32 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigacion

En julio de 1982, empezaron a llegar a las consultas de Neurologfa del norte de California algunos j6venes que presentaban intensos y graves sfntomas (Langston, Ba llard , Tetrud e Irwin, 1983). Los pacientes mas gravemente afectados estaban casi paralizados por completo. No podfan hablar de manera inteligible, salivaban constante­mente y tenfan los ojos siempre abiertos, con Ia mirada fij a. Otros, menos graves, andaban con un paso Iento, vaci lante, moviendose despacio y con gran dificultad . Los sfntomas se parecfan a los de Ia enfermedad de Parkinson , pero este tras­torno se va manifestando gradual mente. Ademas, rara vez se da antes del final de Ia vida adulta y los pacientes estaban todos ell os entre los veinte y los treinta a nos de edad.

El factor comun que relacionaba a estos pacientes era el consumo de drogas por via intravenosa: todos habfan tornado una «herofna nueva», un opioide sintet ico relacionado con Ia petidi na (Demerol). Ciertas pesquisas revelaron que Ia droga ilfcita estaba contam inada con un producto qufmico que dana a las neuronas dopaminergicas y provoca los sfntomas neurol6gicos. Dado que los sfntomas eran simi lares a los de Ia enfermedad de Parkinson, se trat6 a los pacientes con 1-dopa [levodopa] , el farmaco que se utiliza en el tratamiento de dicha enfermedad, y todos ell os mostraron una mejorfa sig­nificativa de sus sfntomas. Lamentablemente, Ia mejorfa fue temporal: Ia droga dej6 de ser eficaz.

El trasplante de neuronas fetales, un metoda neuroqui­rurgico experimental para tratar el parkinsonismo, ha resul­tado hasta cierto punto prometedor. El fundamento de este procedimiento es el sigu iente : los sfntomas parkinsonianos, ya sean debidos a Ia enferm edad de Parkinson o a los efec­tos t6xicos del MPTP, se deben a Ia falta de dopamina en el nucleo caudado y el putamen . Por el momenta no se puede inducir el desarrollo de nuevas neuronas dopam inergicas en el encefalo. Sin embargo, si se pueden injerta r neuronas secre­toras de dopamina en el nucleo caudado y el putamen, y si estas sobreviven y secretan dopamina , entonces tal vez los

E I estudio de Ia Fisiologfa de Ia Conducta implica el esfuerzo de investigad ores de muchas disci­plinas cientfficas, incluyendo Ia Fisiologfa, Ia Neuroanatomia, Ia Bioqufmica, Ia Psicologfa,

Ia Endocrinologfa y Ia Histologfa. Llevar a cabo un pro­yecto d e investigaci6n en Neurocien cia comportamen­tal requiere dominar much as tecnicas experimentales. Puesto que diferentes procedimientos llevan a m enudo a resultad os contradictorios, los investigadores han d e estar familiarizados con las ventaj as y las limitaciones de los metodos que emplean. En este sentido , Ia investiga­ci6n cientffica conlleva un proceso de cuestionarse emi l es la n aturaleza de los fen 6m e n os, y el metoda q4e se utiliza enmarca Ia cuesti6n . Con frecu encia se obtie ne

sfntomas parkinsonianos dism inuyan . Puesto que las neuro­nas implantadas han de estar indemnes, ser resistentes y no desencadena r Ia reacci6n del sistema inmunitario del recep­tor, lomas razonable es obtener las de fetos humanos abor­tados - o, quiza algun dfa, de cu lt ivos de hemocitoblastos (celu las madre) estimulados para convertirse en neuronas secretoras de dopamina- .

AI menos a uno de los afectados porIa in toxicaci6n con MPTP se le realiz6 este tipo de trasplante. (Liamemosle Sr. B.). Antes de que tuv iera Iugar Ia intervenci6n, se le inyect6 1-dopa rad ioacti va , sustancia precursora de dopamina. Luego, una hora mas tarde, se le condujo a una pequefia sala en Ia que habfa un equipo de TEP. Su cabeza fue situada dentro del apa rato y durante varios minutos Ia maquina obtuvo datos de los positrones que se em itfan, en forma de partfculas radioac­ti vas, en su trastornada cabeza .

Unas cuantas semanas mas tarde, el Sr. B. ingres6 en el hospital para someterse a una intervenci6n quirurgica . El eq uipo medico extrajo neuronas dopam inergicas de Ia sus­tancia negra de var ios fetos abortados y las prepar6 para implantarlas en el cerebra del Sr. B. Este estaba anestesiado y el ciru jano le hizo unas incisiones en el cuero cabelludo para dejar al descubierto partes de l craneo. Acop l6 el soporte de un instru mento estereotaxico a su craneo, tom6 algunas medi­das y lu ego taladr6 varios orificios. Utiliz6 el instrumento este­reotaxico para dirigir Ia inyecci6n de las neuronas fetales al nucleo caudado y el putamen del Sr. B. Una vez rea lizada Ia inyecci6n, el cirujano retir6 el soporte estereotaxico y sutur6 las incisiones rea lizadas en el cuero cabellud o.

La operaci6n tuvo un exito cons iderable: el Sr. B. recu­per6 en gran parte el control motor. Poco mas de una no des­pues se le volvi6 a inyectar 1-dopa radioactiva y de nuevo se le co loc6 1a cabeza en el equipo de TEP. Los resultados de esta segunda exp loraci6n indicaron lo que sign ificaba su recupe­raci6n: las ce lulas habfan sobrevivido y estaban segregando dopam in a.

una respuesta que extraiia, hasta que m as tarde se cae en Ia cuenta de que nose estaba planteando Ia pregunta correcta. Como se vera, las m ej o res conclusiones sobre Ia Fisiologfa de Ia Conducta no se extraen de un unico experimento, sino de un program a de investigaci6n que permite comparar los resultados de estudios que abor­dan el mismo problem a con m e todos diferentes.

Los investigadores dispon en d e una enorme - y sor­prendente- serie d e m etod os d e investigaci6n . Si se presentara aquf tan solo u n inventario de ellos, n o serfa de sorprender que ellector se p erdiera o , simplem en te, perdiera interes. En vez de ello, se presentanin u n ica­men te los procedimientos m as importantes y u tilizad os con m ayor frecue n cia, es tructurados en torno a u nos

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cuantos problemas que h an estudiado los investigadores. De esta manera, debera resultar mas facil darse cu enta del tipo de informacion que aportan los diversos meto­dos de investigacion y entender sus ventajas y desven­tajas. Tambien permitira describir las estrategias d e las que se val en los investigadores p ara dis61.ar y realizar un experimento basandose en los resultados de l anterior.

ABlACION EXPERIMENTAl

Uno de los principales m etodos de investigacion utili­zados para es tudiar las funciones cerebrales r equiere destruir una parte d el encefalo y evaluar Ia conducta subsecuente d e l animal. Este metoda se d e n omina ablacion experimental (de l termino Iatino ablatus, << lle­varse de»). En Ia mayor! a de los casos, dicha tecnica no implica extraer el tejido cerebral, en vez de ello, el inves­tigador destruye algo de tejido y lo deja en su sitio. La ablaci6n experimental es el m as antiguo de los metodos utilizado en Neurociencia y sigue utilizandose frecu en­temente hoy en dfa.

Evaluaci6n de los efectos comportamentales del dono cerebral

Una lesion es una herida o un traumatismo, y un investi­gador que destruye una parte del cerebra por lo general describe el dai'io como una lesion cerebral. Los experimen­tos en los que se dal'i.a una parte del e ncefalo y despues se observa Ia conducta del animal se Haman estudios de lesion. Su fundam ento teorico es que Ia funcion de un area cerebral puede d educirse basandose en las conduc­tas que e l animal ya no puede realizar despues de que se h aya d estruido dicha area. Por ejemplo, si despues de que se haya destruido parte del encefalo de un ani­mal este ya no puede realizar tareas que requieren ver, se puede concluir que el animal esta ciego y que el area danada desempei'ia alguna funcion en Ia vision.

2Que es e n realidad lo que se puede aprender d e los estudios de lesion? Nuestro objetivo es descubrir cui ­les son las funciones que cumplen las diferentes regio­n es cerebrales y luego en tender como se combinan estas funciones para dar Iugar a determinadas conductas. La distincion entre junci6n cerebraly conductaes importante . Asi, los circuitos que hay en el encefalo realizan funcio­n es, no conductas. Ninguna region cerebral o circuito n eural es el unico responsable de una conducta: cada region desempena una funcion (o una serie de funcio­n es) que contribuye a Ia ejecucion de Ia conducta. Por ej emplo, el acto de leer implica funciones que requie­ren controlar los movimientos oculares, enfocar Ia lente

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta

del ojo, percibir y reconocer palabras y letras, comprer der el significado de las palabras, etcetera. No obstantt algunas de estas funciones participan tambien en otra conductas. Por ejemplo, el control del movimiento d. los ojos y del enfoque se necesitan para cualquier tare; que requiera mirar, asf como los mecanismos ce rebra les que se utilizan para comprender el significado dt las palabras inte rvienen tambien en Ia comprensi6n de. habla. La tarea del investigador es com pr'ender cual e~

son las funciones que se necesitan para llevar a cabo una conducta especffi ca y determinar cuales son los circui­tos de n euronas cerebrales responsables de cada una de esas funciones.

La interpretacion de los datos de los estudios de lesion se complica por e l hecho de que todas las regio­n es del e ncefalo estin conectadas en tre sf. Supongamos que sabemos bien las funci on es que se requieren para que se lleve a cabo una determinada conducta y descu­brimos que Ia lesion de Ia estructura X altera una deter­minada conducta: 2hemos de concluir forzosamente que los circuitos neuronales localizados en dich a estructura cumplen una funci6n esencial en esa condu cta? Lamen­tablemente, no. Puede que, de hecho, Ia funcion que nos interesa Ia realicen circui tos neurales que se locali­zan en otra p arte del encefalo y que Ia lesion de Ia estruc­tura X tan solo interfiera en el normal funcionamiento de los circuitos neut-ales d e Ia estructura Y

Realizaci6n de lesiones cerebrales

2Como se efectu an las lesiones ce rebrales? Destruir las partes del encefalo que se encuentran jus to debajo del craneo es facil: se anestesia a! animal, se h ace una inci­sion en el cuero cabelludo, se extrae una parte del cra­neo y se corta Ia duramadre, dejando a! descubierto Ia corteza. Se puede utilizar enton ces un dispositivo de suc­,cion para aspirar el tejido cerebral, y para extirparlo se situa una pipeta de vidrio sobre Ia superficie del ence­falo y se su cciona el tejido con una bomba d e vado unida a Ia pipeta .

Lomas frecuente es que Ia region que se quiere des­truir este oculta en el interior del encefalo. Las lesiones cerebrales de regiones subcorticales -region es locali­zadas debajo de la corteza- se realizan por lo general hacienda pasar una corrien te electrica a traves d e un electrodo de acero inoxidable que, salvo en Ia punta, esta cubierto por un barniz aislante electrico. Se gufa el electrodo siguiendo un metoda estereotaxico, de modo

ablaci6n experimental Exrirpaci6n o destrucci6n de una pane del encefalo de un animal de laboratorio. Se supone que las fun cio­nes que ya no pueden real izarse son las que dicha region conrro­laba previamente.

estudio de lesion Sin6nimo de ablaci6n experimental.

34 Capitulo 2 Metod as y procedimientos de investigocion

que su extremo llegue a! Iugar adecuado. (La cirugfa estereot:ixica se describe en el proximo subapartado). Luego, recurrimos a un instrumento para producir lesiones, que produce una corriente de radiofrecuencias (RF) - corriente alterna de frecuencia muy elevada- . El paso de Ia corriente a traves del tejido cerebral pro­duce una alta temperatura, que destruye las celulas cer­canas a Ia region que rodea Ia punta del electrodo (vease Ia Figura 2.1) .

Las lesiones producidas con este metodo destruyen todo lo que se encuentra en las cercanfas de Ia punta del electrodo, incluyendo los somas neuronales y los axones de las neuronas que atraviesan Ia region. Un metodo mas selectivo d e producir lesiones cerebrales es emplear un aminoacido excitador como el acido cainico, que destruye las neuronas estimulandolas hasta destruir­las. (El acido cafnico estimula los receptores glutama­tergicos). A este tipo d e lesiones se les llama lesiones excitot6xicas. Cuando se inyecta a traves de una canula un aminoacido excitador en una region ce rebral, este destruye los somas celulares vecinos, pero no los axones de las diferentes n euronas que pasan por los alrededo­res (vease Ia Figura 2.2) . Esta selectividad le permite a! investigador determinar si los efectos comportamentales de Ia destruccion de una estructura cerebral concreta se deben a Ia muerte de las neuronas que allf se Jocalizan

Figura 2.1 ~~ Lesion por radiofrecuencia

Las flechas seiialan minusculas lesiones producidas par el paso de una corriente de radiofrecuencia a traves de los extremos de electrodos de acero inoxidable, situados en el nucleo preoptico medial del encefalo de una rata. (Seccion frontal, tincion de cuerpos celulares).

(De Turkenburg, j. L.; Swaab, D. F.; Endert, E.; Louwerse, A. L. , y Van de Poll , N. E. Brain Research Bulletin, 1988,21, 215-224. Reprodu­cido con autorizaci6n.)

Figura 2.2 ~~ Lesion excitotoxica

(a) En esta seccion puede verse el hipocampo intacto del en­cefalo de una rata. (b) Lesion producida par Ia infusion de un aminoacido excitador en una region del hipocampo. Las puntas de flecha seiialan los lfmites de Ia region en Ia que se han destruido las neuronas.

(Cortesfa de Benno Roozendaa l, University of California, Irvine.)

(a)

(b)

o a Ia lesion de los axones que pasan cerca. Por ejem­plo, unos investigadores descubrieron que las lesiones por RF de una region determinada del tronco del ence­falo abolfan el su eiio REM, por lo tanto creyeron que esa region participaba en e l establecimiento de dicha fase del sueJ'io. (El sueiio REM es Ia fase del sueiio en Ia que tienen Iugar los ensueiios) . Pero estudios poste­riores demostraro n que cuando se utiliza acido cafnico para destruir las neuronas que contiene esa region, e l sueiio de los animales no resulta afectado, de modo que las lesiones por RF debieron alterar el sueiio a! destruir los axones que a traviesan el area.

lesion excitotox.ica Lesion cerebral producida por Ia inyecci6n en el cerebra de un aminoacido excitador, como por ejemplo el acido cafnico.

I Se dispone, incluso, de metodos mas especlficos para marcar y lesionar un tipo determinado de neuronas. Por ejemplo, los biologos moleculares han ideado pro­cedimientos para incorporar sustancias qufmicas toxicas a los anticuerpos, los cuales se uniran con determina­das protefnas que se encuentran solo en ciertos tipos de neuronas del cerebro. Los anticuerpos alcanzan estas protefnas y las sustancias qulmicas toxicas destruyen las celulas a las que estan unidas las protefnas.

Reparese en que cuando se producen lesiones sub­corticales mediante corriente de RF a traves de un elec­trodo o por infusion de una sustancia qufmica a traves de una canula, siempre se causan daiios adicionales en el encefalo. Cuando se introduce un electrodo o una canula en el encefalo para alcanzar el objetivo que se pretende, inevitablemente se produce un cierto grado de lesion incluso antes de activar el dispositivo de lesion o de iniciar Ia infusion. Por lo tanto, no podemos limi­tarnos a comparar Ia conducta de los animales lesio­nados con Ia de animales de referencia, o controles, intactos. Puede que, en realidad, Ia causa de alguna de las alteraciones comportamentales que se observan sea el daiio fortuito de las regiones cerebrales situadas por encima de Ia lesion. Lo que se hace, entonces, es interve­nir quinirgicamente a un grupo de animales y producir­les una lesion falsa. Para ello, se anestesia a cada animal, se le coloca en el a para to estereotaxico (que se describe mas adelante), se le hace una incision en el cuero cabe­lludo, se le trepana el craneo y se inserta el electrodo o Ia canula, haciendo que penetren hasta Ia profundidad adecuada. En otras palabras, se hace lo mismo que se harfa para producir Ia lesion, excepto activar el dispo­sitivo de lesion o iniciar Ia infusion. Este grupo de ani­males sirve de grupo de referencia: si Ia conducta de los animales con una lesion cerebral es diferente de Ia de los animales de referencia con una lesion falsa, se puede concluir que las lesiones sonIa causa de las alteraciones comportamentales. (Como se puede advertir, una lesion falsa tiene Ia misma finalidad que un tratamiento pla­cebo en los estudios farmacologicos) .

La mayorfa de las veces los investigadores producen lesiones cerebrales permanentes, pero en algunas oca­siones resulta provechoso impedir temporalmente Ia actividad de una determinada region del encefalo. La forma mas sencilla de hacerlo es inyectar un anestesico local o un farmaco llamado muscimol en el Iugar ade­cuado del encefalo. El anestesico bloquea los potencia­les de accion en los axones que entran o salen de esa region yes eficaz para producir una lesion temporal (Ha­mada habitualmente lesion cerebral reversible). El mus­cimol, un farmaco que estimula los receptores GABA, inactiva una region del encefalo al inhibir a las neuronas allf localizadas. (Se recordari que el GABA es el princi­pal neurotransmisor inhibidor en el encefalo).

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 35

Cirugfa estereotaxica

~Como se puede situar Ia punta de un electrodo o una canula en un Iugar preciso del interior del encefalo de un animal? La respuesta es mediante cirugia este­reotaxica. Stereotaxis significa literalmente << disposicion solida>> y, en concreto, se refiere a Ia capacidad de loca­lizar objetos en el espacio. Un aparato estereotaxico consta de un soporte que inmoviliza Ia cabeza del animal en una posicion establecida y un brazo que desplaza el elec­trodo o Ia canula en los tres ejes espaciales a lo largo de distancias cuantificables. No obstante, para realizar una intervencion estereotaxica primero se ha de consultar un atlas estereotaxico.

El atlas estereotaxico

No existen dos encefalos de animales de una determi­nada especie que sean completamente identicos, pero Ia semejanza entre los individuos es suficiente para pre­decir Ia localizacion de una estructura cerebral concreta respecto a las caracteristicas externas de Ia cabeza. Por ejemplo, un nucleo subcortical de Ia rata puede estar a tantos milfmetros en los pianos ventral , anterior y lateral de un pun to formado porIa confluencia de varios huesos del craneo. La Figura 2.3 muestra dos vistas del craneo de una rata: un dibujo de Ia superficie dorsal y, debajo, una vista sagital medial (vease Ia Figura 2.3). El craneo se com pone de varios huesos que crecen juntos y for­man suturas (puntos de union) . En Ia cabeza de los niiios recien nacidos hay un punto blando en donde se unen las suturas sagital y coronal, llamado fontanela. Cuando esta abertura se cierra, Ia union se denomina bregma, de Ia palabra griega que significa << parte anterior de Ia cabeza>>. Tambien se observa bregma en el craneo de una rata, y sirve como un uti! punto de referencia. Si el cra­neo del animal esta orientado tal como se representa en Ia ilustracion, una determinada region del encefalo siem­pre se encuentra en una posicion bastante constante en el espacio, tomando bregma como referencia.

Un atlas estereotaxico incluye fotograffas o esque­mas que corresponden a secciones frontales, tomadas a

lesion falsa Procedimienro placebo que reproduce rodas las eta­pas para producir una lesion cerebral, excepto Ia que en realidad Ia provoca.

cirugia estereotaxica Cirugia cerebral que utiliza instrumenral estereot:ixico para situar un electrodo o una canula en una posicion espedfica del encefalo.

bregma Union de las suturas sagital y coronal del craneo. A menudo se utiliza como punro de referencia en Ia cirugia estereot:ixica.

atlas estereotaxico Recopilacion de esquemas de secciones del encefalo de un determinado animal, con medidas que proporcio­nan coordenadas para Ia cirugia estereot:ixica.

36 Capitulo 2 Metod as y procedimientos de investigocion

Figura 2.3 ~~ Encefalo y craneo de rata

La figura muestra Ia relaci6n entre las suturas del craneo y el encefalo de una rata y Ia localizaci6n del objetivo don­de situar el electrodo. Arriba: vista dorsal. Abajo: vista sagi­tal medial.

Bregma

Contorno de Ia incision

~ .. ,.

Se perforara aqui un agujero por encirna del objetivo de Ia lesion (vease Figura 2.4)

diferentes distancias rostrales y caudales a bregma. Por ej emplo, en Ia pagina representada en Ia Figura 2.4 hay un esquema de una seccion del encefalo en Ia que se halla una estructura cerebral (que seve en rojo) que le interesa a! investigador. Si este quisiera colocar Ia punta de un electrodo en di cha estructura ( e l fornix), tendrfa que perforar el craneo justo por encima de ella (vease Ia Figura 2.4). Cad a pagina de l atlas estereotaxico esta ide ntificada conforme a Ia distancia d e Ia seccion ante­rior o poste rior respec to a bregma, y Ia cuadrfcula de cada pagina indica las coordenadas d e las estructuras ce rebrales e n el plano ventral a Ia p arte superio r del craneo y late ral a Ia linea media. Para situar Ia punta de un electrodo en el fornix habrfa que hacer un tala­dro por en cima de l objetivo y luego bajar el electrodo por el orificio hasta que su punta este e n Ia profun­didad correcta, en relacion a Ia altitud del craneo en bregma ( comparense las Figuras 2.3 y 2.4) . Asf, locali­zando una estructura neural (que n o se puede ver e n el animal d e experimentacion) en una de las paginas de un atlas estereotaxico, se puede determinar su localiza­cion respecto a bregma (que sf se puede ver). Hay que tener en cuenta que , debido a variaciones en Ia cepa y edad de los animales , la localizacion que proporcionan los atlases solo aproximada, por lo que siempre hay que probar con una nueva serie d e coordenadas, seccionar y

Figura 2.4 ~~ Atlas estereotaxico

En esta pagina de muestra de un atlas estereotaxico se re­presenta un encefalo de rata . El objetivo (fornix) se ha resaltado en rojo. Para facilitar su comprensi6n , se han suprimido los r6tulos de las estructu­ras.

(Modificado de Swanson, L. W.: Brain Maps: Structure of the Rat Brain. Nueva York: Elsevier, 1992.)

Objetivo de Ia lesion

teiiir el encefalo del animal, comprobar Ia localizacion exacta d e Ia lesion, corregir los valores y volver a inten­tarlo. (Los metodos de seccion y tincion cerebral se des­cribiran mas adelante).

El instrumento estereotaxico

Un instrumento estereotcixico funciona siguiendo prin­cipios sencillos. El dispositivo incluye un soporte para Ia cabeza, que mantiene el craneo del animal en la ubica­cion adecuada, un soporte para el e lectrodo y un meca­nismo de graduacion por el que se mueve este ultimo soporte en distancias ponderadas a lo largo de los tres ejes espaciales: ante rior-pos terior, dorsal-ventral y late­ral-medial. En Ia Figura 2.5 se presenta un instrumento estereotaxico diseiiado para animales pequeiios. Se pue­den utilizar varios tipos de soportes de cabeza con el fin de adaptar este instrumento a diferentes especies, como ratas, ratones , hamsteres, palomas y tortugas (vease Ia Figura 2.5).

Una vez que se han obtenido las coordenadas este­reotaxicas a partir de un atlas estereotaxico, se an estesia a! animal, se le coloca en el instrumento estereotaxico

instrumento estereot:ixico Dispositivo que perm ire a un ciruj ano siruar un electrodo o una canula en una parte concreta del ence­falo.

Figura 2.5 ~~ Instrumental estereotaxico

Este equipo se uti liza para realizar cirugfa cerebral en ratas.

Electrodo en el encefalo

y se le hace una incision en el cuero cabelludo. Se loca­liza bregma, se marcan los numeros apropiados en el aparato de estereo taxia, se taladra el cni neo y se intro­duce el dispositivo en el encefalo hasta las coordenadas correc tas. Ahora la punta de la canula o d el electrodo esta donde se queria que estuviese y se puede efectuar Ia lesion.

Evidentemente, la cirugia estereotaxica puede uti­lizarse para otros fin es distin tos que producir lesiones. Los electrodos situados en el encefalo pueden emplearse tanto para estimular n euronas como para d estruirlas, y se pued e n inyectar farmacos que estimule n neuronas o bloqueen receptores especfficos. Tambien se pueden implantar canulas 0 e lec trodos perm anentes , siguiendo un procedimiento que se describira luego en este capi­tulo . En cu alquier caso, una vez finalizada la interven­cion quir(Jrgica, se cose la h erida, se retira al animal del instrumento estereo taxico y se deja que se recupere de Ia anestesia.

A proposito, tambien h ay equipos estereotaxicos para seres humanos. En ocasiones, los neurocirujanos efec­tuan lesiones subcorticales -por ejemplo, para reducir los sfntom as de Ia enfermedad de Parkinson- . En estos casos, por lo general, se valen de multiples puntos d e referencia y verifican la localizacion d el electrodo ( o d e otro dispositivo) insertado en el encefalo tomando ima­genes de RM o registrando las actividades de las neuro­nas en esta region antes de producir la lesion cerebral (vease la Figura 2.6) .

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 37

Figura 2.6 ~~ Cirugia estereotaxica en un paciente

(Fotografia por cortesfa de john W. Snell , University of Virgin ia Hea lth System.)

Metodos histol6gicos

Despues de haber producido una lesion cerebral y obser­vado sus efectos en la conducta d el animal, h ay que sec­cionar y teiiir el tejido cerebral de m od o que se pueda inspeccionar con el microscopio y localizar e llugar de la lesion . A m enudo, las lesion es cerebrales yen-an su obj e­tivo, por lo que hay que verificar la localizacion exacta del da1'io cerebral d espues de examin ar el comporta­miento d e l animal. Para e llo se necesita fij ar, seccio­nar, te1'iir y examinar el en cefalo. Tornados en con junto, estos procedimientos se denominan metodos histol6gicos. (El prefijo histo- h ace alusion al tej ido corporal).

Fijaci6n y obtenci6n de cortes histol6gicos Si se pretende estudiar el tejido tal com o era en e l momento de la muerte del o rgan ismo, se h an de d es­truir las enzimas autolfticas ( aut6lisis significa <<autodiso­lucion>>) , ode lo contrario estas convertiran al tejido en una m asa deforme. Tambien hade mantenerse el tej ido en buenas condicion es para evitar que se d escomponga por Ia accion de bacterias o mohos. Con el fin de lograr estos dos objetivos, se sumerge e l tejido n eural en un fijador. El que mas frecuen tem ente se utiliza es el for­mol, solucion acuosa de formalde hfdo, un gas. El fo rmol detiene Ia autolisis, endurece el tej ido, que es extrema­damente blando y fragil , y elimina cu alquier microorga­nismo que pudie ra destruirlo .

formol Solucion acuosa del gas formaldehido, el fijador mas habi­tual para tej idos corporales.

38 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigocion

Antes de f~ar el encefalo (es decir, de ponerlo en una soluci6n f~adora), por lo general se perfunde. La perfusion del tejido (Iiteralmente, <<fluir a traves de>>) supone extraer Ia sangre y susti tuirla con otro lfquido. El encefalo del animal se perfunde porque se obtienen mejores resultados histol6gicos cuando no hay sangre en el tejido. El animal cuyo encefalo va a estudiarse se sacrifica humanitariamente mediante una sobredosis de un anestesico general. Se abren los vasos sangufneos de forma que se puedan vaciar de sangre, reemplazandola por una soluci6n salina diluida. Se extrae el encefalo del craneo y se coloca en un recipiente que contiene el f~ador.

Una vez fijado el encefalo, hay que seccionarlo en delgadas laminas y teiiir diversas estructuras celulares con el fin de examinar pormenorizadamente su estruc­tura. Las secciones se efectuan con un microtomo (lite­ralmente, << aquello que corta en finas laminas»). Las secciones que se preparan para examinarlas al micros­copio 6ptico suelen tener un espesor de 10 a 80 rm, y las que se preparan para el microscopio electr6nico, por lo general menos de lrm. (Por alguna raz6n, los cortes de tejido cerebral sue len denominarse secciones).

Un micr6tomo consta d e tres partes: una cuchilla, una plataforma don de se coloca el tejido y un mecanismo que hace avanzar Ia cuchilla ( o Ia plataforma) lo jus to despues de cada corte, de modo que pueda cortarse otra secci6n. En Ia mayorfa de los casos, Ia plataforma incluye un accesorio que congela el encefalo, endureciendolo lo suficiente para poder cortarlo en finas secciones. En Ia Figura 2.7 se muestra un micr6tomo. El soporte de Ia cuchilla se desliza hacia delante sobre un riel engra­sado y asf se obtiene una secci6n de Ia parte superior del tejido f~ado a Ia plataforma. Esta sube automatica­mente a una altura predeterminada cuando Ia cuchi­lla y el soporte son empujados de nuevo hacia atras, de manera que el siguiente movimiento hacia delante de Ia cuchilla corta otra secci6n (vease Ia Figura 2. 7).

Figura 2.7 ~~ Micr6tomo

Tras haber cortado el tejido, las secciones se montan sobre portaobjetos de vidrio y pueden entonces teiiirse sumergiendo el portaobjetos en diversas soluciones qui­micas. Por ultimo, las secciones teiiidas se cubren con una pequeiia cantidad de lfquido transparente, cono­cido como media de montaje, y se coloca una lamina de

Animaci6n 2.1 Metodos histologicos

Tinci6n

crista! muy fina (cubreobje­tos) sobre elias. El medio de preparaci6n mantiene fijo el cubreobjetos. En MyPsychKit 2.1 Metodos histologicos, pueden verse estos procedimientos.

Si se observa al microscopio una secci6n de tejido cere­bral sin teiiir, se podran ver los contornos de algunas masas celulares grandes y los fascfculos de fibras mas destacados, pero no se dejaran ver los detalles mas finos . Por esta raz6n , el estudio de Ia neuroanatomfa micros­c6pica requiere tinciones histol6gicas especificas. Los investigadores han creado muchas tinciones diferentes para identificar sustancias especificas en el interior o el exterior de las celulas. Para verificar Ia localizaci6n de una lesion cerebral se utilizara una de las mas simples: Ia tinci6n de los somas celulares.

A finales del siglo pasado, Franz Nissl, un neur6logo aleman, descubri6 que un tinte, llamado azul de metileno, podfa teiiir los somas celulares del tejido cerebral. El mate­rial que capta el tinte, conocido como sustancia de Nissl, esta formado por ARN, ADN y protefnas asociadas localizadas en el nucleo y dispersas, en forma de granulos, por el cito­plasma. Ademas del azul de metileno se pueden utilizar muchos tintes para teiiir los somas celulares, pero el que mas se emplea es el violeta de cresilo. Por cierto, los tintes no se desarrollaron expresamente con fines histol6gicos sino que, en un principio, se fabricaron para te!'i.ir telas.

El descubrimiento de las tinciones de somas celula­res hizo posible identificar masas nucleares en el ence­falo. En Ia Figura 2.8 se representa una secci6n frontal de un encefalo de gato teiiida con violeta de cresilo. Reparese en que se pueden distinguir los fasciculos de fibras porque tienen un aspecto mas claro: no absorben el tinte (vease Ia Figura 2.8). La tin cion no tine selectiva­mente los somas celulares neuronales: todas las celulas, ya sean neuron as o neuroglia, quedan teiiidas por igual. Le corresponde al investigador determinar cual es cual , en funci6n de su tama1io , forma y localizaci6n.

perfusion Proceso mediante el cual se reemplaza Ia sangre de un animal por un liquido, tal como una solucion salina o un fijador, a! preparar el encefalo para un examen histologico.

micr6tomo Instrumento que produce laminas muy finas de teji­dos corporales.

Figura 2.8 ~~ Secci6n frontal del encetalo de un gato

El encetalo se ha tefiido con violeta de cresilo, una tinci6n del soma celular. Las puntas de flecha sefialan los nucleos o grupos de somas celulares.

(Materia l histo16gico por cortesfa de Mary Carlson.)

Microscopic electr6nica El microscopio optico tiene una escasa capacidad de resolucion espacial para apreciar pequeii.os detalles, ya que, debido a Ia propia naturaleza de Ia luz, una magni­ficacion o aumento mayor d e aproximadamente 1.500 no aii.ade ningun detalle. Para poder ver estructuras anatomicas tan pequeii.as como las vesiculas sinapticas y detalles de los organulos celulares, los investigadores han de utilizar un microscopio electronico de transmi­sion. Se pasa un haz de electrones de un !ado a otro de una fina lamina del tejido a examinar y el haz de elec­trones proyecta una imagen del tej ido en un a panta­Jla fluorescente, que puede fotografiarse o escanearse mediante un ordenador. Las microfotograffas electro­nicas asf producidas pueden aportar informacion sobre detalles estructurales del orden de unas pocas decenas de nanometros (vease Ia Figura 2.9).

Un microscopio electronico de barrido proporciona menos amplificacion que un microscopio electronico de transmision estandar, el cual transmite el haz de electro­nes a traves del tejido. En cambio, muestra los objetos en tres dimensiones. Para ello, el microscopio explora el tejido mediante un haz de electrones que se desplaza, un detector recibe Ia informacion de Ia reflexion del haz y un orden ador produce una imagen tridimensio­nal muy detallada (vease Ia Figura 2.10).

Microscopic confocal con laser La microscopia convencional o electronica de transmi­sion requiere que el tejido se corte en finas secciones,

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 39

Figura 2.9 ~~ Seccion a traves de una sinapsis axodendritica

En esta microfotograffa electr6nica de una secci6n a traves de una sinapsis axodendrftica, se sefialan con flechas dos regiones sinapticas y se destaca con un cfrculo una region de pinocitosis en un bot6n terminal adyacente, que posi­blemente constituye el reciclado de Ia membrana de Ia vesicula. T = bot6n terminal; f = microfilamentos; M = mi­tocondrias.

(De Rockel , A. j. y jones, E. G. journal of Comparative Neurology, 1973, 147, 61-92. Reproducido con au torizaci6n. )

pero Ia invencion del microscopio confocal con laser permitio ver detalles en el interior de secciones grue­sas de tejido o incluso en bloques de tejido en cultivo o en las capas superiores de tejido de un cerebro vivo. El microscopio confocal requiere que se ti1'ian con un tinte fluorescente aquellas celulas o partes de Ia celula que nos interesan. (Este procedimiento, denominado inmu­nocitoquimica, se describe en el proximo apartado de este capitulo). Por ejemplo , se pueden marcar con un tinte fluorescente las neuronas que producen un tipo espe­dfico de peptido. Un laser produce un rayo de luz de una determinada longitud de onda que se refleja en un espejo dicroico - un tipo especial de espejo que transmite

microscopio electr6nico de transmisi6n Microscopio que hace pasar un haz de electrones enfocado a craves de finas secciones de tej ido para poner de manifiesco deralles extremadamence pequefios.

microscopio electr6nico de barrido Microscopio que propor­ciona informacion uidimensional sabre Ia forma de Ia superficie de un pequefio objeto, explorando el objeco con un fino haz de electrones.

microscopio confocal con laser Microscopio que aporta image­nes de alta resoluci6n de diversas profundidades de una secci6n gruesa de tejido que contiene moleculas fluorescentes, mediante Ia exploraci6n del tejido con Ia luz de un rayo laser.

40 Lr ol Metodos y procedimientos de investigacion

Figura 2.10 ~~ Neuronas y neuroglia

Microfotografia electr6nica de barrido, utilizada pa ra visibi­liza r neuronas y neuroglia.

(De Tissues and Organs: A Text-Atlas of Scann ing Electron Microscopy, por Kessel, R. G. y Kardon , R. H. Copyright © 1979 por W. H. Freeman and Co. Reproducido con autorizaci6n de Barbara Kesse l y Randy Kardon.)

Neurona Botones terminales que sinaptan

Figura 2.11 ~~ Microscopio confocal

Ia luz d e cie r tas longitudes d e onda y refl eja las d e o tras- . Las lentes del microscopio enfocan la luz lase r en una de te rminada profundidad en el tejido. Esta luz desen cad en a Ia fluorescencia en e l tejido, que a traviesa las lentes y se transmite a traves del espej o dicroico a una abertura (pinhole). Esta abertura bloquea la luz extraiia causada por la dispersion dentro d el tejido, y Ia luz que atraviesa Ia abertura se mid e median te un detector. Dos esp ejos moviles h acen que la luz laser explore el tejido, lo que prop orciona a un orden ador Ia inform acion pre­cisa para fo rm ar una imagen de una seccion de tejido localizada a una profundidad de terminada dentro de Ia muestra . Si se realizan multiples explo raciones mien tras se mueve !a localizacion de la abertura, se pued e obte­n er un cumulo d e imagenes de secciones a n·aves d el tejido - recuerdese que puede ser tej ido vivo- (vease Ia Figura 2.11).

En !a Figura 2.12 se ilustra el uso d el microscopi o confocal en el hipocampo de un raton vivo an estesiado (Mizrahi y cols. , 2004). Se abrio el craneo y se seccion 6 la corteza cerebral de m od o que pudie ra n ob ten erse imagenes d el in teri o r d el hipocam po. Se aplicaron metod os gene ti cos m oleculares para insertar en el ADN del animal un gen que prod uce u n a p ro teina fluo res­cen te en cie rtas neuron as d el hipocampo. Mizrahi y sus

Este gratico simplificado y esquem<Hico muestra el microscopic confocal con laser.

Microscopic invertido

Muestra

Ordenador

Figura 2.12 ~~ Ramificaciones de las dendritas

Estas fotograffas de ramificaciones de las dendritas de neu­ronas hipocampicas de un raton vivo se obtuvieron me­diante un microscopio confocal con laser. Las imagenes demuestran que las crisis causadas par Ia inyeccion de dro­gas provocaron Ia perdida de algunas espinas dendrfticas.

(De Mizrahi, A., Crowley, j. C., Shtoyerman, E. y Kart, L. C.: journal of Neuroscience, 2004, 24, 3.147-3.151. Copyright© 2004 porIa So­ciety for Neuroscience. Reproducido con autorizaci6n de Ia Socie­ty for Neuroscience.)

colaboradores tomaron imagenes de cada dendrita de esas neuronas antes y despues de inducir convulsiones en los animales administrandoles drogas excitadoras. Las imagen es obtenidas antes de las convulsiones estan en verde y las realizadas entre cuatro y cinco horas des­pues, en rojo. Como se puede ver, en los animales en los que se provocaron convulsiones hubo perdida de espi­nas dendriticas (flechas), pero no asi en los animales de referencia (vease la Figura 2.12) .

Mercado de conexiones neurales

Supongamos que nos interesa averiguar cuales son los mecanismos neurales que controlan la conducta repro­ductora, y para empezar, quisieramos estudiar la fisiolo­gia de la conducta sexual de ratas hembra. Pues bien, a partir d e algunas pistas obtenidas leyendo articulos de experimentos realizados por otros investigadores y publi­cados en revistas cientificas, se les practica la cirugia este­reotaxica a dos grupos de ratas hembra. A las ratas del grupo experimental se les hace una lesion en e l nucleo

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 41

ventromedial del hipotalamo (HVM) , y a las ratas del grupo de referencia una lesion falsa . Despues de unos cuantos dias de recuperacion, se acomoda (individual­mente, por supuesto) a los animales con ratas macho. Las hembras del grupo de referencia respondieron posi­tivamente a Ia atencion de los machos: aceptaron lacon­ducta de cortejo, a lo que siguio la copulacion. Por el contrario, las hembras con lesiones en el HVM la recha­zaron y rehuyeron la copulacion. Mediante tecnicas histo­logicas, se confirmo que, en efecto, el HVM del encefalo de los animates de experimentacion estaba destruido. (Un animal del grupo experimental copulo, pero mas tarde se vio que en ella lesion no habia afectado al HVM, de modo que se descartaron los datos de dicho suj e to).

Los resultados de este experimen to indican que las neuronas del HVM parecen intervenir en las funciones requeridas para Ia conducta de copula d e las hembras. (Dicho sea de paso, resulta que estas lesiones no afectan ala conducta de apareamiento de los machos) . Asi que ~adonde nos lleva esto? ~Cual es el siguiente paso? De hecho, se pueden seguir explorando muchos aspectos del tema. Uno de ellos concierne a! sistema de estruc­turas cerebrales que participan en Ia conducta d e apa­reamiento de las hembras. Evidentemente , el HVM no opera solo, recibe aferencias de ciertas estructuras y envia efe rencias a otras. La copula requiere integrar percepciones visuales, tactiles y olfativas y organizar los movimientos en respuesta a los de la pareja. Ademas, se n ecesita que todo el sistema sea activado por las hor­monas sexuales adecuadas. Entonces, ~cual es la funcion exacta del HVM en este complejo sistema?

Antes de pre te nder contestar a esta pregunta hay que saber mas acerca de las conexiones del HVM con el resto del encefalo . ~Que estructuras envian sus axones al HVM y a que estructuras los envia este a su vez? Una vez sabido cuales son las conexiones, se podra investigar la funcion de estas estructuras y el caracter de sus interac­ciones (vease la Figura 2.13).

Figura 2.13 ~~ Marcado de circuitos neurales

Una vez que se sabe que una determinada region del ence­falo interviene en el control de una determinada funci6n, cabe preguntarse cuales son las estructuras que le aportan informacion y cuales Ia reciben de ella.

42 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigacion

(Como se pueden investigar las conexiones del HVM? Esta cuestion nose puede resolver mediante pro­cedimientos histologicos que tiiien todas las neuronas, como hace Ia tincion de los somas celulares, pues, si se observa detenidamente un encefalo que ha sido prepa­rado con tales metodos, unicamente se vera una masa enmaraiiada de neuronas. Pero en los ultimos aiios los investigadores han desarrollado metodos de gran preci­sion que hacen resaltar a neuronas especificas de entre todas las demas.

Mercado de axones eferentes En ultima instancia, el HVM tiene que afectar a Ia con­ducta. Es decir, las neuronas de este nucleo tienen que enviar axones a zonas del encefalo en las que haya neu­ronas que medien los movimientos musculares. Proba­blemente Ia via no sea directa: lo mas probable es que las neuronas del HVM afecten a neuronas localizadas en otras estructuras, las cuales a su vez influyan en las de otras estructuras, hasta que, finalmente, las neuronas motoras apropiadas sean estimuladas. Por tanto, para poner de manifiesto este sistema se han de identificar las rutas que siguen los axones que salen del HVM. En otras palabras, se pretende ahora marcar los axones efe­rentes de dicha estructura.

Para marcar dichos axones se utilizara un metodo de marcado anter6grado. (Anter6grado significa <<que se mueve hacia delante»). Estos metodos emplean sus­tancias que son captadas por las dendritas o los somas celulares y las transportan a lo largo del axon hasta los botones terminales.

A lo largo de los aiios, los neurocientfficos han desa­rrollado diferentes metodos para marcar las vias que

siguen los axones eferentes. Por ejemplo, para descu­brir el destino de axones eferentes localizados dentro del HVM podemos inyectar una minuscula cantidad de PHA-L (una proteina que se encuentra en las judias) dentro del nucleo. (Por supuesto, utilizaremos un ins­trumento estereotaxico para hacerlo). Las dendri­tas absorben las moleculas de PHA-L y las transportan atravesando el soma hasta el axon, por donde viajan mediante transporte axoplasmico rapido hasta los boto­nes terminales. En pocos dias las celulas estan repletas de moleculas de PHA-L en su totalidad: las dendritas, el soma, el axon y todas sus ramificaciones y los botones terminales. Entonces, se sacrifica a! animal, se secciona el encefalo y se acoplan las secciones sobre portaobje­tos. Para poder ver las moleculas de PHA-L se aplica un metodo inmunocitoquimico especial y las preparaciones se examinan al microscopio (vease Ia Figura 2.14).

Los metodos inmunocitoquimicos sacan provecho de las reacciones inmunitarias. El sistema inmunitario del organismo tiene Ia capacidad de producir anticuerpos en respuesta a los antigenos. Los antigenos son protefnas (o peptidos), como las que se encuentran en Ia superfi­cie de las bacterias o los virus. Los anticuerpos, que tam­bien son proteinas, son producidos por los leucocitos

metodo de marcado anter6grado Merodo hisrologico que marca los axones y borones rerminales de neuronas cuyos somas celulares se encuenrran en una region dererminada.

PHA-L Phaseolus vulgaris leukoagglutinin. Proreina que se encuen­rra en las judias y se uriliza como marcador anterogrado. La absor­ben las dendritas y el soma de Ia celula y Ia transportan hasra el exrremo del axon.

metodo inmunocitoquimico Merodo hisrologico que uriliza anti­cuerpos radioacrivos o anricuerpos ligados a una molecula refiida para indicar Ia exisrencia de dererminadas proteinas de pepridos.

Figura 2.14 ~~ Utilizaci6n de PHA-L para marcar los axones eferentes

Se inyecta PHA-L en una region del cerebra y esta es captada por dendritas y somas neuronales

Con el microscopio pueden verse los axones y los botones terminales

scu­ltro

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de Ia sangre para destruir a los microrganismos invaso­res. Los anticuerpos o bien son segregados por los leu­cocitos o bien se sinian sobre su superficie y, a! igual que los receptores de los n eurotransmisores, se loca­li zan sobre la membrana d e las neuronas. Cuando los antfgenos presentes en la superficie del microrganismo invasor entran en contacto con los anticuerpos que los reconocen, estos desencadenan e l ataque d e los leucoci­tos sobre el invasor.

Los biologos moleculares h an puesto a punto meto­dos de produccion de anticuerpos para cualquier pep­tido o protefna. Las moleculas d e los anticuerpos estan unidas a distintos tipos de moleculas de colorantes, algu­nos de los cuales reaccionan con o n-as sustancias y tiiien el tej ido de color marron, mientras que otros son fluo­rescentes: brilian cuando son expuestos a una luz de una determinada longitud de onda. Entonces, para determi­nar en que parte del encefalo se localiza e l p eptido o la protefna ( el antfgeno) , los investigadores sumergen secciones frescas de tejido cerebral en una solucion que contiene las moleculas de anticuerpo/ coloran te, y los anticuerpos se unen a su antfgeno . Cuando e l investiga­dor examina las secciones con un microscopio (bajo una luz de una determinada longitud de onda, en e l caso de tintes fluorescentes) puede ver cuales son las partes del encefalo -incluso que neuronas individuales- contie­nen e l antfgeno.

La Figura 2.15 muestra como se puede utilizar la PHA-L para identificar las eferen cias d e una region determinada del encefalo. En un experimento se inyec­taron moleculas de esta sustancia en el HVM y, dos dfas despues, cuando las neuronas de esa region habfan

Figura 2.15 ~~ Metodo de marcado anterogrado

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 43

absorbido y transportado a los extremos de sus axones la PHA-L, se sacrifico a l a nimal. En la Figura 2.15a se indica el Iugar de la inyeccion: como se puede ver, los somas celulares y las dendritas cercanas estan lienos de lecitina (vease Ia Figura 2.15a). En la Figura 2.15b se pre­senta una microfotograffa de la sustancia gris periacue­ductal (SGPA). Esta region contiene a lgunos axones y botones terminales marc ados (en dorado), lo cu al demuestra que algunos axones eferentes del HVM ter­minan en la SGPA (vease la Figura 2.15b) .

Para seguir con el estudio de la funcion del HVM en la conducta sexual de las h em bras, habrfa que averiguar cuales son las es tructuras que reciben info rmacion de las neuronas del HVM (entre elias, la SGPA) y ver que sucede cuando se lesion a cada una de e lias. Supongamos que el daiio de algunas de estas estructuras altera tam­bien la conducta sexual femenina. Se inyectara PHA-L en dichas estru cturas y se observara h acia donde se diri­gen sus axones. Finalmente, se descubrira Ia via princi­pal que va desde el HVM hasta las neuronas motoras cuya actividad es necesaria para copular. (De hecho, los investigadores ya lo han realizado y algunos de los resul­tados obtenidos se expondran en el Capitulo 5).

Mercado de axones aferentes

Trazar los axones eferentes del HVM solo explicara parte de la historia sobre los circuitos neurales implicados en la conducta sexual fem enina: la parte que ocurre entre el HVM y las neuronas motoras. ~Que sucede con los circuitos que se encuentran antes del HVM?, ~interviene de algun modo el HVM en el analisis de Ia informacion

Se inyect6 PHA-Len el nucleo ventromedial del hipotalamo, donde fue captado por las dendritas y transportado a traves de los axones de las celulas hasta sus botones terminales. (a) Lugar de Ia inyecci6n. (b) Axones y botones terminales de Ia sustancia gris periacueductal marcados.

(Cortesfa de Kirsten, Nielsen, Ricciardi y Jeffrey Blaustein , University of Massachussets.)

(a) (b)

44 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigacion

sensorial (como Ia vision, el olor o el contacto del macho)? 0 tal vez los efectos activadores de las hormo­nas sexuales de Ia hembra sobre su conducta acttlan a traves del HVM, o de neuronas cuyos axones establecen sinapsis allf. Para averiguar cuales son las regiones del encefalo que forman parte de los componentes de Ia << corriente superior>> de los circuitos neurales, se ha de determinar cuales son las aferencias que recibe el HVM -sus conexiones aferentes- . Para hacerlo, se empleara un metodo de marcado retr6grado.

El termino retr6grado significa <<que se mueve bacia atras». Los metodos de marcado retrogrado emplean sustancias que son captadas por los botones terminales y transportadas de vuelta a lo largo de los axones hacia los somas celulares. El metoda para identificar las aferencias que recibe una de terminada region del encefalo es simi­lar al utilizado para identificar sus eferencias. En primer Iugar, se inyecta en el HVM una pequeiia cantidad de una sustancia denominada oro fluorado, que es absor­bida por los botones term inales y transportada de vuelta a los somas celulares mediante transporte axoplasmico retrogrado. Pocos dfas despues se sacrifica al animal, se secciona su encefalo y se examina el tejido b~o una luz de la longitud de onda adecuada, bajo la cuallas molecu­las de oro fluorado emiten fluorescencia. Asi, se encon­trara que Ia amfgdala medial es una de las regiones que aportan aferencias al HVM (vease Ia Figura 2.16).

Los metodos de marcado anterogrado y retrogrado que se han descrito hasta aquf identifican un solo esla­bon de una cadena de neuronas - neuronas cuyos

Figura 2.16 ~~ Metodo de marcado retr6grado

Se inyect6 oro flu orado en el HVM, donde fue captado por los botones term inales y tra nsportado de vuelta a traves de los axones hasta sus somas celulares. La microfotogra­ffa muestra estos somas celulares, localizados en Ia amfg­dala medial.

(Cortesfa de Yvon Delville, Medical School, Un ivers ity of Massachu­setts.}

axones entran o salen de una region cerebral determi­nada- , mientras que los metodos de marcado tmnsneu­ronal identifican una serie de dos, tres o mas neuronas que forman conexiones sinapticas en serie una con otra. El metodo de marcado transneuronal retrogrado mas eficaz emplea un virus de la seud~rrabia: una forma debili tada del virus herpes del cerdo que originalmente se concibio como vacuna. Para el marcado trasneuronal anterogrado se utiliza una variedad del virus del herpes simple . que se inyecta directamente en una region cere­bral, es captado por las neuronas del Iugar y las infecta. Luego se extiende a traves de las neuronas infectadas y finalmente es Jiberado, contagiando Ia infeccion a las neuronas con las qu e establece conexiones sinapticas.

Cuanto mas espera el investigador tras inyectar el virus, mayor es la cantidad de neuronas que llegan a infectarse. Despues de que se haya sacrificado el animal y se haya seccionado su encefalo, se aplican metodos inmunocitoquimicos para localizar una protefna produ­cida por el virus. Por ejemplo, Daniels, Miselis y Flana­gan-Cato (1999) inyectaron el virus de Ia seudorrabia en los musculos que controlan la postura de apareamiento de las ratas hem bra. Tras unos cuantos dias, se sacrifico a las ratas y se buscaron en su encefalo signos de infeccion virica. El estudio indico que el virus encontro su trayec­toria a lo largo de los nervios motores hasta las neuronas motoras de Ia med ula espinal, de ahf a Ia formacion reti­cular del bulbo, luego ala sustancia gris periacueductal y por u ltimo al HVM. Estos resultados confirman los de los metodos de marcado anterogrado y retrogrado que se acaban de describir. (Tambien se encontraron neuro­nas infectadas en otras estructuras, pero que no son rele­vantes en esta exposicion).

Combinandolos, los metodos de marcado antero­grado y retrogrado - incluyendo los metodos trans­neuronales- permiten descubrir circuitos de neuronas interrelacionadas. Asi, estos metodos contribuyen a obtener un <<diagrama del cableado neural» del ence­falo (vease Ia Figura 2.17) . Provistos de otros meto­dos de investigacion (incluidos algu nos de los que se

metodo de marcado retr6grado Merodo hisrologico que marca los somas celulares a los que pertenecen los borones rerm inales de los axones que esrablecen sinapsis con las celulas de una region con­crera.

oro fluorado Tincion que si rve como marcador rerrogrado. Lo absorben los borones rerminales y lo rransportan de vuelra al soma celular.

virus de la seudorrabia Forma debili rada del virus del herpes del cerdo urilizado para el marcado rrasneuronal rerrogrado. Marca una serie de neuronas que esran inrerconecradas mediame sinapsis.

virus del herpes simple Forma del virus del herpes que se uriliza para el marcado rrasneuronal anrerogrado. Marca una serie de neu­ronas que esran imerconecradas mediame sinapsis.

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Figura 2.17 ~~ Resultado de los metodos de marcado

En Ia figura se representan una de las aferencias al HVM y una de sus eferencias, puestas de manifiesto por los meto­dos de marcado anter6grado y retr6grado.

1 a Marcado anter6grado: se inyecta PHA-Len el HVM

1 b Entonces pueden verse los axones y terminales en Ia SGPA

2b Entonces pueden verse los somas celulares de Ia amigdala medial

describiran mas adelante en este capitulo), se puede tra­tar de descubrir las funciones de cada uno de los com­ponentes de dicho circuito.

Estudio de Ia estructura del cerebro humano in vivo

Hay muy buenas razones para investigar las funciones del encefalo de otros animates aparte de los seres burna­nos, y una de elias es que se pueden comparar los resul­tados de estudios realizados con diferentes especies para sacar algunas conclusiones sobre la evolucion de varios sistemas neurales. Aunque nuestro principal foco de interes sean las funciones del encefalo humano, obvia­mente nose puede pedir a las personas que se sometan a cirugfa cerebral con el fin de investigarlo. Pero, a veces, las enfermedades y los accidentes daiian el encefalo humano y, si se sabe donde se ha producido la lesion, se puede estudiar la conducta de esas personas e intentar hacer el mismo tipo de inferencias que se hicieron res­pecto a las lesiones cerebrales producidas intencionada­mente en los animales de laboratorio. El problema es: (donde se localiza la lesion?

En el pasado, un investigador podia estudiar la con­ducta de una persona con daiio cerebral y no saber con exactitud su localizacion: la {mica manera de asegurarse

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 45

era conseguir el cerebro del paciente cuando moria y examinarlo al microscopio. Pero solia ser imposible. En ocasiones, el paciente sobrevivfa al investigador. Habia casos en que el paciente cambiaba de ciudad de resi­dencia. Algunas veces (quiza demasiadas), la familia no concedfa la autorizacion para la autopsia. Debido a estos problemas practicos, el estudio de los efectos comporta­mentales del daiio en regiones especificas del encefalo humano progreso mas bien lentamente.

Los recientes avances en las tecnicas de rayos X yen la tecnologfa de los ordenadores han llevado a concebir varios metodos para estudiar la anatomfa del cerebro in vivo. Dichos avances permiten a los investigadores exa­minar la localizacion y extension de la lesion cerebral mientras el paciente esta aun vivo . El primer metodo que se ideo recibio el nombre de tomografia axial com­putarizada (TAC) (de los terminos griegos tomos, «corte>> y graphein, <<escribir»). Este procedimien to, que habi­tualmente se denomina exploraci6n TAC, funciona como sigue: se coloca Ia cabeza del paciente en un amplio cilindro de forma ovalada, que contiene un aparato de rayos X y,justo enfrente de el (al otro lado de la cabeza del pacien te), hay un detector de rayos X. El haz de rayos X pasa a traves de la cabeza del paciente y el detec­tor mide la cantidad de radioactividad que se transmite. Este haz explora Ia cabeza desde todos los angulos y un ordenador convierte los valores que recibe del detec­tor en imagenes del craneo y su contenido (vease la Figura 2.18) .

Figura 2.18 ~~ Tomografia axial computarizada

(© Larry Mulvihiii/Rainbow.)

tomografia axial computarizada (TAC) Tecnica que se sirve de un ordenador para analizar los datos obtenidos mediante una exploracion por rayos X y proporciona una imagen bidimensional de una <<seccion» del cuerpo.

46 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigaci6n

En la Figura 2. 19 se presenta una serie d e estas ima­genes de TAC obtenidas de la cabeza de una paciente que habfa sufrido una apoplejfa. Este accidente cere­brovascular d aiio una parte del encefalo implicada en Ia consciencia del propio cue rpo y en Ia percepcion d el espacio, y Ia paciente perdio Ia percepcion consciente de Ia p arte izquierda de su cuerpo y de los estfmulos localizad os a su izquierda. Se puede ver e l daiio como una mancha blanca en el !ado inferio r izquierdo de Ia imagen 5 (vease la Figura 2.19).

Una radiograffa incluso mas detallada de lo que h ay en el interior d e Ia cabeza de una p ersona Ia propor­cion a una tecnica conocida como resonancia magnetica (RM). El equipo de RM se parece a! del TAC, pero no uti­liza rayos X. En Iugar de ello, h ace pasar un campo mag­netico extremadamente intenso a traves de Ia cabeza del paciente. Cuando se coloca el cuerpo de un sujeto en un intenso campo m agn etico, los micleos de algunos atomos de moleculas del organismo rotan siguiendo una deter­minada alineacion. Si ento n ces se hace pasar una onda de radiofrecuencia a traves del cu erpo, dichos nucleos emiten ondas de radio. Las diferentes moleculas emiten energfa a diferentes frecuencias, de modo que el equipo de RM se ajusta para d e tectar Ia radiacion procedente

de los a tomos de hidrogeno. Ya que la concen tracio n de estos a tomos en los distintos tejidos es diferente , el equipo puede utilizar la informacion p ara elaborar ima­genes de secciones del encefalo . A diferencia de las ima­genes de TAC, que por lo general se limitan a un plano h o rizontal, las de RM pueden obtenerse tambien en un plano sagital o uno frontal (vease Ia Figura 2.20).

Como se aprecia en Ia Figura 2.20, en las imagen es d e RM se puede distinguir entre las regiones de su stan­cia gris y las de sustancia blanca, de modo que pueden verse los principales fascfculos de fibras (tales como el cuerpo callosa). Sin e mbargo, los fascfculos de fibras mas pequeiios no pueden verse en estas exploracion es, salvo que se e mplee una version especial de la RM que permite ver, incluso, pequeiios fascfculos de fi b ras y mar­car haces de fibras . Veamos como. Por encima del cero absoluto, tod as las moleculas se mueven en direccio­n es aleatorias debido a la agitacion termica; por tanto, cuanto mayor es Ia temperatura, mas rapido resulta e l

resonancia magnetica (RM) T ecnica con Ia que se pueden obte­ner im:igenes precisas del interior del cuerpo. Implica Ia inreraccion entre ondas de radio y un inrenso campo magnerico.

Figura 2.19 ~~ Tomografia axial computarizada de una lesion cerebral

El paciente ten fa una lesion en el area parieto-occipital derecha (imagen 5). La lesion seve en blanco debido a Ia hemorragia : Ia sangre absorbe mas radiacion que el tejido cerebral adyacente. La zona rostral se situa arriba, Ia caudal abajo; los !ados izquierdo y derecho estan invertidos. La imagen 1 muestra una seccion a nivel de los ojos y Ia base del encefalo.

(Cortesfa de J. MeA, jones, Good Samaritan Hospital, Portland , Oregon .)

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Figura 2.20 ~~ Resonancia magnetica siguiendo un plano sagital medio de un encefalo humano

(Foto por cortesfa de Philips Medical Systems.)

movimiento aleato rio. Las iimigenes tensoriales de difu­si6n (lTD) se ben efician del h echo de que el movimiento de las moleculas de agua en los fascicul os de sustancia blanca no es aleato rio sino que tie nde a realizarse en una direcci6n paralela ala de los axones que constituyen dichos fasciculos. La RM utiliza Ia informacion relativa al movimiento d e las moleculas d e agua para d e terminar Ia localizaci6 n y orie ntaci6 n de los fasciculos de axones de Ia sustan cia blanca. En Ia Figura 2.21 se presenta una vista sagital d e algunos de los axones que se proyectan

intermedio Ablaci6n experimental

El objetivo de Ia invest igacion en Neurociencia compor­tamental es entender que funciones cerebrales se requie­ren para ll evar a cabo una conducta determinada y luego saber donde se localizan los circuitos neurales que ejecu­tan esas funciones. El metodo de lesion es el mas antiguo de los que se emplean en este tipo de investigacion y sigue siendo uno de los mas 1Jtiles. Para ell o, se efectua una lesion subcort ical con Ia ayuda de un equ ipo estereotaxico, se obtienen las coordenadas en un atlas estereotaxico y luego se situa Ia punta del electrodo ode Ia can ula en el objetivo. Se realiza una lesion hacienda pasar corri ente de RF a traves del electrodo o infundiendo un am inoacido excitador a traves de Ia canula, produciendo asf una lesion

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 47

Figura 2.21 ~~ lmagenes tensoriales de difusi6n

En esta imagen tensorial de difusi6n, vista sagital, se obser­van algunos de los axones que se proyectan desde el talamo hasta Ia corteza cerebral en el cerebro humano.

(De Wakana, S.; jian, H.; Nagae-Poetscher, L. M.; Van Zijl, P. C. M., y Mori, S. Radiology, 2004, 230, 77-87. Reproducido con autorizaci6n.)

Talamo

d esde el talamo h as ta la corte za cerebral del en cefalo humano segun ponen de m anifiesto las imagenes ten­soriales de difusi6n. El ordenador aiiade colo res para distinguir los diferentes fasciculos d e axones. (Vease Ia Figura 2.21).

imagenes tensoriales de difusi6n (lTD) Metodo de neuroima­gen que emplea una RM modificada para poner de manifiesto haces de axones mielinicos en el cerebro humano in vivo.

excitotoxica. La ventaja de estas lesiones es que solo des­truyen los somas ce lulares de las neuronas, pero los axo­nes que atraviesan Ia region no resu ltan danados.

Se ha de determ inar Ia localizacion de Ia lesion tras haber observado Ia conducta del animal. El animal se sacrifi ca de forma humanitaria, se perfunde el encefalo con una solucion sal ina, se extrae del craneo y se conserva en un fijador como el formol. Se utiliza un microtomo para seccionar el tejido, el cual general mente se ha conge­lado con elfin de end urecerlo suficientemente para poder cortarlo en finas secciones. Estas se montan en portaobje­tos, tenidas con un co lora nte de somas ce lulares, y se exa­minan al microscopio.

El microscopio optico permite ver las celulas y sus orga­nulos mas grandes, pero para ver pequenos pormenores,

48 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigacion

ta les como cad a una de las m itocond rias o las vesicu­las sinapt icas, se necesita un microscopio electron ico. El microscopio electronico de barrido proporciona una vista tr idimensiona l del tejido, pero con amplificacion menor que el microscopio electron ico de transm ision convencio­nal. Los microscopios co nfocales proporcionan imagenes de «lam inas» de tejido que pueden descubrir Ia presencia de determ inadas moleculas, inclu so en un tejido vivo.

El siguiente paso en un programa de investigacion a menudo requiere que el invest igador descubra las conexiones aferentes y eferentes de Ia region que se esta estudiando con el resto del encefalo. Las conexiones efe­rentes (las que t ransm iten informacion de dicha region a otras partes del encefa lo) se descubren con metodos de marcado anterogrado, como el que ut ili za PHA-L. Las conexiones aferentes (a quellas que I leva n informacion a dicha region desde otras pa rtes del encefa lo) se eviden­cian con metodos de marcado retrogrado, como el que usa oro fluorado. Las cadenas de neuronas que estab le­cen conexiones sinapti cas pueden verse con el metodo

REGISTRO Y ESTIMULACION DE LA ACTIVIDAD NEURAL

La primera parte de este capitulo se ocupo de Ia anato­mia del encefalo y los efectos de las lesiones en deter­minadas regiones cerebrates. Esta seccion aborda una aproximacion diferente: el estudio del encefalo mediante el registro o Ia estimulacion de Ia actividad de regiones especificas. Las funciones cerebrates implican Ia actividad de circuitos neuronales, asi pues, las diferen­tes p ercepciones y respuestas comportamentales impli­can diferentes pautas de actividad cerebral. Por ello, los investigadores han elaborado metodos para registrar estas pautas o para producirlas de forma artificial.

Registro de Ia actividad neural

Los axones producen potenciales de accion y los boto­nes terminales provocan potenciales postsinapticos en Ia membrana de las celulas con las que establecen sin ap­sis. Estos fenomenos electricos pueden registrarse y los cambios en Ia actividad electrica de una region cono-eta se pueden utilizar para determinar si dicha region par­ticipa en el control de diversas conductas. Por ejemplo, pueden hacerse registros durante la presentacion de un estimulo, el proceso de toma de decisiones o la ejecu­cion de una actividad motora.

Los registros pueden realizarse cr6nicamente, durante un largo perfodo de ti empo despues de que

de marcado transneurona l. El virus de Ia seudorrabia puede utilizarse como marcador retrogrado y una var ie­dad del virus del herpes simp le, como marcador antero­grado.

Aunq ue nose realizan lesiones deliberadas en el ence­falo de los seres humanos con fines de investigacion, las enfermedades y los accidentes pueden causar una lesion cerebral y, si se sabe donde se loca liza dicha lesion, se puede estud iar Ia conducta de los sujetos y saca r conclu­siones acerca de Ia loca lizac ion de los circu itos neurales que ll evan a cabo fun ciones importantes. Si el paciente muere y puede disponerse de su encefalo para exami­narlo, se pueden ap li car los metodos histologicos hab i­tuales. En otro caso, se puede examinar el cerebro in vivo utilizando exploraciones co n TACo con RM. Las imagenes tensoriales de difusion ut ilizan una modificacion de Ia RM para visibilizar fa scfculos de axones mielfnicos en un cere­bro humano in vivo.

En Ia Tabla 2.1 se resumen los metodos de investiga­cion descritos en este apartado.

e l animal se haya recuperado de Ia intervencion qui­n:'lrgica; o de forma aguda, durante un periodo de tiempo relativamente corto durante e l cual el animal permanece anestesiado. Los registros agudos, efectua­dos bajo anestesia, por lo general se limitan al estu­dio de las vias sensoriales y rara vez se acompanan de observaciones comportamentales, ya que Ia capacidad comportamental de un animal anestesiado es, cuando menos, limitada.

Registro con microelectrodos

Los agentes quimicos que afectan a las neuronas seroto­ninergicas y noradrenergicas tambien afectan al sue!"io REM. Supongamos que, sabiendo esto, nos planteamos si Ia actividad de las neuronas serotoninergicas y nora­drenergicas varia durante las diferentes fases del sueii.o. Para averiguarlo, se registrarfa con microelectrodos Ia actividad de dichas neuronas, ya que los microelectrodos tienen una punta muy fina, lo suficientem ente peque1i.a para poder registrar Ia actividad electrica de neuronas individuales. Por lo general esta tecnica se denomina registro de neuronas individuates o de unidades (una unidad se refiere a una nem-ona individual).

Puesto que se quiere registrar Ia ac tividad de neu­ronas individuales durante un largo perfodo de tiempo

microelectrodo Electrodo muy fino utilizado generalmente para registrar la actividad de neuronas individuales.

registro de unidades individuales Registro de la aC[ividad elec­trica de una sola neurona.

a

l_lji:IU'HJIII~I h'JI:II I I

Destruir o inactivar regiones cerebrales especfficas

Situar electrodos o ca nulas en una region especffica dentro del cerebro

Encontrar Ia sede de Ia lesion

ldentificar los axones eferentes de una region determinada y los botones terminales de dichos axones

ldentificar Ia localizacion de neuronas cuyos axones terminan en una region determinada

ldentificar series de neuronas que estan conectadas mediante sinapsis

ldentificar Ia localizacion de Ia lesion en el cerebro humano in vivo

ldentificar Ia localizacion de haces de fibras en el cerebro humano in vivo

Revelar detalles de las celulas en finas secciones de tejido

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 49

lllltll •

li'JI:IIIII

Lesion por radiofrecuencia

Lesion excitotoxica ; utiliza aminoacidos excitadores como el acido cafnico

Lesion con 6-HD

Infusion de un anestesico local; criodo

Ci rugfa estereotaxica

Perfusion, fijacion , seccion del cerebro y ti ncion de las secciones

Metodo de marcado anterogrado, como el de PHA-L

Metodo de marcado retrogrado, como el oro tluorado

Metodo de marcado transneuronal; utiliza el virus de Ia seudorrabia (para el marcado retrogrado) o el virus del herpes simple (para el marcado anterogrado)

Tomograffa axial computarizada {TAC)

Resona ncia magnetica

lmagenes tensoriales de difusion {lTD)

Microscopia confocal con laser

Destruye todo el tejido cerebral proximo a I Ia punta del electrodo

Destruye solo los somas celulares proximos al extremo de Ia canula; no afecta a los axones que atraviesan Ia region

Destruye las neuronas catecolaminergicas proximas al extremo de Ia canula

lnactiva temporalmente regiones cerebrales especfficas; el animal puede servi r como su propio control

Consultar un atlas estereotaxico para determinar las coordenadas

Muestra «laminas» del cerebro; utiliza rayos X

Muestra «laminas» del cerebro; imagen mas detallada que Ia de TAC; utiliza un campo magnetico y ondas de radio

Muestra haces de axones mielfnicos; se basa en Ia RM

Puede utilizarse para ver «laminas» de

tejido en el cerebro in vivo; requiere que existan moleculas tluorescentes en el tejido

en animales no anestesiados, se e leginin electrodos que dure n mas. Para ello, se pued e conseguir un juego de cables muy finos , unidos en un manojo, que estan elec­tricamente aislados, de modo que solo sus puntas que­dan sin recubrir.

estos se fijan al craneo d el animal con una pasta que en un principia se ide6 para uso de los dentistas (cemento dental). Despues, cuando e l animal se ha recuperado de la cirugia, ya se le puede <<Conectar>> al sistema de regis­tro. Los animales de laboratorio no prestan atenci6n a los z6calos de conexi6n e lectrica que tienen sobre Ia cabeza y se comportan con bastante normalidad (vease Ia Figura 2.22) .

Los electrodos se implantan e n el encefalo de los ani­males m ediante cirugia estereotaxica. Luego se con ec­tan a unos z6calos de conexi6n e lectrica en miniatura y

50 Capitulo 2 Metodos y procedimienlos de investigocion

Microelectrodos

En este esquema se representa un grupo de electrodos un i­dos permanentemente al craneo mediante una base de ce­mento.

Z6calo de conexi6n

Electrodos

Craneo

Cemento dental

En muchas ocasiones, los investigadores fuan dispo­sitivos bastante complejos al craneo del animal cuando implantan microelectrodos. Estos dispositivos incluyen mecanismos de tornillos que permiten al experimen­tador desplazar el electrodo -o el conjunto de elec­trodos- al interior del encefalo, de forma que pueda registrar diferentes partes de este mientras realiza sus observaciones.

Las seiiales electricas que detectan los microelec­trodos son bastante debiles y tienen que amplificarse. Los amplificadores utilizados con tal fin funcionan de la misma manera que los de un equipo estereo, convir­tiendo las debiles seiiales registradas en el encefalo en otras mas fuertes, que pueden verse en un osciloscopio y almacenarse en Ia memoria de un ordenador para ana­lizarlas mas tarde.

~Cuales son los resultados de este registro de neuro­nas serotoninergicas y adrenergicas? Como se estudiara en el Capitulo 4, si se registra la actividad de neuronas serotoninergicas y noradrenergicas durante diferentes fases del sueiio se encontrara que la frecuencia de des­carga de estas neuronas decae casi hasta cero durante el sueiio REM. Esta observacion sugiere que tales neuro­nas tienen un efecto inhibidorsobre dicho tipo de sueiio. Es decir, el sueiio REM no puede ocurrir hasta que esas neuronas dejan de descargar.

Registro con macroelectrodos

A veces se quiere registrar Ia actividad de una region global del encefalo, no Ia actividad de las neuronas indi­viduates que se localizan en ella. Para hacerlo se utilizan

macroelectrodos. Los macroelectrodos no detectan la actividad de neuronas individuates, antes bien, los regis­tros que se obtienen mediante tales dispositivos repre­sentan los potenciales postsinapticos de muchos miles - 0 millones- de celulas del area en que se situa el electrodo. Estos electrodos pueden consistir en alam­bres no afilados insertados en el encefalo, tomillos fua­dos sobre el craneo 0 incluso discos de metal pegados sobre el cuero cabelludo de sujetos humanos con una pasta especial que conduce la electricidad. Los regis­tros, en particular los tornados del cuero cabelludo, representan la actividad de una gran cantidad de neu­ronas, cuyas seiiales electricas atraviesan las meninges, el craneo y el cuero cabelludo antes de alcanzar los elec­trodos.

En algunas ocasiones, los neurocirujanos implantan macroelectrodos directamente en el interior del ence­falo humano para detectar el origen de una actividad electrica anomala que origina frecuentes convulsiones. Una vez detectada Ia fuente, el cirujano puede abrir el craneo y extraer el foco de las convulsiones, que en Ia mayoria de las ocasiones es tejido cicatricial produ­cido por un daiio cerebral ocurrido aiios antes. Habi­tualmente, Ia actividad electrica del encefalo humano se registra mediante electrodos pegados a! cuero cabelludo y se muestra en un poligrafo.

Un poligrafo contiene un mecanismo que hace avan­zar una larga tira de papel sobre Ia que escriben una serie de plumillas. Estas basicamente son manecillas de grandes voltfmetros, que se mueven hacia arriba y abajo en respuesta a Ia seiial electrica que les envfan los ampli­ficadores biologicos. (Por lo general, la informacion se almacena en un ordenador y se presenta en una panta­lla en vez de imprimirse en papel). En la Figura 2.23 se representa un registro de Ia actividad electrica obtenido mediante macroelectrodos situados en varios lugares del cuero cabelludo de un sujeto (vease Ia Figura 2.23). Dichos registros se llaman electroencefalogramas (EEG), o «escritos de la electricidad de la cabeza>>. Pueden uti­lizarse para el diagnostico de Ia epilepsia o para estu­diar las fases de sueiio y vigilia, las cuales se asocian con patrones de actividad electrica caracteristicos.

Otra aplicacion del EEG es supervisar el estado del encefalo durante intervenciones que, en principio, pue­den daiiarlo. El autor presencio una de estas interven­ciones hace varios aiios.

macroelectrodo Electrodo utilizado para registrar la actividad electrica de una gran canridad de neuronas en una region esped­fica del encefalo. Su tamafio es mucho mayor que el de un micro­elecrrodo.

electroencefalograma (EEG) Regisrro del potencial electrico cere­bral obtenido mediante electrodos siruados sobre el cuero cabe­lludo.

Figura 2.23 ~~ Registro poligrafico

II El papel se mueve

• hacia Ia izquierda

~--

~~·

~ ~~rv~--~ ....

La Sra_ F sufrio un leve ataque cardfaco y las pruebas posterio­res indicaron que padecfa una considerable arteriosclerosis, generalmente denominada «endurecimiento de las arterias))_ Muchas de sus arterias se habfan estrechado debido a placas arterioscleroticas ricas en colesteroL Un trombo, formado en una parte especial mente estrecha de una de sus arterias coro­narias, fue lo que provoco el ataque,

Meses despues de su ataque al corazon, Ia Sra, F, tuvo varios ataques isquemicos transitorios , breves episod ios de sfntomas neurologicos que al parecer se deben a trombos que se forman y luego se disuelven en los vasos sangufneos cerebrales, En su caso, le provocaron entumecimiento en el brazo derecho y dificultades para hablar_ Su medico Ia remitio a un neurologo, quien le recomendo hacerse un angiograma, Este revelo que su arteria carotida izquierda estaba casi total mente obstruida, El neurologo aconsejo a Ia Sra_ F que consultara al neuroci­rujano, y este Ia urgio a someterse a una intervencion quirur­gica en Ia que se extraerfa Ia placa que estaba obstruyendo parte de su arteria carotida izquierda, con lo que aumentarfa el aporte sangufneo al !ado izquierdo del encefah

El procedimiento se denomina endoarteriectomfa car6tida, Yo estaba conversando con el neurocirujano de Ia Sra, F des­pues de una conferencia y casualmente comento que iba a realizar Ia operacion mas tarde esa manana. Le pregunte si pod fa asistir y dio su consentimiento. Cuando entre en Ia sa la de operaciones, con vestimentas esterilizadas, encontre a Ia Sra. F. ya anestesiada y Ia enfermera habfa preparado el !ado izquierdo de su cuello para Ia incision. Ademas, se le habfan co locado varios electrodos de EEG en el cuero cabelludo y vial Dr. L. , un neurologo especializado en Neurofisio logfa clfnica , sentado ante su equipo de EEG,

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 51

El cirujano hizo una incision en el cue llo de Ia Sra_ F y dejo al descubierto su carot ida interna en el punta donde Ia caro­tida comun, que procede del corazon , se divide en Ia carotida interna y Ia extern a. Coloco una cinta de plastico alrededor de Ia arteria carotida comun, pinzandola y deteniendo el fl ujo de sangre. «c:Que aspecto tiene, Ken?)) le pregunto al DL L. «No muy buena: veo cierta lentitud _ Deberfas hacer una deri­vacion)).

El cirujano quito rapidamente Ia banda compresora y le pidio a Ia enfermera una sonda de derivacion, un corto tuba de plastico un poco mas fino que Ia arteria_ Hizo dos peque­nas incisiones en Ia arteria bastante por encima y por debajo de Ia region en donde estaba Ia placa, e inserto Ia sonda, Ahara ya podia trabajar en Ia arteria sin detener el flujo de sangre al cerebra. Hizo un corte longitudinal en Ia arteria , que dejo ver una masa amarillenta que secciono y extirpo. Cerro Ia incision, extrajo Ia sonda y suturo los pequenos cortes que habfa hecho para co locarla, «c:Va todo bien?)) , pregunto al Dr. L. «Sf, su EEG esta bien>>.

La mayorfa de los neurocirujanos prefieren hacer una endoarteriectomfa pinzando temporal mente Ia arteria ocluida mientras trabajan en ella. El trabajo es mas rapido y las com­plicaciones son menos probables, Dado que hay una conexi on del a porte sangufneo a cada uno de los hemisferios del ence­falo (med iante arterias comunicantes especiales), a menudo es posible sellar una de las arterias carotidas durante unos minu­tos sin provocar ningun dana_ Sin embargo, a veces el flujo sangufneo de un lado del encefalo al otro no es sufic iente para mantener uno de los Iadas abastecido de sangre y oxf­geno. El unico modo que ti ene el cirujano de saberlo es poder disponer en cada momenta del EEG del paciente. Si el cerebra no esta recibiendo el aporte sangufneo necesario, en el EEG se veran las caracterfsticas «ondas lentas))_ Esto es lo que sucedio al pinzar Ia arteria de Ia Sra. F. yes por lo que el cirujano tuvo que usar una sonda de derivacion. Sin ella, Ia intervencion podrfa haber causado una apoplejfa en Iugar de prevenirla.

Por cierto, Ia Sra. F. se recupero bien de Ia intervencion quirurgica ,

Magnetoencefalografla Como sin duda el lecto r ya sabe, cuando una corriente e lectrica fl uye a traves d e un conduc tor, induce un cam po magnetico. Esto significa que cuando los poten­ciales de acci6n se transmiten a lo largo de los axones o los potenciales postsinapticos se transmiten por las den­dritas o se propagan de un !ado a o tro de la membrana somatica de una neurona, tambien se producen campos magneticos. Estos campos son sumamente pequeiios, pero los ingenieros han elaborado detectores su percon­ductores (llamados SQUID, o << dispositivos superconduc­tores de interferencias cuanticaS>>) capaces de detectar campos magn eticos que son de aproximadamen te una

52 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigacion

milmillonesima parte del tamai1o del campo magne­tico de Ia tierra. La magnetoencefalografia se realiza mediante neuromagnet6metros, instrumentos que contie­nen varios SQUID dispuestos de manera que un orde­nador pueda examinar su emision y calcular el origen de se!'iales determinadas en el encefalo . El neuromag­netometro que se muestra en Ia Figura 2.24 contiene 275 SQUID. Este equipo puede utilizarse en Ia pnictica clfnica, por ejemplo, para localizar el foco de crisis epi­lepticas y as! poder extirparlas quirurgicamente. Tam­bien puede usarse en experimentos para cuantiflcar Ia actividad cerebral regional asociada a Ia percepcion de diversos estimulos o a Ia ejecucion de varias conductas o tareas cognitivas (vease Ia Figura 2.24).

Registro de Ia actividad metab61ica y sinaptica del cerebro

Las se!"iales electricas no son los (micas signos de acti­vidad neural. Si Ia actividad neural de una region con­creta del encefalo aumenta, e l indice metabolico tambien lo hace, en gran medida como consecuencia del mayor funcionamiento de las bombas ionicas de Ia membrana de las celulas. Este aumento del indice meta­bolico puede estimarse. Para ella, el investigador inyecta 2-desoxiglucosa (2-DG) radioactiva en el torrente circu­latorio del animal. Dado que esta sustancia es similar a Ia glucosa (Ia principal fuente de energia del encefalo), es transportada a! interior de las celulas. Asi, las celulas

Ma netoelectroencefalo rafia

El neuromagnet6metro se muestra a Ia izquierda de Ia pan­talla. En Ia parte derecha de esta pueden verse las regiones con elevada actividad electrica, superpuestas a una imagen del encetalo obtenida con RM.

(Cortesia de CTF Systems Inc.)

mas activas, que son las que consumen mas glucosa, ll e­gan a ser las que alcanzan Ia mayor concentracion de 2-DG radioactiva. Pero, a diferencia de Ia glucosa nor­mal, Ia 2-DG no puede ser metabolizada, de modo que queda dentro de Ia celula. Luego, el investigador sacri­fica a! animal, extrae su encefalo, lo secciona y lo pre­para para Ia autormdiograjia.

El termino autorradiografia podria traducirse como «escribir con Ia propia radiacion >> . Sabre un portaobjetos se manta una seccion del encefalo y se !leva entonces a una habitacion oscura, donde se cubre con una emulsion fotografica (Ia sustancia que tienen las pelfculas fotogra­f:icas). Varias semanas despues, Ia seccion , con su capa de emulsion, se revela exactamente igual que una pelfcula fo tografica. Las moleculas de 2-DG radioactiva se ponen de manifiesto como puntas de granulos plateados en Ia emulsion revelada, ya que Ia radioactividad revela Ia emulsion, tal como lo harfan los rayos X o Ia luz.

Las zonas mas activas del encefalo contienen el mayor grado de radioactividad, y esta se manifiesta en Ia emulsion revelada como puntas oscuros. En Ia Figura 2.25 se muestra una autorradiografia de una seccion del en cefalo de rata. Los puntas oscuros en Ia parte inferior (seiialados con Ia flecha) son nucleos del hipotalamo que tienen un indice metabolico especialmente elevado.

En el Capitulo 4 se describen ~- dichos nucleos y sus funcio-

Animacion 2_2 nes (vease Ia Figura 2.25). En MyPsychKit 2.2, Autorradiogra-

Autorradiografia fia, puede verse este procedi-

miento. Otro metoda para identificar las regiones activas del

encefalo se beneficia del hecho de que cuando las neu­ronas son estimuladas (por ejemplo, por los botones ter­minales que establecen sinapsis con ellas) determinados genes del nucleo, a los que se llama genes de expresi6n tem­pmna, son activados y se producen proteinas especfficas. Estas proteinas se unen entonces a los cromosomas del nucleo y Ia presencia de estas protefnas nucleares indica que las neuronas acaban de ser activadas.

Una de estas protefnas nucleares producida durante Ia activacion neural recibe el nombre de Fos. Como se

magnetoencefalografia Procedimiento que derecta grupos de neuronas activadas sincronicamenre gracias al campo magn erico inducido par su acrividad electrica. Utiliza un conjunto de elemen­tos superconductores de interferencia cwintica o SQUID.

2-desoxiglucosa (2-DG) Az(tcar que penerra en las celulas junto con Ia glucosa pero que no se meraboliza.

autorradiografia Procedimienro que locaiiza susrancias radioacrivas en una seccion de rejido. La radiacion pone de manifiesto una emul­sion fotogr:ifica o un fragmento de pelicula que recubre el rejido.

Fos Proreina que se produce en el nucleo de una neUI·ona en res­puesra a Ia esrimulacion sinaprica.

-

-

Autorradiografia

Esta secci6n frontal del encefalo de una rata (Ia zona dorsal se situa arriba) muestra regiones con una actividad marca­damente elevada en el par de nucleos hipotalamicos, en Ia base del encefalo.

(De Schwartz, W. ]. y Gainer, H. Science, 1977, 197, 1089-1091. Re­producido con autorizaci6n .)

recordari, antes se estaba explicando una supuesta inves­tigacion acerca de los circuitos neurales implicados en la conducta sexual de Ia rata hembra. Supongamos que se quiere u tilizar el metoda Fos en ese proyecto de investi­gacion para ver que neuronas se activan durante Ia acti­vidad sexual d e una rata hembra. Para ello, se instalan ratas h embra con machos y se les permite aparearse; luego se extrae el encefalo de las ratas, se secciona y se sigue un procedimiento para teiiir la protefna Fos. En Ia Figura 2.26 se presentan los resultados: en las neuro­nas de la amigdala medial de una rata hem bra que acaba de aparearse pueden observarse puntas oscuros, lo que indica la presencia de proteina Fos. Asi, parece ser que estas neuronas se h an activado debido a la copula -quiza por la estimulacion fisica de los genitales que han tenido las ratas-. Com o se recordari, cuando se inyecto un marcador retrogrado (oro fluorado ) e n e l HVM, se encontro que esta region recibe aferencias de Ia amigdala medial (vease Ia Figura 2.26).

La actividad m etabolica de regiones cerebrates espe­cificas puede asimismo es timarse en el cerebra humano utilizando neuroimagen funcional -un metodo com­putarizado para detectar cambios quimicos o m etaboli­cos en el cerebro- . El primer metodo de neuroimagen funcional que se invento fue la tomografia por emision de positrones (TEP). En primer Iugar, al paciente se le inyecta 2-DG radioactiva. (Con e l tiempo, Ia sustancia se degrada y sale d e las celulas. La dosis que se admi­nistra a los pacientes humanos es inocua). Se coloca Ia cabeza del sujeto en un aparato similar al de un TAC,

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 53

Localizad6n de

La microfotografia presenta una secci6n frontal del encefa­lo de una rata hem bra, siguiendo un plano transversal de Ia amigdala medial. Los puntos oscuros indican Ia presencia de proteina Fos, localizada mediante inmunocitoquimica . La sintesis de proteina Fosse estimul6 permitiendo al ani­mal tener una conducta de apareamiento.

(Cortesia de Marc Tetel, We ll es ley Col lege.)

... : ~ .. . . . .. ~··:· "':' ~· .:;· :r: - . ~:· .

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4 ~ .... .:· .'i:.~<r :~~ :

y al descomponerse las moleculas radioactivas de 2-DG, emiten partfculas subatomicas, llamadas positrones, que son detectadas por e l equipo de TEP. El ordena­dor determina cu i les son las regiones del encefalo que han absorbido la sustancia radioactiva y crea una ima­gen de una seccion del e ncefalo , mostrando el nivel de actividad de diversas regiones de dich a seccion (vease la Figura 2.27).

Uno de los inconvenientes de la TEP es su coste de funcionamiento, ya que, por motivos de seguridad, las sustancias radioactivas que se administran tienen una vida media muy corta, es decir, se descomponen y pier­den su radioactividad muy ripidamente. Por ejemplo, la vida media de Ia 2-DG radioactiva es de 110 minutos; la del agua radioactiva (qu e tambien se utiliza para obtener imigenes de TEP) es de solo dos minutos. Teniendo en cuenta que estas sustancias se descomponen tan deprisa, tienen que producirse en el lugar donde se van a utiliza1~ mediante un acelerador de partfculas atomicas denomi­nado ciclotr6n. Par lo tanto, al coste de la TEP hay que aiiadirle el d el ciclotron y los salarios del personal que se encarga de e l.

neuroimagen funcional Metodo computarizado para detectar cam bios qufmicos o metab6licos en regiones concretas del cerebra.

tomografia por emision de positrones (TEP) Metodo de neuro­imagen funcional que revela Ia localizacion de un marcador radio­activo en un encefalo vivo.

54 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigocion

I •

En Ia fila superior de estas imagenes de TEP, secci6n hori­zontal, de encefalos humanos pueden verse tres imagenes de una persona en estado de reposo. En Ia fila inferior se muestran tres imagenes de Ia misma persona mientras abrfa y cerraba el pufio derecho. En elias se observa una elevada absorci6n de 2-desoxiglucosa radioactiva en las regiones del cerebra encargadas del control del movimiento, lo que in­dica un alto grado de actividad metab61ica en dichas areas. Los diferentes colores que genera el ordenador indican dife­rentes indices de absorci6n de 2-DG, conforme representa Ia escala en Ia parte inferior.

(Cortesia del Brookhaven National Laboratory y Ia State University de Nueva York, Stony Brook.)

Otro inconveniente de la TEP es la relativamente baja resolucion espacial de las imagenes (la imagen es borrosa). La resolucion temporal es asimismo relativa­mente baja porque han d e obtenerse muestras d e los positrones que va emitiendo el cerebro durante bas­tante tiempo, lo que implica que probablemente pasen desapercibidos acontecimientos rapidos, effmeros, que suceden en el cerebro. Estas desventajas no se dan en la RM funcional, que se describe a continuacion. No obs­tante, la exploracion con TEP ofrece algo que la explo­racion con RM funcional no puede hacer: estima la concentracion de determinadas sustancias qufmicas en diversas partes del encefalo. Este procedimiento se des­cribira mas adelante en este capitulo.

El metodo de neuroimagen con mejor resolu­cion temporal y espacial se conoce como resonancia

magnetica funcional (RMf). Los ingenieros han llevado a cabo modificaciones de la RM existente y su software que permiten a los equipos obtener imagenes que indican el grado de metabolismo regional. La actividad cerebral se evalua indirectamente al detectar los niveles de oxfgeno en los vasos sangufneos del encefalo. El aumento de acti­vidad de una region del encefalo estimula el aporte san­gufneo a dicha region, lo que eleva el nivel de oxigeno en sangre local. El termino tecnico para referirse a este tipo de exploracion es BOLD1

: seiial dependiente del nivel de oxfgeno en sangre. La RMf tiene una resolucion mayor que Ia TEP y Ia exploracion se puede realizar mucho mas rapidamente. Asf pues, proporciona una informa­cion mas detallada acerca de Ia actividad en una region determinada del cerebro. En los capftulos siguientes de este libro se expondran muchos estudios de neuroima­gen que emplean RMf (vease Ia Figura 2.28).

Estimulaci6n de Ia actividad neural

Hasta aquf, esta seccion se ha dedicado a los metodos de investigacion que evaluan Ia actividad de regiones espe­cfficas del encefalo. Pero a veces se quiere cambiar arti­ficialmente Ia actividad de dichas regiones para observar que efectos tienen estos cambios en Ia conducta del

1 Blood oxygen level-dependent.

Resonancia magm!tica funcional

Estas imagenes de RMf del encefalo humano muestran un aumento localizado del promedio de Ia actividad neural en varones (izquierda) y mujeres (derecha) mientras discernfan si un par de palabras escritas rimaba.

(De Shaywitz, B, A. y cols.: Nature, 1995, 373, 607-609. Reproduci­do ct>n autorizaci6n.)

resonancia magnetica funcional (RMf) Metoda de neuroimagen funcional. Es una modificacion del procedimiento de RM que per­mite calcular el merabolismo regional en el encefalo, por lo general detecrando cambios en el nivel de oxigeno en sangre.

1doa 1que an el a! se ·eno acti­san-1en 1p0 de

yor

ho na-6n de ta-

e :-'-

an imal. Por ejemplo, las ratas hembra copularan con ratas macho solo si ciertas hormonas sexuales femeni­nas esttin presentes, pero si se extirpan los ovarios de Ia rata, Ia perdida de esas hormonas suprimira su con­ducta sexual. En anteriores estudios, el autor hall6 que las Iesiones del HVM alteran esta conducta. Tal vez si se activa el HVM se compensara la falta de hormonas sexuales femeninas y la rata volvera a copular.

Estimulaci6n electrica y qufmica

2C6mo se pueden activar las neuronas? Se puede hacer mediante estimulaci6n electrica o qufmica. La estimula­ci6n electrica implica simplemente pasar una corriente electrica a traves de un cable insertado en el encefalo, como se vio en la Figura 2.22; y la estimulaci6n qufmica se efectua por lo general inyectando en el encefalo una pequei'ia cantidad de un aminoacido excitador, como el acido cafnico o el acido glutamico. El acido glutamico (glutamato) es el principal neurotransmisor excitador que se encuentra en el encefalo, y ambas sustancias esti­mulan los receptores glutamatergicos, activando asf las neuronas en las que se localizan estos receptores.

La inyecci6n de sustancias en el encefalo puede hacerse mediante un dispositivo permanentemente unido al cra­neo, de modo que !a conducta del animal pueda obser­varse en repetidas ocasiones. Se coloca una canula de metal (I a canula gufa) en el encefalo del animal y se f~a con cementa su extrema superior a! craneo. Dfas despues,

Figura 2.29 ~~ Canula endocraneal

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 55

se coloca una canula mas fina de una longitud adecuada dentro de la canula gufa y luego se inyecta una sustancia en el encefalo. Como el animal tiene libertad de movi-

Animocion 2.3 lmplantaci6n de una canula

mientos, se pueden observar los efectos de la inyecci6n en su conducta (vease !a Figura 2.29) . En MyPsychKit 2.3, Implantacion de una canula, puede verse este procedimiento.

El principal inconveniente de la estimulaci6n qui­mica es que resulta algo mas compleja que la electrica: se requieren canulas, tubos, bombas o jeringas especia­les y soluciones esterilizadas de aminoacidos excitadores. No obstante, tiene una clara ventaja sobre la electrica: activa los somas celulares, pero no los axones. Puesto que solo los somas celulares (y por supuesto sus den­dritas) contienen receptores glutamatergicos, se puede estar seguro de que la inyecci6n de un aminoacido exci­tador en una determinada region d el cerebra excita las celulas allf localizadas, pero no los axones de otras neu­ronas que casualmente pasan por la region. Asf pues, los efectos de la estimulaci6n qufmica son mas circunscritos que los de la estimulaci6n electrica.

Como se habra notado, se acaba de decir que el acido cafnico, descrito antes como una n eurotoxina, puede utilizarse para estimular a las n euronas. Estas dos aplicaciones en realidad no son contradictorias. El acido cafnico produce lesiones excitot6xicas al estimular las neuronas hasta destruirlas. Mientras que las dosis altas

Se fija permanentemente a! craneo una canula gufa y posteriormente puede insertarse a su traves en el encefalo una canula mas estrecha. Mediante este dispositivo pueden infundirse sustancias en el encefalo.

Cemento dental

(a)

Gufa de Ia canula

(b)

..._Sustancia qufmica

Tubo de plastico

56 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigocion

de una solucion concentrada destruyen las neuronas, las dosis bajas de una solucion diluida solo las estimula.

(Y respecto a los resultados del experimento que se estaba exponiendo? De hecho (como se vera en el Capi­tulo 5), Ia estimulacion del HVM sustituye Ia accion de las hormonas sexuales femeninas. Por lo tanto, quiza las hormonas sexuales femeninas ejerzan sus efectos en dicho nCtcleo. En Ia seccion final de este capitulo se vera como comprobar esta hipotesis.

Cuando se inyectan sustancias en el encefalo a tra­ves de canulas, las sustancias se difunden por una region que incluye muchos tipos diferentes de neuronas: neu­ronas excitadoras, neuronas inhibidoras, interneuro­nas que forman parte de circuitos locales, neuronas de proyeccion que se comunican con diferentes regio­nes del encefalo y neuronas que liberan o responden a una amplia gama de neurotransmisores y neuromo­duladores. La estimulacion de una region especif:ica del cerebra con electricidad o con una sustancia quimica excitadora afecta a todas estas neuronas y no es proba­ble que el resultado sea similar a Ia actividad cerebral normal, que implica Ia activacion y Ia inhibicion coordi­nada de muchas neuronas diferentes. Lo ideal seria que pudieramos estimular o inhibi r los grupos neuronales que nos interesan en una region dada del cerebra.

Fotoestimulaci6n Los recientes avances cientif:icos estan proporcionando los medias para estimular o inhibir tipos especificos de neuronas en regiones especfficas del encefalo (Boyden y cols. , 2005; Zhang y cols., 2007). En muchos organism as - incluso en organismos unicelulares tales como las algas y las bacterias- han evolucionado protefnas fotosensi­bles. Los investigadores han descubierto que una de estas proteinas, Ia Rodopsina-canal-2 (ChR2), que se encuentra en las algas verdes, controla un canal ionico que, cuando se abre, permite el flujo a traves de ella de iones de sodio, potasio y calcio. Cuando una luz azul incide en un canal ionico de ChR2, el canal se abre y Ia corriente de iones de sodio y calcio cargados positivamente despolariza Ia mem­brana. Una segunda proteina fotosensible, cuyo nombre Iatino es Natronomonas pharaonis halorhodopsin (NpHR), se encuentra en una bacteria y controla un transporta­dor que ingresa cloruro dentro de Ia celula cuando es activada por una luz azul. Esta entrada de iones cargados negativamente hiperpolariza Ia membrana. La accion de ambas proteinas fotosensibles comienza y termina muy rapidamente cuando se enciende y apaga una luz de lon­gitud de onda apropiada (Vease Ia Figura 2.30) .

Se puede introducir ChR2 y NpHR en neuronas incorporando los genes que las codifican al genoma de virus inocuos. Luego se inyectan los virus en el cerebra, donde infectan a las n euron as y comienzan a expresarse las protefnas, que estan insertadas en Ia membrana de Ia

Figura 2.30 ~~ Fotoestimulaci6n

Pueden insertarse protefnas fotosensibles en membranas neurales mediante virus con modificaci6n genetica. (a) La luz azul provoca que los canales i6nicos ChR2 despolaricen Ia membrana y Ia luz amarilla que los transportadores NpHR Ia hiperpolaricen. (b) El grafico muestra los efectos de diferen­tes longitudes de onda de luz sabre el potencial de membra­na al actuar sabre las protefnas ChR2 o NpHR. (c) Los pulsos de luz azul (flechas azules) produjeron potenciales de ac­ci6n; los de luz amarilla, los efectos inhibidores de Ia hiper­polarizaci6n.

(Parte (a) modificada de Hausser, M. y Smith, S.L. Nature, 2007, 446, 617-619; y partes (b) y (c) modificadas de Zhang, F.; Wang, L. P.; Brauner, M.; Liewald, j. F.; Kay, K.; Watzke, N. ; Wood, P. G.; Bamberg, E.; Nagel, G.; Gottschalk, A., y Deisseroth, K. Nature, 2007, 446, 633-639.)

Exterior de Ia celula ChR2 NpHR

Luz azul 0-- Ca2+

000-Na+

Luz amarilla

c1--D oo 0 0

-- ~ -"""'"-"'~'-'

) % ( 0 ~ 0 ......,_ * . ..,...,.....,.....,.....,

~ \

(a)

c ·O '(3 C1l >

""B <(

(b)

o 0 o 0

Canal i6nico

o0

0rransportador deiones

Despolarizaci6n Hiperpolarizaci6n 1,0

0,8 I \ 0,6

-NpHR

0,4

0,2 \ 0

325 425 525 625 725

Longitud de onda (nm)

Potenciales de acci6n

_/\

t t t

Se aplica una luz amarilla

tt ttttt (c) Tiempo --------+-

celula. Los genes se pueden modificar de man era que las protefnas se expresen solo en tipos especificos de neu­ronas. De este modo, los investigadores pueden obser­var los efectos de activar o desactivar tipos especfficos de neuronas en una region concreta del encefalo.

Por supuesto, dado que Ia ChR2 y Ia NpHR son acti­vadas porIa luz, los investigadores necesitan hacer pene­trar luz en el cere bro. Silas neuronas que expresan estas protefnas fotosensibles se localizan en Ia corteza cere­bral, se puede taladrar un peque!'i.o orificio en el craneo y adherir sobre el diodos emisores de luz (DEL). Para activar las proteinas fotosensibles en las membranas de neuronas situadas en Ia profundidad del encefalo , se pueden implantar fibras opticas mediante cirugfa este­reotaxica, como si fueran electrodos o canulas, y Ia luz se puede transmitir mediante dichas fibras.

La puesta a punto de estos procedimientos ha des­pertado gran interes entre los neurocientificos ya que ofrecen una via de estudio de las funciones de circui­tos neurales especfficos en el encefalo. Algunos inves­tigadores estan estudiando el posible uso clinico de las protefnas fotosensibles . Por ejemplo, Bi y colaboradores (2006) utilizaron un virus para insertar genes de ChR2 en las celulas ganglionares de Ia retina de una cepa de ratones ciegos cuya retina carecfa de fotorreceptores. Las celulas ganglionares de Ia retina son neuronas que reciben informacion de los fotorreceptores y transmi­ten esta informacion por el nervio optico a los circuitos cerebrales implicados en Ia vision . Bi y su equipo encon­traron que las celulas ganglionares se hacian sensibles a Ia luz: al estimular Ia retina con un destello de luz azul se registraban potenciales electricos en Ia corteza visual. Como se expondra en el Capitulo 3, Ia retina contiene una cantidad considerable de circuitos neurales que analizan Ia informacion procedente de los fotorrecepto­res antes de que esta se envfe a traves del nervio optico a otras partes del cerebra, de modo que el simple hecho de hacer sensibles a Ia luz a las celulas ganglionares no garantiza que Ia ceguera causada porIa falta de fotorre­ceptores restaure el diseno de Ia vision. Sin embargo, administrar selectivamente ChR2 y NpHR (y otros tipos de proteinas fotosensibles todavfa por descubrir) a tipos especfficos de neuronas de Ia retina puede llevar final­mente al desarrollo de medios para tratar algunos tipos de ceguera. En el Capftulo 10 se analizan otros posibles usos clinicos de las protefnas fotosensibles -por ejem­plo, en el tratamiento de enfermedades neurologicas tales como Ia enfermedad de Parkinson- .

Estimulaci6n magnetica transcraneal

Como se vio antes en este capitulo, la actividad neu­ral induce campos magneticos que pueden detectarse mediante magnetoencefalografia. De modo parecido , pueden emplearse campos magneticos para estimular

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 57

neuronas induciendo corrientes electricas en el tejido cerebral. En Ia estimulacion magnetica transcraneal (EMT) se utiliza una bobina electromagnetica, que por lo general tiene Ia forma d el numero 8, para estimular neuronas de Ia corteza cerebral humana. La bobina de estimulacion se coloca sobre la parte superior del cra­neo de modo que el punto de cruce en medio del 8 se localice jus to encima de la region que se qui ere estimu­lar, y los pulsos de actividad e lectrica envian campos magneticos que activan las neuronas corticales. En Ia Figura 2.31 se muestra Ia bobina electromagnetica que se utiliza para Ia estimulacion magnetica transcraneal y como se sit(Ja sobre la cabeza de Ia persona (vease Ia Figura 2.31).

Los efectos de la EMT son muy parecidos a los de Ia estimulacion directa del encefalo al descubierto. Por

Pulsos electricos aplicados mediante Ia bobina producen un campo magnetico que estimula Ia region de Ia corteza ce­rebral situada bajo el punto marcado con una X en medio de Ia figura .

(Fotografia por cortesfa del Kastner Lab., Princeton University, Prin­ceton, Nueva jersey.)

estimulaci6n electrica transcraneal (EMT) Estimulacion de Ia corteza cerebral mediante campos magneticos, que se producen aplicando pulsos electricos mediante una bobina electromagnetica situada cerca del craneo. Interfiere en Ia funcion de Ia region cere­bral que se estimula.

58 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigocion

ejemplo, como se expondra en el Capitulo 3, Ia estimula­cion de una region especifica de Ia corteza visual de aso­ciacion altera Ia capacidad de una persona para detectar

intermedio Registro y estimulaci6n de Ia actividad neural Cuando los circuitos neuronales desempefian sus funciones habituales, su actividad electrica y metabolica y sus secre­ciones qufmicas aumentan. Asf pues, observando estos procesos mientras un animal percibe diversos estfmulos o I leva a cabo diversas conductas, se pueden hacer algunas inferencias acerca de las funciones que realizan diferen­tes regiones cerebrales. La actividad electrica de neuronas individuales puede registrarse mediante microelectro­dos. Los registros cronicos requieren unir el electrodo a un zocalo electrico, el cual se fija al craneo mediante un ad hesivo plastico. Los macroelectrodos registra n Ia acti­vidad de grandes grupos de neuronas. Rara vez estos se situan profunda mente en el encefalo humano, sino que lo mas frecuente es que se coloquen sabre el cuero cabelludo y su actividad se registre par media de un polfgrafo.

La act ividad metabolica puede est imarse inyectando al animai2-DG radioactiva, Ia cual se acumula en las neuro­nas metabolicamente activas. La autorradiograffa detecta Ia radioactividad: se colocan secciones encefal icas sabre el portaobjetos del microscopio, se recubren con una emul­sion fotogratica , se dejan reposar cierto tiempo y luego se revelan como los negativos fotograticos. Cuando las neu­ronas son estimuladas sintetizan Ia protefna nuclear Fos. La presencia de Fos, puesta de manifiesto par un metoda especial de tincion , aporta otra via para descubrir cuales

METODOS NEUROQUfMICOS

En ocasiones lo que nos in teresa no es Ia actividad metab6-lica general de una determinada region del encefalo sino Ia localizacion de neuronas que tengan un tipo especifico de receptor o que produzcan un tipo especifico de neuro­transmisores o neuromoduladores. Tambien podriamos querer estimar Ia cantidad de aquellas sustancias quimi­cas que segregan las neuronas de una region determi­nada del encefalo en determinadas circunstancias.

Detecci6n de neuronas que producen sustancias neuroqufmicas espedficas

Supongamos que se averigua que una determinada sus­tancia quimica afecta a Ia conducta. ~Como se podria

el movimiento de los estimulos visuales. Ademas, como se vera en el Capitulo 11, Ia EMT se ha utilizado para tratar los sintomas de trastornos mentales como Ia depresion.

son las regiones activas del encefa lo. La actividad metabo­lica de diversas regiones del cerebra humano in vivo puede evidenciarse con el metoda de 2-DG, pero para detectar las regiones act ivas se utiliza una exp loracion con TEP. La RM funcional (RMf) informa de Ia actividad cerebral local esti ­mando el nivel regional de oxfgeno en sangre. La tecnica de RMf tiene una resolucion espacial y temporal mucho mas alta que Ia de TEP.

Los invest igadores pueden estimular varias regiones del encefalo implantando un macroelectrodo y aplicando una estimulacion electrica moderada. Alternativamente, pueden implantar una canula gufa en el encefa lo. Cuando el anima l se ha recuperado de Ia intervencion quirur­gica, insertan una canula mas tina e inyectan una solu ­cion diluida de un aminoacido excitador en el encefalo. La ventaja de este procedimiento es que solo se estimu­lan aquellas neuronas cuyos somas celulares se localizan en las proximidades: los axones que atraviesan Ia region no resultan afectados. Se pueden utilizar virus para apor­tar genes para protefnas fotosensibles que producen una despolarizacion o una hiperpolarizacion de Ia membrana de neuronas especfficas cuando las protefnas son estimu­ladas par Ia luz. La estimulacion magnetica transcraneal induce actividad electrica en Ia corteza cerebral humana, que altera temporal mente el funcionamiento de los circui­tos neurales que se localizan al ii.

En Ia Tabla 2.2 se resumen los metodos de investiga­cion expuestos en este apartado.

llegar a descubrir los circuitos neurales responsables de los efectos de Ia sustancia? Para responder a esta pre­gunta, pondremos un ejemplo concreto. Los medicos revelaron hace varios a1ios que los granjeros que habian estado expuestos a determinados tipos de insectici­das ( organofosfatos) ten ian ensueiios particularmen te intensos y extra1i.os e incluso decian tener alucinacio­nes cuando estaban despiertos. Una posible explicacion de estos sintomas es que Ia sustancia estimula los circui­tos neurales que controlan Ia fase REM del sueiio, aque­lla en Ia que ocurren principalmente los ensueiios. (AI fin y al cabo, los sue1ios son alucinaciones que se tienen es tan do dormido).

La primera pregunta a plantearse es como funcionan los insecticidas organofosfatados, y los farmacologos tie­nen Ia respuesta: estas sustancias inhiben Ia acetilcoli­nesterasa (AChE). Las sustancias que inhiben Ia AChE son potentes agonistas colinergicos, y al inhibir Ia AChE,

o se

ltar

n.

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 59

'll :JI~U'.ll I t••'• :111 I I h'l ::nt I I

Registrar Ia actividad electrica de neuronas individuales

Microelectrodos de vidrio ode metal Puede hacerse una implantacion cronica de microelectrodos de metal para registrar Ia actividad neural del animal cuando se mueve

Registrar Ia actividad electrica de regiones del cerebra

Macroelectrodos de metal En seres humanos, por lo general se adhieren al cuero cabelludo con una pasta especial

Registrar los campos magneticos inducidos porIa actividad neural

Magnetoencefalografia; utiliza un neuramagnetometro que contiene una serie de SQUID

Puede determinar Ia localizacion de un grupo de neuronas que descargan sincranizadamente

Registrar Ia actividad metabolica de regiones del cerebra

Autorradiografia con 2-DG

Medida de Ia protefna Fos

Evalua el consumo local de glucosa

ldentifica las neuranas que se han estimulado recientemente

Medir los neuratransmisores y neuromoduladores liberados por las neuronas

Determinar las sustancias neuroqufmicas existentes en el cerebra humano in vivo

Estimular Ia actividad neural

TEP con 2-DG

RM funcional

Microdialisis

TEP

Estimulacion electrica

Evalua Ia actividad metabolica regional del cerebra humano

Evalua Ia actividad metabolica regional del cerebra humano; mejor resolucion espacial y temporal que Ia de TEP

Puede analizarse una amplia variedad de sustancias

Puede localizar cualquier sustancia radioactiva en el cerebra humano

Estimula las neuronas cercanas a Ia punta del electrado y los axones que atraviesan Ia region

Estimulacion qufmica con un aminoacido excitador

Estimula solo las neuronas proximas a Ia punta de Ia canula, no los axones que atraviesan Ia region

Estimulacion magnetica transcraneal Estimula las neuranas de Ia corteza cerebral humana con una bobina electramagnetica situada sobre Ia cabeza

frenan la rapida destrucci6n de ACh despues de que haya sido liberada por los botones terminales, y asf pro­longan el tiempo durante el que se producen potencia­les postsinapticos en las sinapsis colinergicas.

Ahora que entendemos la acci6n de los insecticidas, sabemos que estas sustancias actuan a nivel de las sinap­sis colinergicas. 2Que metodos neuroqufmicos se debe­dan utilizar para descubrir el lugar de acci6n de estas sustancias en el encefalo? Existen tres posibilidades: se podrfan buscar neuronas que contienen acetilcolina, se podrfa buscar la enzima acetilcolinesterasa (la cual ha de estar presente en las membranas postsinapticas de las celulas que reciben aferencias sinapticas de las neuronas

colinergicas) o se podrfan buscar receptores de acetilco­lina. Examinemos estos tres metodos.

En primer lugar consideraremos los metodos mediante los que se pueden localizar sustancias neuro­qufmicas especfficas, como los neurotransmisores y los neuromoduladores. (En nuestro caso, nos interesa la acetilcolina). Hay tres modos basicos de localizar sustan­cias neuroqufmicas en el encefalo: localizar las sustancias mismas, localizar las enzimas que las sintetizan o localizar el ARN mensajero involucrado en su sfntesis.

Los peptidos ( o las protefn as) pueden localizarse directamente por medio de metodos inmunocitoqufmi­cos, que se describieron en la primera secci6n de este

60 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigocion

capitulo. Se exponen secciones de tej ido cerebral a un anticuerpo para el peptido, asociado a un tinte (por lo general, uno fluorescente), y despues se examinan las secciones al microscopio usando luz de una determi­nada longitud de onda. Por ejemplo, en Ia Figura 2.32 puede verse Ia localizacion en el prosencefalo de axones que contienen vasopresina, un neurotransmisor pepti­dico. En ella se muestran dos conjuntos de axones: uno, agrupado en torno al tercer ventrfculo en Ia base del cerebro, aparece en color pardo; el otro, disperso en el area septal lateral, tiene el aspecto de cadenas de fibras doradas (como puede apreciarse, una seccion cerebral bien teiiida puede ser bonita) (vease Ia Figura 2.32).

Pero lo que interesa aqui es Ia acetilcolina, que no es un peptido. Por ello, no se pueden utilizar metodos inmunocitoquimicos para localizar este neurotransmisor,

Figura 2.32 ~~ Localizacion de un peptido

El peptido pudo verse mediante inmunocitoqufmica. La mi­crofotograffa muestra parte de una secci6n frontal a traves del prosencefalo de una rata . Las fibras doradas y ocres son axones y botones terminales que contienen vasopresina , un neurotransmisor peptfdico.

(Cortesia de Geert DeVries, University of Massachusetts.)

aunque pueden usarse para localizar Ia enzima que lo sintetiza. La sintesis de acetilcolina se logra gracias a Ia enzima colina acetiltransferasa (ChAT). Por lo tanto, casi con toda seguridad las neuronas que contienen esta enzima segregan ACh. En Ia Figura 2.33 pueden verse neuronas colinergicas de Ia protuberancia identifica­das mediante inmunocitoquimica: el tejido cerebral se expuso a un anticuerpo de Ia ChAT unido a un tinte fluorescente. De hecho, investigaciones realizadas utili­zando muchos de los metodos descritos en este capitulo indican que dichas neuronas intervienen en el control del sueiio REM (vease Ia Figura 2.33).

Otra forma indirecta de localizar una sustancia es uti­lizar una tecnica conocida como hibridacion in situ: todos los peptidos y protefnas (incluidas, por supuesto, todas las enzimas) se sintetizan conforme a Ia informacion con­tenida en los cromosomas. Cuando se va a sintetizar una proteina concreta, se co pia Ia informacion necesaria de un cromosoma en un segmento de ARN mensajero, el cual sale del nucleo y se desplaza hasta los ribosomas, donde tiene Iugar Ia sintesis de proteinas. (Este proceso se ilus­tro en Ia Figura 2.6). La formula (estructura quimica) de

Una enzima, responsable de Ia sfntesis de un neurotransmi­sor, se localiza mediante inmunocitoqufmica. La microfo­tograffa muestra una secci6n a traves de Ia protuberancia. Las neuronas en color naranja contienen colina acetiltrans­ferasa, lo cual implica que producen (y por lo tanto segre­gan) acetilcolina.

(Cortesia de David A. Morilak y Roland Ciaranello: Nancy Pritzker Laboratory of Developmental and Molecular Neurobiology, De­partment of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford Univer­sity School of Medicine.)

hibridaci6n in situ Producci6n de ARN complemenrario de un ARN mensajero dererminado con el fin de derecrar el ARN men­sajero.

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Ia protefna esta codificada en terminos de una secuencia especffica de bases de nucle6tidos que componen el ARN mensajero. Si se conoce este c6digo (y en la mayoria de los casos es asf), los bi6logos moleculares pueden sinteti­zar un segmento de ARN radioactivo que contiene una secuencia de nucle6tidos complementaria de Ia secuen­cia del ARN mensajero. Las secciones de tejido cerebral se exponen al ARN radioactivo, que se adhiere a las mole­culas del ARN mensajero apropiado. Se utilizan enton­ces Ia autorradiograffa ( descrita en la segunda secci6n de este capitulo) para poder ver d6nde se localiza el ARN mensajero y, por deducci6n, Ia de las celulas que produ­cen Ia protefna cuya sintesis inicia el ARN.

En Ia Figura 2.34 se explica con un grafico el metodo de hibridaci6n in situ y en Ia Figura 2.35 se muestra Ia localizaci6n del ARN mensajero responsable de Ia sinte­sis de un peptido, Ia vasopresina, puesta de m anifiesto mediante este metodo. La iluminaci6n lateral de los por­taobj etos para el microscopio hace que los granulos de plata de Ia emulsion fotografica aparezcan como puntos blancos (veanse las Figuras 2.34 y 2.35).

localizaci6n de receptores espedficos

Los neurotransmisores, los neuromoduladores y las hor­monas tran sfieren sus m ensajes a las celulas sobre las

Hibridaci6n in situ

Este esquema simplificado explica c6mo se utiliza Ia hibrida­ci6n in situ para localizar el ARN mensajero responsable de Ia sfntesis de una protefna ode un peptido determinados.

ARN radioactivo complementario del ARN mensajero que interesa

ARN mensajero

ARN radioactivo ligado al ARN mensajero

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 61

Localizaci6n de una enzima

Se expuso el tejido a ARN radioactivo, el cual se une al ARN mensajero responsable de Ia sfntesis de vasopresina , un peptido. La localizaci6n del ARN radioactivo, puesta de ma­nifiesto por Ia autorradiograffa, puede verse como puntos blancos. Las neuronas marcadas se situan en un par de nu­cleos del hipotalamo.

(Cortesia de Geert DeVries, University of Massachusetts.)

que actuan uniendose a receptores. La localizaci6n de estos receptores puede determinarse siguiendo dos pro­cedimientos diferentes.

En uno d e ellos se utiliza la autorradiografia. Para ello, se exponen secciones d e tejido cerebral a una solu­ci6n que contiene un ligando radioactivo para un recep­tor especifico. Despues se enj uagan las seccion es, de manera que la unica radioactividad que queda en ellas es lade las moleculas delligando que se h a unido a sus receptores. Por ultimo, se utilizan metod os autorradio­graficos para localizar el ligando radioactivo - y, por lo tanto, los receptores-. En Ia Figura 2.36 se presenta un ejemplo de los resultados de este procedimiento. Puede verse el autorradiograma de una secci6n del encefalo de una rata que se baii6 en una soluci6n con morfina radio­activa, la cual se uni6 a los receptores para los opio ides del encefalo (vease la Figura 2.36).

En el segundo procedimiento se aplica la inmuno­citoquimica, de modo que los receptores son protefnas y, por lo tanto, se pueden producir anticuerpos frente a ellos. Se exponen las secciones de tejido cerebral al anti­cuerpo adecuado (marcado con un tinte fluorescente) y se observan las secciones al microscopio con una luz de una d eterminada longitud de onda.

Se aplica el metodo de localizaci6n de receptores a Ia primera linea de investigaci6n que se consider6 antes en este capitulo: la funci6n del hipotalamo ventrome­dial (HVM) en Ia conducta sexual de las ratas hembra. Segun se vio, las lesiones del HVM abolen esta conducta,

62 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigocion

Figura 2.36 ~~ Autorradiografia del encefalo de rata

En esta secci6n horizontal, Ia zona rostral se situa arriba. Se introduce el encefalo en una estufa de incubaci6n con una soluci6n que contiene morfina radioactiva, un ligan­do para los receptores opioides. Los receptores se destacan como areas blancas.

(De Herkenham, M.A. y Pert, C. B. journal of Neuroscience, 1982,2, 1129-1149. Reproducido con autorizaci6n .)

aunque tambien se vio que la conducta no ocurre si se extirpan los ovarios de Ia rata, pero que puede activarse estimulando el HVM electricamente o con aminoacidos excitadores. Estos resultados sugieren que las hormonas sexuales producidas por los ovarios actuan sobre las neu­ronas del HVM.

Dicha hipotesis sugiere dos experimentos. Primero, se podria utilizar el procedimiento representado en Ia Figura 2.29 para inyectar una pequeiia cantidad de la hormona sexual adecuada en el HVM de ratas hembra cuyos ovarios se han extirpado previamente; como se vera en el Capitulo 5, este procedimiento es eficaz: Ia hormona reactiva la conducta sexual del animal. En un segundo experimento se podria utilizar la tecnica de autorradiografia para localizar los receptores de la hor­mona sexual, para lo cual se expondrfan secciones del encefalo de la rata a la hormona radioactiva, se enjua­garian y se efectuarfa la autorradiograffa. Si se hiciera esto, se encontrarfa efectivamente radioactividad en

~----~

el HVM. (Y si se compararan las secciones cerebrales de ratas macho y hembra, se obtendrian pruebas de la existencia de un mayor numero de receptores hor­monales en los encefalos de las hembras). Tambien se podrfa recurrir a la inmunocitoqufmica para localizar los receptores de las hormonas, y se conseguirfan los mismos resultados.

Estimaci6n de las sustancias qulmicas que segrega el cerebro

Sabemos que la cocafna - una droga particularmente adictiva- bloquea la reabsorcion de la dopamina, lo que sugiere que la concentracion extracelular de dopa­mina aumenta en ciertas regiones del encefalo cuando una persona toma cocafna. Para estimar la cantidad de dopamina en una region determinada del encefalo, se utiliza un metodo denominado microdialisis.

La dialisis es un proceso mediante el cual se separan sustancias mediante una membrana artificial que es per­meable para unas moleculas y no para otras. Una sonda de microdialisis consta de una pequeiia canula meta­lica con la que se introduce una solucion en una sec­cion del tubo de dialisis - un fragmento de membrana artificial con forma de cilindro, sellada en su parte infe­rior-. Mediante una segunda pequeiia canula metalica se retira Ia soluci6n despues de que esta haya circulado a traves de la bolsa. En la Figura 2.37 se representa este tipo de sonda (vease la Figura 2.37) .

Se utiliza cirugia estereotaxica para colocar una sonda de microdialisis en el encefalo de una rata, de modo que el extremo de la sonda se situe en la region que nos interesa. Se bombea luego una pequeiia can­tidad de una soluci6n similar a! lfquido extracelular a traves de una de las pequeiias canulas metalicas en el tubo de dialisis, el lfquido circula por este y atra­viesa la segunda canula metalica, de la cual se recoge para analizarlo. A medida que el lfquido circula por el tubo de dialisis va recogiendo moleculas proceden­tes dellfquido extracelular del encefalo, las cuales son impulsadas a traves de la membrana por la fuerza de difusi6n.

Con un metodo extremadamente sensible, se ana­liza el contenido del lfquido que ha circulado por el tubo de dialisis. Este metodo es tan sensible que puede detectar neurotransmisores (y sus productos de degra­daci6n) que han sido liberados por los botones termi­nales y desde el espacio sinaptico se han dispersado en

microdialisis Procedimiento para analizar las sustancias quimicas que se hallan en elliquido intersticial gracias a un pequefio rubo, hecho con una membrana semipermeable, que se implanta en el encefalo.

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Figura 2.37 ~~ Microdialisis

Se infunde lentamente una soluci6n salina diluida en el tuba de microdialisis, donde capta moleculas dellfquido ex­tracelular que se difunden en el. Despues se analiza el con­tenido del tubo.

(Modificado de Hernandez, L. ; Stanley, B. G., y Hoebel , B. G. Life Sciences, 1986, 39, 2629-2637.)

Cemento dental

Tubo de dialisis

Se bombea el fluido a traves de una canula insertada

Craneo Encefalo

-..._____ 1 1 Las sustancias del fluido ~ A +--- extracelular se difunden

a traves del tubo de dialisis

el resto del liquido extracelular. Puede observarse que Ia cantidad de dopamina existente en el liquido extra­celular del nucleo accumbens, localizado en el prosence­falo basal , aumenta cuando se inyecta cocaina a Ia rata. De hecho, se encuentra que Ia cantidad d e dopamina en esta region aumenta cuando se le administra cu al­quier droga adictiva, como herofna, nicotina o alcohol. Incluso seve un aumento de Ia secrecion d e dopamina cuand o el animal se dedica a una actividad placentera tal como comer cuando esta hambriento, beber cuando esta sedien to o una actividad sexual. Estas observacio­nes apoyan Ia conclusion d e que Ia liberacion de dopa­mina e n e l n u cleo accumbens juega un papel en e l refuerzo.

En u nos cuantos casas excepcionales (por ej em­plo, cuando se determinan las sus tancias quimicas presentes e n e l cerebra d e personas con una h emo­rragia cerebral o un traumatism o craneoencefalico) se ha aplicado e l procedimiento de m icrodialisis al estu­dio del cerebra humano, pero, p o r razones eticas, no se hace con fines de investigacion. Mortunadamente existe un media no lesivo de estimar sustancias n euro­quimicas existentes en e l cerebra humano: el equipo de TEP, que , aunque es caro, tambien es versatil, se puede utilizar para localizar cualquier sustancia radio­activa que emita positrones.

En Ia Figura 2.38 se presentan imagenes d e TEP del cerebra de l Sr. B., el hombre cuyo caso se describio

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 63

Figura 2.38 ~~ Tomografias por emisi6n de positrones de un paciente con sintomas parkinsonianos

Las imagenes muestran Ia absorci6n de levodopa (1-dopa) radioactiva en los nucleos basales de un paciente con enfer­medad de Parkinson provocados por una sustancia qufmica t6xica, antes y despues de recibir un trasplante de neuronas dopaminergicas fetales : (a) imagen previa a Ia intervenci6n y (b) imagen obtenida 13 meses despues de Ia intervenci6n. La elevada absorci6n de levodopa indica que el trasplante fetal estaba segregando dopamina.

(Modificado de Widner, H. ; Tetrud, j.; Rehncrona, S.; Snow, B. ; Brun­di n, P.; Gustavii, B.; Bjorklund, A.; Lindvall , 0. , y Langston , j . W. New England journal of Medicine, 1992, 327, 1556-1563. lmagenes re­producidas co n autorizaci6n.)

(a) (b)

a! comienzo de este capitulo . Mediante instrumen­tal estereo taxico se le trasplantaron neuronas feta­les secre toras de dopamina en los ganglios basales y, como se expu so, se le reali zo una exploracion TEP antes de Ia in terven cion quirurgica y otra alga mas de un aiio d espu es . Se le administro una inyeccion de !-dopa radioactiva una hora antes de que se realizara cada exploracion, qu e es absorbida por los termina­les d e las n euronas dopaminergicas, donde se con­vierte en dopamina. Asi pues, Ia radioactividad que se observa en las imagenes indica Ia presencia de termi­n ales secretores de dopamina e n los ganglios basales. Las imagenes muestran Ia cantidad de radioactividad antes (parte a) y despues (parte b) de que se le hiciera el trasplante . Como se puede ver, los nucleos basales contenian bastante mas dopamina tras Ia intervencion quirurgica (vease Ia Figura 2.38).

Nos gustaria poder decir que el procedimiento de trasplan te fetal h a cu rado a personas afectadas por Ia enfermedad de Parkinson y a aquellas cuyo cerebra fue d aiiado por Ia droga contaminada. Lamentablemente, como se expondra en el Capitulo 10, los efectos tera­p euticos del trasplante suelen ser temporales y, con el tiempo, es frecuente qu e surjan graves efectos colate­rales .

I

I

64 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigocion

intermedio Metodos neuroquimicos

Los metodos neuroqufmicos pueden utilizarse para deter­minar Ia localizaci6n de una enorme variedad de sus­tanci as qufmicas en el encefalo. Con ellos se pueden identificar las neuronas que segregan un neurotransmi­sor o un neuromodulador determinado y aquellas que tienen receptores que responden a Ia presencia de estas sustancias. Los peptidos y las protefnas pueden localizarse directamente, mediante metodos inmunocitoqufmicos: se expone el tejido a un anticuerpo que esta unido a una molecula que se hace fluorescente bajo una luz de una determinada longitud de onda. Tambien pueden detec­tarse otras sustancias mediante localizaci6n inmunocito­qufmica de una enzima que se requiere para su sfntesis. Asimismo, los peptidos y las protefnas pueden localizarse por medio del metodo de hibridaci6n in situ , el cual revela Ia presencia del ARN mensajero que dirige su sfntesis.

Los receptores de las sustancias neuroqufmicas pue­den localizarse de dos formas. El primer metodo utiliza Ia

autorradiograffa para poner de manifiesto Ia distribuci6n de un ligando radioactivo, al cual se ha expuesto el tejido. El segundo se sirve de Ia inmunocitoqufmica para detec­tar Ia presencia de los receptores mismos, que son protef­nas. Combinando metodos de tinci6n se pueden localizar neuronas que tienen un receptor determinado o un pep­tido determinado y que asimismo establecen conexiones con regiones determinadas del encefalo.

Las secreciones de neurotransmisores y neuromodula­dores se pueden determinar implantando el extrema de una sonda de microdialisis en una region determinada del cerebra. Se puede emplear una exploraci6n con TEP para llevar a cabo observaciones similares en el cerebra humano: se inyecta al sujeto un marcador radioactivo, tal como una droga que se une con un receptor determinado o una sustancia qufmica que se incorpora a un neurotras­misor determi nado, y posteriormente una exploraci6n TEP revela Ia localizaci6n del marcador en el cerebra.

En Ia Tabla 2.3 se ofrece un compendia de los meto­dos de investigaci6n explicados en este apartado.

" Tabla 2.3 ~~ Metodos de investigaci6n: parte Ill

OBJETIVO DEL METODO METODO OBSERVACIONES

Estimar los neurotransmisores o neuromoduladores liberados por las neuronas

ldentificar las neuronas que producen un neurotransmisor o neuromodulador determinado

Metodos geneticos

Microdialisis

Localizaci6n mediante inmunocitoqufmica de un peptido o una protefna

Localizaci6n mediante inmunocitoqufmica de Ia enzima responsable de Ia sfntesis de una sustancia

Estudios con gemelos

Mutaciones dirigidas

Oligonucle6tidos «antisentido»

Puede analizarse una amplia serie de sustancias

Requiere un anticuerpo especffico

Otil si Ia sustancia noes un peptido o una protefna

Comparando el fndice de concordancia de gemelos monocig6ticos y dicig6ticos puede estimarse si un rasgo se hereda

lnactivaci6n , inserci6n o aumento de Ia expresi6n de un gen

Se unen al ARN mensajero; impiden Ia sfntesis de protefna

METODOS GENETICOS <<venir de familia••, lo que sugiere que los factores gene­ticos pued e n ser un fac to r importan te e n el d esarro­llo de diferencias fisiol 6gicas que, en ultima instancia, son responsables d e dichas carac teristicas. En algu­nos casos, Ia relaci6n con factores gen eticos esta muy clara: un gen defec tuoso interfi ere en el d esarrollo cere­bral y una an om alia n eurol6gica provoca alte raci ones

Toda conducta esta d eterminada por interacciones entre el cerebro d e un individuo y su entorno. Much as carac­teristicas comportamentales - como el talento, las varia­bles de personalidad y los trastornos mentales- parecen

comportamentales. En o tros casos, Ia relacion entre herencia y cond u cta es mucho mas sutil y para eviden­ciarla han de emplearse metodos geneticos especiales.

Estudios con gemelos

Un metodo muy eficaz para evaluar Ia influencia de Ia herencia en un rasgo concreto consiste en comparar el indice de concordancia de este rasgo e n pares de gemelos monocigoticos y d icigoticos. Los gemelos monocigoticos (univitelinos) tienen un genotipo identico: es decir, sus cromosomas, y los genes que contienen, son identicos. Por el contrario, Ia semejan za genetica entre gemelos dicig6ticos (bivitelin os) es, por termino medio, del 50 por ciento. Los investigadores estudian las historias clini­cas para identificar pares de gemelos en los que al m enos uno de ellos tenga e l rasgo - por ejemplo, el diagnostico de un determinado trastorno mental-. Si a ambos geme­los se les ha diagnosticado este trastorno, se dice que son concordantes. Si solo uno de e llos h a recibido este diag­n6stico, se dice que son discordantes. Asf pues, si un tras­torno tiene una base gene tica, e l porcentaje de gemelos monocig6 ticos que son con cordantes en cuan to a] diag­n6stico sera superior a! de los dicigoticos. Por ej emplo, como se vera en el Capitulo 11 , el indice de concordan­cia para Ia esquizofrenia en gemelos es a! menos cuatro veces mayor en los monocigoticos que e n los dicigoticos, dato que aporta un a salida prueba de que Ia esquizo­frenia es un rasgo h ereditario. En estudios con gemelos se ha encontrado que los factores geneticos influyen en muchas caracteristicas individuales, entre ellas rasgos de personalidad , prevalencia de Ia obesidad, inciden cia del alcoholismo y una am plia serie de trasto rnos mentales.

Estudios sobre adopci6n

O tro metodo para evaluar e l caracter h ereditario de un rasgo de comportami ento concre to es com parar perso­nas que fu eron ad optadas en una epoca temprana de Ia vida con sus padres biologicos y sus padres adopti­vos. Todos los rasgos de comportamiento es tan influi­dos en cierto grad o por factores hereditarios, factores ambientales y una interacci6n entre factores h eredita­rios yam bien tales. Los factores ambientales son tanto de ti po social como biologico. Por ejemplo, Ia salud de Ia madre, su nutricion o e l consumo de drogas durante el embarazo son factores ambientales prenatales; y Ia dieta del nino, su aten cion m edica y su entorno social (tanto d e ntro como fuera del hogar) son factores ambienta­les posnatales. Si se adopta a un nino poco despues de que nazca, los fac to res geneticos estaran asociados con los padres biologicos, los factores ambientales prenata­les con Ia m adre biologica y Ia mayoria de los factores ambientales posnatales con los padres ad optivos .

Fundamentos de fisiologia de Ia conducta 65

Los estudios de adopcion requieren que el investiga­dor conozca Ia identidad de los padres de las personas que se estan estudiando y pueda evaluar el rasgo compor­tamental en los padres biologicos y en los adoptivos. Si los individuos estudiados se parecen notablemente a sus padres biologicos, se llega a Ia conclusion de que el rasgo probablemente este influido p or factores geneticos. Para asegurarse, se han d e descartar posibles diferencias en el en torno prenatal de los niiios adoptados. Si, en vez de ello, los individuos se parecen a sus padres adoptivos, se concluye que e l rasgo esta influido por factores am bien­tales. (Habrfa que realizar mas estudios para determinar cuales podrfan ser exactamente estos factm·es ambienta­les). Por supuesto, es posible que intervengan tanto los factores h ereditarios como los am bien tales, en cuyo caso los individuos estudiados se pareceran tanto a los padres adoptivos como a los biologicos.

Mutaciones dirigidas

Un metodo genetico desarrollado por biologos molecula­res ha puesto en manos de los neurocientificos un pode­roso instrumento. Las mutaciones dirigidas consisten en gen es transformados que se producen en e l labora to­rio y se insertan en cromosomas d e ratones. Estos genes mutados (tambien llamad os genes knockout) 2 son defec­tuosos -no pueden producir una protefna que sea fun­cional-. En muchos casos, el objetivo de Ia mutaci6n es una enzima que controla una reaccion quimica especi­fica. Por ejemplo , e n el Capitulo 8 se vera que Ia falta de una enzima determinada inte rfiere en e l aprendizaj e, dato que su giere que Ia enzima es, en parte, responsa­ble de los cam bios en Ia estructura de sinapsis necesarios para que tenga Iugar el aprendizaje. En o tros casos, el objetivo d e Ia mutacion es una protefna que por sf misma desempena una uti! funcion en Ia celula . Por ejemplo, en e l Capitulo 13 se vera que un tipo concreto d e recep­tor para los opioides in terviene en los efectos reforzan­tes y analgesicos de estos. Los investigadores pueden incluso producir knockouts condicionales que provocan que los genes del animal dej en de expresar un determinado gen cuando se le suministra una determinada droga, lo que permite que el gen objetivo o sobre el que se actua se exprese normalmente durante el desarrollo del animal y posteriormente sea suprimido. Los investigadores pueden asimismo valerse de m e todos d e ingenieria genetica para insertar gen es e n el ADN d el raton, genes que pueden

2 0 genes suprimidos. (N. de la T )

mutadon dirigida Alteraci6n de un gen (tambien llamado «gen knockout>>) que se produce en laborarorio y se inserta en los cromo­somas de un raton. Este gen no puede produci r una protefna fun­cional.

66 Capitulo 2 Metodos y procedimientos de investigoci6n

dar Iugar a un aumento de Ia producci6n de protefnas que se encuentran normal mente en Ia especie <<huesped>> o pueden producir protefnas completamente nuevas.

Oligonucle6tidos «antisentido»

Otro metodo genetico implica la producci6n de molecu­las que bloquean la producci6n de protefnas codificadas por determinados genes mediante Ia inyecci6n de oligo­nucleotidos << antisentido>> 3. El tipo mas frecuente de o li­gonucle6tidos <<antisentido >> son cadenas modificadas de ADN o de ARN que se uniran con moleculas especfficas

~ 0 de he bra complementaria. (N de la T)

intermedio Metodos geneticos

Dado que los genes dirigen el desarrollo de un organismo, los metodos geneticos resultan de gran utilidad en los estudios de Ia fisiologfa de Ia conducta . Los estudios con gemelos comparan el fndice de concordancia de geme­los monocig6ticos (univitelinos) y dicig6ticos (bivitelinos) en cuanto a un rasgo concreto. Un mayor fndice de con­cordancia en los gemelos monocig6ticos es una prueba de que el rasgo esta influido por Ia herencia. En los estu ­dios sobre adopci6n se compara a individuos adoptados durante Ia infancia con sus padres biol6gicos y sus padres adoptivos. Si los individuos se parecen a sus padres biola­gicos, es prueba de que se debe a factores geneticos. Si se parecen a sus padres adopt ivos, es prueba de que intervie­nen factores del entorno familiar.

Las mutaciones dirigidas permiten a los neurocien­tfficos estudiar los efectos de Ia falta de una protefna concreta -por ejemplo, una enzima, una protefna estruc­tural o un receptor- sobre las caracterfst icas fisiol6gicas y comportamentales de un animal. Los genes que causan Ia

LECTURAS RECOMENDADAS

Manual de laboratorio Wellman , P.: Laboratory Exercises in Physiological Psychology. Boston:

Allyn and Bacon, 1994.

Atlas estereotaxi.co Paxinos, G. y Watson, C. : The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, 4' ed.

San Diego, CA: Academic Press, 1998.

Slotn ick, B. M. y Leonard, C. M.: A Stereotaxic Atlas of the Albino Mouse

Forebrain. Rockville , MD: Public Health Service, 1975. (U.S. Government Printing Office Stock Number 017-024-00491-0).

d e ARN mensajero (ARNm) e impiden que produzcan su protefna. Una vez que las moleculas de ARNm estan bloqueadas de este modo, son destruidas por enzimas que hay en la celula. El termino <<antisentido» se refiere al hecho de que los oligonucle6tidos sinteticos contie­nen una secuencia de bases complementarias a las que contiene un gen determinado o molecula de ARNm. (Como se puede apreciar, este metodo se parece al que se utiliza en la hibridaci6n in situ).

oligonucle6tido <<antisentido» Cadena modificada de ADN o de ARN que se une con una molecula espedfica de ARN mensajero e impide que produzca su proteina.

producci6n de protefnas extranas o aumentan Ia produc­ci6n de protefnas innatas se pueden insertar en el genoma de esti rpes dean i males. Los oligonucle6tidos <<a ntisentido» se pueden utilizar para bloquear Ia producci6n de deter­m i nadas protefnas.

En Ia Tabla 2.3 se resumen los metodos de investiga­ci6n que se han expuesto en este apartado.

Cuestiones a considerar

1. Posiblemente haya lefdo nuevas publicaciones sobre estud ios de Ia base genetica de los rasgos comporta­mentales humanos o lo haya visto en television. c:Que se quiere decir, en realidad, cuando un laboratorio informa del descubrimiento de, supongamos, un Hgen de Ia timidez»?

2. AI parecer, a Ia mayorfa de las ratas no les gusta el sabor del alcohol , pero los investigadores han criado algunas ratas que llegan a beber una gran cantidad de este. c:Se le ocurre alguna manera de utilizar a estos animales para investigar el posible papel de los factores geneti ­cos en el alcoholismo en los seres humanos?

Snider, R. S. y Niemer, W. T.: A Stereotaxic Atlas of the Cat Brain. Chicago: University of Chicago Press, 1961.

Swanson, L. W.: Brain Maps: Structure of the Rat Brain. Amsterdam: Elsevier, 1992.

Metodos histologicos

Heimer, L. y Zaborsky, L. : Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2:

Recent Progress. Nueva York: Plenum Press, 1989.

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