
Los aceites esenciales (AEs) o esencias son fracciones liquidas volátiles altamente concentradas
que poseen olores agradables, responsables del aroma de las plantas, están constituidos por
mezclas que puede tener desde 50 hasta 300 componentes volátiles y semivolátiles. Los AEs son
el producto del metabolismo secundario de las plantas; en su composición química se encuentran
hidrocarburos terpénicos, sus derivados oxigenados (alcoholes, aldehídos, cetonas, esteres y
ácidos) y fenilpropanoides (Stashenko,2009; Bandoni, 2003).
Los AEs son conocidos por tener un potencial terapéutico y se utilizan ampliamente para
prevenir y tratar las enfermedades humanas por sus propiedades bactericidas, virucidas, fúngicas,
antinflamatorias, antitumorales entre otras; también son utilizados en los sectores agronómicos,
alimentos, sanitarios, cosmético y perfumería. (Santos, et al., 2014; Stashenko,2009; Bandoni,
2003).
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El hidrolato es un subproducto del proceso de destilación y corresponde al agua condensada en la
cual se solubilizan los compuestos más polares del aceite esencial y en muchas ocasiones puede
ser aprovechado por sus características de aroma (Stashenko,2009; Bandoni, 2003).
3.5.1. Obtención de AEs por destilación de arrastre con vapor
Los AEs se extraen por destilación de arrastre con vapor, hidrodestilación o métodos mecánicos
como es el caso de la obtención de cítricos. Los aceites esenciales generalmente están presentes
entre el 0.5 a 2% del material vegetal (Mascret, 2010; Stashenko,2009; Bandoni, 2003).
Destilación por arrastre con vapor es una técnica utilizada en la obtención de aceites esenciales
debido a las características olfativas o de aroma del aceite esencial que se aproximan al aroma de
la planta, además no requiere de tecnologías sofisticadas (Santos, et al., 2014).
En la técnica se utiliza vapor de agua para extraer los compuestos volátiles del material vegetal;
la generación del vapor puede ser local (hervidor), remota (caldera) o interna (base del
recipiente). El vapor transfiere energía al material que va ir ganando temperatura hasta que los
compuestos volátiles pasan a fase vapor y son arrastrados por el vapor que ascenderá hasta
encontrarse con la parte fría del condensador. En el condensador, la mezcla se condensada se
enfría y como resultado se obtiene la mezcla de agua y aceite esencial que al no ser miscibles se
separan por diferencia de densidad. Cuando el aceite esencial está compuesto por sustancias
oxigenadas, éstas pueden distribuirse entre la fase del aceite esencial y la fase acuosa. Los
compuestos volátiles solubles en el agua pueden ser extraídos usando un disolvente (Albarracín
& Gallo, 2003).
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3.5.2. Método de análisis e identificación de los componentes de los AEs
3.5.2.1. Cromatografía de gases de alta resolución (GC)
La cromatografía de gases de alta resolución es una técnica de análisis que permite la separación
de mezclas de compuestos volátiles o volatilizables. La separación se da por la interacción de los
analitos con la fase estacionaria y la fase móvil que en este caso es un gas (H2, He) y por el
gradiente de temperatura al que es sometido el sistema de separación. Permitiendo por ello la
separación de compuestos químicamente muy similares, que no es posible realizar por otros
métodos.
En cromatografía de gases, la muestra se inyecta en el puerto de inyección que se encuentra a
una temperatura de 250 °C a la cual la muestra se volatiliza y luego es llevada por el gas de
arrastre hasta la cabeza de la columna cromatográfica. La columna utilizada en esta
cromatografía es capilar, la cual tiene una longitud de 30 m o 60 m; posee una fase estacionaria
con columnas con diferentes polaridades, así como el espesor de la fase estacionaria y el
diámetro interno (Skoog, West y Holler,1996).
La cromatografía de gases es la técnica más empleada en el análisis de aceites esenciales que al
ser mezclas complejas de compuestos químicamente muy relacionados, como el caso de los
terpenos, solo pueden ser separados por esta técnica. La cromatografía de gases emplea
diferentes detectores, el detector de ionización en llama (FID). El detector de ionización en llama
(FID, Flame Ionization Detector) es considerado un detector universal y por lo general se emplea
para llevar a cabo análisis cuantivativo l (Bandoni, 2003; Marriott, Shellie & Cornwell, 2001).
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3.5.2.2. Cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas (GC-MS)
La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas permite, además de hacer una
separación de los compuestos, permite obtener la información del espectro de masas de los
compuestos presentes en la mezcla y con ello hacer análisis cualitativos y cuantitativos. Este
sistema de GC- MS consta de las tres unidades; cromatógrafo de gases, espectrómetro de masas
y un sistema de datos (McNair y Miller, 2011; McLafferty, y Tureček, 1993).
Durante las dos últimas décadas se ha demostrado que el método de identificación por CG-MS es
el más apropiado para el análisis de AEs debido a que los componentes de este son compuestos
volátiles y de bajo peso molecular (300 Dalton.En CG-MS la muestra se inyecta en el
cromatógrafo, luego, los componentes del AE se separan y a medida que salen de la columna
pasan al espectrómetro de masas y se obtienen los espectros de masas de cada una
de las sustancias (Bandoni, 2003).
Pasan al espectrómetro de masas proporcionando información estructural de los componentes de
la mezcla a partir de los patrones de fragmentación y el peso molecular de cada compuesto.
Página 26
Figura 4. Diagrama de un sistema convencional de CG-MS (Grob, & Barry, 2004).
3.5.2.3 Identificación de los componentes presentes en un aceite esencial
La identificación de los compuestos de un aceite esencial analizado por GC-MS se realiza con
base en dos criterios, el primero es el índice de Kovat’s o índice de retención y el segundo por el
espectro de masas del compuesto.
El índice de Kovat’s es un valor que se determina con base en los tiempos de retención de cada
compuesto a identificar y el tiempo de retención de un patrón de n-alcanos corridos en las
mismas condiciones analíticas de la muestra. El índice de retención de un n-alcano es igual a
cien veces el número de carbonos del compuesto. El Ik es un valor característico para cada
compuesto y fase estacionaria usada lo que permite comparar este valor con reportes en la
literatura (Skoog, West y Holler,1996; Stashenko & Martínez, 2010).
Página 27
3.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales
Una manera de evaluar la actividad antimicrobiana es por medio de los bioensayos de difusión,
dilución y bioautográficos (Ramírez, Stella, & Marín Castaño, 2009) que consisten en valorar la
resistencia y/o susceptibilidad microbiana y la concentración minina inhibitoria (Sánche,
Castillo, García, 2016). Los resultados que se obtienen permiten cuantificar la actividad
antimicrobiana de una sustancia frente al microorganismo en estudio y comparar con lo
reportado por la literatura.
Los métodos más utilizados para determinar la actividad antimicrobiana se describen a
continuación.
3.6.1. Difusión en agar
El método de difusión en agar o el método Kirby-Bauer permite establecer la susceptibilidad
antimicrobiana, es decir, proporciona resultados cualitativos del efecto de la sustancia evaluada
sobre el microorganismo que puede ser susceptibles, intermedio o resistentes. Por lo tanto, este
método se emplea para microorganismos de crecimiento rápido; además presenta la ventaja de
ser reproducible, de bajo costo, no requiere gran cantidad de extracto y/o compuesto tiene
capacidad para probar un gran número de microorganismos, agentes antimicrobianos y la
facilidad para interpretar los resultados proporcionados (Balouiri, et al. 2016).
Sin embargo, una de las desventajas de este método es que no se puede distinguir entre los
efectos bactericidas de los bacteriostáticos, dado que, aunque haya inhibición esto no significa
que se produzca una muerte bacteriana (Balouiri, et al. 2016; Sánche, et al., 2016)
Página 28
La difusión en agar se puede desarrollar en disco o pozo; las técnicas de discos son más costosas
es inexactas a la hora de impregnar la sustancia en el disco, pero es una técnica muy práctica por
la facilidad del montaje. La técnica de pozos requiere que se perfore el agar con un sacabocados
estéril y es de bajo costo (Sánche, et al., 2016; Balouiri, et al. 2016).
La difusión en agar permite evaluar el grado de inhibición para el crecimiento de los
microorganismos y posiblemente cambios en su morfología provocados por la sustancia
evaluada (Ramírez, et al., 2009). La inhibición se establece con base en la relación entre la
concentración de la sustancia que inhibe el crecimiento del microorganismo y el halo de
inhibición de crecimiento o distancia alrededor del lugar de aplicación de la sustancia que
permite medir la sensibilidad bacteriana (Sánche, et al., 2016).
3.6.2 Dilución en caldo
El método de dilución en caldo es un método que permite definir la sensibilidad de agentes
antimicrobianos potenciales. El objetivo es determinar la concentración mínima inhibitoria
(CMI) que corresponde a la mínima concentración del aceite esencial o compuesto capaz de
inhibir el crecimiento de la bacteria. La ventaja de este método es que es reproducible y fácil de
cuantificar que los basados en los métodos de difusión en disco y en pozo agar que son
cualitativos (Sánche, et al., 2016).
3.7. Escherichia coli E
Escherichia coli es una bacteriana gram-negativa de la familia de las enterobacterias y es
representativa del grupo de los coliformes que está presente en la flora intestinal normal de los
seres humanos y su importancia radica en que puede generar infecciones urinarias, meningitis
Página 29
entre otras. Es un microorganismo muy utilizado en bioensayos porque es cultivable en un medio
básico con fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo (Baker, 2009).
El microorganismo Escherichia coli, fue seleccionado para ser evaluado frente al aceite esencial
de Peperomia subsphatulata por ser un agente patógeno para humanos que crea resistencia con
mucha facilidad (Bartram, Cotruvo, Exner, Fricker & Glasmacher,2003; Baker, 2009). También
porque esta bacteria fue evaluada por AEs de especies de esta familia (Fidalgo, Parra, Lizama,
Maes, & Wellens, 2012) en los cuales se reportó efecto inhibitorio moderado frente a E. coli .
Página 30
4. Metodología
El desarrollo experimental de este estudio se llevó a cabo según el esquema que aparece en la
Figura 5.
Figura 5. Diagrama de la metodología.
AE
obtención por destilación de arrastre con
vapor
Material Vegetal
- Selección
- Identificación
Evaluación
Actividad antimicrobiana
Analisis de composición quimica por
GC-MS
Identificación
tentativa de la
composición del
AE
Página 31
4.1. Material vegetal
La recolección del material vegetal se llevó acabo en de agosto de 2016 en el Jardín Botánico de
José Celestino Mutis, un espécimen se entregó al Herbario del Jardín Botánico para su
clasificación taxonómica. Se trabajó con tallos, hojas frescas e inflorescencia sanas y limpias.
4.2. Obtención del aceite esencial de Peperomia subsphatulata por destilación de arrastre
con vapor
El material fresco (tallos, hojas, e inflorescencias) se pesó 1450 g de Peperomia subsphatulata,
se sometió a destilación por arrastre con vapor; en un destilador semi-industrial de acero
inoxidable y se obtuvo 1.8 mL de aceite esencial. El destilador utilizado consta de una fuente de
vapor (1) que luego pasa al depósito (2) donde se dispone el material vegetal troceado. El vapor
arrastra los componentes volátiles presentes en el material vegetal y la mezcla vapor y aceite
esencial hasta el condensador (3) que enfría el vapor y los componentes volátiles del material
vegetal, el condensado se colecta en un tubo en U (4) (Figura 3). Este procedimiento se realizó
en el laboratorio de productos naturales vegetales del departamento de Química de la
Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá.
Página 32
Figura 6. Destilador de arrastre con vapor empleado para la obtención del aceite esencial
de Peperomia subsphatulata
El rendimiento de la extracción se calculó con la fórmula:
%𝑅 = (𝑃𝐴𝐸
𝑃𝑀𝑉) ∗ 100 (1)
Donde:
%R: es el porcentaje de rendimiento, de la extracción del aceite esencial,
PAE: La cantidad de aceite esencial obtenida en gramo.
PMV: La cantidad de material vegetal sometido a extracción en gramos.
1
2
3 2 4
Página 33
4.3. Análisis de la composición del AE por cromatografía de gases de alta resolución
acoplada a espectrometría de masas (GC- MS)
La determinación de la composición del AE se realizó por cromatografía de gases de alta
resolución acoplada a espectrometría de masas, se utilizó un cromatógrafo de gases (Agilent
Technologies 7890) acoplado a un detector selectivo de masas (Agilent Technologies 5977A)
con ionización de impacto electrónico (EI, 70 eV), inyector split / splitless con (relación de
división de flujo de 1/30) un sistema de datos MassHunter. Se usó una columna capilar polar tipo
DB- FFAP (Polietilenglicol modificado con ácido nitrotereftálico) de 25 m de longitud, 200 µm
de diámetro interno y 0,3 µm de espesor de la fase estacionaria. Se empleó Helio como gas de
arrastre a un flujo de 1,0 mL/min, con un programa de temperatura desde 40 (2 min) hasta 250
ºC (1min), a una velocidad de 4 ºC/min (10min).
Las temperaturas del puerto de inyección y de la línea de transferencia se fijaron en 250 y 285
ºC respectivamente. La muestra del aceite esencial se diluyó con CH2Cl2 (50 µL/mL) y se
inyecto 1µL de AE.
La identificación tentativa de los componentes presentes en el aceite esencial se realizó mediante
los índices de retención de Kovat’s (IK) para lo cual se corrió una solución patrón de parafinas de
C8 a C24 y su comparación con los reportados en las bases de datos NIST y FLAVORNET y por
el análisis y comparación de los espectros de masas de cada uno de los analitos con la base de
datos y con los reportados en la literatura.
Se calculó con la siguiente ecuación:
𝐼𝐾 = 100𝑛 + 100 [𝑡𝑅𝑥−𝑡𝑅𝑛
𝑡𝑅𝑁−𝑡𝑅𝑛] (2)
Página 34
Dónde:
Ik: Índice de retención del compuesto de interés x;
N: Números de átomos de carbono del n-alcano que eluye después del compuesto de
interés x;
n: Números de átomos de carbono del n-alcano que eluye antes del compuesto de
interés x;
tRX: Tiempo de retención del compuesto de interés x;
tRn: Tiempo de retención de n-alcanos que eluye antes del compuesto x;
tRN: Tiempo de retención de n-alcanos que eluye después del compuesto x.
4.4. Evaluación de la actividad biológica del aceite esencial
El aceite esencial se evaluó frente a la cepa de la bacteria Escherichia Coli (ATCC® 8739)
mediante métodos de difusión en agar y dilución en caldo y se realizarón en el laboratorio Laser.
Inicialmente la bacteria fue reconstituida en caldo tripticasa de soya y seguidamente fue aislada
en agar tripticasa de soya por un tiempo de incubación de 24 horas a 35 °C.
La solución del inóculo se preparó empleando agua estéril y se realizaron diluciones hasta
obtener una concentración de 0.5 según la escala Mcfarland; que corresponde a 1,5X108
UFC/mL. La medida de absorbancia se realizó a una longitud de onda de 640 nm en un
espectrofotómetro BDOSCIENT.
4.4.1. Determinación de la sensibilidad del AE frente a Escherichia Coli
Para el desarrollo del bioensayo en difusión en agar para la evaluación de la susceptibilidad y
capacidad microbiana del AE y del hidrolato. Se prepararon las soluciones stock
Página 35
correspondientes a 9,436 µg/μL del AE y 9,966 µg/μL del hidrolato y se evaluaron las siguientes
cantidades.
Tabla 3.
Volumen aplicado del stock de AE e Hidrolato en sus respectivos pozos.
VOLUMEN DE LA
SOLUCIÓN STOCK (µL)
ACEITE ESENCIAL (µg) HIDROLATO (µg)
10 94.36 99.66
20 188.72 199.32
30 283.08 N.E
50 471.80 N.E
100 943.60 996.60
N.E: No fueron evaluadas
Cada ensayo se evaluó por triplicado, tanto para el método de dilución en caldo y difusión en
agar, se empleó control negativo dimetilsulfóxido (DMSO) y se eligió la gentamicina (10 μg)
como control positivo ya que es aminoglucosido que ingresa a la célula mediante transporte
activo, una vez dentro de la célula se une de manera irreversible a la subunidad 30s del ribosoma
bacteriano; que provoca error de lectura del RNA-mensajero con producción de una proteína
anómala, la cual unido a las alternativas funcionales de la membrana, (induce fuga de sodio,
potasio y otros componentes esenciales) que producen la muerte bacteriana (Lorenzo, et al.,
2008).
Para llevar a cabo la evaluación de la actividad antimicrobiana de ambas muestras se prepararon
cajas plásticas de 90 x 15 mm 15 mL de medio Mueller Hinton y se dejó solidificar.
Página 36
Seguidamente, se adicionó 10 mL del medio con inóculo (Escherichia coli) y se dejó solidificar
por 30 minutos. Luego se realizaron los micropozos con el sacabocados de 5 mm, El residuo se
retiró con una aguja estéril y se sellaron con 0,1 mL del mismo agar, para evitar la dispersión del
AE dejando el pozo disponible para la aplicación de las muestras a evaluar.
El porcentaje de inhibición se determinó midiendo el diámetro del halo o zona alrededor del
micropozo donde no creció el microorganismo de acuerdo con la siguiente fórmula:
%𝐼 = H.M (mm)
H.C (mm) 𝑥 100 (3)
Dónde:
%I: porcentaje de inhibición.
H.M: promedio de halo de la muestra en (mm)
H.C: promedio de halo del control positivo en (mm)
4.4.2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria de aceite esencial (CMI) en
dilución en caldo
Con el fin de determinar la concentración mínima inhibitoria se prepararon tubos de ensayo con
3 mL de medio de cultivo caldo tripticasa de soya y se les adicionó una alícuota de la solución
stock del aceite esencial (10, 20, 30, 50, 80, 100, 150, 200 μL). Los tubos se incubaron se 35 °C
por 24 horas y se analizaron en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 640 nm con lo
cual se determinó el valor de absorbancia de cada ensayo y se realizó la curva de calibración para
determinar la concentración mínima inhibitoria.
Página 37
5. Resultados y análisis de resultados.
5.1. Determinación taxonómica del material vegetal.
El material Vegetal estudiado en la presente investigación fue identificado por el Botánico
Carlos Suarez como Peperomia subsphatulata y un espécimen reposa en el Herbario del Jardín
Botánico de Bogotá (JBB) con el código CISB 699 y el Voucher C.I. Suarez 699. La
clasificación taxonómica aparece en la Tabla 4.
Tabla 4.
Determinación taxonómica de la especie Peperomia subspathulata.
Reino Plantae
División Angiospermas
Orden Piperales
Familia Piperaceae
Género Peperomia
Epíteto específico Subspathulata
Autor del epíteto específico Yunck.
Nombre científico Peperomia subspathulata Yunck.
5.2 Extracción y caracterización química del aceite esencial.
A partir de 1450 g de material fresco se obtuvo 1,8 mL del AE por destilación de arrastre con
vapor con un rendimiento 0.11% p/p y además el hidrolato fue sometido a extracción con éter y
se obtuvo 0.498 g con un rendimiento 0.03% p/p.
Página 38
Tabla 5.
Masa, densidad y rendimiento del AE e hidrolato obtenidas por destilación de arrastre con
vapor.
AE HIDROLATO
Masa (g) 1.6890 0.4986
Densidad (g/mL) 0,9383 0,9936
% Rendimiento(p/p) 0.1164 0.0343
Para el análisis por CG-MS se preparó una dilución del AE y del hidrolato (1 μL en 1 mL de
DCM). El análisis de las muestras se realizó en un equipo acoplado a un detector selectivo de
masas con ionización de impacto electrónico. Y los perfiles cromatográficos obtenidos
corresponden a la Figuras 7.
Los compuestos químicos presentes en mayor proporción fueron identificados por medio de la
determinación de los Ik y su comparación; así como la comparación de los espectros de masas de
los compuestos individuales con las bases de datos (las que aparecen en los reportes) e inclusive
con las bases de datos Nist, Flavornet. Anexo.1 espectros de masas
En total se identificaron tentativamente 23 en AE y 27 en el hidrolato que representan el 98.6 %
del AE y 99.3% de la composición del hidrolato. Los compuestos identificados aparecen
numerados en el perfil cromatográfico de acuerdo con el tiempo de retención y coincide con la
numeración en la identificación tentativa de los componentes que se presenta en la Tabla 6.
Además, se incluye la composición relativa con base en las familias de compuestos identificados.
Página 39
Los porcentajes corresponden al valor del área relativa de los picos cromatográficos de cada una
de las muestras.
Tabla 6.
Identificación tentativa de los compuestos presentes en el AE e hidrolato de Peperomia
subsphatulata.
No.
PICO
IK
IK
DB-FFAP
calculado
COMPUESTO CANTIDAD RELATIVA (%)
BASE DE
DATOS
AE HIDROLATO
1 1145 1140 1-β-Mirceno 0,15 N.D
2 1201 1209 Limoneno 0,09 N.D
3 1213 1218 1,8-Cineol 0,19 1.18
4 1220 1237 Hexanoato de etilo 0.09 0.08
5 1386 1404 NI 0,07 0.18
6 1458 1457 Octanoato de etilo 0,11 N.D
7 1535 1562 NI 0,44 2.76
8 1638 1633 β-Cariofileno 1,42 0.57
9 1650 1651 Aromandendreno 0,10 N.D
10 1671 1707 E- β-Farneseno 0,24 0.19
11 1660 1710 NI 1,44 0.86
12 1700 1724 α-Humuleno 1,16 0.69
13 1718 1737 α-Terpineol N.D 0.86
14 1736 1742 Ledeno 0,93 0.55
15 1772 1793 Trans-α-Bisaboleno 0,02 0.04
16 1903 1931 Safrol 69,48 37.95
17 1919 1948 Ionol N.D 0.60
18 2033 2042 Metileugenol 0,60 1.23
19 2053 2056 Trans-Nerolidol 0,70 1.00
20 2110 2118 NI N.D 0.12
21 2129 2160 Espatulenol N.D 0.21
22 2118 2171 Cinamato de etilo 0,24 0.32
23 2163 2175 Oxido de α-
Bisabolol β
N.D 0.73
24 2081 2183 NI 0,10 0.19
25 2198 2198 NI N.D 0.42
26 2227 2231 α-Bisabolol 16,13 34.56
27 - 2243 NI 0,23 0.59
28 - 2251 NI N.D 0.14
Página 40
Composición por familias de compuestos
Monoterpenos 0,24 N.D
Monoterpenoides 0,19 2,04
Sesquiterpenos 3,47 2,04
Sesquiterpenoides 16,83 37,1
Fenilpropanos 73,73 44,95
Policetidos 1,01 7,45
Otros 0,44 0,40
N.I: No identificado,
N.D: No detectado.
* (No se encontraron reportes en la columna DB-FFAP)
29 - 2269 NI N.D 0.05
30 2272 2279 Miristicina 3,65 5.77
31 - - Xantoxilina * 1.01 7.45
Página 41
Figura 8. Perfiles cromatográficos del aceite esencial (a) e hidrolato (b) de Peperomia
subsphatulata utilizando una columna DB- FFAP de 25 m de largo.
El AE e hidrolato presentan semejansas en composicion; para el AE se establecieron la presencia
a
b
Figura 7. Perfiles cromatográficos del aceite esencial (a) e hidrolato (b) de la Peperomia subsphatulata
utilizando una columna DB-FFAP de 25 m de largo.
a
b
Página 42
El safrol (69,48 %), el α-bisabolol (16,13 %), la miristicina (3,65 %) y la xantoxilina (1,01%),
como los componentes mayoritarios del AE que corresponden al 90 % en el caso del hidrolato el
safrol (37,95 %), el α-bisabolol (34,56 %), la miristicina (5,77%) y la xantoxilina (7,45%)
representan el 86 %. Otros compuestos como el β-cariofileno (1,42%), el α-humuleno (1,16%) y
el metileugenol( 1,23%) se encuentran en menor proporcion.
La composición relativa de acuerdo con las familias de compuestos (Tabla 6) demuestra que los
fenilpropanos son los componentes de mayor proporción tanto en el AE como en el hidrolato
siendo el 73,73% y 44,95% respectivamente.
Este análisis corresponde al primer reporte científico de la composición del AE de la especie
Peperomia subspathulata con lo cual se contribuye al estudio químico de los compuestos safrol,
miristicina, α-bisabolol, α-humuleno que son comunes en el AE de especies de los géneros
Peperomia y Piper (Gutiérrez, 2016; Rivera, et al., 2015; Guerrini, 2009; Andrés, et al., 2017;
Conde, L., Espinosa, J., & Guerrero, J. 2017).
La identificación química tentativa del AE de Peperomia subspathulata realizada en este trabajo
de investigación solo se puede comparar con otros reportes de especies de la familia Piperaceae
por ser esta la primera caracterización química que se realiza a esta especie. En los reportes
encontrados en la literatura se puede observar que los componentes identificados safrol, α-
bisabolol y miristicina son representativos de la familia Piperaceae, pero en la identificación
tentativa se encontró la presencia de xantoxilina (7,45%), que no es un componente común de
esta familia; sería interesante confirmar la presencia de esta molécula ya que está se encuentra en
pocas especies de otras familias y puede ser un indicador quimiotaxonomíco de la especie
Página 43
Peperomia subspathulata. Este componente es muy importante porque se utiliza actualmente en
la industria farmacéutica y cosmética como compuesto bioactivo contra el virus de la hepatitis B
(Yoon, Chung & Chung, 2000), pero a un mayor por su utilización como molécula cabeza de
serie para el diseño de nuevos fármacos.
El α-bisabolol (34,56 %), presente en el AE se caracteriza por ser un agente antinflamatorio
(Barreto, et al., 2016); esta sustancia posee un potencial uso en la utilización para el tratamiento
de procesos inflamatorios por ende el AE de esta especie puede ser fuente de este componente.
Entre los principales componentes responsables de la acción antimicrobiana del AE encontramos
la miristicina y el safrol. La miristicina es una molécula activa frente a la bacteria E. coli
(Pavlović, et al., 2012; Sadgrove, et al., 2014) acción que puede estar en sinergia con el safrol.
El safrol 69,48 %), es un agente antimicrobiano con estudios de posibles mecanismos de
inhibición sobre enterobacterias; este actúa inhibiendo la producción de enzimas intracelulares,
como las amilasas y proteasas, lo que provoca el deterioro de la pared celular y un alto grado de
lisis celular, posiblemente debido a un efecto sinérgico entre ellos (Avello, et al.,2012).
5.2. Actividad antimicrobiana del aceite esencial
El aceite esencial y el hidrolato se evaluaron frente a Escherichia coli por el método de difusión
en agar, se determinaron los halos de inhibición y a las mediciones obtenidas para el bioensayo
se consignan en las Tablas 7 y 8.
Página 44
Tabla 7.
Porcentaje de inhibición del AE de la especie Peperomia subsphatulata frente Escherichia
coli mediante método de difusión en agar a 35 °C 24 horas.
AE
μg/ POZO
HALOS
(mm)
INHIBICIÓN
(% )
PROMEDIO
INHIBICIÓN
(% )
S
CV
94.4 0,1 0,5 0,2 0,3 173,2
0 0,0
0 0,0
188.7 6,9 36,1 35,6 0,5 1,3
6,5 35,3
7,1 35,3
283,1 8,5 44,5 43,1 2,8 6,4
8,8 44,9
8,1 39,9
471,8 11,1 55,0 53,8 1,2 2,2
10,2 52-6
10,8 53,7
943,6 13,2 69,1 68,6 1,6 2,3
14,1 69.8
13,5 66,8
Control positivo (gentamicina) 19,7 mm y control negativo (DMSO) 0,0 mm.
Tabla 8.
Porcentaje de inhibición del hidrolato de la especie Peperomia subsphatulata frente
Escherichia coli mediante método de difusión en agar a 35 °C 24 horas.
HIDROLATO
μg/ Pozo
HIDROLATO
HALOS (mm)
INHIBICIÓN
(%)
PROMEDIO DE
INHIBICIÓN
(%)
S
CV
99.6 0,0 0,0 0,0 0,0 173,2
0,0 0,0
0,0 0,0
199.3 5,5 28,8 28,4 3,9 13,6
Página 45
Control positivo (gentamicina)19,7 mm y control negativo (DMSO) 0,0 mm.
Según los estándares de sensibilidad microbiana para el método de difusión o Kirby-Bauer para
clasificar un agente antimicrobiano como sensibilidad frente a un microrganismo se tiene en
cuenta el diámetro del halo este debe ser mayor de 20 mm, para intermedio 15-19 mm y
resistente menor o igual a 14 mm (corso, Pasteran, & Antimicrobianos, 2012); por esta razón se
determinó que el microrganismo E. coli presenta resistencia bacteriana al efecto inhibitorio del
AE de la especie Peperomia subsphatulata ya que presentó un halo de inhibición con un
diámetro de 13.6 mm.
La desviación estándar de las mediciones realizadas indica que los ensayos son reproducibles y
no se encontró diferencias estadísticamente significativas de una prueba a otra; los coeficientes
de variación calculados para cada una de las cantidades inyectadas se encuentran en un
porcentaje menor al 15%, lo cual demuestra que el método de difusión en agar es reproducible.
También, se comparó el porcentaje de inhibición del hidrolato para observar la sensibilidad
bacteriana frente a Escherichia Coli y compararla con la sensibilidad bacteriana del AE.
5,9 32,1
4,9 24,1
996.6 12,1 63,4 61,9 2,6 4,6
12,9 63,4
11,8 58,9
Página 46
Grafica 1. Comparación de % inhibición bacteriana del AE e Hidrolato de la especie
Peperomia subsphatulata frente a Escherichia coli a 35 °C 24 horas.
En la Gráfica 1 se puedo analizar que el AE e hidrolato la desviación estándar muestra que no
hay diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de inhibición de los dos
compuestos frente a E. coli, ya que en la prueba t es de 0,7; para que haya diferencias
significativas debe ser inferior de a 0,05 por esta razón su efectividad de sensibilidad frente a
esta bacteria es similar.
Tabla 9.
Resultados prueba t comparación efecto inhibitorio del aceite e hidrolato.
PRUEBA T PARA DOS MUESTRAS SUPONIENDO VARIANZAS IGUALES
Variable 1 Variable 2
Media 30,07 34,76
Varianza 725,86 878,28
Observaciones 9,00 9,00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
94,4 943,6
% d
e in
hib
icio
n
Cantidad μg
aceite esencial
hidrolato
Página 47
Varianza agrupada 802,07
Diferencia hipotética de las medias 0,00
Grados de libertad 16,00
Estadístico t -0,35
P(T<=t) una cola 0,36
Valor crítico de t (una cola) 1,74
P(T<=t) dos colas 0,73
Valor crítico de t (dos colas) 2,11
La concentración mínima inhibitoria (CMI) del AE frente a E. coli, se determinó mediante el
método de dilución en caldo, al graficar los datos obtenidos para las diferentes concentraciones
evaluadas en este método se determinó la CMI que corresponde a 283,08 μg/mL a esta
concentración del aceite esencial no se observó crecimiento bacteriano por lo cual este valor
representa la concentración mínima inhibitoria. Los datos de este ensayo se presentan en la
Tabla 10.
Tabla 10.
Evaluación de la CMI del AE de la Peperomia subsphatulata frente a Escherichia coli a 35
°C 24 horas.
Cantidad
( μg/ mL)
Absorbancia
Replica1 Replica2 Replica3 Promedio
Blanco del Caldo 0,021 0,021 0,019 0,020
Control Blanco TSB 1,051 1,053 1,051 1,052
Control + 1,125 1,126 1,125 1,125
Gentamicina + E. coli
10
0,044 0,043 0,045 0,044
Gentamicina + E. coli
20
0,046 0,048 0,045 0,046
Stock AE + E. coli
47,18
1,024 1,029 1,031 1,028
Página 48
Control positivo (E. coli)1.125, control blanco TSB 1.052, Blanco del Caldo 0.020
Para visualizar más claramente la concentración mínima inhibitoria (CMI) del AE de la especie
Peperomia subspathulata frente a Escherichia coli lo representamos en el sistema de
coordenadas absorbancia Vs. concentración.
Stock AE + E. coli
94,36
0,915 0,914 0,913 0,914
Stock AE+ E. coli
188,72
0,712 0,711 0,712 0,712
Stock AE+ E. coli
283,08
0,454 0,452 0,449 0,452
Stock AE + E. coli
471,80
0,323 0,324 0,323 0,441
Stock AE + E. coli
754,88
0,224 0,225 0,225 0,419
Stock AE + E. coli
943,60
0,197 0,199 0,198 0,409
Stock AE + E. coli
1415,40
0,112 0,111 0,110 0,409
Stock AE + E. coli
1887,20
0,108 0,109 0,107 0,409
Página 49
Grafica 2. Determinación de la CMI del AE de Peperomia subsphatulata frente a
Escherichia coli a 35 °C 24 horas.
De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas de sensibilidad antimicrobiana y de
concentración mínima inhibitoria se puede decir que el AE e hidrolato de Peperomia
subsphatulata no presenta una actividad según los estándares clínicos de laboratorio (Jorgensen,
2012). Estos resultados pueden ser comparados o contrastados con lo que se han reportado para
aceites esenciales de especies de la familia Piperaceae, como por ejemplo el aceite esencial
obtenido de la parte área de la planta Piper auritum obtenido por destilación el cual presenta el
70% de safrol (Fidalgo, et al 2012; Avello, et al., 2012) este mostró una actividad antimicrobiana
moderada frente a E. coli y alta a Plasmodium falciparum.
El AE obtenido de las hojas por destilación de arrastre con vapor de la especie Peperomia
ineaqualifolia (Rivera, et al., 2015) presentó baja inhibición a la bacteria E. coli y alta a
Pseudomonas aeruginosa y en ésta especie se identificaron compuestos como safrol y miristicina
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 500 1000 1500 2000
AB
SOR
BA
NC
IA
CONCENTRACION μg / mL
CMI
Página 50
como los mayoritarios; la composición de éste AE es muy similar al de la especie en estudio
Peperomia subsphatulata que también no presenta actividad.
De acuerdo con lo anterior, se puede inferir que entre los componentes químicos presentes en el
AE; la principal acción antimicrobiana frente a E. coli se le atribuye a la alta presencia de safrol
(Khayyat, & Al-Zahrani, 2014). El safrol y sus derivados en cepas de distintas bacterias gram-
positivas y negativas reportan un efecto efectivo frente a E. coli. pese a la alta presencia de safrol
y miristicina (Pavlović, et al., 2012; Sadgrove, et al., 2014); la baja actividad del AE en estudio
puede ser explicada por la presencia de otros componentes que induzcan un efecto antagonista en
el AE de la especie Peperomia subspathulata disminuyendo el potencial inhibitorio bacteriano
del safrol y miristicina.
Página 51
6. Conclusiones
El AE y el hidrolato de la especie Peperomia subsphatulata obtenido por destilación de
arrastre con vapor mostró un mayor contenido de fenilpropanos, sesquiterpenos y
policetidos siendo los más representativos el safrol, α-bisabolol, xantoxilina y miristicina
ya que estos corresponden al 88%.
La identificación tentativa del AE realizada bajo criterios de índice de Kovat’s (IK) y los
espectros de masas de los compuestos individuales (MS) corresponden al primer reporte
de la composición aceite esencial de la especie Peperomia subsphatulata.
Los ensayos de actividad antimicrobiana mostraron que el microorganismo Escherichia
coli presenta resistencia al efecto inhibitorio del aceite esencial de la especie Peperomia
subsphatulata.
Con base a la identificación tentativa la presencia de α-bisabolol (34,56 %), y xantoxilina
(7,45 %), tienen un uso potencial en la industria farmacéutica ya que estas se caracterizan
por presentar propiedades antinflamatorias y antivirales respectivamente.
Página 52
7. Recomendaciones
Se recomienda realizar la confirmación de los compuestos identificados mediante el uso
de estándares y/o el aislamiento por ejemplo de la xantoxilina que es un compuesto que
por primera vez se identifica en una especie de la familia Piperaceae.
Con base a la composición AE es posible que este tenga actividad antimicrobiana frente a
otros microorganismos, por lo tanto, se recomienda evaluar su actividad frente a otras
bacterias ya que puede ser más efectivo.
Página 53
8. Bibliografía
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9. Anexos.
9.1. Anexo 1. Espectros de masas de la identificación tentativa de la especie
Peperomia Subsphatulata
4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
3 5 0 0
4 0 0 0
4 5 0 0
5 0 0 0
5 5 0 0
6 0 0 0
6 5 0 0
7 0 0 0
m / z - ->
A b u n d a n c e
S c a n 9 8 2 (1 5 . 8 6 8 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( -9 4 5 ) ( - )
9 3 . 1
6 9 . 04 1 . 0
7 7 . 05 3 . 0
1 2 1 . 11 0 5 . 0 1 3 6 . 0
4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
1 6 0 0
1 8 0 0
2 0 0 0
2 2 0 0
2 4 0 0
2 6 0 0
2 8 0 0
3 0 0 0
3 2 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 1 2 7 5 ( 1 7 . 2 6 3 m i n ) : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 1 2 4 6 ) ( - )
6 8 . 1
9 3 . 1
7 9 . 0
1 2 1 . 1
1 3 6 . 1
1 0 7 . 15 3 . 04 1 . 0
1
2 Limoneno
1-β-Mirceno
Página 61
4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 00
1 0 0 0 0
2 0 0 0 0
3 0 0 0 0
4 0 0 0 0
5 0 0 0 0
6 0 0 0 0
7 0 0 0 0
8 0 0 0 0
9 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 1 3 4 7 ( 1 7 . 6 0 6 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 1 3 1 5 ) ( - )4 3 . 0
8 1 . 1
1 0 8 . 1
1 5 4 . 1
1 3 9 . 1
6 7 . 0
9 5 . 1
1 2 5 . 1
2 0 6 . 9
4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
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7 0 0 0
8 0 0 0
9 0 0 0
1 0 0 0 0
1 1 0 0 0
1 2 0 0 0
1 3 0 0 0
m / z -->
A b u n d a n c e
S c a n 1 5 1 6 (1 8 .4 1 1 m in ): C a n e lo n _ 2 .D \ d a ta .m s (-1 4 8 4 ) (-)
8 8 .0
9 9 .0
4 3 .0
6 0 .0
7 3 .0
1 1 5 .0
1 5 3 .91 3 1 .0 1 4 4 .0
4
3
Hexanoato de etilo
1,8-Cineol
Página 62
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
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5 0 0
1 0 0 0
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2 0 0 0
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4 0 0 0
4 5 0 0
5 0 0 0
5 5 0 0
6 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 2 9 7 2 ( 2 5 . 3 4 4 m i n ) : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 2 9 1 4 ) ( - )
8 8 . 0
1 2 7 . 0
5 7 . 0
1 0 9 . 0 1 7 2 . 12 0 7 . 0 2 8 1 . 0
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
0
2 0 0 0
4 0 0 0
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8 0 0 0
1 0 0 0 0
1 2 0 0 0
1 4 0 0 0
1 6 0 0 0
1 8 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 3 5 4 4 ( 2 8 . 0 6 8 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 3 6 0 2 ) ( - )
4 5 . 0
6 9 . 0
9 8 . 1
1 2 9 . 11 9 3 . 0 2 8 0 . 9
6
5
Octanoato de etilo
Página 63
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
0
2 0 0 0 0
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8 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
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2 2 0 0 0 0
2 4 0 0 0 0
2 6 0 0 0 0
2 8 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 3 7 0 3 ( 2 8 . 8 2 5 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s
7 1 . 1
9 3 . 1
4 3 . 0
1 2 1 . 1
1 3 9 . 12 0 7 . 01 6 2 . 0 2 8 1 . 0
4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 00
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1 0 0 0 0
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2 0 0 0 0
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5 5 0 0 0
6 0 0 0 0
6 5 0 0 0
7 0 0 0 0
7 5 0 0 0
8 0 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 4 1 5 4 ( 3 0 . 9 7 3 m i n ) : C a n e l o n _ 1 . D \ d a t a . m s ( - 4 1 2 6 ) ( - )9 3 . 0
1 3 3 . 0
4 1 . 0
6 9 . 0
1 0 7 . 1
1 2 0 . 1
5 5 . 0
1 6 1 . 1
1 4 7 . 0
1 8 9 . 1
1 7 5 . 1
2 0 4 . 2
7
8 β-Cariofileno
Página 64
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
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1 8 0 0
2 0 0 0
2 2 0 0
2 4 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
A v e r a g e o f 3 1 . 2 7 3 t o 3 1 . 2 7 8 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )
4 1 . 0
9 1 . 0
6 7 . 0
1 6 1 . 1
1 1 9 . 1
2 0 4 . 2
2 8 1 . 0
4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 00
2 0 0 0
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2 0 0 0 0
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2 8 0 0 0
3 0 0 0 0
3 2 0 0 0
3 4 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 4 4 8 0 ( 3 2 . 5 2 5 m i n ) : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 4 4 5 4 ) ( - )6 9 . 0
4 1 . 0
9 3 . 0
1 3 3 . 0
1 2 0 . 15 5 . 0
1 6 1 . 1
1 0 7 . 0
2 0 4 . 21 4 8 . 01 8 9 . 1
1 7 5 . 1
10
Aromandendreno
9
E- β-Farneseno
Página 65
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
2 0 0 0 0
2 5 0 0 0
3 0 0 0 0
3 5 0 0 0
4 0 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 4 5 0 1 ( 3 2 . 6 2 5 m i n ) : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 4 4 8 9 ) ( - )
1 0 5 . 1
2 0 4 . 2
1 2 3 . 1
1 4 8 . 18 1 . 1
4 1 . 1
1 7 5 . 1
6 3 . 02 6 6 . 9
4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 00
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7 0 0 0 0
7 5 0 0 0
8 0 0 0 0
8 5 0 0 0
9 0 0 0 0
9 5 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
A v e r a g e o f 3 3 . 1 8 3 t o 3 3 . 1 8 7 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )9 3 . 0
8 0 . 0
1 2 1 . 1
1 4 7 . 14 1 . 0
6 7 . 0 1 0 7 . 1
2 0 4 . 2
1 6 1 . 11 8 9 . 11 3 4 . 0
5 4 . 0 1 7 5 . 1
12
11
α-Humuleno
Página 66
4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 00
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1 0 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0
1 2 0 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
A v e r a g e o f 3 3 . 6 4 9 t o 3 3 . 6 5 9 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )5 9 . 0
9 3 . 0
1 2 1 . 1
1 3 6 . 1
4 3 . 0
7 9 . 0
1 0 7 . 1
1 6 3 . 0 1 9 3 . 01 7 7 . 0 2 0 9 . 0
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
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3 5 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 4 7 6 0 ( 3 3 . 8 5 9 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 4 7 4 0 ) ( - )
1 0 7 . 1
1 6 1 . 1
4 1 . 1 1 3 5 . 07 9 . 0
1 8 9 . 1
6 1 . 0 2 8 1 . 02 0 7 . 0
14
13 α-Terpineol
Ledeno
Página 67
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
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1 0 0 0
2 0 0 0
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7 0 0 0
8 0 0 0
9 0 0 0
1 0 0 0 0
1 1 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
A v e r a g e o f 3 5 . 0 3 0 t o 3 5 . 0 4 0 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )
1 2 1 . 1
9 3 . 0
4 1 . 0
6 7 . 1
1 6 1 . 1
2 0 4 . 1
1 3 9 . 1
2 8 1 . 0
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 00
2 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0
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2 0 0 0 0 0 0
2 2 0 0 0 0 0
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2 8 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0
3 2 0 0 0 0 0
m / z -->
A b u n d a n c e
A v e ra g e o f 3 8 . 9 6 8 t o 3 9 . 0 1 1 m in . : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )1 6 2 . 0
1 0 4 . 0
1 3 1 . 0
7 7 . 0
5 1 . 0
2 0 7 . 0 2 8 2 . 0 3 5 4 . 9
15
16 Safrol
Trans-α-Bisaboleno
Página 68
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 3400
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10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
60000
65000
m/ z-->
Abundance
Scan 5952 (39.535 min): Canelon_2.D\ data.ms (-5938) (-)205.1
57.0145.0
177.191.0 115.0355.0281.9
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
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2 2 0 0 0 0
m / z -->
A b u n d a n c e
S c a n 6 5 2 1 (4 2 .2 4 5 m in ): C a n e lo n _ 2 .D \ d a ta .m s (-6 5 5 4 ) (-)
1 7 8 .1
9 1 .1
1 4 7 .0
6 5 .0 1 1 5 .0
4 1 .0
2 0 7 .9 2 6 6 .9
17
18 Metileugenol
Ionol
Página 69
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
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1 0 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0
1 2 0 0 0 0
m / z - ->
A b u n d a n c e
S c a n 6 5 8 5 (4 2 . 5 4 9 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( -6 5 5 9 ) ( - )
6 9 . 0
9 3 . 0
4 1 . 0
1 3 6 . 1
1 6 1 . 1
1 8 9 . 11 1 1 . 12 0 7 . 0 2 8 0 . 9
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5 0 0 0
5 5 0 0
m / z -->
A b u n d a n c e
S c a n 6 8 8 4 (4 3 .9 7 3 m in ): C a n e lo n _ 2 .D \ d a ta .m s (-)4 3 .0
1 0 9 .1
1 6 1 .16 9 .0
1 8 9 .1
1 3 5 .0
2 2 2 .2 3 4 0 .92 8 1 .0
20
19 Trans-Nerolidol
Página 70
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1 0 0 0 0
1 1 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 7 1 2 4 ( 4 5 . 1 1 6 m i n ) : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 7 1 0 3 ) ( - )
4 3 . 0
9 1 . 0 2 0 5 . 1
1 1 9 . 0
1 5 9 . 1
6 9 . 0
1 8 7 . 1
1 3 7 . 0
2 8 1 . 0
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m / z -->
A b u n d a n c e
S c a n 7 1 9 0 (4 5 .4 3 0 m in ): C a n e lo n _ 2 .D \ d a ta .m s (-7 1 6 6 ) (-)1 3 1 .0
1 0 3 .0
7 7 .0
1 7 6 .1
5 1 .0
2 0 8 .9 3 5 5 .12 6 6 .9
21
22 Cinamato de etilo
Espatulenol
Página 71
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 00
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2 4 0 0 0
m / z - ->
A b u n d a n c e
S c a n 7 2 1 2 (4 5 . 5 3 5 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( -7 1 9 9 ) ( - )1 4 3 . 0
4 3 . 0
8 5 . 0
1 2 1 . 1
1 7 9 . 1
2 2 0 . 1
2 8 1 . 9 3 4 0 . 9
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2000
4000
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8000
10000
12000
14000
m/ z-->
Abundance
Average of 45.726 to 45.764 min.: Canelon_2.D\ data.ms (-)59.0
82.1
107.1149.1
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266.9 340.9
24
23
oxido de α-bisabolol β
Página 72
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m / z - - >
A b u n d a n c e
A v e r a g e o f 4 6 . 1 2 1 t o 4 6 . 1 6 4 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )1 6 4 . 1
7 7 . 01 4 9 . 0
1 0 3 . 0
1 3 1 . 0
5 5 . 0
1 8 9 . 12 0 4 . 2
2 2 2 . 1
3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 00
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2 8 0 0 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
A v e r a g e o f 4 7 . 1 1 1 t o 4 7 . 1 3 0 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )1 0 9 . 1
6 9 . 1
4 3 . 0
9 3 . 0
2 0 4 . 2
1 6 1 . 11 3 4 . 1
1 8 9 . 1
2 2 2 . 2 2 4 8 . 9
25
26 α-Bisabolol
Página 73
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
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1 0 0 0 0
1 1 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 7 6 1 7 ( 4 7 . 4 6 4 m i n ) : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 7 5 9 3 ) ( - )
5 9 . 0
1 4 9 . 1
1 8 9 . 1
9 1 . 0
1 2 3 . 0
2 2 2 . 2
2 6 4 . 9 2 8 3 . 0
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 00
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1 1 0 0 0
m / z -->
A b u n d a n c e
S c a n 7 6 6 5 (4 7 . 6 9 2 m in ): C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s (-7 6 4 7 ) (-)5 9 . 0
1 4 9 . 0
1 0 8 . 1
8 2 . 0
1 8 9 . 12 2 2 . 1
2 4 8 . 9 3 4 1 . 02 8 3 . 0
27
28
Página 74
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
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3 0 0 0
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4 0 0 0
4 5 0 0
5 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 7 7 7 4 ( 4 8 . 2 1 1 m i n ) : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 7 7 5 1 ) ( - )
6 9 . 14 1 . 1
9 3 . 0
1 2 1 . 1
1 8 7 . 1
2 4 3 . 1
1 6 1 . 1
2 2 2 . 12 8 1 . 0
1 3 9 . 9
4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 00
1 0 0 0 0 0
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8 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 7 8 3 6 ( 4 8 . 5 0 7 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 7 8 1 8 ) ( - )1 9 2 . 1
9 1 . 0
1 6 5 . 01 1 9 . 0
6 5 . 0
1 4 7 . 0
5 0 . 0
2 0 7 . 9
29
30 Miristicina
Página 75
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0
0
1 0 0 0 0 0
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1 7 0 0 0 0 0
m / z - - >
A b u n d a n c e
S c a n 9 4 5 4 ( 5 6 . 2 1 1 m i n ) : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 9 4 2 3 ) ( - )
1 8 1 . 0
9 5 . 04 3 . 01 3 8 . 0
2 0 8 . 0 2 8 1 . 0 4 1 4 . 92 4 9 . 9 3 5 5 . 03 2 7 . 0
31 XANTOXILINA
Página 76
9.2. Anexo 2. Actividad antimicrobiana con las diferentes concentraciones del AE
frente a E. coli
6,8mm
8,1mm
Página 77
13,6mm 10,7mm
19,7mm