Capítulo 3 Fermentación de productos industriales · PDF file183....
164
181 Capítulo 3 Capítulo 3 Fermentación de productos industriales Propósito Conocer y manejar los conceptos fundamentales de la microbiología microbiana como base para los procesos de fermentación.
Transcript of Capítulo 3 Fermentación de productos industriales · PDF file183....
181
Capítulo 3
Capítulo 3 Fermentación de productos industriales
PropósitoConocer y manejar los conceptos fundamentales de la microbiología microbiana como base para los procesos de fermentación.
182182
Capítulo 3
183
Capítulo 3
Introducción
Las Fermentaciones de Productos Industriales comprenden un buen número de procesos industriales que son utilizados por el hombre para producir satisfactores para la salud y la alimentación.
Para poder aprovechar las fermentaciones se deben desarrollar tecnologías que permitan fabricar productos en cantidades industriales para satisfacer necesidades del hombre, tanto en el ámbito doméstico, como social y comercial.
En el desarrollo de las tecnologías de las fermentaciones se debe buscar siempre el bajo costo, de tal forma que compitan con los productos que se usan actualmente.
Existen procesos fermentativos que se conocen desde la antigüedad, como la fabricación del vino, la cerveza, etc. Tradicionalmente, la humanidad utilizaba estos procesos fermentativos y se consumían sin considerar que se podría desarrollar tecnológicamente a un costo más bajo y con mejores resultados de calidad de los productos.
184184
Capítulo 3
185
Capítulo 3
Unidad 1 Antecedentes de la microbiología industrial
1.1 RAP Identifica y maneja los conceptos fundamentales de la microbiología industrial
1.1.1 Antecedentes históricos de la microbiología industrial
Es el estudio de la microbiología orientada a la producción de elementos de interés industrial mediante procesos en los cuales interviene, en algún paso, un microorganismo. Es el caso de la producción de alimentos (fermentación del vino, pan o cerveza) y suplementos dietéticos (como los cultivos de algas, vitaminas o aminoácidos) biopolímeros, como el xantano, alginato, celulosa, ácido hialurónico, polihidroxialcanatos; biorremediación de entornos contaminados o tratamiento de desechos, así como la producción de principios activos de interés en medicina, como la insulina y hormona del crecimiento o de sustancias implicadas en el diagnóstico, como las Taq polimerasas empleadas en PCR cuantitativa.
Es tan antigua ésta, como la manipulación de alimentos fermentados como el vino, pan o yogur. No obstante, durante el siglo XX su aplicación se diversificó con el ánimo de generar un gran número de compuestos químicos complejos de forma más sencilla y barata que mediante síntesis orgánica; este hecho se debe a la enorme versatilidad metabólica de los microorganismos que, frecuentemente, son capaces de producir los compuestos deseados o sus precursores. Así mismo, ha sido clave en la producción de penicilinas, ya naturales, como la penicilina G (esto es, producidas de forma totalmente microbiológica), ya semisintéticas, como la meticilina, que requieren la purificación de un intermediario que luego ha de modificarse química o enzimáticamente. Por último, la tecnología avocada al estudio del ADN recombinante ha permitido, con un enfoque de ingeniería genética, diversificar aún más la disciplina, llegando a producirse proteínas humanas mediante microorganismos transformados con genes humanos.
186186
Capítulo 3
Los microorganismos pueden ser considerados en dos cri-terios. El primero corresponde a las actividades útiles que tienen algunos para obtener bienes o servicios y el segun-do, a los efectos perjudiciales que ocasionan, que están generalmente asociados a la producción de enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, y que también se pueden extender al deterioro producido sobre alimentos y materiales diversos.
La Microbiología Industrial se ocupa fundamentalmente de las actividades útiles de los microorganismos. El término microorganismo se aplica en este Manual, a los organis-mos tales como bacterias, hongos y levaduras, es decir procariotes y eucariotes, con inclusión de algas microscó-picas, pero que no comprende a los virus. Aunque existen aplicaciones industriales de los virus como es el caso de la producción de algunas vacunas, esos procesos quedan excluidos de este Manual.
Cultivo de un Penicillium productor de penicilina y estructura de la penicilina G.
La biosíntesis de ácidos grasos, ocurre a través de la condensa-ción de unidades de dos carbo-nos, es el sentido opuesto a la oxidación.
Figura: diferencias entre las vías de oxidación de los áci-dos grasos y su síntesis. Las diferencias se encuentran a 5 niveles: 1. localización celular; 2. acarreador del grupo acilo; 3. pares dador/aceptor de electrones; 4. estereoquí-mica de la reacción de hidratación/deshidratación; y 5. la forma en que las unidades C2 son producidas o donadas.
β
187
Capítulo 3
Las aplicaciones de los microorganismos son de tiempo inmemorial. El hombre inventó o descubrió al azar la ma-nera de hacer cerveza, vinagre, vino o pan. La cerveza era conocida antes del año 6000 a.C. por sumerios y babilo-nios, y en el antiguo Egipto existía ya verdadera producción en el año 1700 a.C.; el vinagre se producía desde antes de esa fecha y el vino es también muy antiguo, ya que existe evidencia de su producción antes del año 2000 a.C. en Egipto y China, y finalmente, el pan se conoce desde el año 4000 a.C. aproximadamente.
En los comienzos del siglo XX existían muy pocos o ningún control de los procedimientos utilizados para la elabo-ración de esos productos o alimentos. Se pueden fijar 4 grandes etapas en el desarrollo de la Microbiología Indus-trial: 1) hasta 1900; 2) 1900-1945; 3) 1945-1979 y 4) 1979 hasta el presente, y considerar el comienzo del siglo XXI como el inicio de cierto control en los procesos de utiliza-ción de cultivos puros.
La fermentación es la parte principal del proceso de la elaboración del vino, tiene como principal efecto la con-versión de los azúcares del mosto en alcohol etílico.
Figura Producción de vino (Archivo:Red wine cap.jpg
Evidencia de la pro-ducción de vino por los egipcios antes del año2000 a. c.
188188
Capítulo 3
Para 1900 comienza la etapa de producción de una se-rie de productos nuevos que se suman a los conocidos desde la más remota antigüedad, y que son la levadura de cerveza, glicerol, ácido láctico, acetona butanol y eta-nol. Hasta el 1945 el futuro de la Microbiología Industrial, ya que solamente unos pocos productos eran fabricados con microorganismos, y además varios de esos productos podían obtenerse por otras vías, ya más convenientes por razones económicas, como etanol, ácido láctico o ace-tona butanol. Con la aparición de la penicilina en 1945 y la necesidad de su producción, se produce un impacto formidable sobre los procedimientos microbiológicos, ya que se plantea el desafío de la producción en gran escala en condiciones de mucho mayor control y con necesidad de operaciones más complejas para la separación y pu-rificación de los productos. Como consecuencia de los avances logrados en esos desarrollos se produce en pocos años la aparición de un gran número de nuevos productos, como otros antibióticos, aminoácidos, esteroides, enzimas, biomasa aplicada a la alimentación animal y humana (pro-teínas unicelulares), nucleótidos, etc.
La Microbiología Industrial para 1979 recibe un nuevo y no-table impulso que se suma al anterior cuando se concretan a nivel de procedimientos prácticos las posibilidades que ofrece la ingeniería genética, disciplina surgida como con-secuencia del avance de la Biología Molecular. Este nuevo impulso posibilita la producción industrial, basada en la utilización de microorganismos recombinantes, de sustan-cias nuevas nunca producidas antes por esa vía como la insulina, hormona de crecimiento, interferón y otras de muy reciente aparición en el mercado de productos relaciona-dos con el área de la salud. A través de una evolución en los conceptos, el avance de los conocimientos y sobre todo, con la necesidad de resolver problemas de produc-ción vinculados a procesos cada vez más complejos, se fue haciendo necesaria la participación de ingenieros y bioquí-micos además de los microbiólogos, y se fue produciendo también la integración de conocimientos provenientes de
189
Capítulo 3
varias disciplinas. Se fue profundizando, el estudio de los microorganismos de interés industrial, no sólo en sus aspectos microbiológicos, sino también en relación a los requerimientos surgidos de las aplicaciones industriales de los mismos. Si de esta manera diferenciando la meto-dología general empleada en la selección, mantenimiento y mejoramiento de los microorganismos, estos aspectos debían orientarse a los productos de interés y al aumento de la productividad de las cepas empleadas.
La insulina humana ha sido el primer producto comercial de la clonación de genes y su éxito ha sido debido al pequeño tamaño de la molécula que hizo posible la síntesis química de un gen.
Para llevar a cabo la producción de insulina humana re-combinante, se sintetizaron químicamente las cadenas de ADN con las secuencias correspondientes a las cadenas de glicocola y fenilalanina, siendo necesarias 63 nucleótidos para la primera y 90 para la segunda más un triplete para señalar el fin de la traducción. Además. Para facilitar la separación de los productos sintetizados, se añadió a cada gen el triplete correspondiente a la metionina.
Figura Producción de in-sulina recombinante.
190190
Capítulo 3
A la par sucedió con los requerimientos de los medios de producción que deben incluir consideraciones económicas además de las microbiológicas. Se produjeron en los aspec-tos tecnológicos, evoluciones necesarias, ya que de las cubas clásicas de fermentación construidas de materiales diversos y con poca instrumentación se pasó a biorreacto-res de acero inoxidable muy instrumentados.
La evolución de los procesos en los reacto-res y la interacción microorganismo- medio que en los mismos requirió aportes fun-damentales de la Bioquímica y Fisiología Microbiana, como el conocimiento de las rutas metabólicas, cinética enzimática, mecanismos de regulación y estudios acerca de la influencia del medio ambiente sobre la productividad del proceso. Con ello a la Tecnología se incorporaron conocimientos funda-mentales de fenómenos de transporte como transfe-rencia de materia, calor y cantidad de movimiento y criterios de cambio de escala. Como consecuencia de la contribución de otras disciplinas básicas como la Química, se fueron incorporando también conceptos de termodinámica y estequiometría que se integraron con los de la cinética enzimática para ser aplicados al crecimiento microbiano y a la formación de productos. Todos esos conceptos de la Microbiología, Química, Bioquímica y Tecnología, constituyeron las bases de la Microbiología Industrial actual.
En ella se utilizan los términos fer-mentación y fermentaciones industria-
les, para caracterizar a los procesos o tecnologías basados en el uso de microorganismos. La “fermentación”, que deriva del latín fermentar (hervir), inicialmente reservado a la actividad microbiana anaerobia, se fue aplicando asimismo a procesos aerobios y finalmente también a aquéllos que utilizan células animales y vegetales.
Los procesos de la Microbiología Industrial o las fermentaciones industriales, o los procesos de fermentación, son o pueden considerarse como sinónimos.
Biorreactores de membrana(Producto del desarrollo de la biotecno-logía)
191
Capítulo 3
1.1.2 Identificación de microorganismos
Los criterios utilizados, en la elección de microorganismos deberán tener en cuenta ciertos criterios generales como son:
• La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos.• Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos a partir de me-dios de cultivo de costo reducido.• Debe ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo, sin pérdida de sus características particulares.• Debería llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.
En un proceso si el objetivo es un producto, éste debería ser de alto rendimiento y de fácil extracción del medio de cultivo. Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos. En la industria, en general, cada firma posee su propia colección de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados a través de técnicas clásicas de mutación o de ingeniería genética. En cambio, estas cepas sólo son empleadas por la industria que las posee, debido al gran valor comercial de las mismas, por lo que hay casos donde se dispone de organismos modificados genéticamente para llevar a cabo reacciones específicas de biosíntesis, degradación o biocatálisis, los cuales están protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos aislados o modificados no son disponibles para uso general en laboratorios.
A nivel mundial hay un gran número de colecciones depositarias de cultivos. Entre la diversidad de colecciones se destacan: “American Type Culture Collection”, USA, la cual mantiene bacterias, levaduras, algas, actinomycetes, mohos, protozoos, virus y líneas celulares; “Colletion Nationale de Cultures de Microorganismes” del Institut Pasteur, Francia; “Northern Regional Research Laboratory” (NRRL), de Peoria, USA, y “National Collection of Type Cultures”, Londres, Inglaterra.
192192
Capítulo 3
1.1.3 Manejo de cepas microbianas
Al aislar un organismo de sus fuentes naturales como agua, suelo, plantas y desechos, la elección del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo exprese en ese ambiente las propiedades que son de interés. En el caso de suelos tratados con pesticidas se podrían encontrar organismos adaptados a la degradación de estos productos químicos, o en larvas de in-sectos muertos y agentes causales de la muerte. Cuando se elige la fuente de aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica elegida para el mismo; en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, o b) enrique-cimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra.
Cuando se realiza el muestreo y selección (screening) para el aislamiento de una cepa de interés, la misma deberá ser caracterizada. En este se debe tener en cuenta que la composición química del material a partir del cual se va a realizar el aislamiento comienza a variar desde el momento en que es tomada la muestra; por lo tanto, ésta se debe procesar rápidamente, tratando de evitar alteraciones que afecten a la población de interés.
a) Aislamiento directo: en este caso es preferible que el medio que se uti-liza permita la máxima expresión del material genético del organismo. En el caso un organismo con acción antimi-crobiana, se puede crecer al potencial productor, en una caja de petri en presencia del o los organismos con-tra los cuales se requiere la acción antimicrobiana, observándose la pro-ducción del inhibidor por las zonas de inhibición de crecimiento. Para la detección de productores de factores de crecimiento tales como ami-noácidos y nucleótidos se utiliza la estimulación del desarrollo de bacterias auxótrofas por un lisado del organismo, pudiéndose llevar a cabo en medios sólidos, en donde es una “réplica” de la caja por ensayar. Al obtener el crecimiento en la primera caja, se replica a una segunda, antes de “matar” las colonias con luz. U.V., por ejemplo. Esta caja es luego cargada con agar conteniendo una suspensión del organismo auxótrofo al producto buscado. Después de un período de incubación se observa crecimiento en forma de halo alrededor de las
Aislamiento vegetativo de cepas
193
Capítulo 3
colonias productoras, lo que permite el aislamiento de este organismo de la placa réplica.
b) Enriquecimiento del cultivo: consis-te en incrementar en una población mixta el número de organismos de interés en relación con el resto, don-de se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de microorganismos mediante condiciones de cultivo ade-cuadas al mismo, o de condiciones inapropiadas para el desarrollo de
los otros. Con el empleo de sustratos específicos o ciertos inhibidores.
Para mantener la fuerza selectiva del medio, el cual se modifica por el crecimiento del organismo buscado, se realizan subcultivos periódicos en medio fresco. Conlleva a que el organismo de interés sea el dominante de la población, lo cual facilita su posterior aislamiento en medio sólido, con-siderando en este caso el efecto del medio sobre la velocidad específica de crecimiento (µ). Para este procedimiento la selección de un organismo depende del valor de (µ) comparado con los de los otros organismos. El dominante de la población será el que posea el mayor valor de (µ) para las condiciones de cultivo empleadas. Sin embargo, no necesariamente será más útil un organismo de (µ) más alto; puede ser deseable uno con mayor afinidad por el sustrato.
La problemática de selección puede ser superada empleando el sistema de cultivo continuo, donde la fuerza de selección se mantiene en un nivel constante y el organismo dominante será seleccionado por su afinidad por el sustrato, más que por su (µ) máxima.
Aislamiento con esporas
194194
Capítulo 3
a) Hacer una Figura que muestre un modelo de com-petición entre dos organismos capaces de crecer en un cultivo continuo enriquecido.
b) Indica tres aspectos importantes que se deban to-mar en cuenta para la conservación de cepas de uso industrial: _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________.
c) ¿Cómo pueden conocerse las características de un cultivo para aplicación industrial? ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________.
1Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
195
Capítulo 3
Unidad2Desarrollodelasfermentaciones
2.1 RAP Identifica los requerimientos y procesos para el desarrollo de las fermentaciones en la industria
La preparación de medios para el desarrollo de fermenta-ción es una etapa fundamental para asegurar la produc-tividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos, ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. Los microorganismos suelen variar considerable-
mente respecto de los nutrientes que pueden necesitar; es posible efectuar la distinción de las siguientes categorías de componentes:
a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro, que están repre-sentados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro y
c) Factores de crecimiento, que están constituidos generalmente por componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni me-tabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función metabólica específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc.
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los compo-nentes, en:
1) Medios sintéticos o medios químicamente definidos, y 2) Medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son quí-micamente indefinidas y de composición variable.
Preparación de medios de cultivo
196196
Capítulo 3
En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el diseño para tratar a continuación la formulación y optimización de los mismos.
2.1.1 Diseño
Tiene como finalidad, en un medio de fermentación la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la forma-ción de productos correspondientes al proceso por desarrollar. Se deben tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos para ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. Tam-bién importantes son los que se refieren a todos los procesos y operaciones previas y posteriores a la etapa de fermentación y al conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la for-mación de algunos productos, como es el caso de la importancia del anión P04.
2.1.2 Requerimientos nutricionales
Están determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea autotrófico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del C02 como las algas y algunas bacterias, y los heterotróficos que necesitan compuestos or-gánicos como fuente de carbono. Otro factor esencial son las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El 02 es uno de los oxidantes más comunes en el metabolismo energético. En la ausencia del 02, el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias metano-génicas son auxótrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el C02 a CH4 y obtener energía. Algunas protistas obtienen su energía, en condiciones anaero-bias por reacción de óxido-reducción realizadas sobre compuestos orgánicos. Las fuentes de carbono cumplen también el rol de ser fuente de energía.
Otro, está constituido por las fuentes de nitrógeno que pueden ser de naturaleza inorgánica u orgánica. El nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Para la síntesis de proteína se requieren en general L-aminoácidos, aunque también son necesarios algunos aminoácidos de la serie D como D-alanina y D-aspártico para su
Sistemadealimentaciónporlote
197
Capítulo 3
incorporación a la pared de la células. En algunos casos se requieren también péptidos de histidina.
En el caso de macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de HP04 y S04 (o aminoácidos azufrados). El fósforo se incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados, y además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.
Por otro, lado el del K y Mg son también esenciales. Una parte importante del pri-mero está unida al RNA, de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las células, como la velocidad de crecimiento. El ión K actúa como coenzima y probablemente actúa como catión en la estructura aniónica de varios componentes celulares. El ión Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y actúa como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato.
Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categorías:
Elementos esenciales para el crecimiento
En ocasiones es difícil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente está presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los requerimientos de estos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a “stress”, como por ejemplo, por aumento de temperatura por encima de un valor óptimo.
De factores de crecimiento los requerimientos comprenden ciertos aminoácidos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, ácido pantotético, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de coenzimas. Otros factores de crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, etc.
Elementos esenciales para el crecimiento Oligoelementos esenciales para el crecimiento
Ca Ba, Ni,
Mn Na As
Fe Al Se
Co Si Mo
Cu Cl Sn
Zn V I
Cr
198198
Capítulo 3
En algunos procesos existe la necesidad de efec-tuar otros agregados, aparte de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que repre-sentan los requerimientos específicos del proceso considerado. En el caso de los precursores que constituyen la base de una molécula que debe ser sintetizada por el microorganismo, como el ácido fenil acético para la penicilina. Otro ejemplo es el agregado de ciclo dextrinas en procesos de
producción de Bordetella pertussis que puede actuar como complejante de inhibidores de crecimiento celular.
El agregado de cloruros o bromuros en el caso de algunos antibióticos como cloro y bromotetraciclinas, tetraciclidas producidas por el Streptomyces aureofaciens, responde también a requerimientos específicos para inhibir la sínte-sis de productos no deseados, como ocurre también con el agregado de mananos y barbitúricos en la producción de estreptomicina por S. griseus. El agregado de sulfato, en el proceso de fermentación alcohólica, que favorece la formación de glicerol, es otro ejemplo de un requerimiento específico. El diseño adecuado tiene que ver con las carac-terísticas bioquímicas propias y evolución de los parámetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracterizado por un descenso continuo de pH, debido al uso de una sal de amonio como fuente de nitrógeno, obliga a considerar en su diseño algún agregado que no corresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del control de pH del mismo. Son efectuados por agregados al medio de agentes “buffer” como mezclas de fosfatos o de carbonato de calcio o como más generalmente se hace, con agregados periódicos de soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma más conveniente mediante un control automático de pH. En un medio específico el diseño para la producción de ácido cítrico debe considerar la influencia negativa que para el proceso tiene un exceso de hierro en su composición; por lo tanto, dicho medio debe diseñarse de manera tal que su preparación (a partir de diversas materias primas) consi-dere una eliminación total del hierro y posterior agregado del mismo en cantidades controladas.
Bordetella Pertussis
StreptomycesAureofaciens
StreptomycesAureofaciens
Producción de estreptomicina a partir deStreptomycesgriseusconagregadode mánanos y barbitúricos cultivada en una caja de Petri
199
Capítulo 3
2.1.3DisponibilidaddeloscomponentesIndependientemente de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar disponibles para ser usados por la célula.Es necesario mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metá-licos cuya concentración es modificada por quelación, ya que muchos constituyentes del medio y productos del metabolismo actúan como agen-tes complejantes o precipitantes, por ejemplo aminoácidos, hidroxiácidos, hidróxidos, y los aniones P04 y C03
Con el objeto de controlar su concentración y prevenir la precipitación de los iones metálicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algún agente quelante agregado, como el EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacé-tico).En medios complejos de uso industrial la situación es aún más complicada, ya que existe una gran variedad de sustancias orgánicas, las cuales pueden quelar, secuestrar o absorber iones metálicos reduciendo la concentración iónica disponible. Por ejemplo: aminoá-cidos, proteínas, ácidos orgánicos, polifenoles, polifos-fatos y materiales coloidales. En el caso de material insoluble presente en el medio de cultivo va a tener una determinada capacidad de unión a elementos me-tálicos disminuyendo su concentración efectiva, como ocurre también con los aminoácidos y proteínas que tienen los grupos reactivos R-COO - , RHN- , RS- , O, que son los más importantes. La dinámica de forma-ción del complejo está determinada por la constante
de equilibrio de formación del complejo metal- ligando, y por la velocidad a la cual el equilibrio es obtenido. La constante de equilibrio para la for-mación del complejo del ión metálico (M) con el ligando (L) se expresa de la siguiente forma:
K = [M L] _________ [M] [L]
StreptomycesAureofaciens
AgenteQuelanteEDTAylosAminopoli-carboxilatos en la fermentación
200200
Capítulo 3
2.1.4 Materias primas fundamentales
De los componentes empleados en las industrias de fermentación, es importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composición química. Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentación, se hace prioritario disminuir el costo de los medios. Las materias primas más importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrógeno.
Las fuentes de carbono pueden ser: 1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina; 2) Alcoholes como el glicerol y manitol; y 3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.
Entonces las cargas del catión y ligando están omitidas. El valor de K es prácticamente independiente de la naturaleza del ligando, que depende parti-cularmente del ion metálico. Se puede hacer una lista de términos de valores decrecientes de la constante de equilibrio como sigue:
Fe+3 > Pb+2 > Cu+2+ > Ni+2 > Co+3 > Zn+2 > Co+2 > Cd+2 > Fe+2 > Mn+2 > Mg+2> Ca+2 > Sr+2 > Ba+2> Na+1> K+1> y de la cual se puede deducir, por ejemplo, que el ion Cu+2 estará fundamentalmente como complejo mientras que Ca+2, Na+1 y K+1 estarán en forma de iones metálicos libres.
Por otro lado la velocidad a la cual se alcanza el equilibrio tiene también una serie de orden decreciente de velocidades de acuerdo al ion:
Sr+2 > Ca+2 > Zn+2 >Mn+2 > Fe+2> Co+2> Mg+2> Ni+2.
De ambas consideraciones surge por ejemplo que cuando se alcanza el equilibrio el ion Ca +2 estará casi siempre libre para ser utilizado y si está complejado se hará rápidamente disponible; en cambio, el Mg+2 estará generalmente libre, pero si está complejado se hará disponible muy lentamente. En la misma forma se puede deducir que el Co+2 estará fundamentalmente en forma complejada siendo disponible además a muy baja velocidad. Por esa razón ese elemento es potencialmente limitante.
Concluyendo, es importante tener en cuenta la naturaleza de los compuestos orgánicos que tienen capacidad para actuar como ligandos y sobre todo el ion metálico considerado, ya que la concentración libre de éste es lo que interesa.
201
Capítulo 3
Son muy importantes también por su disponibilidad y costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc. También se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos como las vinazas de destilería, alpechín y residuos sulfíticos, que son sin embargo solamente útiles para procesos de producción de biomasa destinados al consumo animal, ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los microorganismos, también contienen muchas impurezas que impiden su utilización en otros procesos por las dificultades y costo elevado que presentan las operaciones de separación y purificación de los productos.
Las fuentes de nitrógeno de naturaleza inorgánica más comunes como el amoníaco o las sales de amonio. Las orgánicas están representadas por varios productos, como:
1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas) que son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes órganos y animales, pescado, caseína, gelatina, harina de soja, algodón, girasol, etc.. Mediante ajuste de la relación enzima-sustrato y variando tiempo de hidrólisis es posible variar el tamaño de la cadena de polipéptidos. Aparte de su función como fuente nitrogenada, las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgánicas como fosfatos y suministran también algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu. 2) Extracto de carne, que se obtiene por
extracción acuosa y concentración posterior variando su tipo de acuerdo con la calidad de carne, tiempo de extracción y temperatura de la misma.
3) Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autólisis o plasmólisis de la levadura, es básicamente una mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en H2O y carbohidratos.
4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada y
5) “Cornsteep”, el agua de maceración de la industria del maíz tiene mucha importancia por su utilización como componente esencial de los medios para la producción de varios antibióticos y enzimas.
También es importante la correcta elección de una determinada fuente cuando se presentan varias alternativas posibles, considerándose los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompañar a las distintas materias primas utilizadas.
2.1.5 Formulación
Ésta tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir, debe establecer las concentraciones de cada componente para ser utilizadas. Una aproximación con respecto a las cantidades por utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composición de biomasa del microorganismo al ser empleado. Una composición elemental y típica de la biomasa es (en porciento de peso seco): Carbono,
202202
Capítulo 3
46-48; Nitrógeno, 7-12; Fósforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%. Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada can-tidad de biomasa debemos promover las distintas fuentes que aseguren como mínimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados.
Por el conocimiento de la estequiometría de crecimiento y de formación del producto, es posible formular adecuadamente un medio. En general puedes escribir para cualquier proceso de fermentación:
Fuente de C + fuente de N + 0 2 + minerales + nutrientes específicos biomasa + productos + C02 + H20.
De la misma forma se pueden establecer balances de materia para otras reacciones que incluyan productos y deducir de las mismas la cantidad de biomasa y productos que se pueden obtener a partir de una determinada cantidad de fuentes de carbono y de nitrógeno. Las otras fuentes de ele-mentos menores y factores no son necesarias de incluir en las ecuaciones.
Con este criterio podemos establecer entonces que para obtener una determinada concentración de biomasa, por ejemplo 30 gl -1 , debemos formular el medio como mínimo con 60 gl -1 de fuentes de carbono asimilable, que es en el caso anterior la sacarosa. Con respecto a las fuentes de nitrógeno, ésta debe estar en concentración tal, como para satisfacer la ecuación anterior, que es 0.61 moles de NH3 o sea 10.37 g de amoníaco, lo que representa 8.54 g de N2. Ya tenemos por lo tanto, la cantidad de la otra fuente fundamental para ser agregada. El conocimiento de la composición centesimal de otros componentes menores puede establecer así las cantidades por agregar.
En este sentido, sabemos por otra parte que la levadura necesita para crecer algunas
vitaminas del grupo B como la biotina, tiamina, ácido pantoténico, etc. Esas vitaminas deben estar por lo tanto presentes en el medio. Como el proceso de producción de levadura es un proceso industrial que interesa desarrollar con costos de producción mínimos, es conveniente estudiar las fuentes de carbono, nitrógeno y de vitaminas y minerales más económicos y disponibles que podamos encontrar. Surge así la elección lógica de las melazas de caña de azúcar o de remolacha que reúnen la mayor parte de las condiciones. Del conocimiento del efecto Crabtree y para evitar la formación de alcohol y maximizar la producción de biomasa surge la necesidad de implementar una alimentación programada empleando melaza como sustrato limitante, de lo cual resulta la elección de un sistema de lotes alimentado para la producción.
203
Capítulo 3
Al conocer los coeficientes de rendimiento para la formación de biomasa y producto y los valores de la energía de mantenimiento será posible establecer también los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular un medio.
2.1.6 Optimización
Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimización de los medios de cultivo. Entre ellas podemos mencionar las siguientes:
1) No existencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de macro y microelementos para el cultivo del microorganismo determinado.
2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de micro-elementos y factores de crecimiento.
3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestión, que pue-den causar inhibición del crecimiento.
4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del creci-miento y formación del producto.
5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
La metodología más elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales se varía la concentración del componente por ensayar, manteniéndose cons-tante las concentraciones de los demás ingredientes. Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados. En este caso, se analiza el efecto de la variable escogida sobre la velocidad de creci-miento y la concentración de biomasa obtenida.
Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace falta una gran, cantidad de trabajo preliminar, ya que el operador no conoce de antema-no que nutriente es el limitante del crecimiento. Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes el método resulta poco práctico. Por otra parte, puede ocurrir que la respuesta obtenida al variar la concentración de un componente de los niveles de los otros, produzca interacción entre componentes. Se puede mejorar mucho la optimización en un lote empleando técnicas estadísticas o
204204
Capítulo 3
utilizando sistemas continuos con pulsos de componentes. Utilizando cultivos continuos es posible obtener un cultivo limitado por un sólo factor o sustrato a lo largo de todo el experimento, pudiéndose conocer por lo tanto el efecto que su variación ejerce sobre el cultivo al mantenerse los demás componentes constantes.
2.1.7 Esterilización Es conveniente, al tratar este tema, dar una definición clara del término y de otros relacionados, ya que a veces suelen producirse confusiones. Esterilización significa la eliminación de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios físicos, por ejemplo, filtración, o por muerte de los organismos por calor, productos químicos u otra vía.
Esta definición excluye por lo tanto cualquier técnica que resulte solamente en un daño a los microorganismos o atenuación de la actividad de cualquier tipo. La palabra desinfección se aplica a la remoción o destrucción por cualquier vía de organismos vivos que pueden causar daño particular o infección. No significa por lo tanto la destrucción de todos los microorganismos, sino solamente de aquellos que pueden producir un resultado no deseado.
Un antiséptico es un desinfectante, o sea un agente químico usado para destruir microorganismos dañinos. Se utiliza en general para agentes al ser aplicados en animales o humanos.
Asepsia es la exclusión continuada de microorganismos contaminantes. Así por ejemplo, el cultivo de microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo asépticamente como en muchas fermentaciones industriales. El medio de cultivo es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado con el cultivo requerido. Se dice entonces que el sistema se mantiene en condiciones asépticas.
Autoclave para esterilizar alimentos y otros productos
Esterilizador tipo Jané
205
Capítulo 3
Pasteurización es el término aplicado al proceso que se utiliza para la destrucción de algunos de los microorganismos posiblemente presentes en materiales sensibles al calor como la leche y cerveza. Consiste en calentar la leche, por ejemplo a 62 °C, mantenerla a esta temperatura 30 minutos y después enfriarla lo más rápidamente posible. Esta técnica no es de ninguna manera un procedimiento de esterilización. Es solamente un método para destruir organismos patógenos y al mismo tiempo disminuir el nivel de aquellos organismos que más pueden deteriorar la leche.
Fundamentalmente para efectuar la esterilización en Mi-crobiología Industrial es para evitar la competición por los nutrientes en medios de cultivo y permitir así que el cultivo de microorganismos específicos que se utilizan en un pro-ceso de fermentación de los rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos específicos.
Pasteurizador en acero inoxidable
Pasteurizador de placas para la industria de lácteos
206206
Capítulo 3
Métodos de esterilización
Los métodos de esterilización pueden ser de 3 tipos: a) Por destrucción total de microorganismosb) Por muerte o inactivación; yc) Por eliminación con medios físicos.
El proceso violento llamado destrucción total implica calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicación de una llama, que es lo que hacemos en el laboratorio cuando flameamos un ansa de platino o las bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto ésta metodología, aunque es efectiva, está muy restringida en su empleo.
La muerte o inactivación implica la eliminación de microorganismos sin que exista necesariamente desintegración de las células. Se puede efectuar por calentamiento, seco o húmedo, por radiaciones o por agentes químicos. El calor húmedo, generalmente en forma de vapor bajo presión, es muy útil y de gran valor en la esterilización en el laboratorio, que se efectúa en autoclave, o en la industria
207
Capítulo 3
2 Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Formular un medio para la producción de biomasa de levadura de panifica-ción. Considera la formación de 100 g de biomasa a partir de 200 g de sacarosa.
a)
b) ¿Cómo se lleva a cabo la esterilización de gases líquidos?
208208
Capítulo 3
209
Capítulo 3
Unidad 3 Productos producidos por fermentación3.1 RAP Conoce los productos producidos en la industria a través de los procesos de fermentación 3.1.1DiversidaddeproductosysuobtenciónLa gama de productos formados por los distintos tipos de microorganismos es sumamente amplia, desde moléculas muy simples como el etanol hasta las muy complejas, como pueden serlo una enzima o un antígeno.
Se pueden entonces clasificar los productos como:
1. Productos de bajo peso molecular. Estos incluyen a alcoholes, ácidos carboxílicos, aminoácidos, nucleótidos, antibióticos, etc.
2. Productos de alto peso molecular, los que a su vez pueden dividirse en:
2.1. Componentes estructurales: Polisacáridos, proteínas, antígenos, etc.
2.2. Enzimas: Pudiendo ser éstas intra o extracelulares.
La industria química “compite con los microorganismos” tan sólo en la obtención de algunos productos de bajo peso molecular, como por ejemplo, el etanol o el butanol, siendo los demás de dominio exclusivo de los microorganismos y, por otra parte, la única fuente disponible para el hombre.
Cualquiera que sea el producto que se desee obtener, son varios los aspectos que deben considerarse. Estos según Pirt, pueden resumirse como:
I. Selección de una cepa microbiana apropiada.
II. Determinación de los valores óptimos de temperatura, pH, presión osmótica.
210210
Capítulo 3
Figura1.Diversosproductosqueseobtienenporfermentación.
En procesos aerobios, además, es de fundamental importancia conocer el requerimiento de oxígeno a fin de poder satisfacerlo.
III. Determinación y optimización de los requerimientos nutricionales y de la concentración de biomasa.
IV. Modificación del genoma tendiente para incrementar la formación del producto deseado.
211
Capítulo 3
La formación de biomasa y de un producto son procesos contrapuestos aunque el producto es una consecuencia de la actividad de los microorganismos; luego la presencia de éstos también es importante.
Los productos de bajo peso molecular, se pueden clasificar según la función que cumplan dentro del metabolismo. Se pueden distinguir así tres grupos:
I. Productos finales del metabolismo energético. Son ejemplos de este grupo el etanol, ácido láctico, acético, butírico, butanol, y otros compuestos asociados a procesos anaerobios. Su
formación es consecuencia directa de la degradación de la fuente de carbono para obtener energía.
II. Productos intermedios de metabolismo primario. Pertenecen a este grupo los aminoácidos, los nucleótidos, las vitaminas, los ácidos orgánicos, y pueden incluirse también biopolímeros como enzimas.
III. Productos de metabolismo secundario. Pertenecen a este grupo los antibióticos, las toxinas, los alcaloides y las giberelinas
La obtención de los productos finales del metabolismo energético consiste en contar con una concentración celular elevada sometida a condiciones tales que el mantenimiento sea grande, lo cual puede lograrse, aumentando la tonicidad del medio y también modificando la temperatura. Existe otra alternativa que consiste en limitar el cultivo en nitrógeno, de modo tal que las células se vean impedidas de duplicarse al no poder sintetizar más componentes estructurales, y la fuente de carbono se derive, principalmente vía mantenimiento, hacia la formación del producto. Por ejemplo la obtención del etanol por levadura puede dividirse en dos etapas: en la primera el proceso es aerobio y el medio de cultivo contiene una relación de fuente de carbono a fuente de nitrógeno apropiada para obtener un buen crecimiento. La segunda etapa se realiza en condiciones anaerobias y en un medio con escasa concentración de fuente de nitrógeno y elevada concentración de fuente de carbono, la cual es convertida prácticamente en un 90% en etanol y C02. En este caso la tolerancia de la levadura al
Favorecer el metabolismo energético, especialmente el de los ácidos grasos a nivel del ciclo de Krebs
212212
Capítulo 3
etanol es un aspecto importante por considerar.
Los procesos de obtención de los productos intermedios de metabolismo primario son aerobios y la formación de estos productos ocurre principalmente en organismos que han sido sometidos a mutaciones o que se los hace crecer en medios deficientes. En cualquier caso, lo que se pretende es lograr una regulación anormal del metabolismo tal, que la fuente de carbono y energía se derive hacia la formación del producto deseado. Por ejemplo, para la obtención de lisina se emplean cepas de Corynebacteriuin glutamicum que carecen de la enzima Homoserina deshidrogenasa, de este modo resulta ser auxotrofo para metionina y Treonina. Además la enzima deshidroxipicolinato sintetasa no es inhibida por lisina. Ésta conjuntamente con la treonina ejerce inhibición concentrada sobre la Aspartatoquinasa de modo tal que aún en este mutante no se acumulará lisina si en el medio de cultivo hay treonina libre.
La estrategia para obtener lisina consiste en realizar el cultivo en condiciones tales que la concentración de treonina libre sea mínima, lo cual se consigue alimentando el cultivo con este aminoácido y tratando de mantener su concentración en valores muy pequeños. Así se evita la inhibición concertada, con lo cual la lisina, al no ejercer retroinhibición sobre la dihidroxipicolinato sintetasa, se acumula en el medio de cultivo.En general, y a diferencia de los productos pertenecientes al primer grupo, no existe una relación directa entre la generación de energía y la síntesis de los productos de este grupo. Volviendo al ejemplo de la lisina, por cada mol formado se forman cuatro de NADH y se consume uno de ATP, por lo que la formación de lisina está asociada en una formación neta de ATP si se tiene en cuenta el poder reductor acumulado.
La cinética de formación de estos productos es más compleja que los del grupo I, y no existe hasta el momento ninguna expresión simple que abarque a todos.
En los productos de metabolismo secundario, históricamente se han considerado a los metabolitos secundarios como aquellos que no son indispensables para las funciones vitales del microorganismo, a diferencia de los metabolitos primarios, aunque tal afirmación se encuentre actualmente en revisión. Cualquiera que sea el caso, existen algunas características que diferencian a este grupo del anterior.
213
Capítulo 3
Frecuentemente los precursores específicos para la biosíntesis de estos productos son obtenidos por modificación de metabolitos primarios. Así muchos antibióticos contienen en su molécula aminoácidos infrecuentes como D-aminoácidos, N-metil aminoácidos, B-aminoácidos o iminoácidos; o azúcares modificados, bajo la forma de dimetil aminoazúcares.Por otra parte, estos precursores suelen ser limitantes de la biosíntesis. Por ejemplo la adición al medio de cultivo de ácido fenil acético estimula la producción de Bencil penicilina, los ácidos a-aminobutírico y a,y-diaminobutírico son limitantes de la biosíntesis de colistina. En estos casos, la supresión de los mecanismos de regulación de la síntesis de los precursores puede resultar en un incremento en la producción.La característica de algunas enzimas del metabolismo secundario no poseen alta especificidad por el sustrato. Un ejemplo bien conocido es el de la penicilina aciltransferasa del Penicillican chrysogenum, que cataliza el intercambio del resto a-aminoadipil de la penicilina N (amino adipil penicilina), por restos acídicos hidrofóbicos (ver Figura. 14). La enzima es específica para uno de los sustratos, el ácido 6-amino-penicilánico, mientras que es relativamente inespecífica para el precursor de la cadena lateral, el cual debe poseer el grupo -CH2- COOH terminal para ser incorporado.
Por último, la mayoría de los productos de este grupo comparten la propiedad de formarse cuando los microorganismos crecen a bajos valores de velocidad. Se cree que una de las causas sería el fenómeno conocido como represión catabólica ya comentado, por el cual estaría reprimida la biosíntesis de las enzimas asociadas al metabolismo secundario cuando el crecimiento ocurre a valores de velocidad altos, mientras que dejaría de reprimirse a valores de velocidad bajos.
Por años, se utilizó lactosa como fuente carbonada para la obtención de penicilina porque daba mejores rendimientos que la glucosa. La diferencia radicaba en que la lactosa era metabolizada lentamente por el hongo, y la glucosa rápidamente.
Ésta última como fuente carbonada, pero suministrándola lentamente al cultivo a fin de regular u a valores compatibles con la síntesis de penicilina. En caso de los productos del grupo III comparten con el anterior la necesidad de un adecuado suministro de oxígeno para su formación. Cuando este requisito no es satisfecho los rendimientos disminuyen.
214214
Capítulo 3
Haz un esquema de la biosíntesis de la lisina, empleando cepas de Corynebac-teriuin glutamicum
es 3 y 4 Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
215
Capítulo 3
Indica algunas fórmulas genéricas de las penicilinas que se usan más frecuentemente en el mercado. __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
216216
Capítulo 3
Indica ¿cómo es el proceso de obtención de la penicilina a partir del Penicillican chrysogenum?
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
5Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
217
Capítulo 3
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
218218
Capítulo 3
- 1 litro de leche- 3 cucharadas de yogur (entero o descremado)- 6 cucharadas de azúcar- Termómetro- Tiras para medir el pH.
Equipo y material
Procedimiento
1. Se colocan en un recipiente la leche con el azúcar.2. Medir el pH y anotar.3. Calentar (sin llegar a hervir) durante 5 minutos. Luego, dejar enfriar hasta los 45°C aproximadamente y agregar el resto de los ingredientes (yogur, gotas de vainilla). Mezclar bien y colocar en un termo.4. Dejar reposar durante 7 a 8 horas.. Cumplidas las horas establecidas, se obtendrán 10 vasos de yogur.6. Medir nuevamente el pH7. Colocar de inmediato en la heladera.
La sesión tendrá una duración de cuatro horas, y se de-berá tomar nota de todos los datos que se consideren importantes e interesantes.
Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
1
219
Capítulo 3
Cuestionario de la práctica
1) ¿Cuál será el objetivo de utilizar una cucharada de yogur en la elabora-ción casera de este producto? ¿Con qué etapa de la elaboración industrial se podría comparar?
2) ¿Qué función cumplirá el azúcar adicionado a la leche?
3) ¿Qué diferencias se observan de pH durante la experiencia? ¿A qué se deben?
4) ¿Por qué en esta experiencia no se realiza la etapa de calentamiento a 90°C, pero sí se incuba a 45°C?
220220
Capítulo 3
221
Capítulo 3
Unidad 4 Organismos mutantes
4.1 RAP Conoce la variedad y posibilidades de las mutaciones de los organismos y su utilidad en la industria
En general los organismos aislados de la naturaleza productores de meta-bolitos de interés industrial producen a los mismos en niveles muy bajos; por lo tanto, se hace necesario incrementar estos rendimientos para lograr una mayor rentabilidad de los procesos.
Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimización del me-dio de cultivo y de las condiciones de operación, pero esto está limitado por la capacidad de síntesis máxima del producto deseado que tiene el organismo. La otra posibilidad es el mejoramiento genético de la cepa.
En un organismo la productividad potencial es controlada por su genoma, pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendimientos. La forma de reexaminar un organismo modificado; son las condiciones del cultivo para lograr nuevamente la máxima productividad. Entonces los pro-gramas de desarrollo involucran una continua modificación genética del microorganismo, seguida por una readaptación del medio de cultivo a los nuevos requerimientos, mejoras de las condiciones de operación y también de los procesos de extracción y purificación.
La obtención de cepas modificadas genéticamente se puede realizar por:
1) Selección natural de variantes, 2) Mutación inducida, y 3) Recombinación genética.
222222
Capítulo 3
4.1.1Selecciónnatural
Siempre se debe tener en cuenta que en cada división celular hay una pequeña probabilidad de que ocurra un cambio genético, por lo cual no es sorprendente que en una gran masa celular la población sea hete-rogénea. Esta distribución puede presentar problemas de rendimientos debido a que en general las variantes tienen menores niveles de producción que la población parental. Estas variaciones definitivas (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones fenotípicas que de-penden de las condiciones ambientales y que tienen lugar en todas las células de la población que expre-san la misma modificación fisiológica, dentro de las va-riaciones permitidas por su genotipo. En las mutaciones espontáneas el elemento responsable de la mutación no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor mutagénico se conoce) son estables y hereditarias y tienen una frecuencia estadísticamente medible (tasa de mutación).
La frecuencia de éstas últimas varía entre 10 -6 a 10 -9 mutaciones por genoma y por generación. Por lo tanto si se considera un valor de 10 -7 se deberá es-tudiar un gran número de organismos (> 10 7 ) en la búsqueda del tipo deseado.
En la selección de variantes naturales, una práctica que todavía es utilizada se refiere a la observación de las características morfológicas de las colonias, las cuales, en manos de un operador avezado, se asocian con mayor o menor productividad, lo que permite se-leccionar y posteriormente estudiar los clones aislados.
Estas investigaciones involucran una etapa de creci-miento seguida por ensayos de evaluación del produc-to. Siendo más adecuado realizar las experiencias en Erlenmeyers de hasta 500 ml, ya que si bien demanda una considerable mano de obra, los resultados de en-
223
Capítulo 3
sayos en tubos o pequeños frascos son menos confiables.
A veces es posible el diseño de un procedimiento simple de “screening” selectivo para un tipo particular de mutantes. Por ejemplo, células no mu-tadas que mueren en un plaqueo por selección de mutantes resistentes a drogas, metales, etc. En estas condiciones se aíslan mutantes con un esfuerzo mínimo aún de poblaciones donde la tasa de mutación es menor a 1’000,000.
Cuando se comparan los aumentos en los rendimientos de cepas obte-nidas por mutaciones naturales como las que resultan del empleo de un agente tal como la luz ultravioleta, se observa, en general, que con agen-tes como el mencionado, los incrementos en productividad son superiores y con una mayor tasa de mutación.
Las designaciones de las di-versas partes que aparecen en la ilustración muestran la mutación del microorganis-mo, obtenida y adaptada por el Grupo de NanomáquinasProtónicas (Protonic Nano-Machine Group) de la Uni-versidaddeOsaka.
224224
Capítulo 3
4.1.2 Mutación inducida
Este procedimiento es mediante el empleo de un agente determi-nado que implica dos etapas, el tratamiento de la población con el mutágeno elegido y luego el ais-lamiento de los mutantes para su posterior ensayo y selección. Empí-ricamente el empleo de diferentes agentes resulta en el aislamiento de distintos “espectros” de mutan-
tes. La elección de un agente mutagénico depende en general de consideraciones prácticas. En algunos de los casos es más conveniente el empleo de más de uno en lugar del uso masivo de uno solo. La técnica por emplear puede producir una alta tasa de mutación o puede favorecer la separación de un nú-mero reducido de tipos deseables de un gran número de pro-ductores mediocres. Hasta donde sea posible el aislamiento del mutante debería utilizar la característica mejorada del mismo como factor de selección. El incremento de su productividad podría ser el resultado de una modificación en los mecanismos de control que limitan el nivel de producción y/o de una va-riación en los precursores que llevan al producto. Por lo que el conocimiento de las rutas y mecanismos de control de la biosíntesis de un producto facilitan la estrategia por seguir en el aislamiento. En los programas de búsqueda y selección, es importante tener una alta proporción de mutantes entre la po-blación sobreviviente al tratamiento, debido a que sólo estos individuos son los estudiados. Con el incremento de la dosis del mutágeno en general se incrementa esta proporción, aunque para cada mutágeno y cada organismo hay una dosis óptima. Los agentes mutagénicos pueden ser agrupados en:
1) Físicos, como la luz ultravioleta, que es un mutágeno muy conveniente. La longitud de onda puede variar de 200 a 300 nm y el tiempo de exposición entre 0.5 y 20 minutos, depen-diendo de la sensibilidad del organismo y tratando de lograr un porcentaje de muerte entre el 90 y 99.9%. Otros agentes como rayos X y rayos V son actualmente poco utilizados.
Transición inducida por etilmetanosulfonato.
225
Capítulo 3
4.1.3 Mutantes con niveles mejora-dos de metabolitos primarios
Metabolitos primarios son aquellos esencia-les para la vida de un microorganismo como por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, vita-minas, ácidos orgánicos. Antes de conside-rar la selección de este tipo de mutantes, es necesario conocer los mecanismos de control involucrados en la biosíntesis de es-tos metabolitos. Las concentraciones de los mismos están reguladas por sistemas de control por retroalimentación “feed back”. Los dos principales sistemas involucrados son inhibición y represión “feed back”.
En el sistema de la inhibición, el producto final de una vía metabólica inhibe la acti-
vidad de una enzima (normalmente la primera) de su vía de formación, cuando se ha sobrepasado un valor máximo de concentración intracelular de dicho producto (caso de biosíntesis de aminoácidos). La primera enzima de la vía es de tipo “alostérica”, lo que significa que en este caso el producto final se une a ella en el centro regulador (no compite con el sustrato por el centro activo, como en la llamada inhibición competitiva), afectando la unión de la enzima al sustrato. Es un control fino y casi instantáneo.
En el sistema de la represión es aquel donde el producto final de una vía metabólica previene la síntesis de una enzima o de todas las que catalizan la vía mencionada. Esto ocurre en el nivel de ácido desoxirribonucleico (ADN), impidiendo la transcripción del gen a ácido ribonucleico mensajero (ARNm). Este mecanismo es de acción más lenta que el anterior, ya que permite actuar a las enzimas preformadas. Los mecanismos de regulación son más complejos en caso de vías biosintéticas ramificadas donde los productos de cada brazo son raramente requeridos por el organismo en igual pro-porción. Los procesos de control de estos son los siguientes:
a) isoenzimas b) concertado o multivalente c) cooperativo d) acumulativo e) secuencial.
Representación esquemática de la síntesis de los meta-bolitosprincipalesproducidosporS.cerevisiaeduran-te la fermentación alcohólica
226226
Capítulo 3
debido a que los esporos germinados por su mayor tamaño son retenidos en el filtro.
Los mutantes auxotróficos se utilizan para producir grandes cantidades de muchas sustancias de interés, los mismos no son adecuados para la obtención de productos que controlan independientemente su sín-tesis. Un caso típico es el que figura a continuación, donde se sintetiza un producto P.Las letras minúsculas indican las enzimas que intervie-nen en el proceso. En este caso si P es el producto requerido, no es apropiado tener un auxótrofo. La so-lución es modificar el organismo de tal forma que la primera enzima (a) no reconozca la presencia de nive-les inhibidores de P. El aislamiento de tales mutantes se puede alcanzar a partir de mutantes resistentes a metabolitos análogos y/o de revertantes.
Cuando metabolitos análogos (compuestos similares a otros en su estructura) han ampliado el rango de inhi-bidores, se obtienen mutantes resistentes.
En el aislamiento de este tipo de mutantes se puede emplear la técnica de gradiente en placa, en la cual existe una variación en la concentración del análogo en un sentido de la placa, presentando la misma, zo-nas de escaso crecimiento por altos niveles del análo-go tóxico desde donde es posible aislar los mutantes resistentes, para posteriormente ser estudiados en re-lación con la producción de un producto P.
Existe posibilidad de mejorar los rendimientos de este tipo de productos es el empleo de revertantes. En este caso, un mutante auxotrófico para P (no produce la enzima “a”) es sometido a una segunda mutación con el objeto de obtener revertantes que elaboran el pro-ducto final en mayores niveles (la enzima “a” producida no reconoce en control de P).
227
Capítulo 3
4.1.4 Mutantes productores de enzimas de inte-rés industrial
Se toman en cuenta las enzimas degradativas, cuya pro-ducción puede ser controlada por inducción, represión “feed back” y/o represión catabólica.
Cuando pretenden alterar los mecanismos de inductor y aún en presencia de represores, a esto le llamamos técnica de mutación. Éstas pueden tener lugar en un gen regulador, eliminando la producción de un represor activo, o si se producen en el operador, se podría evitar la unión del represor. Cuando se producen enzimas in-ducibles en ausencia de inductor se denominan mutantes constitutivos. Los mismos pueden ser aislados a partir de un cultivo continuo en el cual el sustrato inductor esté en concentraciones limitantes, lo cual favorece el desarrollo de los mutantes constitutivos sobre la población induci-ble; empleando inductores débiles o utilizando ciclos con y sin inductor, tratando de favorecer el enriquecimiento en la población del mutante constitutivo, ya que al trans-ferir a un medio con inductor, el tipo inducible requiere un tiempo de inducción que no lo requiere el constitutivo.
Para la selección de mutantes resistentes a la represión catabólica pueden aprovecharse las posibilidades del sis-tema continuo empleando un medio de cultivo con el sustrato de la enzima y el represor catabólico. En estas condiciones, el organismo capaz de emplear ambos sus
Mutantes resistentes a análogos de aminoácidos han sido empleados en procesos de mejoramiento de cepas, para la obtención de antibióticos. Uno de los mejores ejemplos de mutantes modificados en la permeabi-lidad es el caso de la fermentación de ácido glutámico. Se ha aislado un mutante de Corynebacterium glutamicum, cuya permeabilidad puede ser modificada por el nivel de biotina. O sea la permeabilidad celular es controlada por la composición del medio de cultivo; en esta forma el organismo puede excretar glutamato (50 g) con bajas concentraciones de biotina (5 µg). Esto sugiere la posibilidad de modificar genéticamente la permeabilidad celular para incrementar la productividad.
228228
Capítulo 3
4.1.5 Mutantes con mejores rendimientos de metabolitos se-cundarios
Las sustancias como los metabolitos secundarios no imprescindibles para las funciones vitales, como por ejemplo alcaloides, toxinas, antibióticos, gibereli-nas, etc. La relación entre metabolito primario y secundario presenta todavía numerosos interrogantes en relación con los mecanismos que controlan la síntesis de estos últimos. En ciertas fermentaciones de antibióticos la velocidad de crecimiento regula la formación de enzimas biosintéticas. En el caso de la gramicidina S (GS), las GS sintetasas se forman en la última parte de la fase de crecimiento exponencial. Las enzimas, después de alcanzar un pico en sus ac-tividades específicas, desaparecen rápidamente al entrar la población en fase estacionaria. Los estudios de este producto en cultivo continuo permitieron establecer una
La glucosa y la fuente de nitrógeno (en especial amonio) si es rápidamente metabolizada ejerce represión catabólica. Un ejemplo es la producción de ca-falosporinas por Streptomyces clavuligerus, la cual es suprimida por amonio. Debido a que la producción de estos metabolitos es afectada por mecanismos de control genéticamente determinados, las mutaciones pueden tener efectos importantes en el mejoramiento de cepas. Los programas iniciales en la in-dustria de antibióticos inducían mutaciones sobre células o esporos mediante el empleo de agentes físicos y químicos. Si uno repasa el caso típico de la penicilina en el cual las primeras cepas de Penicill um chrysogenum producían alrededor de 20 unidades por ml ,(20 U /ml), se observa que las técnicas de mutación clásica han permitido obtener mutantes adecuados para la aplicación posterior de técnicas más recientes como la fusión de protoplastos y las de clonaje de genes. En general, en un programa de mejoramiento, en que los saltos en la producción al inicio del programa son importantes, después la selección de mutantes super productores se vuelve cada vez más difícil. Con referencia a los estudios de “screening” en placas, un factor importante es la composición del medio sólido para lograr que la cepa pueda expresar toda su capacidad productora. En al-gunos casos las condiciones de limitaciones de nutrientes, que favorecen el
tratos tendría una ventaja competitiva y podría ser selec-cionado a una determinada velocidad de dilución.
229
Capítulo 3
comienzo de la producción de antibióticos en medio líquido no son alcan-zadas en medio sólido; sin embargo, esto se puede corregir suprimiendo la principal fuente de carbono y reduciendo, por ejemplo, el contenido de agua de macerado de maíz, como en el caso de penicilina.
Con base en la experiencia adquirida en el curso de los trabajos de mutagénesis-selección, establecer una correlación entre los caracteres fisiológicos o bioquímicos y la producción del microorganismo, en este sentido pueden a veces intervenir en la selección en medios sólidos cri-terios morfológicos, pigmentación de colonias, resistencia al antibiótico producido, etc.
4.1.6 Recombinación genéticaPara la amejora de una cepa industrial empleando técnicas de mutagéne-sis selección conduce a la creación de líneas divergentes. Una forma más lógica en tal programa de mejoramiento sería reagrupar las potencialida-des de distintas variantes con el objeto de seleccionar la mejor combi-nación de genes responsables de codificar la producción de determinado metabolito.Los trabajos de Hopwood (1977) muestran que es posible lograr la re-combinación genética, definiendo por tal a cualquier proceso que genere nuevas combinaciones de genes los cuales estaban originalmente en indi-viduos diferentes. Todos los procesos no meióticos en células vegetativas que llevan a recombinación son llamados parasexuales y aparecen, tanto en organismos procariotes como eucariotes.Pueden intercambiar los virus material genético entre cepas heterogénicas después de una infección mixta en el mismo huésped. El fenómeno de recombinación en bacterias se observa en: 1) conjugación, en donde la transferencia de material genético se realiza a través de pilis, teniendo algunas características de un proceso sexual; 2) transducción, en el que la transferencia de ADN de una célula a otra se realiza mediante una partícula viral que actúa como vector; y 3) transformación, donde la re-combinación puede ocurrir después de la inserción experimental de un ADN aislado, a una bacteria receptora.El material genético entre diferentes especies puede intercambiarse tam-bién alcanzando la fusión celular. En este caso, lo primero es la prepa-ración de protoplastos, los cuales son células que han perdido su pared celular externa y son limitadas solamente por su membrana, sometiendo una suspensión celular a la acción de enzimas degradativas de la pared
230230
Capítulo 3
(lisozima) en un medio isotónico, para minimizar la ruptura por efectos osmóticos. Los protoplastos de los cultivos que se desea fusionar, son mezclados y fusionados en presencia de un agente inductor (polietilen-glicol 50%) y de dimetil sulfóxido en algunos casos, luego de lo cual se siembran rápidamente en un medio completo para regenerar las células. La incubación de protoplastos resulta en regeneración de la pared celular y reversión a una célula de morfología normal, lo cual es una propiedad crítica, ya que después de la fusión se desea recuperar un organismo, el cual pueda ser cultivado normalmente en pequeña y gran escala. La fusión celular es seguida por fusión nuclear.
La técnica de fusión celular se emplea en la obtención de hibridomas que son células que se obtienen por fusión de linfocitos con células de mieloma (cáncer de piel) de ratón u otro animal. Cada célula de hibrido-ma sintetiza una sola especie molecular de anticuerpo. El cultivo de este tipo de células produce anticuerpos monoclonales, los cuales tienen una enorme importancia en reactivos de diagnóstico, en la purificación de mo-léculas por su alta afinidad específica y como vectores de drogas u otros reactivos para combatir tumores.
4.1.7 Obtención de nuevas cepas por ingeniería genéticaLa unión entre las técnicas bioquímicas (1970) para manipular el ADN in vitro con las técnicas genéticas para transferir el ADN de una célula a otra, es la nueva metodología resultante conocida con el nombre de ingeniería genética que ha revolucionado el campo específico de la Biotecnología.
Por medio del procedimiento de clonado de ADN, genes de cualquier tipo pueden ser tomados de su ambiente natural, analizados, alterados y reinsertados en el mismo tipo de organismo o en otro diferente. Así que la producción de solventes, productos químicos, hormonas, antígenos, enzimas y otras sustancias de interés farmacológico puede realizarse en grandes cantidades, a través del clonado de genes específicos en organismos que pueden ser desarrollados en escala industrial. En una fermentación, su éxito se da con base en el incremento del rendimiento de un producto; aumentar su velocidad de formación, eliminar productos indeseables o la inhibición por un producto final, se puede alcanzar, al menos en principio, mediante el empleo de técnicas genéticas y estrategias que involucran metodología de ADN recombinante in vitro. Esta metodología ha contribuído además al conocimiento de las funciones del ADN, a la organización de los genes, a la regulación de la expresión y a la estructura primaria de proteínas.
231
Capítulo 3
El principal aspecto del clonado es la propagación de un fragmento determinado de ADN en una línea celular en crecimiento. Este fragmento, para poder propagarse, debe ser unido a una molécula transportadora o vector, el cual sí es capaz de multiplicarse en el huésped.
El clonado de genes ha sido gracias a una serie de descubrimientos fundamentales. Como la puesta en evidencia de enzimas denominadas endonucleasas de restricción, las cuales reconocen y cortan el ADN en sitios bien definidos, generando fragmentos de distintos tamaños, determinados por la distancia que separa cada sitio de restricción ubicado al azar sobre el genoma.
Entonces es necesario hablar de distintos tipos de enzimas de restricción. Las de tipo II, catalizan la ruptura de dobles hebras en sitios donde reconocen secuencias de 4 o 6 bases de longitud. Se ha encontrado que los sitios de reconocimiento se leen igual en ambas hebras de ADN. En algunos casos la ruptura del ADN se produce en sitios opuestos de las dos hebras rindiendo fragmentos romos (Hae III), mientras que en otras ocasiones la ruptura se produce en forma de escalones, dejando extremos “cohesivos” (Eco RI). En todos los casos la enzima hidroliza enlaces fosfo-diester en el lado 3’ dejando extremos libres 3’ -OH y 5’ -fosfatos. Los extremos romos resultantes de un corte pueden transformarse en cohesivos añadiendo a los extremos 3’, nucleótidos (poli “A” a uno y poli “T” al otro) por acción de una transferasa terminal.
Clononado de genes a través de enzimas endonucleasas de restricción
232232
Capítulo 3
es 6, 7 y 8Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Hacer un esquema empleando dos técnicas de selección al azar, de mutantes obtenidos des-pués de un tratamiento.
233
Capítulo 3
Uno de los avances fundamentales en la In-geniería Genética fue el descubrimiento de enzimas que pueden unir extremos libres de hebrasdeADN.
¿Cómo pueden ser ligadas moléculas separa-dasdeADNdedoblehebra?
¿Qué se requiere para la transferencia y ex-presión de un ADN “extraño” en una célulahuésped?
234234
Capítulo 3
235
Capítulo 3
Unidad 5 Métodos de conservación y preserva-ción de cepas microbianas
5.1 RAP Conoce y maneja los métodos de conservación y preservación de cepas microbianas
Los métodos de conservación y preservación de microorganismos, se llevan a cabo por la importancia que tienen estos microorganismos para la sociedad; se expone la importancia de los microorganismos para la sociedad, los obje-tivos de un buen método de preservación y los criterios por considerar para la elección de la(s) técnica(s) más apropiada(s).
5.1.1 Métodos de elección o de conservación a largo, mediano y corto plazo
Desde la antigüedad los microorganismos han sido empleados como mate-riales esenciales de trabajo en la obtención de medicamentos (antibióticos, vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebi-das y licores) y fabricación de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El aumento en el uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la protección medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cul-tivos microbianos, de manera que las propiedades que los hacen importantes permanezcan estables.
No es tarea fácil la preservación de cepas microbianas, ya que deben garan-tizar la viabilidad, pureza y estabilidad genética de los cultivos, características que coinciden con los objetivos de un buen método de conservación. El co-nocimiento de las peculiaridades de estas técnicas de preservación existentes para su correcta aplicación, así como el seguimiento de las propiedades de las cepas, propician su empleo como inóculo confiable en la industria, la do-cencia y la investigación.
Muy a menudo la elección de la técnica más adecuada para conservar culti-vos microbianos resulta difícil, pues deben tomarse en consideración los cri-terios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genéticos, número
236236
Capítulo 3
y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, así como la frecuencia del uso de los cultivos.
El método que se elija debe garantizar la supervivencia de al menos el 70 % de las células por un período considerable de tiempo, de forma tal que la población sobreviviente se asemeje a la original como sea posible, conserve las propiedades de importancia de los cultivos y minimice la ocurrencia de los eventos genéticos. De igual manera debe reducir al mínimo el riesgo de contaminación y permitir que la pureza del cultivo permanezca inalterable.
En relación con el número y valor de los cultivos, debe considerarse el tiempo para ser empledo por los curadores en la preservación inicial, manipulación y control periódico de las cepas, el espacio de almacenamiento disponible y su importancia, al ser empleadas en su mayoría como materiales de referencia en el aseguramiento de la calidad microbiológica. Es recomendable entonces la selección de al menos 2 métodos de conservación que brinden seguridad y reduzcan los riesgos de pérdida durante el almacenamiento.
En cuanto al costo de la conservación de cepas se incluyen los costos de personal, equipos y su mantenimiento, materiales y facilidades generales (almacenamiento y poder de abastecimiento). A esto se le suma la distribución, para la cual se necesitarán réplicas conservadas y empaquetadas convenientemente que permitan la llegada al lugar de destino en las mejores condiciones. Los microorganismos son enviados por varios medios: correo aéreo, postal o a través de las manos, de un laboratorio a otro dentro de un mismo país y con frecuencia a través de las fronteras o continentes. Su distribución y manipulación está regulada en el ámbito internacional y nacional, y para su transportación es necesario el uso del “triple” empaque para asegurar que todo el personal involucrado en este proceso esté protegido de la exposición a cualquier agente contenido en el envase. Algunos cultivos son empleados como cepas controles, cepas de ensayo, cepas de producción industrial
Colocación de cajas Petri den-tro de la estufa la cual se man-tiene a temperatura constante para el control de cepas donde se ubican cepas de ensayo y cepas de producción indus-trial.
237
Capítulo 3
y pueden ser utilizadas frecuentemente en un laboratorio. En estos casos, la facilidad del recobrado y el riesgo de contaminación de los cultivos necesitan ser considerados.
Se encuentran disponibles variadas técnicas para la conservación de microorganismos y para eso debe considerarse lo recomendado por la Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC, siglas en inglés), en sus guías generales, la cual enuncia que por seguridad y para minimizar la probabilidad de pérdida de las cepas, cada una debe ser mantenida por al menos 2 procedimientos diferentes. En general, existen 3 categorías en las que se agrupan los métodos de preservación, según el tiempo en que permanecen viables las células conservadas, que son los métodos de conservación a largo, mediano y corto plazos.
Una de las categorías es la congelación (a –70 °C y –196 °C) y la liofilización como técnicas que minimizan al máximo el riesgo de cambio genético en las células y las mantienen viables por 10 años o más, ventajas que han condicionado su extensa utilización para conservar disímiles materiales biológicos (cultivos de hongos, bacterias y levaduras, algas, suero, células sanguíneas, entre otros) y que sean reconocidas como técnicas de elección. Su costo es alto por los equipos que emplean estos métodos, dificulta su implementación en muchas instituciones, las que en ocasiones hacen uso del servicio de mantenimiento y conservación mediante estos, los cuales brindan colecciones de cultivos reconocidas.
Las de mediano plazo, son las técnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los cultivos entre 2 y 5 años. En este grupo se destacan: la desecación en diferentes soportes (arena, sílica gel, perlas de vidrio) donde la paralización del crecimiento se produce por eliminación del agua disponible), el almacenamiento en tierra, parafina líquida y la suspensión en agua estéril (destilada o de mar), métodos bien documentados en especial para los hongos.
En el caso de la resiembra periódica, ésta permite la supervivencia de los cultivos en cortos períodos de tiempo, por eso se reconoce como un método de conservación a corto plazo. En ésta transfiere el cultivo del medio seco a uno fresco proporcionándole las condiciones óptimas de crecimiento, lo que condiciona el elevado riesgo de contaminación y variabilidad de las características de las cepas, las cuales constituyen sus principales desventajas.
238238
Capítulo 3
a). Conservación por transferencia periódica. Se guarda la cepa microbiana en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. No es el mejor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus características. Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inóculo; rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido y origina productos generalmente tóxicos; y almacenando los cultivos a 4ºC - 8ºC. A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que podría ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los hongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es
5.1.2 Métodos alternativos
Se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los equipos necesarios o porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por estos métodos. Se recomienda tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que es mejor conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.
239
Capítulo 3
que la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos.
b). Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.
Es un método alternativo y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Aquí se suspenden en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se prepara en criotubos donde la concentración celular no debe ser superior a 104 - 105 células/ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en agua de mar diluida.Los resultados obtenidos en la conservación de microorganismos por este método muestran altos porcentajes de viabilidad en períodos a veces superiores a 5 años. La estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es buena, pero no se ha comprobado para caracteres específicos como la virulencia, el poder fermentativo, etc.
240240
Capítulo 3
Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
2
Determinar la influencia de la actividad del agua, pH y temperatura en el cre-cimiento de aspergillus penicillioides y a. Terreus aislados de la carne seca y salada de atún listado (katsuwonus pelamis).
Para la realización de esta práctica se utilizan dos especies de hongos perte-necientes al género Aspergillus, identificados como A.penicillioides y A.terreus, ambos mohos se escogieron por su predominancia y efecto de deterioro en la carne seco-salada del atún listado (Katsuwonus pelamis), Para su aislamiento se emplean como medio de cultivo el agar MEA (Malt Estract Agar, Merck) con 20% de sacarosa y NaCl (5%) y Potato Dextrosa Agar (PDA, Merck) acidificado con 2 gotas de ácido tartárico al 10%. A todos los medios se les determina la aw, empleándose un medidor del punto de rocío (Decagon, cx-2) previamente calibrado con una batería de soluciones salinas saturadas.
Identificación de los hongos
Conservación de las cepas aisladas
Se efectúa a partir de cultivos puros, utilizándose como medios Agar Czapek, Agar DG 18 (Dichloran 18% Glicerol Agar, para especies xerofílicas) y PDA acidificado. Se reali-zan montajes húmedos y microcultivos. Para la identifica-ción hasta el nivel de especie se deben considerar en forma minuciosa las características macroscópicas de cada uno de los hongos.
Las cepas de mohos aisladas se pue-den resembrar en tubos de ensayos con el medio PDA inclinado con adi-ción de 20% de sacarosa y NaCl al 5%. Se deben incubar a 25°/± 1°C hasta la aparición de colonias bien formadas y se conservan en refrigeración a 5°C ± 1°C hasta su posterior utilización.
241
Capítulo 3
En las siguientes figuras se tiene en A) se tiene la colonia de aspergillus peni-cillioides, y en B) se tiene la morfo-logía microscópica típica mostrando la cabeza conidial columnar uniseriada las demás figuras muestran cómo se desarrolla el aspergillus penicillioides en medios de cultivo en cajas Petri.
Aspergillus Penicillioides
242242
Capítulo 3
5.1.3 Métodos restringidos
No son los más empleados, pero a los que es necesario recurrir para conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro métodos que vamos a citar se basan en la paralización del crecimiento por eliminación del agua disponible para las células.
a).- Desecación en papel de filtro.
Se usa un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una solución muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles). Hay posibilidad de desecarlos por el procedimiento que se llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelación incontrolada de las células.
b).- Desecación en suelo, arena, sílica - gel, etc.
Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método.
c).- Desecación en bolitas de alginato.
. Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua, lo cual resulta ser bastante eficaz. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato. Se está utilizando incluso para la conservación de algas y células vegetales.
243
Capítulo 3
d).- Desecación en cloruro de sodio de cristal grueso para halobacterias.
Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se dejan desecar espontáneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible.
5.1.4 Consideraciones generales en la conservación de cepas
Cualquiera que haya sido el método empleado en la conservación de las cepas microbianas, cuando éstas se recuperan para hacer nuevos lotes para su conservación o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente las células que se han estado guardando, porque éstas vienen de una situación de estrés más o menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por liofilización) y por lo tanto no son adecuadas para ningún tipo de prueba. Primero habría que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrándolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo más posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivándolas en medios selectivos cuando sea necesario. Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme diversidad microbiana, cada microorganismo soportará determinados métodos de conservación mejor que otros, o será necesario tomar precauciones especiales en su conservación. Como ya dijimos al comienzo, no existe un método general de conservación de los microorganismos, aunque no resulta difícil determinar el más aconsejable en cada caso. La mayoría de microorganismos de interés sanitario pueden conservarse a largo plazo con los métodos generales de congelación y/o liofilización, y para períodos cortos pueden mantenerse vivos por alguno de los métodos alternativos si se hace en las condiciones adecuadas y bien controlados por un microbiólogo.
Por último, es frecuente encontrar que una técnica de preservación resulte más efectiva para un grupo microbiano que para otro, lo que indica que además de considerar los aspectos anteriores es necesario revisar la literatura disponible sobre los microorganismos en cuestión y las alternativas de mantenimiento utilizadas, y adecuarlas a la situación real de la organización. Podemos entonces resaltar que no existe una técnica universal para conservar adecuadamente todos los microorganismos.
244244
Capítulo 3
Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
3
Primera etapa Selección de los Microorganismos:Las cepas microbianas se seleccionan de ban-co de cepas y genes, conservadas por el mé-todo de criopreservación a -70°C, y a 4°C en condiciones de liofilización y papel filtro. Identificación de los microorganismos: En esta primera etapa se efectúa una iden-tificación de los microorganismos del banco, los cuales se estratifican según el método y la temperatura de conservación. Debido a la gran cantidad de cepas de Escherichia coli, este género se debe separar de la familia En-terobacteriaceae para facilitar el análisis de los resultados.
Segunda etapa Recuperación de los microorganismos: Se lleva a cabo una recuperación de los micro-organismos, teniendo en cuenta el esquema propuesto por Espitia y Díaz. Para la recupe-ración de los microorganismos conservados a 4°C, los viales fueron rehidratados con 1.5 ml de un caldo BHI (Brain Heat Infusión Oxoid Ò)
asépticamente durante treinta minutos; poste-riormente se dispensan 0.5ml de la suspensión en 5 ml de caldo BHI y se incubaron a 37°C por 24 h. En el caso de las cepas conservadas a -70°C, los viales se descongelan lentamente y se mantienen en baño de hielo, para tomar 0.1ml del cultivo e inocularlo en 5 ml de Caldo BHI, y luego se incuba a 37°C por 24 h.
Comparación de dos métodos de conservación de cepas
Materiales y métodos
Para llevar a cabo esta práctica se utilizarán cepas de las familias de Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae para ser conservadas por los métodos de semistock en papel filtro y el método stock de criopreservación. La eficacia de los métodos de preservación se realiza mediante la evaluación de la viabilidad a las 24 horas de conservación y se calcula el porcentaje de recuperación. En conclusión, la preservación en papel filtro y criopreservación son métodos adecuados; ya que el 73.7% de los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae y el 82.3% de los microorganismos de la familia Pseudomonadaceae, presentaron un porcentaje de recuperación mayor al 50%.
Muestra un camino con sus ramificaciones para llegar a un destino Esque-madeEspitiayDíaz (víaspecuarias).
245
Capítulo 3
Tercera etapa Con el fin de observar las características macro y microscópicas, los cultivos se siembran en Agar BHI, e incubados a 37°C por 24h. Para descartar posibles contaminaciones se realizan repiques sucesivos de la colonia característica. Al cultivo puro se le debe realizar, para la caracterización morfológica y bioquímica, la prueba de la coloración de Gram, pruebas bioquímicas y siembra en Agar Mac Conkey (MERCK ®) en el caso de las enterobacterias; y en agar Cetrimide (Pseudomonas Cetrimide Agar USP, OXOID ®), en el caso de Pseudomonas.Finalmente, se realizan repiques del cultivo puro en Agar LB (Lurian Bertain: triptona 10g/l, extracto de levadura 5g/l, NaCl 10g/l), para su posterior conservación.
Cuarta etapa Determinación de los microorganismos por conservar: Luego de aislados los microorganismos, los que se encuentran a 4°C y a -70°C, se les determina la cantidad de microorganismos por conservar. En seguida, se clasifican las cepas según los métodos de conservación más adecuados y se establece la conservación por el método Stock de Criopreservación a -70°C y por el método Semistock en papel filtro.
Quinta etapa Conservación de los microorganismos: La conservación por el método Semistock en papel filtro se realiza, basada en el protocolo propuesto por Kirsop. Este método mantiene la viabilidad de los microorganismos trabajados (Enterobacterias y Pseudomonas) en un intervalo.
Para esta prueba se toman 4 viales de 2 ml por cada cepa por conservar que corresponden a la viabilidad de 24 horas, 2 meses, 6 meses y un año; y se le adicionan a cada uno 15 discos de papel filtro Whatman N°4 de 5 mm, los cuales se deben esterilizar a 121°C por 15 minutos.
Se lleva a cabo un cultivo en caldo BHI incubado a 37°C en agitación a 200 rpm y con una densidad óptica de 0.4-0.5 leído en un espectrofotómetro (Spectronic 2000) a 600nm. Se toman 0.1ml de cada uno de los cultivos y se agregan a los viales, previamente preparados realizando una buena homogenización y se almacenan a 4°C. La criopreservación a .70°C se selecciona como método stock, debido a que a diferencia de la liofilización, éste es un proceso rápido, con baja contaminación, poco laborioso, económico y mantiene las propiedades genéticas de los microorganismos que contienen plásmidos. El proceso se realiza según lo propuesto por Frank P. Se preparan cinco viales por cada cepa que corresponden a la viabilidad de 24 horas, 6 meses, 1 año, 2 años y 5 años, en los cuales se dispensa 0.8 ml de medio de preservación recomendado por MacFaddin y Gherna (Caldo Tripticasa de Soya 3g, Glucosa 0.5g, Leche descremada en polvo 2g, Agente crioprotector (Glicerol 10 ml), Agua destilada 990 ml; esterilizado a 10 libras de presión por 10 min); con modificación en el agente crioprotector para E.coli, usando Dimetilsulfóxido (DMSO), según lo recomendado por Sharp.
246246
Capítulo 3
Sexta etapa Eficacia del método de conservación: Con el objetivo de evaluar la eficacia del método de conservación se debe realizar un recuento inicial de cultivo y un recuento a las 24 horas de con-servación, con los cuales se calcula el porcentaje.
En la siguiente figura se indica el porcentaje de recuperación y pérdida de los microorganismos que están conservados a 4°C en papel filtro y liofilización.
Para la realización de esta práctica se requiere un acondicionamiento especial de los laboratorios del plantel, disponer del Nitrógeno líquido y de equipo relativamente especializado. Si el plantel no cuenta con estas condiciones, se puede acudir a alguna empresa de producción de cepas los cuales en general son anuentes a ser visitados y a permitir que se realicen prácticas de conser-vación de cepas.
Microorganismos que se encontraban conservados 4°C y a –70°C.
Posteriormente, de cada una de las cepas se realiza un cultivo en caldo BHI incubado a 37°C con agitación de 200 rpm, hasta alcanzar una densidad óptica de 0.8 a 600 nm, leído en un espectrofotómetro (Spectronic 200); de este cultivo se toman 0.8 ml que se suspenden en 0.8 ml del medio de preservación previamente preparado en los viales, realizándose luego una homogenización por vortex durante 10 seg. Finalmente, los viales se refrigeran a 4°C por 15 minutos para un periodo de equilibración e inmediatamente congelados a -70°C.
247
Capítulo 3
es 9 y 10Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Indica los métodos más importantes para la conservación de cepas microbianas.
Indica los tres objetivos principales para una correcta conservación de cepas de interés industrial.
248248
Capítulo 3
249
Capítulo 3
Unidad 6 Cinética de fermentación
6.1 RAP Identifica en procesos fermentativos los inóculos, levaduras y enzima que aceleran estos procesos
La cinética de los procesos fermentativos es gobernada por diversos factores, tales como la naturaleza de los inóculos, levaduras y la presencia de enzimas que aceleran las fermentaciones.
Los inóculos se utilizan actualmente en el procesado de alimentos para inducir diversos cambios en sus propiedades, tales como la modificación de la textura, la conservación, el desarrollo de aromas o la mejora nutricional.
La utilización de estos cultivos debe tener en cuenta estos efectos, cumpliendo a su vez con la exigencia de la automatización del proceso, calidad del producto y reproducibilidad. Lo que lleva consigo la producción de cultivos con una actividad definida en términos de viabilidad, eficacia y vida útil.
Las principales aplicaciones de los inóculos se encuentran en las industrias de panadería y lechería, aunque también existen levaduras destinadas a la fermentación de bebidas alcohólicas y a la producción de alcohol industrial.
El proceso de producción de estas últimas es similar al efectuado en la manufactura de levaduras de panadería, que además se utilizan con frecuencia en las fermentaciones alcohólicas.
Las levaduras Saccharomyce crevisiae, utilizadas en la elaboración del pan degradan los azúcares a una mezcla de alcohol y de dióxido de carbono gaseoso que queda retenido en la masa. Con la excreción de compuestos como cisteína y glutatión que rompen los puentes disulfuro intramoleculares y con la producción de gas, las levaduras actúan modificando química y mecánicamente el gluten, que es la proteína mayoritaria del trigo.
250250
Capítulo 3
6.1.1 Fermentaciones con levaduras
Aproximadamente el 96% de la fermentación del etanol se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyce crevisiae o especies relacionadas; entre éstas S. Uvarum el etanol se produce en la ruta Embden Meyerhof Parnas en la que el pi-ruvato producido durante la glicosilizacion se convierte en Acetaldehído y etanol la reacción global es la siguiente:
Glucosa + 2 ADP 2 Etanol + 2 CO2 + 2ATP
El rendimiento teórico de un gramo de glucosa es de 0.51 gr. de etanol y 0.49 gr. de CO2; sin embargo, en la práctica aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en biomasa y el rendimiento de etanol y CO2 alcanzan el 90% del valor teórico.
La levadura incluye en su envoltura de la célula una membrana plástica, un espacio periplásmico y una pared celular constituida principalmente por polisacáridos y una pequeña cantidad de péptidos.
La pared tiene una estructura semirígida permeable al soluto que proporciona a las levaduras una conside-rable fuerza de compresión y de tensión. Los grupos carbóxilos de los péptidos de la pared celular con-fieren a las levaduras utilizadas en la elaboración de cerveza una capacidad de floculación importante, lo que permite la separación sólido-líquido; después de la fermentación se cree que la floculación se debe a la formación de puentes salinos entre los iones calcio y estos grupos carbóxilos de la pared celular.
La importación de la densidad celular es que nos ayuda a lograr óptimos resultados en la fermentación, ya que nos ayuda a predecir la cinética de crecimiento y por medio de esto puedes determinar en cuanto tiempo podrás obtener los metabolitos deseados.
251
Capítulo 3
6.1.2 Factores que afectan la velocidad de fermentación
Es bien conocido que existe un cierto número de factores que determinan si una reacción se producirá o no, si será lenta o rápida, o si absorberá o libe-rará calor. Hay sin embargo otros factores que determinan la velocidad de la reacción; estos son:
Temperatura:Cuando temperatura aumenta, lógicamente, la energía cinética de las mo-léculas reaccionantes, con lo que habrá un mayor número de moléculas con una energía igual o superior a la de activación. Esto se describe nor-malmente mediante una regla según la cual cada aumento en 10° C de temperatura hace que se duplique la velocidad de la reacción. Sin embargo, esto no quiere decir que la energía cinética de las moléculas se haya he-cho el doble. Por supuesto, cuando se disminuye la temperatura ocurre lo inverso.
Concentración y presión: El aumento de la concentración de uno de los reactantes quiere decir que habrá más moléculas presentes y que en esta forma aumentará el número de colisiones. Por tanto, también se elevará el número de interacciones favorables por unidad de tiempo.
Otra manera de enfocar el problema es considerando que aunque permanece igual la proporción de moléculas que tienen la energía de activación requerida, por existir más moléculas presentes al aumentar la concentración, hay un ma-yor número de ellas capaces de reaccionar.
Catálisis
En ciertos casos, como en el de las proteínas, pueden incrementar la velocidad de las reacciones. Estos se le conocen con el nombre de catalizadores, y en el caso de las proteínas se llaman enzimas. (Los compuestos que hacen disminuir las velocidades de reacción se llaman inhibidores). Los catalizadores son ca-paces de alguna manera de reducir la energía de activación a un nivel inferior al de la reacción no catalizada. Al ser incrementado el número de colisiones fa-vorables entre las moléculas reaccionantes, es decir, favorecen la geometría
252252
Capítulo 3
de colisión, en tal forma que sea mayor el número de choques efectivos. Ello se convierte en una mayor facilidad de reacción con una menor energía de activa-ción. Ambas reacciones, catalizadas o no, proceden al mismo tiempo.
Se creyó que el catalizador no intervenía en la reacción, pero ahora se sabe que juega un papel importante y que en algunos casos resulta químicamente alterado en la reacción, aunque no obstante se regenera antes de que la reacción se haya completado. En la mayoría de los casos no se conoce el mecanismo de acción. Por lo que hay reacciones como la de descomposición del ácido fórmico en agua y monóxido de carbono, que están catalizadas por un ácido y que han sido es-tudiadas con cierto detalle.
Muy lentamente el ácido fórmico se descompondrá por sí mismo, pero si se aña-de ácido sulfúrico la solución burbujea violentamente gracias al gas desalojado. La reacción transcurre en tres etapas. Primeramente se dona un protón desde el ácido a la molécula del ácido fórmico dejando, en el caso del sulfúrico, un ión sulfato de hidrógeno:
El ácido fórmico protonado es inestable y se rompe para formar agua y una mo-lécula de HCO.
La molécula intermedia HCO es inestable y pierde un protón para formar monóxi-do de carbono. El protón es a continuación devuelto a la molécula de sulfato de hidrógeno para originar el catalizador ácido sulfúrico original.
H+ + HS04 - H2SO4
Se puede observar que el catalizador sufrió un cambio químico al comienzo de la reacción. Donó un protón al ácido fórmico, aunque éste fue devuelto de nuevo al ión sulfato hidrógeno al final de la reacción.
En cada una de las etapas de la reacción tendrán su propia energía de activación, pero ninguna será superior a la energía de activación de la reacción no catalizada. Con las enzimas quimotripsina, lisozima (enzima presente en las lágrimas, clara de huevo, y producida por algunos virus) y papaína, se sabe algo de su mecanismo de acción, gracias a investigaciones recientes llevadas a cabo por bioquímicos y cristalógrafos. Basándose en la actividad de las enzimas se pueden emplear test sensibles para estudiar tejidos dañados, por ejemplo, para determinar la presencia de sangre en laboratorios médicos forenses.
253
Capítulo 3
CatalizadoresEl mecanismo que hace cambiar de una reacción química es el catalizador. En presencia de éste la reacción avanza a través de etapas sucesivas más rápidas y la constante de velocidad adquiere un valor más alto. En la ecuación de Arrhenius se llega a la conclusión que la presencia de un catalizador tiene que traer como resultado una reducción en la energía de activación porque de otra manera no podría explicarse cómo puede aumentar el valor de la constante de velocidad en comparación con la de la reacción no catalizada ya que en la ecuación de Arrhenius a temperatura constante A, R y T son constantes, de modo que la única forma de hacer que K aumente es que disminuya Ea. Desde el punto de vista de la ecuación de Arrhenius, el efecto que produce un catalizador consiste en reducir la energía de activación a la vez que aumenta, tanto la fracción activada de moléculas como la velocidad de la reacción.
K = A exp (Ea/RT)
Sin embargo, los catalizadores afectan a la velocidad de una reacción, no tienen influencia alguna sobre la posición de equilibrio de la reacción. Esto es explicable si tenemos en cuenta que los catalizadores ejercen su acción sobre ambas reacciones, la directa y la inversa. Así, la velocidad de la reacción en su conjunto estará aumentada sin que se afecte la posición del equilibrio.
En el principio general un aumento de la temperatura modificará la posición de equilibrio, de tal manera que el efecto que produzca ese aumento será contrarrestado por el sistema.
Catálisis enzimática
La cinética química ha sido aplicada con gran éxito en el desarrollo de rápidos y económicos métodos de producción de muchos materiales. Pero en años recientes los investigadores en cinética química se han ocupado con creciente interés en el estudio de las reacciones catalizadas por enzimas que ocurren en las células vivas; éste es uno de los campos más fascinantes de la investigación química moder-na. Las enzimas son polipéptidos gigantes cuyo peso molecular llega a 20.000 o más. Cada fragmento peptídico lleva consigo un sustituyente orgánico o grupo R. Cuando la enzima se pliega para formar su estructura terciaria, los grupos polares R quedan sobresaliendo como puntas dentro del medio acuoso de la célula. Se cree que el efecto catalítico de las enzimas se debe a la manera como se hallan dispuestos tales grupos R sobre
254254
Capítulo 3
zona de la superficie de la enzima plegada. El sustrato, o sea la molécula pequeña sobre la cual actúa la enzima, se adhiere a la superficie de la enzima por medio de enlaces de hidrógeno que lo ligan a los grupos R.
La diferencia entre catalizadores y enzimas es la siguiente:
Catalizador: es un metal o elemento que actúa como acelerador de una reacción química sin modificarse en el transcurso de la misma. Son cuerpos que por su presencia hacen variar la velocidad de una reacción. Mientras que las Enzimas son proteínas que actúan como catalizadores.
Enzimas
Entre los diversos tipos de proteínas, las enzimas son las que cumplen una función más específica: modifican la ve-locidad de las reacciones que se producen en un ser vivo, en la gran mayoría de los casos, acelerándolas. De esta manera estamos definiendo las enzimas como proteínas que actúan como catalizadores.
Las enzimas facilitan el curso de las reacciones disminu-yendo la energía de activación de modo tal que se pueden producir simultáneamente y en un tiempo brevísimo la gran cantidad de reacciones que posibilitan la vida.
Al cumplir su función, las enzimas no son alteradas por las reacciones que promueven. La especificidad de una enzima le permite distinguir con gran selectividad entre diferentes sustancias y aún entre isómeros ópticos.
Algunas enzimas son proteínas simples constituidas sólo por aminoácidos. Las hidrolasas, en general son proteínas simples. Muchas están formadas por asocia-ción de varias unidades o cadenas polipeptídicas. Hay enzimas que sólo pueden realizar su función catalítica en asociación con otra molécula no proteica, de tamaño
255
Capítulo 3
relativamente pequeño, a la cual se le denomina coenzima. La coenzima puede estar firmemente unida a la enzima por uniones covalentes u otro tipo de enlace fuerte, formando un complejo que no se separa fácilmente.
Entonces el catalizador es un cuerpo que puede producir aceleración o retardo de una reacción química por presencia de una sustancia que permanece apa-rentemente intacta sin destruirse ni inactivarse en el proceso.
Algunas reacciones se aceleran bajo la influencia ejercida por algunas sus-tancias que al término del proceso resultan inalteradas. Estas sustancias se denominan catalizadores y el efecto que producen es la catálisis.
Cuando actúan como catalizador negativo disminuyendo la velocidad del pro-ceso, reciben el nombre de inhibidores.
1 No se altera la composición de los catalizadores en las reacciones quí-micas en que intervienen. 2. Pequeñas cantidades de catalizadores bastan para acelerar el proceso de grandes cantidades de sustancias reaccionantes. 3. Los catalizadores sólo pueden modificar, disminuir o aumentar la velo-cidad de reacción, pero son incapaces de provocar una reacción. 4. Los catalizadores son específicos de la reacción de que se trate.
256256
Capítulo 3
11Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Describe la metodología que permite contar bacterias en cámara de Neubauer.
• Cámaras de recuento DIN 12847
• Cajita individual con 2 cubre. Objetos de 0,4 mm.
CámaradeNeubauer
257
Capítulo 3
Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
4
En la presente Práctica se utiliza la técnica in vitro de producción periódica de biogás, con el objeto de estudiar la producción de este biogás y la fermentación de la materia seca, en muestras prove-nientes de un forraje disponible a ras de suelo consumido por vacas lecheras.
El experimento se lleva a cabo tomando muestras de forraje compuesta principalmente de gramí-neas perennes (Lolium perenne), bajo un sistema de pastoreo continuo controlado, consumido por vacas lecheras. La muestra se obtiene cortando y colectando el forraje inmediatamente adyacente a aquel forraje consumido por el animal en pastoreo. Este proceso de selección del forraje se realiza siguiendo a las vacas en los lugares de pastoreo. Las muestras compuestas deben secarse a 60° C en una estufa con circulación de aire por 48 horas, y luego se muelen en un molino de cuchillos con una criba de 1 mm. Las determinaciones se realizan en la materia seca (MS), proteína cruda (PC) y cenizas totales (CT) (A.O.A.C. 1980), fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA), y celulasa neutro detergente (CND), para determinar la energía metabolizable (EM).
Estudio de la cinética de la fermentación in vitro y del residuo no fermentado de un forraje consumido por vacas lecheras.
La práctica se lleva a cabo en un bio-digestor piloto, como lo muestra la siguiente figura, en la cual se lleva a cabo la fermentación anaeróbica del sustrato, produciendo biogás que se recolecta en recipientes herméticos de plástico.
Biodigestor piloto para la producción de biogas
258258
Capítulo 3
Preparación de las botellas: El medio se hierve y luego se enfría permitiendo la gasificación con CO2. Se coloca en botellas con capacidad de 125 ml, bajo continua gasi-ficación con CO2. Una vez llenas, éstas deben sellarse con tapas de goma y luego almacenarlas a 4° C por 60 horas. Posteriormente, los sustratos a incubar se deben transferir a las botellas que contengan el medio. Se les permite la gasificación con CO2 y deben sellarse nuevamente con tapón de goma, y ponerlas a incubar a 4° C por 10 horas, para posteriormente pasar a temperatura de incubación de 39° C.
La inoculación. El fluido ruminal se obtiene de dos ovejas usando una bomba aspiradora y guardado en termos a temperatura de 39° C. El líquido ruminal se filtra a través de 4 capas de muselina y se almacena bajo una atmósfera de CO2.
Dos ovinos canulados ruminalmente pueden ser usados para suplir de líquido ruminal. Los animales deben recibir una ración de heno de pradera permanente y un concentrado comercial (220 g PC/kg MS y 13,2 MJ / kg MS) en una proporción aproximada de 3:1. Las raciones se calculan para lograr un consumo diario de 1.0 a 1.5 veces el nivel de mantenimiento. A los alimentos se les deben dar dos raciones iguales durante el día y disponer de libre acceso al agua.
La técnica de producción de biogás se realiza usando 1 g de sustrato (± 0.002 g) (base seca) por tratamiento y en triplicado. Cada muestra se fermenta en forma independiente.
259
Capítulo 3
Inoculación de las botellas. Mientras el inóculo está siendo preparado, las botellas cerradas se ajustan a la presión atmosférica. Posteriormente, se inyectan 10 ml de inóculo a cada botella mediante una jeringa. Luego las botellas deben agitarse y devueltas a la estufa de incuba-ción a 39° C, momento en que se considera el comienzo del experimento (tiempo cero = 0). Las lecturas se llevan a cabo a los siguientes tiempos, después del tiempo cero: 3, 6, 9, 12, 15, 21, 27, 33, 39, 48, 60, 72 y 96 h.
260260
Capítulo 3
261
Capítulo 3
Unidad 7 Fermentadores industriales y procesos mi-crobiológicos
7.1 RAP Conoce los fermentadores industriales, su función, métodos y procesos implicados en los procesos microbio-lógicos
7.1.1 Fermentadores y tipos de fermentaciones
Huelga decir que la fermentación es un proceso mediante el cual ocurren reaccio-nes químicas debido a la presencia de microorganismos o enzimas de éstas. En los procesos industriales, las fermentaciones se llevan a cabo en un reactor que se conoce como fermentador. De la forma más general, se puede decir que un fermentador, es aquél lugar donde ocurre la fermentación. Esta definición provee para considerar un fermentador tanto aquel que está equipado con modernos sistemas computadorizados de control de parámetros (tales como el pH y la tem-peratura), como un envase simple de yougurt donde se fermente este producto. Los fermentadores pueden utilizarse en uno de tres modos comunes de operación. El más común es el fermentador por lotes (batch), en el cual una
Fermentador industrial en acero inoxidable multifuncional para la industria cervecera
262262
Capítulo 3
cantidad fija de materia prima se prepara y se intro-duce en el fermentador. El fermentador se inocula con el microorganismo seleccionado y el proceso de fermentación ocurre durante un período de tiempo específico. Luego de terminada la fermentación, el producto fermentado se extrae del mismo finalizando el proceso. Las fermentaciones por lotes se pueden realizar generalmente en una de dos formas: con agi-tación y sin agitación.
Figura 5. Modos de fermentación.
El segundo modo de operación es conocido en inglés como “fed-batch”. En estas fermentaciones se introduce parte de la materia prima por procesarse al principio del proceso. Se inocula la misma con el microorganismo seleccionado comenzando el proceso de la fermentación. Posterior-mente y utilizando un criterio preestablecido para la razón de alimentación, el resto de la materia prima se añade durante el tiempo de la fermentación. Dentro de esta modalidad de fermentación existen dos tipos principales: la incremental y la de volumen fijo. En la incremental, la concentración de sustrato de la alimentación es igual o mayor a la concentración que había en el fermentador al comienzo del proceso. El volumen del medio dentro del fermentador aumenta significativamente durante el pro-ceso de alimentación y de ahí el nombre de fermentación “incremental”. En las fermentaciones “fed-batch” de vo-lumen fijo, la concentración de sustrato en la alimentación es tan alta que no hay que añadir grandes cantidades de ésta, lo que resulta que no ocurran cambios significativos
por lotes alimentación por lotes
alimentación y producción continua
263
Capítulo 3
El fermentador de células inmovilizadas es uno usual-mente en forma tubular (ver la Figura No superior derecha) con una matriz porosa en su interior, la cual es tratada químicamente para que las células del mi-croorganismo seleccionado se adhieran a las paredes de los poros. Luego de permitir el crecimiento de las células de microorganismo dentro de la matriz, la ali-mentación se introduce al reactor y la misma mantiene contacto con las células de microorganismo mientras ésta pasa a través de los poros. La velocidad de la alimentación debe ser adecuada para que el sustrato mantenga suficientemente tiempo de contacto con las células adheridas y reaccione totalmente.
Figura 6: Algunos tipos de fermentado-res continuos.
de volumen. En la fermentación “fed-batch” de volumen fijo, moléculas de sustrato van ocupando los espacios vacios disponibles entre las moléculas de soluto en la mezcla que se fermenta.
El tercer modo de fermentaciones es el modo continuo. En este modo de operación, se opera el fermentador con una razón de alimentación de sustrato de igual magnitud a la razón de extracción de producto, por lo cual el volumen de operación del reactor se mantiene constante. Esto permite operar el fermentador por prolongados períodos de tiempo sin la necesidad de preparar inóculos continuamente y eliminando repetidos períodos de propagación de masa celular que consumen gran cantidad de tiempo.
Existen fermentadores especialmente diseñados para operar de forma continua, como lo son el fermentador de torre (tower fermentor) y el de células inmovilidas. El fermentador de torre (ilustrado en la Figura No ) es un tubo que se extiende longitudinalmente hacia arriba y posee diá-metros diferentes en algunas partes del cilindro. El microorganismo por utilizarse en este tipo de fermentadores debe ser capaz de sedimentar rá-pidamente. La alimentación en este tipo de fermentadores se realiza por la parte inferior y el producto se extrae del tope del mismo. La diferen-cia en diámetros y una razón de alimentación adecuada permiten que el microorganismo sedimente manteniéndose en la parte inferior del mismo.
264264
Capítulo 3
Sistemas de control de temperatura, pH y otros parámetros
Los fermentadores pueden estar equipados con diversos mecanismos de control que permiten mantener las condiciones adecuadas para que las enzimas de los microorganismos operen en condiciones óptimas. Los parámetros comunes que usualmente se controlan en los fermentadores son la temperatura, el pH y la razón de oxígeno disuelto. A continuación se ilustra un sistema de control de temperatura típico de un fermentador.
Figura 7. Fermentador con control de temperatura
265
Capítulo 3
Figura 8. Fermentador con control de pH.
El fermentador está rodeado de una chaqueta que junto a un sistema de mezclado permite una distribución de temperaturas similar en todas las partes del líquido fermentándose. En este sistema, un sensor se utiliza para medir la temperatura dentro del fermentador. La señal eléctrica es recibida por una unidad de control que determina si la temperatura está dentro de un rango adecuado o si la misma está más alta o más baja de lo previsto. Dentro de unos parámetros establecidos para la desviación, el controlador activará la válvula de vapor en caso de requerirse aumentar la temperatura; si se requiere una disminución de temperatura, se activará la válvula que permite el paso de agua fría; por último, en el caso en que la temperatura se encuentre dentro del rango aceptable, tanto la válvula de vapor como la de agua fría permanecerán cerradas.
De igual forma se ilustra a continuación un sistema de control de pH. Observa que un sensor se utiliza para establecer la medida de pH. La señal eléctrica del sensor es recibida por el controlador que determina la acción por seguir, según el valor de pH y el rango de operación de esta variable de control. Si el pH es más bajo que el permitido en la lógica de control, el controlador activará la bomba de base introduciendo un medio alcalino que permita subir el pH. En el caso de que el pH sea más alto de lo establecido en el criterio de control, se activará la bomba de ácido y el pH bajará. En el caso de que el pH esté dentro del rango permitido, ambas bombas permanecerán desactivadas.
266266
Capítulo 3
En el caso en que una fermentación sea aeróbica, se requiere un sistema de control para el oxígeno disuelto. Los sistemas de control de oxígeno disuelto tienen un sensor y un controlador al igual que otros sistemas de control. En estos casos se establece una cantidad mínima de oxígeno disuelto, en la cual se activarán elementos de control para aumentar la cantidad de oxígeno pre-sente en el medio. Estos elementos pueden ser compresores o válvulas de aire. También los sistemas de control de oxígeno disuelto pueden aumentar la velocidad de agitación, causando turbulencia, lo que ayuda a exponer más área de superficie del líquido al aire y así aumentar la transferencia de oxígeno al medio.
Figura 9: Fermentador con control de oxígeno disuelto.
Similar a lo establecido anteriormente funcionan otros sistemas de control. Por ejemplo, en ocasiones es necesario que el fermentador tenga algún tipo de sistema que controle la formación de espuma (antifoam control system). Estos sistemas pueden ser mecánicos o pueden añadir algún compuesto quí-mico (antiespumante) que disminuya la tensión superficial del medio en que se fermenta, evitando la acumulación de espuma.
267
Capítulo 3
7.1.2 Etapasparallevaracaboeldiseñodeunfermentador
4. Optimización del rendimien-to del producto respecto al costo energético y de los sustratos de fermentación.
5. Facilitar la recuperación de los productos de la fermentación (ya sea en forma de biomasa o en el medio de cultivo).
6. Los fermentadores industria-les están generalmente diseñados para procesos concretos.
1. Control de la entrada y salida de microorganismos, nutrientes y productos de la fermentación.
2. Control de los intercambios de gases y energía.
3. Proporcionar un ambiente ópti-mo para el crecimiento del micro-organismo o para el desarrollo del proceso fermentativo.
Consideraciones especiales en el diseño y selección de un fermentadorLas siguientes consideraciones son de suma importancia al seleccionar o diseñar fermentadores para procesos controlados:
1. El envase o contenedor en donde se realizará la fermentación debe ser capaz de ser operado asépticamente durante el tiempo en que la operación se realice. Esto es de vital importancia en procesos continuos.
2. La aeración (o ausencia de ésta) y la agitación deben realizarse de forma que se cumplan con los requerimientos metabólicos del microorganismo utilizado. El mezclado debe hacerse en tal forma que los nutrientes estén uniformemente distribuidos en el fermentador sin que esto conlleve daño físico al microorganismo. El aire debe estar filtrado para evitar la entrada de microorganismos en el polvo.
3. El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.
4. Un sistema de control de temperatura debe ser provisto prácticamente en todas las operaciones controladas. La temperatura es un factor sumamente importante en todos los procesos de fermentación.
5. Un sistema de control de pH debe ser provisto en la gran mayoría de las operaciones. En muchos casos, solo se requiere de un ajuste inicial
268268
Capítulo 3
de pH. Sin embargo, en medios que no tengan efectos amortiguantes, el control de pH es muy importante, en especial si pequeñas variaciones de pH afectan adversamente al microorganismo.
6. El fermentador debe proveer algún tipo de sistema para un muestreo eficiente y que no promueva la contaminación del proceso.
7. Las perdidas por evaporación deben ser mínimas.
8. El diseño del envase (o tanque) debe considerar un fácil manejo para las operaciones de limpieza y mantenimiento. Las paredes del envase (o tanque) deben ser pulidas, es decir, no deben tener porosidad que dificulte la limpieza y sanitización.
9. Los materiales de construcción deben ser resistentes a los compuestos que se generen durante el proceso y a la materia prima, sales, ácidos o bases que se añadan.
7.1.3 Diseño y elección del sustrato de fermentacionesalimentarias
1. Alimentos fermentados.- Sustrato tradicional.- Sustrato tradicional con correcciones (adición o purificación) para:- Favorecer o garantizar el desarrollo de los microorganismos deseables.- Mejorar o garantizar la calidad del producto, o crear nuevos productos alimenticios.
269
Capítulo 3
2. Aditivos y enzimas.- Proporcionar todos los elementos y la energía necesarios para el crecimiento del microorganismo y la formación del producto.- Evitar la presencia de sustancias inhibidoras del crecimiento o de la síntesis del producto (incluidos algunos nutrientes).- Extender en el tiempo la fase productiva de crecimiento (p.ej., cultivo continuo).- Favorecer la recuperación del producto al final del proceso.- Evitar la formación de espuma.- Reducir costos mediante el uso de subproductos (bagazo, suero de quesería,...).
* El medio debe estar adaptado a cada fase del proceso (mantenimiento de la cepa, preinóculo, escalado, producción,...).
Desarrollodelprocesodepanificaciónmedianteenzimas
270270
Capítulo 3
Haz una descripción de los criterios más importantes para el diseño de un fermentador:
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
es 12 y 13 Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
271
Capítulo 3
¿De qué están provistos principalmente los fermentadores industriales?
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
272272
Capítulo 3
14Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
¿En qué consisten los biorreactores de enzimas o células inmovilizadas?
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
273
Capítulo 3
Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
5
Realiza dos ensayos basados en la coinoculación y la inoculación secuencial de las levaduras Sa-ccharomyces y no Saccharomyces. En el caso de la coinoculación, ambas levaduras se inoculan en el mismo momento, aunque en diferentes proporciones, 60 y 70 % de Torulospora delbrueckii; compara los resultados con la misma fermentación realizada en pureza con solo Saccharomyces. Mientras que en la inoculación secuencia, primero se adiciona al mosto la levadura no Saccha-romyces y la Saccharomyces se inocula con una pérdida de 20 puntos de densidad, comparando de nuevo los resultados con la fermentación en pureza de Saccharomyces.
La meta de esta Práctica es verificar la hi-pótesis siguiente: la inoculación de una cepa de levadura “exótica” y una cepa de levadura Saccharomyces deben engendrar directamente una mayor complejidad e intensidad en el perfil sensorial de los vinos. Para validar esta hipó-tesis, se escoge estudiar la levadura “exótica” de la especie Torulaspora delbrueckii, conocida por ser una levadura inicialmente presente en ciertos mostos que no presentan ningún defecto organoléptico conocido.
Las diversas inoculaciones deben realizarse en un mosto de la variedad Macabeo con un grado alcohólico potencial de 12.5 % v/v. La temperatura de fermentación debe ser de 20°C. Las co-inoculaciones se examinan combinando una cepa de levadura de la especie Torulaspora delbrueckii con una cepa de la especie Saccharomyces cerevisiae
A densidad de 1060 kg/m³ se le adiciona nutrientes específicos de levadura para inhibir el efecto de compe-tencia interespecífica en el caso de coinoculación. En la inoculación secuencial, la adición de nutrientes se debe dividir en dos momentos diferentes: a densidad 1070 y a densidad 1060.
Exaltación de las propiedades aromáticas del mosto mediante el uso de especies de levadura no-saccharomyces y sacharomyces
Levadura saccharomyces
Levadura saccharomyces
274274
Capítulo 3
Figura 10. Cinéticas de fermentación en coinoculación.
Una vez acabada la fermentación, se deben analizar las concentraciones de los principales ésteres que resulten de la fermentación de las levaduras: acetato de isoamilo, hexanoato de etilo, octanato de etilo, decanato de etilo, butanato de etilo y acetato de hexilo en los vinos obtenidos con los dos tipos de inoculación y en el vino producido con sólo Saccharomyces cerevisiae (Figura No. 11). Para determinar el número de unidades de olor de cada uno de los ésteres, se utiliza el sistema del número de unidades de olor (NUO) .
NOU para cada éster = Concentración de cada éster / el valor de su umbral de per-cepción.
Tabla 1. Análisis estándar de los vinos
Resultados de la co-inoculación de Saccharomyces/no-Saccharomyces:
Los análisis estándar del vino están resumidos en la Tabla 1, donde se puede observar una caída significativa de la acidez volátil en los vinos sometidos a co-inoculación.
275
Capítulo 3
Una vez acabada la fermentación, se deben analizar las concentraciones de los c Los otros ésteres no son modificados de forma perceptible comparados con los de la fermentación sólo con Saccharomyces.
Para confirmar el perfil aromático obtenido con el análisis químico, los vinos son sometidos a análisis organoléptico por un jurado de catadores entrena-dos en análisis sensorial. El jurado estuvo deliberadamente compuesto por 20 catadores no profesionales, que son por consiguiente más representativos de consumidores normales de vino.
En todos los casos, el impacto de la nota amílica (acetato de isoamilo) resulta ser extremadamente pronunciado, cubriendo la presencia de otros ésteres, tanto en los vinos producidos con sólo Saccharomyces cerevisiae como en los producidos con las cepas exóticas. Por lo tanto, el jurado no puede detectar diferencias significativas entre los vinos que resultaron de las co-inoculaciones y los vinos producidos con la fermentación de una sola cepa pura de levadura Saccharomyces cerevisiae.
Los primeros resultados demuestran que la inoculación de diferentes especies fue percibida como una manera de aumentar la intensidad de ciertas notas aromáticas que ya eran predominantes, con riesgo de acentuar el desequilibrio y por lo tanto, de debilitar la complejidad aromática de los vinos. El riesgo en este caso, es el aumento potencial de acetato de isoamilo, que podría desequi-librar el aroma del vino si la concentración alcanzase niveles demasiado altos. Así, la hipótesis que consiste en considerar que la co-inoculación con una cepa “exótica” y una cepa de Saccharomyces engendra directamente complejidad e intensidad en los perfiles sensoriales de los vinos, se podría confirmar en esta práctica.
Figura 11. Perfiles del aroma químico de los vinos, obtenidos mediante el análisis de seis ésteres.
276276
Capítulo 3
Figura 12. Cinética de fermentación en inoculación secuencial.
Actualmente se está evaluando esta experimentación con un enfoque diferente, que aporta mayores limitaciones en términos de control, pero que sin embargo tiene la posibilidad de dar lugar a vinos más armoniosos e intensos aromáti-camente. Este enfoque consiste en reproducir la ecología del ambiente de la fermentación alcohólica fomentando lo siguiente:• El desarrollo de levaduras exóticas durante el primer tercio de la fermentación, momento crucial para el equilibrio y la intensidad de los aromas en el vino.• El desarrollo de levaduras Saccharomyces para garantizar una fermentación más segura.
Tal inoculación secuencial evita crear competiciones entre las características sensoriales y la cinética de fermentación de cada especie de levadura.
Resultados de la inoculación secuencial de levaduras Sac-charomyces/no-Saccharomy-ces
Bajo condiciones de fermentación idénticas a las aplicadas en las ex-perimentaciones de co-inoculación y usando igualmente un mosto de la variedad Macabeo, con un gra-do alcohólico potencial de 13.6% vol., se debe reproducir la sucesión de poblaciones de levadura exótica y de Saccharomyces, como se ob-serva en numerosos estudios sobre ecología de las levaduras en siste-mas fermentativos (Figura. 12). Los análisis estándar de los vinos pro-ducidos están resumidos en la Ta-bla 2, donde se han concentrados datos típicos semejantes a los que deben obtenerse en el desarrollo de esta práctica.
277
Capítulo 3
Figura 13. Perfil aromático de los vinos del ensayo en comparación a datos medios de vinos blancos comunes de la variedad Macabeo producidos en la zona.
278278
Capítulo 3
Para visualizar mejor el efecto de la inoculación secuencial sobre los ésteres (Figura No. 13), la concentración de cada uno de los ésteres presentes en el vino producido con inoculaciones secuenciales se divide por la respectiva con-centración del éster presente en el vino testigo (Figura No. 14).
El perfil aromático que resulta del desarrollo secuencial de Torulaspora del-brueckii y después de Saccharomyces muestra claramente una intensificación uniforme de las concentraciones de los ésteres: cuatro de los seis ésteres analizados presentan concentraciones superiores respecto a las obtenidas en el vino producido con una fermentación de una cepa pura de Saccharomyces; solamente en el caso del acetato de isoamilo, cuya elevada concentración dominaba el perfil aromático del vino testigo (Figura No. 13), disminuyó su concentración con la inoculación secuencial.
Figura 14. Efecto de la inoculación secuencial sobre la concentración de seis ésteres.
279
Capítulo 3
Los vinos que se elaboren deben someterse al jurado de catadores mediante un análisis sensorial con una prueba de diferenciación y un análisis descrip-tivo. Se observan diferencias estadísticamente significativas, con un umbral del 5%, entre los vinos producidos con inoculación secuencial (realizada con la levadura Torulaspora delbrueckii y después con la levadura Saccharomyces cerevisiae) y el vino testigo (producido con una cepa pura de Saccharomyces). Al jurado se le debe pedir entonces realizar un análisis descriptivo. Los perfiles sensoriales obtenidos muestran una intensificación de ciertos descriptores, como “floral”, “fruta en almíbar” y “galleta de jengibre”, ayudados por un dulzor más intenso en el paladar. Notas más comunes, como “manzana”, “plátano” o incluso “picante” o “animal” (Figura No. 15) fueron menos presentes.
Figura 15. Comparación de perfiles sensoriales.
280280
Capítulo 3
Conclusiones
En esta práctica deben analizarse los resultados que se obtengan para demuestrar que la sucesión de predominancia de la población de levadura de la especie Torulaspora delbrueckii y después de levadura del género Saccharomyces permite un aumento homogéneo del nivel de ésteres, compuestos esenciales en los aromas fermentativos de los vinos.
Un estudio parecido al propuesto en esta práctica con la cepa Torulaspora delbrueckii se realizó con una cepa de levadura de la especie Cándida stellata. Se obtuvieron resultados idénticos, reforzando la decisión de desarrollar un instrumento innovador que reproduzca la ecología del ambiente fermentativo espontáneo.Además, para armonizar e intensificar la complejidad aromática de los vinos, sería preferible la opción de una inoculación secuencial con la levadura “exótica” y después la levadura Saccharomyces, más que una inoculación interespecífica combinada.
Esta práctica puede ser desarrollada en alguna instalación piloto de la industria vinícola o cervecera para los casos en que la institución no disponga del equipamiento necesario.
281
Capítulo 3
Termina la Unidad
282282
Capítulo 3
283
Capítulo 3
Unidad 8 Procesos biológicos y su control de calidad
8.1 RAP Conoce los fermentadores industriales, su función, métodos y procesos implicados en los procesos microbiológicos
Las materias primas tradicionales están siendo complementadas con otras muy abundantes basadas en recursos renovables y que hasta el presente han sido poco o nada aprovechadas como sustratos en procesos de fermentación, como es el caso de los residuos celulósicos, que pueden ser materias primas de muy bajo costo para la producción de alcohol, enzimas y otros productos. También se están ampliando los usos de hidrocarburos como sustrato de procesos en la producción de ácido cítrico y otros compuestos. La utilización de efluentes industriales de varias agroindustrias como materias primas de costo cero o negativo será sin duda ampliada en el futuro, pues ello representa además una contribución a la eliminación parcial o total de residuos contaminantes.
Algunos pigmentos como los carotenos y las ficobilinas producidas por algunas algas del género Dunaliella, Spirulina y Nostoc tienen también un futuro promisorio. Se han mencionado también algunos herbicidas de origen microbiano, que tienen igualmente perspectivas de ser desarrollados.
En varios casos la elección de la vía microbiana es obligada por razones económicas, ya que aunque sea posible producir algunas moléculas por vía química, desde el punto de vista económico esto no resulta rentable, como sucede en el caso de los antibióticos, algunas vitaminas y aminoácidos. Sin embargo, los procesos microbiológicos se presentan también como alternativas válidas para el caso de moléculas sencillas como el etanol, el butanol o el ácido láctico, con los cuales existe lógicamente la competencia con los procesos que derivan de la petroquímica.
Estos casos están directamente relacionados con el costo del petróleo y sus derivados.
284284
Capítulo 3
En el primer caso es necesario el desarrollo de nuevos reactores y lo-grar la optimización de los mismos. Estos sistemas permiten prever la producción comercial de nuevos productos como algunas enzimas. El uso de reactores con microorganismos inmovilizados es otro campo de futuro desarrollo de la Microbiología Industrial, que ya está siendo aplicado a la producción de alcohol, algunos aminoácidos y otros compuestos.
La Microbiología Industrial ofrece también como se ha visto alternativas interesantes y únicas para resolver problemas de contaminación ambien-tal, ya sea para el tratamiento convencional de residuos o para el apro-vechamiento específico de algunos de ellos, por lo cual es de esperar en el futuro nuevos avances en este campo vinculados a mejoras en el control de los procesos en conjunto con adelantos en los conocimientos básicos y diseño de nuevos reactores. Recientes desarrollos que están siendo investigados y que sin duda tendrán mayor trascendencia en el futuro en esta área están relacionados con el uso de microorganismos para la eliminación de metales pesados y purificación de efluentes gaseo-sos. Finalmente las metodologías tecnológicas utilizadas en el desarrollo de procesos de la Microbiología Industrial son ya de gran valor para otro tipo de procesos biotecnológicos, como los que se realizan con células animales y vegetales. En este último caso se suele emplear ya el término fitofermentación para referirse a procesos realizados con cultivos de cé-lulas en suspensión en biorreactores.
El ejemplo del butanol es muy claro es ese sentido, ya que en los últimos años se ha producido un renovado interés en su producción por fermentación a partir de materias primas de bajo costo o de residuos, ya que en esta forma se pueden desarrollar procesos que son competitivos con los derivados de la petroquímica, cuando el valor del petróleo supera un determinado valor crítico.
En algunas transformaciones microbiológicas la alta especificidad permite la posibilidad de efectuar reacciones que son imposibles de realizar por vía quí-mica, como ocurre en los diversos procesos de producción de compuestos esteroidales. Este campo de aplicación se ha visto enriquecido últimamente, y lo será sin duda mucho más en el futuro, por las grandes posibilidades que ofrece ya la biocatálisis, que está siendo aplicada, no sólo en la fase acuosa, sino también en presencia de solventes orgánicos para lo obtención de un gran número de compuestos. Entre los sistemas de producción no tradicionales se incluyen fundamentalmente los procesos en estado sólido y los que emplean microorganismos inmovilizados.
285
Capítulo 3
PROTEÍNAS AMINOÁCIDOS: Las levaduras que son un producto de fermentación, presentarían las carac-terísticas más favorables como importante fuente de proteínas, en comparación con todos los demás micro-organismos. Además de su valor proteico, la levadura depara otros beneficios importantes desde el punto de vista nutricional, en particular por su contenido de vita-minas del complejo B.Muchas veces es ventajoso suple-mentar las raciones para el ganado con determinados aminoácidos y con proteínas intactas. Así, es de notar que en la actualidad se realizan fermentaciones en escala comercial para producir lisina y ácido glutámico.
VITAMINAS: Cierto suplementos vitamínicos se obtie-nen mediante fermentación. Se desarrollan procesos para sintetizar caroteno y vitamina A, Riboflavina y vi-tamina B12. Además, una multitud de microorganismos elaboran vitaminas del complejo B.
Dos procesos microbiológicos de fermentación revisten importancias prácticas en la alimentación de animales de la granja, que ocurren cuando se almacena o se efectúan reservas de forrajes para uso posterior.
1. Ensilado: Consiste en el mejoramiento del va-lor nutritivo de los alimentos, sea fermentado el alimento mismo o bien otros materiales que se pueden emplear como aditivos para suplementar el alimento original.
2. Mejoramiento del contenido de principios nutriti-vos mediante fermentación. La antigua práctica de dar papilla a los cerdos era un proceso de fermen-tación continua.
En la actualidad se utilizan técnicas más sofisticadas y mejor controladas de fermentación, entre ellas las siguientes:
286286
Capítulo 3
8.1.1Vitaminas
Las vitaminas son compuestos orgánicos requeridos en pequeña cantidad por el organismo, pero impres-cindibles para un desarrollo normal del hombre y los animales. El estudio de las vitaminas es relativamente nuevo, aunque las enfermedades producidas por sus deficiencias se conocen desde hace muchos años.
Los requerimientos de vitaminas para el hombre y los animales se deben distinguir; en éstos últimos, en-tre las necesidades de las vitaminas en los procesos metabólicos y las necesidades de las vitaminas en la alimentación. Por ejemplo, los rumiantes requieren en sus procesos metabólicos muchas de las vitaminas del complejo B, en cambio, no necesitan recibirlas en la alimentación ya que las sintetizan las bacterias del ru-men. El ácido ascórbico o vitamina C es requerida en los procesos metabólicos de numerosas especies, es esencial en la alimentación de alguna de ellas (hombre, mono), ya que la mayor parte de las especies la sinte-tizan en sus organismos en cantidad suficiente.
Para los bovinos, el complejo vitamínico B y la vitami-na K son sintetizada por las bacterias del rumen y la vitamina C en los tejidos. O sea, que prácticamente, las vitaminas A, D y en algunas casos la E podrían
ENZIMAS: Existen procesos microbiológicos para producir diversas enzimas y la idea de mejorar la eficiencia digestiva de los animales agregando enzimas apropiadas a la dieta es apasionante, pero el aparato digestivo de los animales produce suficientes enzimas para obtener la digestión máxima de almidones, grasas y proteínas. En lo mencionado anteriormente, se identifican algunas contribuciones que los procesos de fermentación han hecho a la alimentación de los anima-les, pero más allá de esta realizaciones existe un ámbito que ha ejercido un gran impacto: el empleo de procesos de fermentación para convertir en alimento para el ganado los subproductos y materiales de desechos y al mismo tiempo, reducir la contaminación del ambiente humano.
287
Capítulo 3
ser las únicas con posibilidad de deficiencia, aunque si los animales dispongan de una buena alimentación las mismas no se producirán.
Complejos compuestos orgánicos que participan en sis-temas enzimáticos esenciales para transportar energía y regular el metabolismo corporal, se requieren en minúsculas cantidades en una o más especies de ani-males para el crecimiento normal, producción, repro-ducción y/o salud.Son solubles en las grasas o agua; sobre esta base, se agrupan del siguiente modo:
Vitaminas Liposolubles: se disuelven en grasas. Ejemplo: vitamina A, D, E y K.
Vitaminas Hidrosolubles: se disuelven en agua. Ejemplo: B, C, etc.
288288
Capítulo 3
289
Capítulo 3
Unidad 9. Producción de alcohol, ácidos orgánicos y proteínas unicelulares.
9.1 RAP Conoce los fermentadores industriales, su función, métodos y procesos implicados en los procesos microbio-lógicos
9.1.1 Producción de alcohol La fermentación es un proceso metabólico energético que comprende la descom-posición de moléculas, tales como carbohidratos, de manera anaerobia, se ha utilizado desde tiempos antiguos en la preparación de alimentos y bebidas. El de-sarrollo químico ha revelado la naturaleza biológica del proceso de fermentación, que da como producto el alcohol etílico y pequeñas cantidades de propanol, buta-nol, ácido acético, y ácido láctico; los alcoholes de alta concentración también se pueden formar. El alcohol etílico está familiarizado con las bebidas alcohólicas. En su forma no natural es usado como un solvente industrial y como materia prima para la manufactura de acetaldehido, acetato etílico, ácido acético, dibromito de etileno, glicol y muchos otros químicos orgánicos. El alcohol puro también puede ser utilizado para propósitos medicinales, farmacéuticos y saborizantes.
La fermentación del alcohol etílico es realizada en forma cerrada por cualquier carbohidrato rico en substratos. La melaza, licor producido de desechos, perma-nece después de la cristalización de la sacarosa y es usada ampliamente como materia prima en la fermentación alcohólica. La melaza contiene 35-40% de sa-carosa y 15-20% de azúcares invertidos (glucosa y fructuosa). La melaza contiene 21-22% de sacarosa y 50-55% de azúcares invertidos. La mayoría de las melazas no requieren otros nutrientes adicionales para realizar la fermentación del alcohol etílico. Sin embargo, las melazas requieren cantidades considerables de sulfato de amonio y otras sales, como fosfatos. El contenido de nutrientes no azucarados de 50-lids de las melazas es aproximadamente 7%, comparado con el 28-35% encontrado en las melazas.
El alcohol etílico también puede ser producido por fermentación del almidón, suero o licor de desechos de sulfito. La fermentación de granos requiere un pretrata-miento, dado que la levadura no puede metabolizar directamente el almidón. Los granos (usualmente el maíz) son agrupados y calentados en una lechada acuosa para gelatinizar o solubilizar el almidón. Algunas enzimas líquidas pueden ser aña-didas a bajas temperaturas. El almidón líquido es enfriado alrededor de 65°C y tratado con amilasa de malta o de hongos para convertir el almidón en oligosa-
290290
Capítulo 3
cáridos. Luego, la levadura es añadida junto con amiloglucosidasa (o glucoamilasa) los cuales convierten los oligosacáridos en glucosa. El proceso de fermentación y refinación posteriores son los mismos que se realizan cuando se usa melaza como materia prima.
La producción del alcohol etílico es realizada a través de procesos eficientes y automáticos. El proceso de manufactura no es muy complejo y es fácil de realizar. El control de la contaminación y el mantenimiento y reparación de las maqui-narias y equipos también son fáciles. Aquellas naciones con climas tropicales y sub-tropicales, con abundante producción de azúcar y maíz, podrían invertir en el establecimiento de esta planta de producción que puede ser orientada tanto a la exportación como a la importación.
Descripción del proceso
1. Transporte y almacenamiento de la melaza: La melaza obtenida desde una fábri-ca proveedora es transportada vía transferencia de tuberías o carros de almacena-miento a la planta de procesamiento de alcohol etílico. La melaza es colocada en un tanque de almacenamiento de concreto bajo tierra por bombeo de la melaza.
Cuando el proceso ha comenzado, la melaza almacenada será bombeada en un contenedor o vasija de disolución para ajustarlo a una concentración adecuada.
Proceso de fabricación del vino
291
Capítulo 3
2. Preparación de la melaza: La melaza es bombeada dentro del tanque medidor a través de un bombeo desde el tanque bajo tierra, el cual recibe el material directa-mente desde el tanque de almacenamiento por transferencia de tuberías. Después que la melaza es medida exactamente, fluye hacia el tanque de disolución de la melaza. Debido a su resistente concentración de azúcar, la melaza no soporta una fermentación directa; por lo tanto, primero debe ser diluido a la concentración deseada. Éste es llamado masa o templa, y presenta los carbohidratos listos para la inoculación o vacunación de los cultivos de semillas. La melaza utilizada en este proceso no necesita ser esterilizada o “nutriotinizada” por un proceso diseñado especialmente, el cual será útil para eliminar el consumo de vapor y los costos de producción de corte. Después de que la melaza es diluida a la concentración deseada, una mezcladora automática ayudará a darle una concentración homo-génea para el proceso de fermentación, antes de que sea bombeado a una serie de fermentadores de acero.
3. Estación de cultivo de granos: La estación es equipada con un fermentador pi-loto en conjunto con el equipo de cultivo de granos y los instrumentos de cultivo diseñados especialmente. Este proceso es realizado bajo una exacta supervisión de laboratorio, incluyendo la selección de la inoculación de los granos de levadura, la adición de nutrientes, el ajuste del pH, el control de temperatura, y finalmente, la limpieza y esterilización de la máquina de cultivo de levadura para la realización del siguiente lote.
4. Suministro de agua procesada: El equipo suministrador de agua procesada y el equipo incrementador de presión son proporcionados. El agua utilizada en el proceso podría ser tratada como agua drenada de calidad o suministrado por un pozo de 90-100 metros de profundidad.
5. Estación de fermentación: Los fermentadores se conectan por tuberías para una operación de fermentación continua. Esta estación debe tener un control automá-tico de temperatura, velocidad de flujo, operación de templado y operación de alimentación. Usualmente el ciclo de fermentación dura de 2-3 días. Dado que el alcohol etílico es formado por levadura desde monosacárido, es necesario des-componer la sacarosa en d-glucosa y l-fructuosa.
292292
Capítulo 3
Las enzimas producidas por la levadura cambian los monosacáridos en alcohol y dióxido de carbono. Después que ha sucedido la reacción, el alcohol etílico pre-sente en los fermentadores puede ser separado por destilación. El contenido de alcohol de la masa es de 7-12% de su volumen, es bombeada hasta la sección de destilación del alcohol. Después de pasar a través de varios intercambiadores de temperatura, el residuo en la base del destilador transporta proteínas, residuos de azúcar y otras impurezas que pueden ser extraídas y usadas como componentes para alimento animal.
6. Estación de destilación y rectificación: El caldo conteniendo alcohol etílico, agua, aldehido, ácido acético, etc., pasa a través de un intercambiador de temperatura hacia un condensador parcial para mantener el alcohol en la columna y para proporcionar un reflujo para las placas superiores. Los productos más volátiles, los cuales todavía pueden contener rastros de aldehído y alcohol, son condensados completamente y transportados detrás de la parte superior del destilador de aldehido. Cerca de la parte superior de la columna, el 95-96% del alcohol es absorbido a través del condensador para su almacenamiento.
9.1.2. Producción de ácidos orgánicos
Los ácidos orgánicos encuentran amplio uso como aditivos en la industria de alimentos y también como aditivos químicos en piensos. Todos los ácidos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos pueden ser producidos microbiológicamente con un alto rendimiento. Algunos ácidos que derivan indirectamente del ciclo de Krebs, como el ácido itacónico (se obtiene a partir del ácido isocítrico), también pueden producirse de la misma manera. Así mismo se obtienen otros ácidos orgánicos que derivan directamente de la glucosa (p.ej. el ácido glucó-nico) o que se forman como productos finales a partir del piruvato o del etanol (p.ej. el ácido láctico o el ácido acético).
Excepto en la producción del ácido cítrico, que se produce enteramente por procesos microbianos, existe frecuentemente una gran competición entre los procesos químicos y los biológicos. En algunos ácidos como el láctico y acé-tico, se utilizan indistintamente los métodos químicos o microbiológicos para su preparación. Para otros ácidos (cetoglutárico, málico) se han desarrollado procesos de fermentación que no se utilizan comercialmente, bien debido a la insuficiente demanda del ácido o por razones económicas.
293
Capítulo 3
Ácido cítrico
La principal fuente de ácido cítrico, antes de que se desarrollaran los procesos microbianos, fueron los cítricos procedentes de Italia (los limones contienen 7%-9% de ácido cítrico). Actualmente, más del 99% de la producción mundial de ácido cítrico se produce microbiológicamente. El 70% se utiliza en la indus-tria de alimentos y bebidas, ya que el sabor de los jugos de frutas, extractos de jugos de frutas, caramelos, helados y mermeladas se aumenta o se preserva por adición de ácido cítrico. El 20% se destina a productos farmacéuticos como el citrato de hierro y ácido cítrico que se usan como conservantes de la sangre almacenada así como en tabletas, pomadas y preparaciones cosméticas. En la industria química (10% restante) el ácido cítrico se utiliza como agente anties-pumante, como reblandecedor y para el tratamiento de textiles. En la industria metalúrgica los metales puros se producen como citratos metálicos.
En la actualidad, para la producción comercial de ácido cítrico, sólo se utilizan mutantes de Aspergillus niger. La esencia de la obtención del ácido cítrico conlleva limitar las cantidades de trazas de metales, como el manganeso y el hierro (cofactor de la aconitasa), para evitar el sobre crecimiento de Aspergillus niger. El medio suele tratarse con resinas de intercambio iónico para asegurar concentraciones bajas y controladas de los metales disponibles. La obtención del ácido cítrico, que en un principio se realizaba mediante el crecimiento en una superficie estática, ahora se lleva a cabo en fermentadores aeróbicos con agitación. Generalmente se utilizan como materia prima las melazas en altas concentraciones (15-18%). El ácido cítrico es un producto metabólico primario y se forma en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucosa es la principal fuente de carbono utilizada para la producción de ácido cítrico. En la trofofase, parte de la glucosa añadida se utiliza para la producción de micelio y se con-vierte, a través de la respiración, en CO2. En la idiofase, el resto de glucosa se convierte en ácidos orgánicos existiendo una pérdida mínima por respiración. Durante la idiofase y cuando el nivel de sustrato es alto, se expresan todas las enzimas del ciclo de Krebs excepto la α-cetoglutarato deshidrogenasa. La acti-vidad citrato sintasa aumenta por un factor de 10, mientras que las actividades de las enzimas que catalizan el ácido cítrico, aconitasa e isocitrato deshidro-
294294
Capítulo 3
Ácido acético
La producción de ácido acético a partir de líquidos alco-hólicos ha sido conocida desde hace tanto tiempo como la producción de vino (unos 10.000 años). Los romanos y los griegos, que utilizaban el vinagre diluido como bebida refrescante, producían vinagre dejando el vino abierto al aire. El vinagre se produjo sólo para consumo local hasta la Edad Media. Los primeros vinagres fabricados indus-trialmente eran producidos en vasijas planas abiertas. Eran procesos lentos en los que flotaba una película de bacterias sobre la superficie del vino. En el siglo XIX se modificaron los procesos en superficie hacia procesos más rápidos. Uno de estos, el proceso del generador de goteo, se utiliza todavía en la actualidad.
En este proceso el biorreactor de madera tiene un volumen de 60 m³ y está lleno de virutas de haya. El material de partida se rocía sobre la superficie y se deja gotear a través de las virutas (que contienen bacterias) hasta el fondo del
genasa, se reducen drásticamente en comparación con su actividad durante la trofofase. Esto da lugar a una acumulación y excreción de ácido cítrico por el microorganismo sobrecargado. El rendimiento teórico es de 112g de ácido cítrico anhidro por 100g de sacarosa. Sin embargo, tales rendimientos no se obtienen en la práctica debido a las pérdidas durante la trofofase. General-mente se consigue un 60% sobre el rendimiento teórico.
Ácido glucónico
En la producción de ácido glucónico sólo participa una única enzima microbiana, la glucosa oxidasa, que se en-cuentra en Aspergillus niger. Este hongo crece en condi-ciones óptimas en el líquido de maceración del maíz, pero cuando el crecimiento se ve limitado por el nitrógeno, las células en reposo transforman la glucosa restante en áci-do glucónico. El gluconato sódico se utiliza como agente secuestrante en muchos detergentes.
295
Capítulo 3
recipiente donde la solución parcialmente convertida es enfriada y bombeada de vuelta a la parte superior. A medi-da que el alcohol pasa a través de las virutas, las bacterias acéticas (Acetobacter y Gluconobacter) oxidan parte del alcohol a ácido acético. Este proceso se repite hasta que se obtiene el vinagre con la fuerza que se quiera. Al ser un proceso aeróbico se debe suministrar abundante aire a través de la cámara. Además, la temperatura se debe mantener entre 15°C y 34ºC que es el rango óptimo de cre-cimiento de Acetobacter. Del alcohol que se añade, el 88-90% se convierte en ácido acético. El resto del alcohol se utiliza en el metabolismo primario o escapa con los gases de salida. El tiempo necesario para producir ácido acético del 12% mediante este proceso es de unos tres días.
9.1.3 Producción de proteína unicelular
El término proteína unicelular (PUC) se emplea para referirse a microorganismos tales como bacterias, levaduras, algas y hongos filamentosos, que son empleados para alimentación humana o animal, principalmente por su alto contenido en proteínas. El hombre ha consumido microorganismos presentes en alimentos fermentados desde hace siglos y más recientemente empleo para consumo animal microorganismos derivados de la producción de cerveza y de bebidas alcohólicas.
Pero el alto costo de su producción sólo es competitivo en ciertas circunstancias respecto de las proteínas de origen vegetal. Los microorganismos crecen rápidamente, lo cual es una de las razones más importantes para su interés en su producción industrial.
Bacterias de los géneros Methilomonas, Pseudomonas, Bacillus y Aerobacter tuvieron en los 60 gran interés debido a su alta velocidad de duplicación y alto contenido proteico; pero el incremento del costo de los sustratos (metano, metanol, hidrocarburos...) han limitado su aplicación.
Sin embargo ciertas especies de levaduras, como Cándida utilis, Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromycees fragilis (k.marxianus) han sido aceptadas para alimentación humana y producidas continuamente desde la Segunda Guerra Mundial.
296296
Capítulo 3
Los hongos filamentosos y las algas tienen la desventaja de crecer más lentamente. En la actualidad se producen comercialmente los hongos Gliocladium deliquescens, Paecilomyces varioti y Fusarium graminearum y las algas Spirulina y Chlorella. En el caso de las algas, su producción es similar a la de la agricultura convencional.
En cuanto al sustrato, aunque la atención inicial se centró en hidrocarburos y derivados del petróleo, recientemente se ha derivado hacia recursos renovables como residuos agrícolas y subproductos industriales. En muchos casos los sustratos requieren de un pretratamiento fisico, químico o enzimático previo a la fermentación. Los residuos agrícolas forestales, por ejemplo, deben ser hidrolizados a azúcares simples o sometidos a una deslignificación parcial para que puedan ser fácilmente accesibles a los microorganismos.
Los principales sustratos utilizados son alcanos, alcoholes y carbohidratos:
La Cándida utilis se obtuvo en ambas guerras mundiales como suplemento proteico por fermentación de caldos de sulfito desecho de plantas de celulosa y por crecimiento en melazas en Jamaica. Después también en USA y Finlandia como levadura forrajera; pero debido a la superabundancia de proteínas vegetales, estos procesos se convirtieron en antieconómicos.
En Finlandia (1974) se desarrolló el proceso Pekilo para la producción de proteínas de organismos unicelulares fúngicos para alimentación animal, haciendo crecer Paecilomyces varioti y utilizando como sustrato caldos de sulfito.
La celulosa de fuentes naturales y restos de madera como material de partida para la producción de PUC frecuentemente necesita de un pretratamiento térmico o químico combinado con la hidrólisis enzimática.
El suero de leche entera o el desproteizado son una fuente de carbohidratos que crea problemas de eliminación, de variaciones estacionales de suministro y elevado contenido en agua. Aunque la mayoría de los organismos no utilizan lactosa como fuente de carbono, las levaduras Kluyveromyces fragilis crecen fácilmente en este carbohidrato, por lo que se han construido plantas utilizándolo para la producción de PUC.
El proceso Symba diseñado en Suecia para producir PUC utiliza dos cepas
297
Capítulo 3
de levaduras: Saccharomycopsis fibuligera, que produce enzimas para la degradación del almidón y permite el cocrecimiento de Cándida utilis, fue diseñado para aprovechar los deshechos del procesado de patata.
La glucosa de calidad alimentaria fue el sustrato elegido por RHM ( Rank Hovis McDougall para producir PUC utilizando Fusarium graminearum.
El proceso original de BP (British Petroleum) para producir PUC mediante la fermentación de alcanos que aunque el costo del sustrato ( ceras contenidas en el gas-oil) era bajo, hubo de cerrar debido a los inconvenientes de eliminar de las levaduras producidas los carcinógenos y el mal olor mediante un exhaustivo proceso de extracción y además existía cierta tendencia a la contaminación microbiana. Otra planta construida en Cerdeña en asociación de BP y ANIC que empleaba n-parafinas nunca fue autorizada a operar comercialmente.
ICI escogió metanol como sustrato para la producción de PUC para consumo animal, usando Methilophilus methylotrophus; pero también hubo de cerrar con el aumento del precio del metanol.
ICI se asoció con RHM para usar el proceso Fusarium RHM en la gran planta de fermentación de ICI.
Pure Culture Products utilizó etanol como sustrato y Cándida para producir proteínas de calidad alimentaria, hasta que dejó también de ser rentable.
298298
Capítulo 3
ACTIVIDAD 15 Indica la maquinaria y equipo para la producción de alcohol.
ACTIVIDAD 16- ¿Dónde se recomienda que se ubique la planta de producción de alcohol?
es 15, 16 y 17Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
299
Capítulo 3
ACTIVIDAD 17 ¿Cómo se selecciona un microorganismo para la producción de proteína unicelular?
300300
Capítulo 3
301
Capítulo 3
Unidad 10 Producción industrial de enzimas, antibióticos y productos lácteos fermentados
10.1 RAP Conoce los procesos de obtención de enzimas, antibióticos y productos lácteos en la industria
10.1.1 Producción industrial de enzimas
La producción de enzimas para uso industrial tuvo sus orígenes en Dinamarca y Japón, a finales del siglo XIX, cuando se produjeron las primeras preparaciones de renina a partir del estómago de becerros y de amilasa de origen fúngico. Las enzimas son productos de las células y por lo tanto, pueden obtenerse a partir de tejidos animales, tejidos vegetales o mediante procesos de fermentación empleando microorganismos seleccionados. Las plantas han sido la fuente tradicional de ciertas enzimas. A partir del latex producido por la papaya, algunas proteasa aisladas desde la higuera y la piña. La cebada malteada también ha sido fuente importante de enzimas vegetales. La industria cervecera ha empleado tradicionalmente este material crudo por su actividad proteásica y amilásica. En cuanto a las enzimas de origen animal, se han obtenido pocas, por ejemplo, lipasa pancreática y tripsina, debido principalmente a la disponibilidad limitada de material adecuado y a la posibilidad de reemplazarlas por enzimas similares derivadas de microorganismos. Debido a que las aplicaciones industriales de las enzimas requieren que éstas sean producidas a gran escala y bajo costo, el empleo de algunas enzimas de origen vegetal y animal ha ido decayendo, en favor de las enzimas de origen microbiano.
Una de las primeras enzimas producidas industrialmente fue la amilasa fúngica takadiastasa, empleada en USA como agente farmacéutico (para los desórdenes intestinales) en 1894. El proceso patentado de Otto Roehm “procesos de lavandería para todos y cualquier tipo de tejidos mediante adición de enzima tríptica” se anunciaba en 1915. En 1969, el 80% de todos los detergentes de lavandería contenían enzimas, fundamentalmente proteasas. Junto a éstas se empezaron a utilizar en la industria de los detergentes enzimas adicionales como lipasas, amilasas, pectinasas y oxidorreductasas. En 1971 y debido a la existencia de alergias entre los trabajadores de la industria de producción, así como entre los consumidores, se redujo drásticamente el uso de proteasas en detergentes. Solamente cuando se desarrollaron técnicas especiales, como la microencapsulación, pudieron ser producidas preparaciones de proteasas carentes de riesgo
302302
Capítulo 3
para los trabajadores y los consumidores. Actualmente en Europa el 95% de los detergentes de lavandería contienen proteasas (subtilisinas). Mientras que en México sólo el 40% de los detergentes contienen el 40% proteasas.
En la actualidad se producen comercialmente las siguientes enzimas:
1. Enzimas utilizados en la industria como amilasas, proteasas, catalasas, isomerasas y penicilina acilasas.
2. Enzimas utilizadas con propósitos analíticos como la glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, alcohol deshidrogenasa, hexoquinasa, muraminidasa y colesterol oxidasa.
3. Enzimas utilizadas en medicina como la asparraginasa, proteasas, lipasas y estreptoquinasa.
Estas tres áreas de aplicación requieren niveles variables de calidad y cantidad. Con base en toneladas, las más importantes son las enzimas industriales que se producen en fermentadores de 120 m³, mientras que en las enzimas producidas para propósitos analíticos o médicos se utilizan fermentadores de planta piloto. Todas las enzimas producidas en grandes cantidades, salvo la glucosa isomerasa y la invertasa, son extracelulares.
Las enzimas pueden ser intracelulares o extracelulares. Pocas enzimas intracelulares son producidas a gran escala y las ventas de estas enzimas representan sólo un pequeño porcentaje del total de ventas. Sin embargo, la producción de enzimas intracelulares es de gran interés por varias razones. Con los avances en las técnicas de inmovilización, el uso de enzimas y células inmovilizadas está en aumento. Por ejemplo, se han establecido procesos comerciales para la producción de jarabes de fructosa usando glucosa isomerasa. Enzimas Extracelulares los microorganismos producen una amplia variedad de enzimas potencialmente útiles, muchas de las cuales son excretadas al medio. La mayoría de las enzimas extracelulares son producidas por organismos pertenecientes a dos géneros: Bacillus y Aspergillus. y que en su mayoría son del tipo hidrolítico.
303
Capítulo 3
Estabilidad de las enzimas
La frágil naturaleza proteica de las enzimas, que conlleva a una estabilidad limitada de su estructura y funcionalidad, constituye un aspecto importante en un contexto tecnológico. Se considera que una enzima es apropiada para una aplicación comercial, si su estabilidad es suficiente para dicha aplicación.
Las enzimas se obtienen por fermentación en cultivos semisólidos, sumer-gidos, extracción de tejidos, ya sea en plantas o animales bajo condiciones controladas. Unas 20 compañías de Europa, Japón y Estados Unidos realizan la producción de enzimas; pero el mercado es dominado por 3 de ellas: Novo Nordisk (Dinamarca) con el 50% de las ventas a nivel mundial, seguida por Gist Brocades (Neatherlands) y Rhom and Haas (Alemania).
El mercado de las enzimas ha tenido gran crecimiento desde los años 70 y éste ha sido paralelo con el desarrollo de un gran número de aplicaciones en la industria alimentaria.
En América latina existen empresas productoras de enzimas en México, Brasil, Argentina y Uruguay, muchas de las cuales son subsidiarias de empresas trans-nacionales, como es el caso de Pfizer en México y Brasil y Novo en Brasil. En Colombia no hay producción de enzimas a escala industrial, siendo importadas de diversos países de Europa, también de Japón, Estados Unidos , Canadá y México. La importación de enzimas en Colombia se hace en su mayor parte a través de representantes o casas comerciales; pero algunas industrias de cervecería, molinería y lácteos hacen importación directa de las enzimas que requieren.
304304
Capítulo 3
Carbohidrasas
Las amilasas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, son las enzimas responsables de la degradación del almidón, hidrolizan los enlaces glucosídicos α-1-4. Las amilasas se pueden dividir en tres grupos:
α-amilasas: rompen al azar los enlaces en el interior del sustrato (endoamiladas);
β-amilasas: hidrolizan ordenadamente en unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores del sustrato (exoamilasas) y
glucoamilasas: liberan unidades de glucosa a partir de los extremos no reductores del sustrato.
Las b -amilasas están presentes en la mayoría de las plantas superiores, están ausentes en los mamíferos y su existencia en microorganismos es dudosa. Se han cristalizado β amilasas a partir de trigo, malta de cebada, patata dulce y soya. La enzima hidroliza únicamente enlaces glicosídicos α-1-4, con inversión en la configuración del C 1 en el glicosido, de la forma α a la forma β.
Este cambio de configuración es la razón por la cual la enzima se llama beta amilasa.
Los pH’s de mayor actividad para las β amilasas están en el rango entre 4.5 - 7 y el límite de temperatura está alrededor de 55°C. Los grupos sulfhídricos son esenciales para la actividad, por lo que la enzima se inactiva por oxidación, por los metales pesados y sus sales.
Glucoamilasa (amiloglucosidasa)
El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el almidón es glucosa, lo que la diferencia claramente de las α y β amilasas. La enzima también produce pequeñas cantidades de oligosacáridos.
La sacarificación del almidón puede alcanzar hasta 96% de dextrosa. La acción de la enzima causa inversión de la configuración, produciendo β glucosa.
En el comercio se encuentran diversas preparaciones derivadas de hongos de los grupos Aspergillus y Rhizopus. excepto por la enzima de Aspergillus
305
Capítulo 3
awamori; las glucoamilasas son inactivas sobre almidón nativo. Su actividad es máxima entre pH 4 y 5.5, y temperatura alrededor de 55°C – 65°C. La velocidad de reacción cae rápidamente a medida que disminuye el tamaño de la molécula de sustrato, siendo máxima sobre almidones previamente sometidos a licuefacción.
La producción de nuevos compuestos representa otra posibilidad interesante de los procesos fermentativos. Un ejemplo está constituido por diversos productos que presentan actividad farmacológica como los inhibidores enzimáticos y los antitumorales.
Algunos inhibidores enzimáticos han sido ya aceptados en algunos países para su empleo en medicina humana, como la bestatina, un inmunoregulador.
Otros productos interesantes en desarrollo son los polímeros biodegradables como el polibetahidroxibutirato, que tiene aplicaciones industriales y medicinales.
306306
Capítulo 3
¿Cuáles son las enzimas pécticas?
18Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
307
Capítulo 3
10.1.2 Métodos de obtención de antibióticos
Definición
Son sustancias químicas producidas por organismos vivientes, capaces de inhibir en pequeñas cantidades los procesos vitales de ciertos microorganismos, destruyendo e impidiendo su desarrollo y reproducción.
Literalmente la palabra “antibiótico” significa cualquier sustancia antagonista de la vida, pero en medicina este término tiene un concepto más restringido.
Para su uso en terapia humana es también necesario un elevado índice terapeútico.
La definición de antibiótico hecha por Waksman (1951) se refería a las sustancias producidas por microorganismos, pero en la actualidad debe ampliarse la definición para poder incluir sustancias similares preparadas sintéticamente o existentes en algunas plantas superiores. La mayor parte de los antibióticos utilizados en clínicas, son producidos por microorganismos u hongos del suelo, pero se conocen ejemplos de otro grupo que se mencionan a continuación:
Líquenes: Muchos de los antibióticos parecen deber sus propiedades bacteriótaticas y antifúngicas al ácido úsnico o al ácido vulpínico.
Monocotiledóneas: El ajo fresco debe su acción antibiótica a la aliína, aminoácido que contiene azufre.
Dicotiledóneas: Son ejemplo de este grupo los siguientes: lúpulo (Fam. Cannabinaceae) que contiene las cetonas humuleno y lupuleno; en el Anemone pulsatilla y en muchas otras ranunculaceaes está la lactona protoanemonina; diversos compuestos sulfurados se han encontrado en las crucíferas; en la Drosera se encuentra la plumbagina (2-metil-5-hidroxil-1,4-naftoquinona). De las compuestas se han aislado principios en diversas especies como la bardana, el cardo y el Hieracium pilosella. Esta última planta, “oreja de ratón” o “pelosilla”, se ha utilizado clínicamente para el tratamiento de la fiebre de Malta. Se han ensayado respecto a la actividad antimicrobiana muchas otras plantas y en la literatura científica están apareciendo continuamente nuevos trabajos.
308308
Capítulo 3
Figura 16. Aislamiento de un microorganismo para la producción de antibióticos.
Historia
El primer registro científico de actividad antibiótica fue realizado por Luis Pasteur (1877), quién comunicó que no se había desarrollado el Carbunco en animales inyectados con un inóculo que contenían bacillus Anthracis y otros bacillus comunes. En la figura número 16 se muestra como se puede separar un microorganismo en forma selectiva dentro de una caja Petri, para lo cual se utiliza un medio de cultivo selectivo.
En Tyndal (1881), en sus ensayos sobre la materia flotante en el aire, en relación con la putrefacción e infección , establecía que en algunos tubos que contenían una infusión nutritiva y bacterias y que se habían contaminado también con Penicillium glaucum, las bacterias perdían su “poder de translación y caían al fondo del tubo”. Tyndal interpretó este fenómeno como debido a la suspensión del suministro de oxígeno a las bacterias por las películas formadas por el moho. Diez años después del descubrimiento de Pasteur, Emmerich (1887) descubrió accidentalmente que un cobaya al que había inyectado inicialmente Estreptococcus erysipelatis no padeció el cólera al inyectarle cultivos virulentos de Vibrium cholerae . Reconoció inmediatamente el significado del descubrimiento y logró evitar el ántrax en animales de experimentación administrando Str. Erysipelatis previamente a la inyección de bacillus anthracis.
309
Capítulo 3
Bouchard (1889) comunicó que el Pseudomona aeruginosa evitaba el desarrollo del ántrax en el conejo, observación que fue ampliada por Woodhead y Wood (1889) al descubrir que cultivos esterilizados de P. aeruginosa; concentraron estos filtrados, desprovistos de células en un décimo de su volumen inicial y demostraron que destruían al Corinebacterium difteriae, stafilococcos, estreptococos, neumococos, gonococos, el vibrium cholerae y Shigella paradysenteriae in vitro. En la actualidad se ha aislado y purificado el principio activo de este preparado, determinándose su estructura. El reconocimiento del fenómeno de la antibiosis había sido establecido, pero Sir Alexander Fleming observó en 1928 la inhibición de las bacterias por una colonia de Penicillium notatum que se habían desarrollado como contaminante sobre una caja petri. Fleming abogó en su publicación por el posible uso clínico de la sustancia formada en el cultivo de Penicillium.
Con la Segunda Guerra Mundial se inició un programa a gran escala para la producción y ensayo de la sustancia, conocida en la actualidad como Penicilina y los recursos de la industria y de las instituciones académicas se dedicaron al estudio de esta sustancia y a la búsqueda de otros antibióticos. Esto tuvo como consecuencia el descubrimiento de Streptomicina , Aureomicina, Cloromicetina y muchos otros antibióticos. En la actualidad para la fabricación de Penicilina han reemplazado al P. notatum cepa de alto rendimiento de Penicillium chrysogenum, que producen además poco pigmento. Se consigue la síntesis preferente de Bencilpenicilina por adición de ácido fenilacético al medio de fermentación.
Constitución química
En general los antibióticos son sustancias químicas diversas, complejas, de gran peso molecular, cuya síntesis suele ser muy dificultosa, y en algunos casos antieconómica en comparación con su obtención por los medios biotecnológicos.
La adición de varios radicales químicos a la estructura molecular de los antibióticos da lugar a sustancias de mayor solubilidad, de menor toxicidad y mayor actividad, y la alteración de la molécula ha producido algunas sustancias antibióticas presumiblemente no conocidas en la naturaleza.
310310
Capítulo 3
Penicilina
Es una sustancia antibiótica producida por los hongos Penicillium notatum y P. chrysogenum de la familia Aspergiliaceas. Es un hongo de color verde azulado que posee delgadas hifas sumergidas como también aéreas tabicadas de las cuáles arrancan conideoforos ramificados. La penicilina fue descubierta por Alexander Fleminig en 1929.
Métodos de obtención de la penicilina
En general el procedimiento de obtención de los antibióticos por métodos biotecnológicos, es parecido y consiste en cultivar en gran escala el hongo productor del antibiótico en un medio de cultivo a temperatura adecuada y luego extraer la sustancia activa desarrollada en el medio por solventes especiales y evaporar el solvente y someterlo después a purificaciones sucesivas.
Se conocen dos métodos para la producción natural de la penicilina: el método de superficie y el método de sumersión o de profundidad. En el método de superficie las esporas o cenidios de un cultivo de penicilina se desarrollan en forma de nata en la superficie, del medio de cultivo sílido, húmedo colocado en frascos planos o en bandeja; este medio puede ser, por ejemplo, salvado de trigo.
En el método de sumersión se desarrolla en un medio líquido consistente en una maceración de maíz con lactosa, colocado en tanques de fermentación en donde el medio es constantemente agitado y aireado y a una temperatura de 23°C – 25°C; por este método se obtiene el mayor rendimiento.
En ambos métodos las esporas germinan en medio nutritivo formando un micelio que excreta
la penicilina vertiéndola en substrato; el micelio se separa después de un tiempo por filtración a presión y a 5°C. La penicilina cruda obtenida se extrae ya sea por absorción con carbón activado o por extracción del mismo medio mediante solventes orgánicos no miscibles en agua. Cuando se extrae por adsorción se hace pasar el medio filtrado a través de una columna que contiene carbón activado que adsorbe el antibiótico y este es luego separado del carbón por medio de un solvente apropiado (por ejemplo acetona al 80 %) por elusión, el cual por evaporación deja al antibiótico que se purifica, se valora y se envasa.
La extracción de algunos medicamentos se puede llevar a cabo por medio de dos líquidos inmiscibles haciendo que el sustrato pase de una fase a la otra; tal es el caso de la extracción del ácido penicilínico utilizando agua y acetato de amilo que son inmiscibles. El proceso consiste en ajustar primero el pH a 2 para liberar el ácido penicilínico que es soluble en el solvente orgánico e insoluble en agua. La penicilina se extrae del solvente orgánico con una solución de bicarbonato de potasio o de sodio a pH de 7.5, formándose penicilina potásica o sódica. Esta sal de penicilina se esteriliza por filtración a través de filtros bactereológicos, para purificarse por cristalización fraccionada. Una vez separada la penicilina se seca al vacío a 1 a 2 °C y se envasa asépticamente.
311
Capítulo 3
Propiedades
La penicilina que más abunda en el comercio es la penicilina G potásica o bencil Penicilina potásica. Se presenta como un polvo cristalino blanco inodoro, muy soluble en agua, también en alcohol y glicerina, insoluble en éter y cloroformo. Se destruye por acción del calor, por ácidos, álcalis y agentes oxidantes y fer-mentos bacterianos.
Sus soluciones se deterioran a la temperatura atmosférica, pero refrigeradas permanecen estables por algunos días.
Tipos de penicilina
Se conocen diferentes penicilinas, todas las cuales derivan de una es-tructura química fundamental común : dos anillos heterocíclicos, uno de tiazolidina y otro de beta - lactama, unido por un encadenamiento emídico a un radical R variable; la penicilina es un ácido orgánico, el ácido pe-nicilínico; pero por extensión se acepta el mismo nombre para sus sales. Por el radical carboxilo la penicilina forma sales con los metales alcalinos.
Sustituyendo diferentes radicales en la posición R se tienen las siguientes pe-nicilinas:
1. Bencil-penicilina R = C6H5CH2- , es la Penicilina G.2. Pentenil-penicilina R = CH3CH2CH=CHCH2- , es la Penicilina F.3. Heptil-penicilina R = CH3(CH2)6- , es la Penicilina K.4. p-Hidroxibencil penicilina R = HO-C6H5-CH2- , es la Penicilina X.5. Fenoximetil-penicilina R = C6H5OCH2- , es la Penicilina V.
De estas penicilinas, la más importante es la Penicilina G o bencil penicilina que se combina con el sodio, potasio, calcio y la procaína para formar los compuestos:
Penicilian G sódica, G potásica, G cálcica y Peniclina G Procaína, que es de ac-ción prolongada. La penicilina V es activa por vía oral.
Actualmente existe la d-alfa-aminobencil-penicilina que es de amplio espectro, activa contra microorganismos gram + y gram -, y activa por vía oral.
312312
Capítulo 3
Figura 17. Acción de la Penicilina inhibiendo el desarrollo y reproducción de gérmenes patógenos.
Identificación
La actividad de la penicilina es referida en unidades biológicas. Al tratar una solución de penicilina al 2% con HCl diluido se forma un precipitado de ácido Penicilinico que es soluble en exceso de ácido, alcohol, éter o cloroformo.
Acción farmacológica
La Penicilina tiene efecto bacteriostático (inhibiendo el desarrollo y reproduc-ción de los gérmenes) o bacteriolítico (provocando su destrucción), según la dosis y tiempo de contacto.
Las sales de Penicilina que se fabrican actualmente permiten conservarlas en estado sólido sin necesidad de refrigeración.
313
Capítulo 3
Espectro farmacológico
La penicilina es particularmente activa contra bacterias gran positivas, en espe-cial en infecciones producidas por estafilococos, estreptococos, neumococos, algunos clostridium y lactobacillus; ejerce también acción contra treponema pallidum.
Es el antibiótico más usado, especialmente en infecciones estafilocócicas, como Ántrax, en heridas y quemaduras infectadas, en el tratamiento de infec-ciones neumocócicas como neumonía, pleuritis y endocarditis neumocicas, en enfermedades estreptocócicas como infección puerperal, peritonitis. En infec-ciones gonocócicas como gonorrea oftálmica. Se usa también en la sifilis, en la Verruga peruana, profilacticamente en obstetricia y antes de las intervenciones quirúrgicas.
En general la penicilina es considerada como una droga antibiótica de poca toxicidad, sin embargo puede producir reacciones alérgicas como dermatitis, urticaria, etc.
La penicilinasa es una enzima bacteriana que antagoniza específicamente el efecto antimicrobiano de la penicilina produciendo su destrucción por la aper-tura del anillo lactámico.
314314
Capítulo 3
Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
6
El Cloranfenicol es un antibiótico aislado a partir de cultivos de Strep-tomyces venezuelae de una muestra de tierra llevada de Caracas. Fue descubierto por Burkholder en 1948.
Químicamente es C11H12Cl2N2O5. p-nitrofenil-di-cloroacetamido propano-diol, cuyo peso molecular es 323.13
Es un polvo blanco o blancoamarillento, inodoro, intensamente amargo; es poco soluble en agua, muy soluble en alcohol, propilenglicol, acetona y acetato de etilo. Es prácticamente estable en soluciones neutras o ligeramente ácidas, pero se destruye rápidamente en solución alcalina.
Identificación del Cloranfenicol
315
Capítulo 3
Desarrollo de la práctica:
Disuélvase 10 mg de cloranfenicol en una mezcla de 1 mg de alcohol diluido y 3 ml de solución reactivo de CaCl2 al 10 %. Adicionar 50 mg de Zn en polvo y calentar en baño María por 10 minutos. Descartar el líquido transparente en un tubo de ensayo y agregar 100 mg de acetato de sodio anhidro y 11 gotas de cloruro de benzoilo. Agítese la mezcla por 1 minuto, agréguese 0.5 ml de solución reactivo de FeCl3 y HCl diluido hasta producir una solución transparente, se obtendrá un color rojo violado púrpura.
316316
Capítulo 3
Los productos lácteos se conocen desde hace varios milenios; es muy posible que estén unidos al consumo humano desde los tiempos de las antiguas tribus nómadas del neolítico; el ser humano logró la domesticación de cabras y ove-jas probablemente hace casi unos 9.000 años en las zonas del Mediterráneo Oriental, aunque no existen registros de consumos lácteos desde hace unos mil años, luego de tal domesticación: hace 8.500 años puede suponerse la insipiencia de producción láctea para consumo humano, aunque recién hace 7.000 años es que se datan importantes producciones de leche de vaca, cabra y oveja en zonas como el noreste de Anatolia, debido a la gran disponibilidad de leche procedente de los ganados que se desplazaban con la población. La elaboración de ciertos lácteos como el queso se asocia en la cultura popular con las costumbres culinarias de los pastores de ganado. Algunos autores mencionan que el mismo puede haberse originado en la fermentación de la leche que se almacenaba en las vasijas elaboradas con los estómagos de ani-males. Los productos lácteos y la leche se han desarrollado históricamente en aquellas poblaciones, o razas humanas, que han evolucionado físicamente para mantener en la edad adulta una mejor capacidad de digestión del princi-pal azúcar de la leche: la lactosa. En los demás grupos humanos, la secreción de la lactasa (una enzima esencial para esa digestión) se pierde tras la fase de lactancia infantil, y por esta razón muchas culturas tienen una «aversión culinaria» a la leche y sus derivados. Sólo en algunas partes de Asia o África se consumen habitualmente productos lácteos; y su consumo más extendido
Los productos lácteos son aquellos del grupo de alimentos que incluyen la leche, así como sus derivados procesados (generalmente fermentados). Las plantas industriales que producen estos alimentos pertenecen a la industria láctea y se caracterizan por la manipulación de un producto altamente perecedero, como es la leche, que debe vigilarse y analizarse correctamente durante todos los pasos de la cadena de frío hasta su llegada al consumidor.
Los productos lácteos que se elaboran utilizan leche en la industria, utilizan le-che de vaca, principalmente de la raza Holstein, aunque también se utiliza leche de cabra o de oveja; en algunos países se llega a utilizar la leche de búfala, la de camella y hasta la de la yegua.
317
Capítulo 3
se centra en el norte de Europa y en las zonas del mundo con presencia migratoria significativa de ese origen, como Norteamérica, Argentina y Australia. Se ha estimado que casi un 96% de los europeos del norte son capaces de digerir la lactosa; entre un 50% y un 75% de los africanos, indios, habitantes de Oriente Medio y europeos del este; mientras que casi todos los nativos americanos y asiáticos son incapaces de digerirla.
El desarrollo de los productos lácteos se considera como uno de los principales logros de la humanidad. El problema de la digestión de la lactosa, en algunas personas se resuel-ve al transformarse en un derivado lácteo mejor digerible. Las razones evolutivas aducidas están ligadas al equilibrio con otro nutriente esencial que, como la lactosa, ayuda a la absorción del calcio: la vitamina D, que se puede sintetizar por el organismo en presencia de luz solar. Los pueblos ganaderos del norte de Europa, con un débil sol que nunca se alza mucho sobre el horizonte, vivían la mayor parte del año bajo cielos cubiertos y protegidos por ropa que les tapaba casi por completo la piel, además de no acceder fácilmente a otras fuentes de calcio (verduras, por ejem-plo). Verían comprometido su desarrollo si no accedieran al calcio aportado por la leche líquida junto con la lactosa (la cual desempeña el papel que en otras latitudes cum-ple una abundante vitamina D sintetizada gracias a la luz solar). Por el contrario, pueblos secularmente dedicados a la ganadería, como judíos, árabes, griegos, sudaneses y culturas del Asia Meridional, que presentan altos índices de intolerancia a la lactosa, desarrollaron tradicionalmente la elaboración y consumo de productos lácteos fermentados, en vez de la leche líquida sin fermentar.
318318
Capítulo 3
CARACTERÍSTICAS Las características físicas y químicas de los lácteos se testean en muchos casos de forma similar que en la leche, es decir, se emplean por ejemplo lactómetros para medir la densidad específica. No obstante la elaboración de los lácteos es diferente según el proceso que se haya realizado; por ejemplo algunos de ellos se han sometido a fermentación láctica (un ejemplo son los yogures); otros por el contrario, sufren un proceso mecánico de concentración de su contenido graso (mantequillas). A veces es posible un proceso combinado de fermentación y maduración (quesos). Estos procesos cambian la composición y la concentración inicial de ciertos macronutrientes y micronutrientes, depen-diendo del lácteo en cuestión.
Contenido proteínicoGran parte de los lácteos provienen del procesado de la le-che de la vaca que está compuesta principalmente de agua con un contenido aproximado de 4,8% de lactosa, 3,2% de proteínas, 3,7% de grasas y un 0,19% de contenido no proteínico, así como un 0,7% de cenizas. Las principales familias de proteínas en la leche son las caseínas, las pro-teínas de los sueros de leche y las inmunoglobulinas.
Contenido graso La leche de vaca, cabra, oveja y de otros animales, tiene un contenido graso de lípidos formados por glóbulos micros-cópicos de 1 – 4 mµ, en forma de emulsión agua – aceite. La mayoría de los lípidos lácteos son triglicéridos (97 – 98 %), el resto son:
Fosfolípidos 0.2 – 1 %Esteroles libres 0.2 – 0.4 % yTrazas de ácidos grasos.
Figura 18. Estructura química de la lactosa.
El siglo XX es el período donde la leche y los lácteos sufren una fuerte expansión en su consumo a lo largo de todo el planeta, las mejoras en los métodos artificiales de ordeña, alimentación y las mejoras en selección artificial de las especies; los avances tecnológicos en los procesos de transporte y refrigeración,
hicieron que se produjera la paradoja de la «sobreproducción» (paradójico, ya que se empezaba a extraer más leche con menos vacas). Al mismo tiempo se empezaron a abrir serios debates acerca de lo adecuado de sus valores nutricionales aplicados a una dieta sana.
319
Capítulo 3
Figura 19. Mujer elaborando mantequilla
Aproximadamente el 62% de de la grasa de la leche tiene un 30 % de ácidos grasos mono-insaturados (ácido oleico), 4 % de ácidos graso poli-insaturados.
Los productos lácteos contienen colesterol y está rela-cionado con la concentración de ácidos grasos que con-tengan. Por ejemplo una mantequilla con 80 % de ácidos grasos contiene 200 mg de colesterol por cada 100 g de producto.
Carbohidratos y otros
La lactosa es el principal carbohidrato de la leche, con un contenido del 5 %, es un disacárido formado de galactosa y glucosa y proporciona un 30 % del contenido energético de la leche. La lactosa no es soluble en agua y cuando la leche se agria se convierte en ácido láctico.
La leche también contiene minerales, como el calcio, fós-foro, magnesio, potasio y otros; y vitaminas, como la D, esenciales para la alimentación humana.
320320
Capítulo 3
LÁCTEOS CON FERMENTACIÓN
Una de las propiedades de la leche es que invita a la propia preservación: la propia leche tiene unos cultivos lácticos que permiten convertir sus azú-cares en ácidos, permitiendo de esta forma que la leche pueda preservarse durante períodos mayores. Este proceso hace que las propiedades de la le-che cambien sustancialmente dando lugar a una nueva gama de productos: productos fermentados de la leche gracias a la acción de las bacterias de la familia Lactobacillales (bacterias del ácido láctico). Algunas poblaciones como los escandinavos poseen una gran tradición en el uso de productos lácteos fermentados. Por regla general se producen en la leche tres tipos de fermentaciones: la primera es una fermentación láctica, donde mediante las bacterias lácticas se consumen los azúcares de la leche; la segunda ataca los albuminoides de la leche y la tercera se denomina fermentación butírica y ataca a las grasas.
El yogur es leche con un grado medio de fermentación al igual que las cremas de mantequilla como la crema agria, como la créme fraiche y el Smetana, muy popular en los países eslavos. En algunos casos las bacterias empleadas en la fermentación de la leche corresponden a los mesófilos denominados: Lactococcus lactis subsp. lactis/cremoris/diacetilactis y la Leuconoctoc cremoris, que trabajan a temperaturas dentro del rango de los 20°C–30 °C durante periodos de tiempo entre las 16 y 20 horas. Todos los productos lácteos contienen bacterias lácticas vivas, a menos que se haya procedido a su pasteurización tras la fermentación.
321
Capítulo 3
YOGUR
Yoğurt es el término turco para la «leche» que ha sido fermentada hasta lograr una forma final de masa semilíquida. El yogur permaneció desconocido en gran parte de Europa hasta que el premio Nobel concedido al inmunólogo Ilya Metchnikov (profesor del Instituto Pasteur de París que obtuvo el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1908) conectó la longevidad de algunas etnias en países tales como Bulgaria, Rusia o Francia con el consumo de este lácteo. El empleo del yogur está muy extendido en algunas gastronomías del Mediterrá-neo Oriental, donde se emplea como ingrediente principal de algunos platos y bebidas muy populares (ayran). En la India se consume el Lassi, que es una especie de yogur que se toma bebido. Una leyenda europea menciona que el yogur (y el kéfir) nace en las laderas septentrionales del monte Elbrus en el Cáucaso.
Uno de los productos lácteos fermen-tados que más se ha desarrollado es el yogur, que desde mediados del si-glo pasado se han producido diversas combinaciones de yogur con fruta, en este caso la fermentación se produ-ce por bacterias acidófilas como el Streptococcus thermophilus y el Lac-tobacillus delbrueckii bulgaris.
Para fabricar el yogur se fermenta la leche una temperatura de 30 a 43 °C durante 2.5 a 20 horas. La selección del cultivo define el tiempo de fermen-tación y el sabor del producto final. Cuando se le agrega fruta al yogur, esto se hace justo antes de empacar el producto en una proporción es del 15 % en peso.
Figura 20. Yogur
322322
Capítulo 3
QUESO
El queso es el producto lácteo de mayor antigüedad en la historia de la hu-manidad, es producido de la fermentación cuajada de leche de vaca, cabra, oveja, u otros mamíferos. El proceso consiste en cuajar la leche con cuajo o con quimosina obtenida por biosíntesis, con una ligera acidificación y agregado de cloruro de sodio.
La composición promedio del queso es:
35 – 55 % de agua. 10 – 40 % de proteína (caseína) 4 – 5 % de sales
La acidificación de la leche en el proceso de producción de queso se hace a través de bacterias existentes en el líquido lácteo.
Figura21.Queso
323
Capítulo 3
Algunas variantes de quesos frescos empleados como alimento lácteo para untar son:
Queso cottage - Se denomina así al queso no madurado, bien sea escaldado o no, de alta humedad en su interior, que posee textura blanda o suave, algo granular o cremosa, preparado con leche descremada coagulada con enzimas y/o por cultivos lácticos. Un ejemplo es la ricota de origen italiano.
Queso crema - es un queso joven y blando que se prepara al unir el cuajo seco del requesón con una mezcla cremosa de leche. A diferencia del queso cottage es ligeramente dulce. El cuajo seco de requesón tiene un contenido de materia grasa inferior al 0,5 %. Sin embargo, el requesón deberá tener un contenido graso no menor del 4%. Un ejemplo de este tipo de queso es el quark empleado en la cocina alemana.
OTROS PRODUCTOS LÁCTEOS FERMENTADOS
Dependiendo del cultivo de bacterias empleado en la fermentación láctica se pueden obtener diferentes productos lácteos; algunos de los más populares en las gastronomías de los Balcanes son el kumis y el kéfir que emplean diversos cultivos de bacterias: Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, el acetobacter y las levaduras que les proporcionan sabores y aromas característicos. El kéfir es técnicamente una bebida espumosa efervescente que por regla general se elabora a partir de leche entera tratada térmicamente a temperatura de 95ºC. Posee en su cuerpo gránulos gelatinosos de 2-15 mm de diámetro que están compuestos por una mezcla de microorganismos agrupados. En Suecia, uno de los productos lácteos más populares es el filmjölk, elaborado con cultivos mesófilos de la Lactococcus lactis y Leuconostoc mesenteroides. Algunos productos lácteos emplean leche de animales como el caballo, por ejemplo, la cocina mongola, en la que fermentan la leche de caballo en una bebida que recibe el nombre de airag.
Los lácteos probióticos son productos de leche fermentada con Lactobacillus y Bifidobacterium, ambos presentes en la leche, pero algunas veces no se desarrollan espontáneamente y debe estimular su producción, tal es caso del Yakult, producto de origen japonés que se consume en todo el mundo.
324324
Capítulo 3
INNOVACIÓN DE LOS PRODUCTOS LÁCTEOS FERMENTADOS
La reconocida aceptación de los productos lácteos los posiciona como instru-mentos efectivos al apoyo de la salud y bienestar del consumidor. En particular, las leches fermentadas han ayudado a mejor la salud intestinal, y su aceptación y popularidad continúan en ascenso. Estas constituyen una herramienta exce-lente para explotar su potencial y posibilidades de innovación.
Las innovaciones actuales incluyen fórmulas nutritivas en combinación de yogur con jugo de frutas (Smoothies), fórmulas reducidas en grasa o en car-bohidratos, bebidas lácteas fermentadas fortificadas con calcio, probióticos, extractos vegetales, adición de sabores exóticos, mezclas de sabores, empa-ques novedosos-convenientes y estrategias de segmentación de mercado. En el futuro inmediato es importante considerar la fortificación con proteínas y péptidos lácteos, los cuales poseen propiedades bioactivas como los regula-dores del sistema inmunológico, reguladores del metabolismo, control de peso y apetito, control de hipertensión y la promoción de la salud dental.
El reto para la industria de alimentos será el desarrollar productos lácteos fermentados, más allá de su calidad nutricional, sabor, conveniencia, o ino-cuidad. Los nuevos productos deben promover la salud y el bienestar del consumidor.
Los alimentos prebióticos (favorecen el crecimiento o actividad de la flora intestinal en el colon) y los simbióticos, (mezcla de los probióticos y de los prebióticos) se consideran alimentos lácteos. Los prebióticos introducen cultivos exógenos en el organismo y rara vez son digeridos en el tracto superior del intestino, debido en parte a la ausencia de enzimas capaces de romper los enlaces de hidrógeno de los monosacáridos y por esta forma actúan como fibras digestivas que se digieren en el colon.
325
Capítulo 3
19Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Hacer unta tabla que contenga los cinco siguientes productos: lácteos fermentados: leche fermentada, leche búlgara, leche de acidófilos, yogur y kéfir, con sus correspondientes microorganismos que lo producen y la descripción del producto.
326326
Capítulo 3
20Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Tomando como base las necesidades del mercado y la presión de la industria, indica los principales criterios de innovación en la producción de productos fermentados lácteos.
327
Capítulo 3
Actividad 1: a)
Gráfica del Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad específica de crecimiento de dos organismos Ay B
En cultivo continuo el valor de µm está determinado por la concentración de sustrato y es igual en estado estacionario a la velocidad de dilución (D). A valores de u = D < µz se tiene que µA > µB y por lo tanto el organismo A podrá ser seleccionado a pesar de que µmA < µmB (µz = valor de µ a partir del cual µB > µA).
b). a) Preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de sus propiedades bioquímicas; b) preservar los niveles de su productividad inicial; y c) lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad. Esto puede ser un factor esencial en la selección
de un método de preservación.
c). El método de preservación utilizado en los cultivos depende de sus características de crecimiento en diferentes medios. Los cultivos, en general, no son estudiados sistemáticamente debido a la imposibilidad de determinar si se ha tenido una alteración genética. En la mayoría de los casos sólo se observan la pigmentación, la morfología, las reacciones fermentativas, las propiedades microscópicas, etc.
Respuestas a las actividades
Figura 3. Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad específica de crecimiento de dos organismos A y B.
328328
Capítulo 3
a) En este caso se puede establecer la siguiente ecuación basada en la estequiometría:
0.585 C12 H22 012 + 3.205 02 + 0.61 NH3
C3,72 H6.11O1.95N0 .61 + 3.30 C02 + (Sacarosa)
(Biomasa) +4.29 H 20 + 387 Kcal.
En la ecuación anterior se representa la formación de 100 g de biomasa a partir de 200 g de sacarosa. En este caso no se han indicado los elementos menores como el P. el S, y el Mg, por eso es que la suma da 90.46 en lugar de 100. Esta es la demostración de que toda fuente de carbono se puede emplear para obtener biomasa y CO2.
b) La esterilización de gases y líquidos fundamentalmente es llevada a cabo por filtración mediante filtros absolutos o filtros fibrosos.
Los filtros absolutos son de materiales cerámicos, de vidrio o de metal sinterizado con poros tan pequeños que la penetración de los microorganismos no es posible.
Los filtros fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede ser lana de vidrio, amianto y esteres de celulosa, siendo las fibras de un diámetro variable de 0.5 a 15 micrones.
329
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Regulación de la síntesis de lisina en Corynebacterium glutamicum
330330
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Distintas penicilinas que pueden obtenerse en función del precursor de la cadena lateral y a partir del Penicillican chrysogenum.
331
Capítulo 3
Actividad 5
La producción de penicilina como otros procesos biotecnológicos está dominada por su aspecto competitivo entre los grandes laboratorios productores, que realizan permanentes esfuerzos de mejoramiento en cada área del proceso: cepa, fermentación y separación. El proceso a grandes rasgos implica el cultivo de Penicillican chrysogenum en reactores de volumen creciente hasta una escala de 500.000 l, separación del micelio por filtración y extracción del antibiótico del caldo, seguida por la cristalización o precipitación ácida del mismo.Las distintas penicilinas son producidas a partir de P. chrysogeizuin por adición de una apropiada cadena carboxílica en cantidad adecuada en el medio de cultivo; pero solamente tienen valor terapéutico la penicilina G y la V. Ambas tienen un espectro y actividad similar, pero la penicilina V es más estable a pH ácido, lo que permite su administración por vía oral.
Actividad 6Los procedimientos en medios líquidos son en general largos y requieren gran cantidad de material. La ventaja es que el proceso es controlado en condiciones relativamente comparables a las de producción en relación a agitación y aeración.El test en placas es más rápido, permite controlar un mayor número de colonias con menor material, pero en condiciones que no reproducen la fermentación en medio líquido. Se trata aquí de evaluar la cantidad de antibiótico excretado por una colonia. Una variante consiste en cubrir la placa con un celofán estéril y agregar sobre el mismo una capa de agar conteniendo el organismo indicador, incubando luego la placa toda la noche. De esta forma, las colonias de los mutantes son mantenidas libres de contaminación por el organismo sensible. En este caso el tamaño de la zona de inhibición es controlado por el espesor de la capa.
332332
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Actividad 7Se requiere de un vector de expresión, el cual debe ser capaz de entrar y replicarse dentro de ella. Un vector ideal debería ser pequeño, de fácil preparacióny replicación en la célula huésped, no generar productos tóxicos para la misma, poseer uno o más marcadores (resistencia a drogas, etc.) para facilitar una rápida y positiva selección y contener al menos un sitio donde se pueda integrar el ADN extraño sin destruir una función esencial (replicación).
Actividad 8Pueden ser ligadas, ya sea por el ADN ligasa del bacteriófago T4 si los extremos son romos, o por la acción de la ligasa de E. coli, o de T4 si son cohesivos.
Actividad 91.Mantenimiento n Cultivo puro. (PUREZA)2.Que esté viva (VIABILIDAD)3.La cepa debe guardarse genéticamente estable. (ESTABILIDAD)
Actividad 10
Método de elección o de conservación a largo plazo– Conservación por congelación– Conservación por liofilización
Métodos Alternativos– Conservación por transferencia periódica– Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar
estéril Actividad 11Recuento en cámara de Neubauer Es una cámara que se utiliza para contar glóbulos y está diseñada de manera de contener una cantidad fija de líquido. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos está, a su vez, dividido en 16 cuadrados.Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales, de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cámara. Esto determina que el líquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3.
333
Capítulo 3
Actividad 121. El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos días, así como para las operaciones de más larga duración.2. Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir las necesidades metabólicas de los microorganismos.3. El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.4. Debe tener un sistema para el control del pH.5. El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras.6. Debe existir un sistema para el control de la temperatura.7. Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas.8. El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento sean mínimas.9. El tanque debe ser versátil para la aplicación de diversas modalidades de procesos.10. Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea posible, soldaduras.11. La geometría del fermentador debe ser similar a otros tanques más pequeños o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos en diferentes escalas.12. Deben emplearse los materiales más baratos que proporcionen resultados satisfactorios.13. Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.
Actividad 13Los fermentadores más ampliamente utilizados en el nivel industrial están provistos de mecanismos de agitación, dispersión y aireación, así como de sistemas para el control de la temperatura, pH y formación de espuma.
Actividad 14Consiste en pasar el medio fresco a través de un biorreactor en el que por diversas técnicas hemos inmovilizado células (o enzimas). En el biorreactor se producen las transformaciones bioquímicas que deseamos y recuperamos el producto transformado tras su paso por la columna. Con este sistema se eliminan los problemas de desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo clásico y además el producto resultante está libre de células. Presenta el inconveniente de que no todos los microorganismos pueden inmovilizarse.
334334
Capítulo 3
Actividad 15 MAQUINARIA Y EQUIPO.A. Equipo de fermentación:Fermentadores continuos. Equipo de disolución de la melazaTanque de almacenamiento del caldo. Tanque medidor del caldo. B. Equipo de destilación:Columna de la masa. Columna del aldehido.Refrigerador del producto.Tanque de almacenamiento de polvo. Refrigerador. Máquina de entrega de residuos. Tanque medidor de alcohol. Columna del producto. Columna de tratamiento. Examinador de residuos. Columna de aceite combustible. Separador. Columna para el producto refrigerado. Precalentador de la masa. Columna para el producto refrigerado. Columna para el refrigerador de la base.Columna para el refrigerador. Columna para el refrigerador.Sistema de entrega de los desechos de gas.Columna para el refrigerador. C. Equipos de servicio:Caldera de vapor. Bombas de alcohol. Tanque de la masa. Bomba de agua. Panel eléctrico. Filtros de alcohol. D. Equipo automático:
Respuestas a las actividades
335
Capítulo 3
Sistema de entrega automática. Control automático de vapor. Registrador de temperatura. Controlador de flujo. Regulador automático de la masa o mezcla.E. Equipo de laboratorio:Medidor de pH. Microscopio. Medidor de viscosidad. Medidor de sacarosa.Fotómetro eléctrico. Medidor de atincado. Refractómetro.
Actividad 16La planta de alcohol etílico podría ser ubicada cerca de un suministro de caña de azúcar y del mercado de alcohol etílico con buenas facilidades de transportación. La mayor parte de la planta será ubicada en área abierta, pero el cliente podría requerir una estructura de concreto reforzada para soportar aquellos servicios ubicados en posiciones elevadas.
Actividad 17Se deben tener en cuenta criterios como el sustrato necesario y los posibles suplementos del mismo, la velocidad de crecimiento, productividad y rendimiento del sustrato, el pH y la temperatura, la aireación, morfología del crecimiento en el fermentador, seguridad y no patogenicidad, ausencia de productos tóxicos, facilidad de recuperación de las proteínas de organismos unicelulares, la composición proteica, el contenido de RNA (indeseable para la utilización humana)Los hongos tienen la capacidad de degradar un amplio rango de productos vegetales y son fáciles de recuperar por filtración, pero son difíciles de airear en su morfología filamentosa que optimiza la velocidad de crecimiento de los mismos. Por su parte las bacterias crecen muy rápidamente, pero exigen de refrigeración en el fermentador. Las bacterias y levaduras son más fáciles de airear pero más difíciles de recuperar que los hongos, exigiendo técnicas de sedimentación y centrifugación. Además, aunque las bacterias tienen mayor contenido proteico que los hongos, estos tienen un nivel mayor de RNA indeseable nutricionalmente.
336336
Capítulo 3
Actividad 18El término se refiere a un complejo formado por varias enzimas, presentes en diversas proporciones, capaces de actuar sobre pectinas y sus derivados. El grupo incluye:
1. Pectin esterasa, que actúa para desesterificar pectinas, removiendo los grupos metoxilo y produciendo ácido péctico.
2. Enzimas despolimerizantes que actúan principalmente sobre pectina, ácidos pépticos y protopectina.
Actividad 19 Productos con base en fermentación de la leche.Productos fermentados de leche
PRODUCTO MICROORGANISMOS DESCRIPCIÓNLeche fermentada
Streptococcus sp. Leuconostoc sp.
Fabricada con leche total o parcialmente descremada y pasteurizada.
Leche búlgaraLactobacillus bulgaricus
Leche fermentada con alta acidez y poco aroma.
Leche de acidófilos
Lactobacillus acidophilus
Leche fermentada por L. acidophilus. Esta leche se usa por su valor benéfico al tracto digestivo y mejora el estado de salud.
Yogurt
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus
Producto de leche con sólidos concentrados por evaporación o por la adición de sólidos de leche descremada. Producto con consistencia de budín.
Kefir Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Levaduras
Leche fermentada conteniendo ácido láctico y alcohol. Las bacterias lácticas producen ácido láctico, las levaduras producen alcohol.
Respuestas a las actividades
337
Capítulo 3
Actividad 20
- La preferencia del mercado por alimentos dulces ha sido determinante en la aceptación de productos lácteos como bebidas edulcoradas refrescantes y postres, y no sólo de alimentos con valor nutrimental.- La demanda por alimentos bajos en calorías se aprovecha para diseñar productos reducidos en grasa o en carbohidratos, dirigidos al apoyo de programas de reducción de peso en personas preocupadas por su figura.- Las campañas de promoción y comercialización, encaminadas a mejorar la imagen de estos productos en el mercado y aumentar así sus ventas.La orientación de la publicidad y su mensaje hacia las generaciones más jóvenes, quienes han respondido en forma entusiasta.
La investigación y desarrollo tecnológico realizados para lograr innovaciones en estos productos, puede conducir a un importante aumento en su aceptación.
338338
Capítulo 3
Actividad
Autoevaluación
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Fermentación de productos industriales1. El ámbito de la Biotecnología microbiana o Microbiología industrial se centra principalmente en:(a) La comercialización de cepas microbiana(b) Las actividades útiles de los microorganismos(c) La alimentación de los microorganismos(d) Los efectos perjudiciales de los microorganismos
2. ¿Cuál es la fuente más frecuente de aislamiento de una cepa de interés industrial?(a) Aislamiento directo de fuentes naturales, como agua, suelo, plantas y desechos.(b) De cultivos desarrollados en el laboratorio.(c) De microorganismos modificados genéticamente.(d) De enriquecimiento de cultivos mixtos, buscando favorecer el crecimiento del microorganismo deseado.
3. ¿Cuál es la principal característica que debe reunir la preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación.(a) Bajos requerimientos de nutrientes.(b) Que no requiera de micronutrientes o en una cantidad muy pequeña. (c) Que los nutrientes solo sean de origen animal o vegetal.(d) Que tenga factores de crecimiento adecuados para asegurar una alta productividad.
4. ¿Con qué finalidad se diseña un medio de fermentación?(a) Conocer los requerimientos nutricionales de las cepas por utilizar en el proceso fermentativo (b) Determinar la disponibilidad real de los componentes del medio de fermentación(c) Determinar los componentes necesarios para lograr el crecimiento de las cepas y la formación de los productos por fabricar. (d) Conocer los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de los productos de fermentación.
5.ANÁLISISDEUNCASO:sedeseadesarrollar una levadura para la industria vinícola y obtener 30 gramos de biomasa/ltenunfermentador.Determinalascondiciones del medio de cultivo, su formulación y optimización del proceso.
6.¿Quésignificaesterilización?(a) Es la remoción o destrucción por cualquier vía de organismos vivos que pueden causar daño particular o infección. (b) Es la exclusión continuada de microorganismos contaminantes. (c) Es la eliminación de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios físicos(d) Es el proceso que se utiliza para la destrucción de algunos de los microorganismos posiblemente presentes en materiales sensibles al calor como la leche y cerveza.
339
Capítulo 3
7. ¿Cuál es el primer aspecto para considerar en el desarrollo de de un procesofermentativo?(a) Determinación de la temperatura óptima(b) Determinación del pH (c) Determinación de la presión osmótica(d) Selección de una cepa microbiana apropiada
8. ¿En qué consiste la mutación inducida delosmicroorganismos?(a) La que ocurre cuando se produce una división celular(b) Es la mutación producida mediante el empleo de un mutágeno(c) Cuando el elemento mutagénico es desconocido(d) Es la mutación que ocurre espontáneamente9.¿Quésonlosmetabolitos?(a) Son elementos esenciales para la vida de un microorganismo (b) Son los nutrientes de los microorganismos(c) Son los oligoelementos que requieren los microorganismos en su alimentación(d) Es el producto eliminado por la célula debido a la permeabilidad de la membrana celular
10. ¿Cuál de las siguientes opciones es un metabolitosecundario?(a) Los aminoácidos(b) Los antibióticos(c) Las melazas(d) Las vinazas11. ¿Para qué se lleva a cabo la conservacióndecepas?(a) Para su regulación gubernamental(b) Para mantener la supervivencia de las cepas sin alteración genética(c) Para la manipulación de las cepas(d) Para el desarrollo de las cepas
12. ¿Cuál de los siguientes factores no afectalavelocidaddefermentación?(a) La textura de las células(b) La temperatura(c) La concentración de las cepas(d) La presencia de catalizadores
13. ¿Cuál es la función más específica de lasenzimasenlosprocesosfermentativos?(a) Actúan como inhibidores de los procesos fermentativos(b) No tienen ninguna función específica en la fermentación(c) Cambia las reacciones de fermentación(d) Aumenta la velocidad de fermentación
340340
Capítulo 3
14. ¿En qué modo de operación de las fermentaciones se introduce parte de la materia prima por procesarse al principio del proceso, luego se inocula la misma con el microorganismo seleccionado comenzando el proceso de la fermentación. Posteriormente se adiciona el resto de la materia prima durante el tiempo de la fermentación, utilizando un criterio preestablecidoparalarazóndealimentación?(a) Operación por lotes(b) Operación continúa(c) Operación semicontinua(d) Operación Fed-Batch
15. ¿Cuál grupo de tres parámetros son principalmente controlados en la operación de losfermentadores?(a) Temperatura, concentración del microorganismo y tamaño del fermentador(b) Temperatura, pH y concentración de oxígeno disuelto(c) Temperatura, densidad del caldo de fermentación y pH (d) Temperatura, diámetro del fermentador y producción de CO2
16. En la fabricación de un producto para elegir si se lleva a cabo por vía química o biotecnológica, se toman en cuenta varios factores, entre ellos ¿cuáleselmásimportante?(a) El tamaño del equipo(b) El transporte de la materia prima(c) El costo del proceso(d) La temperatura de operación del proceso
341
Capítulo 3
17. En la producción de etanol ¿cuál es la principal materia prima que se utiliza mayoritariamente?(a) El petróleo(b) Las melazas (subproducto en la fabricación de sacarosa)(c) Los cereales(d) Síntesis química
18. ¿Cuál de los ácidos orgánicos es el que se produceenmayorcantidadporfermentación?(a) El ácido cítrico(b) El ácido glucónico(c) El ácido acético(d) El ácido málico
19. ¿Cuáles fueron las dos enzimas que se produjeronprimero?(a) Renina y amilasa(b) Proteasa y lipasas(c) Isomerasa e invertasa(d) Pectinasa y esterasa
20.¿Quésonlosantibióticos?(a) Son microorganismos que curan enfermedades microbianas(b) Son cepas modificadas genéticamente para combatir enfermedades virales y bactereanas(c) Son extractos de plantas que curan diversas enfermedades actuando como bacteriostáticas y antifúngicas(d) Son substancias químicas producidas por organismos vivientes, en la mayoría de los casos, capaces de inhibir los procesos bacterianos y fúngicos
342342
Capítulo 3
Respuestas a la autoevaluación
1. (b)
2. (a)
3. (d)
4. (c)
5. Para tener una biomasa de levadura de 30 gal/ se deberá formular un medio de por lo menos con 60 g/lt de fuentes de carbono asimilable. Con respecto a la fuente de nitrógeno, ésta debe estar en concentración tal como para satisfacer las condiciones necesarias, como es 0.61 moles de NH3 o sea 10.37 g de amoníaco, lo que representa 8.54 g de N2. Ya tenemos por lo tanto la cantidad de la otra fuente fundamental a ser agregada. Del conocimiento de la composición centesimal de otros componentes menores se pueden establecer así las cantidades por agregar.
Por otro lado, sabes que la levadura necesita para crecer algunas vitaminas del grupo B como la biotina, tiamina, ácido pantoténico, etc. Esas vitaminas deben estar por lo tanto presentes en el medio. Como el proceso de producción de levadura es un proceso industrial que interesa desarrollar con costos de producción mínimos, es conveniente estudiar las fuentes de carbono, nitrógeno y de vitaminas y minerales más económicos y disponibles que puedas encontrar. Surge así la elección lógica de las melazas de caña de azúcar o de remolacha que reúnen la mayor parte de las condiciones. Para evitar la formación de alcohol y maximizar la producción de biomasa se debe implementar una alimentación programada utilizando melaza como sustrato limitante, de lo cual resulta la elección de un sistema de lotes alimentado para la producción.
Para llevar a cabo una optimización del medio de cultivo para el desarrollo de la levadura deberán considerarse las situaciones siguientes:
1) No existencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de macro y microelementos para el cultivo de la levadura.
2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento.
343
Capítulo 3
3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales de la levadura en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.
4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formación del producto.
5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
6. (c)
7. (d)
8. (b)
9. (a)
10. (b)
11. (b)
12,- (a)
13. (d)
14. (d)
15. (b)
16. (c)
17 (b)
18. (c)
19. (a)
20. (d)
