Búsqueda de microorganismos psicrófilos antárticos capaces de degradar fenantreno para uso en biorremediación de suelos y aguas contaminadas con hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs).

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Información

Establecimiento educacional: Nombre: Liceo Nº1 de niñas ‘Javiera Carrera’ Comuna: Santiago Región: Metropolitana Dirección: Compañía de Jesús #1484, Santiago. Director: Julia Alvarado Thimeos Teléfono: 6964714 Web / e-mail: www.liceo1.cl / direccionliceo1@gmail.com Estudiante Nº1 Nombre: Naomi Chantal Estay Casanova RUT: 19.289.434-4 Fecha de nacimiento: 10/11/1995 Curso: III medio Dirección Particular: V centenario #037, Puente Alto. Teléfonos / e-mail: (02) 2658859 / (08) 2897421 / Naomi.estay@hotmail.com Estudiante Nº2 Nombre: Omayra Belén Toro Salamanca RUT: 19.184.209-K Fecha de nacimiento:27/7/1995 Curso: III medio Dirección Particular: El Alcazar #0501 – Parque Central, Quilicura Teléfonos / e-mail: (02) 8944845 / (07)6777058 / Omayra.belen.-@live.cl

Docente Guía: Nombre: Roxana Nahuelcura Lobos RUT: 8.861.081-4 Fecha de nacimiento: 12/6/75 Dirección Particular: Compañía #2045 dpto. 201, Santiago. Teléfonos / e-mail: (09) 7946941 / roxananahuelcura@liceo1.cl Asesor Científico Externo: Nombre: José Manuel Pérez-Donoso Institución Educacional: Universidad de Chile Especialidad: Microbiología Dirección Particular: Vicuña Mackena # 20, Providencia Teléfonos / e-mail: (02) 9781643 / jose.perez@ciq.uchile.cl

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Índice Contenido Páginas

Resumen _____________________________________________________ 4 Resumen Ejecutivo______________________________________________5 Introducción____________________________________________________6 Formulación de pregunta__________________________________________8 Materiales y métodos_____________________________________________9 Resultados obtenidos_____________________________________________13 Análisis y discución______________________________________________16 Conclusión____________________________________________________ 18 Análisis y discusión_______________________________________________13 Conclusiones_____________________________________________________15 Proyecciones_____________________________________________________18 Cronograma de Actividades_________________________________________19 Bibliografía______________________________________________________19

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Resumen Investigación

Búsqueda y selección de microorganismos psicrófilos antárticos capaces de metabolizar fenantreno (HAP), como única fuente de carbono, con el propósito de ser usados en biorremediación de aguas contaminadas de zonas con extremas bajas temperaturas. Hallazgo de 12 cepas bacterianas antárticas capaces de degradar fenantreno.

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Resumen Ejecutivo En la actualidad existe una gran preocupación por la creciente contaminación con hidrocarburos. En particular, en el continente Antártico estos compuestos han sido introducidos de forma antropogénica durante el almacenamiento y la distribución de combustibles necesarios para la generación de energía y funcionamiento de las bases.

Esta incipiente situación, constituye un atractivo foco de investigación ya que la búsqueda de nuevas alternativas de descontaminación podría significar una solución no solo para el continente antártico, sino también, para otras zonas contaminadas.

La presente investigación experimental se aboca a la búsqueda y selección de microorganismos psicrófilos antárticos capaces de metabolizar fenantreno-hidrocarburo policíclico aromático (HPA)- como única fuente de carbono, con el propósito de ser usados en biotécnicas de recuperación de suelos y aguas (biorremediación) determinadas por las bajas temperaturas.

‘Bacterias psicrófilas antárticas capaces de degradar fenantreno, pueden ser utilizadas en biorremediación de suelo y agua’, con esta afirmación se da inicio al proyecto de búsqueda de microorganismos degradadores.

Inicialmente se estudió de manera individual 5 cepas previamente aisladas en el laboratorio de Microbiología de la Universidad de Chile. De ellas, se seleccionó una cepa bacteriana que presento excelentes resultados de crecimiento en presencia de fenantreno como única fuente de carbono.

Posteriormente, y con el propósito de aumentar el espectro de aislados bacterianos a analizar, se realizó ensayos de crecimiento en fenantreno en cultivos inoculados con grupos bacterianos (cada cultivo fue inoculado con 10 cepas). Con este último procedimiento, se logró la selección y aislamiento de 11 cepas antárticas con potencial capacidad de degradación.

Los resultados obtenidos indican que una de las cepas aisladas presenta una gran capacidad de utilizar el fenantreno como fuente de carbono, la cual podría ser utilizada en procesos de biorremediación.

La hipótesis y los objetivos se cumplieron al finalizar el tiempo de investigación, abriendo nuevas posibilidades de estudio y análisis para las cepas encontradas.

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Introducción

A lo largo del último siglo, las actividades humanas en la Antártica han incrementado notablemente. Actualmente, más de treinta naciones realizan actividades científicas con su logística asociada (Brander J.M., 2001) y anualmente nuestro país realiza expediciones que contribuyen a la investigación y al enriquecimiento de información sobre el continente.

Recientemente en la XLVII expedición científica antártica, se reportó el hallazgo de alrededor de 230 especies nuevas de microorganismos, con posibles grandes potenciales biotecnológicos. (Blamey J. 2011, Nature)

Sin embargo, este notable crecimiento de flujo humano en la zona antártica, ha aumentado la probabilidad de producir impactos negativos sobre el medio ambiente.

El continente blanco es la región más limpia de todo el mundo; pero en sitios cercanos a bases científicas se han registrado niveles de contaminación superiores a los normales, específicamente junto a tanques de almacenamiento de combustibles. Un reciente estudio plantea que si bien la contaminación es baja y localizada, podría permanecer inalterada durante décadas (Astorga M., et al, 2011).

Es importante conocer la viabilidad de una estrategia de limpieza en la Antártica y en zonas de bajas temperaturas, puesto que debe resistir condiciones ambientales adversas, ser de fácil instalación, tener bajo consumo de energía y tener el mínimo impacto posible sobre el medio ambiente. Este último punto considera además, tratados internacionales que restringen las intervenciones en la Antártica, y lugares de gran riqueza animal.

Con ello, se hace realmente difícil pensar en maquinaria especializada, o el uso de químicos en suelos y aguas, no sólo por los altos costos de aplicación, sino también por el significativo impacto ambiental que podría generar.

De acuerdo a esto, la biorremediación puede ser utilizada exitosamente. Esta técnica biológica consiste en el uso de microorganismos existentes en el medio, para descomponer o degradar sustancias peligrosas en sustancias menos toxicas o bien inocuas para el medio ambiente y la salud humana (Arroyo M, et al., n.d.)

Más aún, el ‘Protocolo de Madrid’, anexo al tratado antártico, no permite la entrada de microorganismos exógenos al territorio Antártico, es decir, para aplicar la técnica de biorremediación es necesario contar con alguna especie natural del continente.

Por lo tanto, la posibilidad de contar con microorganismos nativos degradadores de hidrocarburos que soporten condiciones ambientales tan extremas como las de la Antártica, permitiría su uso en estrategias de biorremediación disminuyendo los daños y tiempos de eliminación de los contaminantes en ecosistemas donde la temperatura es un factor

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limitante para el crecimiento de las bacterias, como el territorio Antártico (W. Mac Cormack, 2011).

En respuesta a una preocupante problemática mundial, la investigación a realizar se centrará en la búsqueda de bacterias antárticas psicrófilas que sean capaces de utilizar sustancias orgánicas contaminantes (como hidrocarburos policíclicos aromáticos), como fuente de carbono necesaria para su crecimiento.

Las bacterias disponibles para la búsqueda (organismos unicelulares microscópicos), corresponden a 55 cepas aisladas de muestras de tierra, agua y hielo obtenidas de las Islas Shetland del sur, descubiertas en la ECA 47 por el grupo de investigación del Dr. José Manuel Pérez-Donoso.

Estas bacterias serán sometidas a un medio que presente contaminación por un componente de petróleo llamado fenantreno (C14H10), hidrocarburo policíclico aromático presente en mayor proporción en las muestras contaminadas en las cercanías de la base O’Higgins y considerado por la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (EPA), de alta toxicidad.

Es así, como la siguiente investigación experimental intenta dar un primer gran paso a la aplicación de Biorremediación en zonas extremas de bajas temperaturas contaminadas con hidrocarburos alrededor del mundo, entregando el soporte para el diseño de ésta; ‘bacterias con gran potencial degradador de HPA’.

Cuando se determinó la concentración de

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Formulación del Problema

Preguntas:

¿Bacterias psicrófilas antárticas son capaces de utilizar fenantreno como única fuente de carbono?

¿Pueden ser utilizados microorganismos psicrófilos antárticos en biorremediación de aguas contaminadas con hidrocarburos?

Hipótesis:

Bacterias psicrófilas antárticas son capaces de degradar fenantreno, y por ende pueden ser utilizadas en biorremediación de aguas contaminadas en zonas con extremas bajas temperaturas.

Objetivo general:

A partir de muestras extraídas de la península Antártica, buscar bacterias psicrófilas capaces de metabolizar fenantreno para ser utilizadas en biorremediación.

Objetivos específicos:

1.- Seleccionar aislados antárticos que puedan usar como única fuente de carbono fenantreno.

2.- Identificar y caracterizar aquellas bacterias que presenten las mejores propiedades de crecimiento y degradación de fenantreno.

3.- Determinar el potencial de degradación de fenantreno a distintas concentraciones del contaminante.

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Materiales y metodología de investigación

Área de Estudio:

El siguiente trabajo experimental se llevó a cabo en el grupo de investigación de Microbiología y Bionanotecnología del Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.

El estudio se realizó con cepas de bacterias recientemente aisladas a partir de muestras de hielo, agua y tierra obtenidas en la XLVIII expedición científica de la Antártica chilena.

Materiales:

Micropipeta (P10, P20, P200 y P1000), matraz, placas petri, aza de siembra, tubos Falcon (15 y 50 ml), tubos Eppendorf (1,6 ml), incubadora de 15°C con agitación, vórtex, campana de flujo laminar, pH-metro, espectrofotómetro UV (lector de densidad óptica), cámara de electroforesis de ADN y fuente de poder.

I. Búsqueda de bacterias antárticas capaces de degradar fenantreno como única fuente de carbono.

• Preparación de los medios de cultivo:

- Se preparó medio acuoso M9 con glucosa en matraz y se midió con pH-metro hasta alcanzar pH 7. - Luego, se aforó con agua destilada estéril hasta alcanzar 150 mL. - Ésta solución se filtró utilizando un filtro de 0,2 µm estéril en campana de flujo laminar. - Paralelamente se preparó medio de cultivo mínimo para bacterias. - Las muestras de fenantreno a utilizar (1mg/ml) en el medio mínimo para bacterias fueron irradiadas con luz UV para esterilizar (10 min).

Medio acuoso M9 Glucosa (200 ml) - Sales M9 -->40 mL - MgSO4 (1M) --> 400 µL - Glucosa 20% --> 20 mL - CaCl (1M) --> 20 µl - H2O 138,58 µl

Medio acuoso mínimo para Fenantreno - NaCl --> 5 gr. - K2HPO4--> 1 gr. - H2(NH4)PO4 --> 1gr. - (NH4)2 SO4 --> 1 gr - KNO3 --> 3gr. - MgSO4 --> 0,2 gr

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• Siembra y crecimiento de bacterias antárticas: - Se rotuló placas de petri ‘madres’ en medio LB para la siembra de las cepas

antárticas psicrófilas a utilizar durante el transcurso de la investigación. - Se realizó siembra de colonias; se tomo un inóculo de bacteria con asa de siembra, y

se deposita en la placa utilizando técnica de separación de colonias por estrias. - Las muestras fueron incubadas a 15ºC (su temperatura óptima).

• Primer set de búsqueda: - Se seleccionó 4 cepas con antecedentes previos de resistencia a HPAs (cepas 10, 12,

37T y 38C) - Se realizó siembra de las cepas en tubos de ensayo de vidrio y tubos falcon,

suplementados con fenantreno como única fuente de carbono (5 mg), y se aforó con medio mínimo de fenantreno hasta alcanzar 5 mL.

- Se inóculo con las distintas bacterias utilizando asa de siembra. - El mismo procedimiento se realizó para sembrar las mismas 4 cepas en tubos de

ensayo con medio acuoso M9 y un control negativo sin bacterias. - Las muestras se incubaron a 15ºC con agitación. - Luego de 10 días, se tomó muestras de los tubos con las cepas incubadas, y con

ayuda de un asa se depositó un pequeño volumen en placas Petri con medio LB, para verificar presencia bacteriana.

• Segundo set de búsqueda: - Se sembró las cepas 37T, 38C y Escherichia coli (control) en tubos de ensayo de

vidrio, con distintas concentraciones de fenantreno (2,5 mg; 5 mg o 10 mg) en 5 mL.

- Para la siembra se diluyó un inóculo de cada cepa en 200 µl de H2Od. De esta solución se utilizó 20µl para inocular los tubos con medio de cultivo.

- Se realizó siembra de 10 nuevas cepas en tubos con medio M9 y tubos con 1mg/mL de fenantreno, aforando con medio mínimo hasta 5 mL.

- Para cuantificar las colonias agregadas, se diluyó un inóculo de cada cepa en 1000 µl de H2Od, y se evaluó la densidad óptica a 600 nm en un espectrofotómetro.

- Una vez inoculadas las muestras en los tubos, se incubó a 15°C.

• Tercer set de búsqueda: - Se eligió al azar 45 nuevas cepas antárticas psicrófilas previamente aisladas. - Se distribuyó estas cepas en 5 grupos, 4 de ellos con 10 cepas, uno con 5 cepas y un

control negativo. - Se sembró los distintos grupos de cepas en tubos falcon con medio mínimo para

fenantreno suplementados con 1mg/mL del hidrocarburo, aforando hasta alcanzar los 5 mL.

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- Para ello, se tomó un pequeño inóculo de cada cepa y se agregó 10 µL de este inoculo a un tubo eppendorf con 200 µL de H2Od para cada grupo.

- Esta solución fue llevada a un vórtex para homogenizar el inóculo. - De cada uno de estos inóculos preparados se extrajo 10 µL que fueron agregados a

cada tubo falcon correspondiente a los distintos grupos.

II. Pruebas específicas con bacterias seleccionadas * Con aquellas cepas seleccionadas por su capacidad de utilizar fenantreno como fuente de carbono se realizó una serie de experimentos de caracterización.

• Extracción de ADN plasmidial: - Se tomó una muestra de bacteria y se depositó en 40 µL de buffer de lisis. - Se incubó los tubos a 50°C por 5 minutos y luego en hielo por 5 minutos. - Luego, se centrifugaron a 12.000 rpm por 10 minutos. - Se cargó 7 µL del sobrenadante de esta solución al gel. - El control positivo para el análisis de plasmidios fue la cepa E. coli gshA (posee el

plásmido pBADTOPO, de Invitrogen)* - Para la preparación del gel de agarosa para la electroforesis de ADN, se utilizó 50

mL de buffer TAE 1x y 0,5 mg de agarosa (1%). La solución se calentó para disolver la agarosa.

- Se retiró la peineta del gel. - Se corrió el gel a 100 voltios por una hora y media.

• Conteo de colonias de la cepa 38C mediante microgota - Con el propósito de cuantificar el crecimiento bacteriano en presencia de

fenantreno, se determinó las unidades formadoras de colonias (UFCs) de la cepa 38C crecida en presencia de fenantreno a distintos tiempos, teniendo en cuenta el número de unidades formadoras de colonias agregadas al inicio (tiempo 0).

- Para ello, en tubos eppendorf con 90 µL de H2Od estéril se realizó 8 diluciones seriadas, agregando a la primera, 10 µL de muestra de cada tubo falcon con cepa 38C y traspasándolo a la siguiente dilución hasta llegar a la última.

- Este procedimiento se realizó también a los 3 y 6 días de incubación a 15 °C.

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• Conteo de colonias por microgota para los grupos - Se realizó conteo de colonias por microgota en placas Petri con medio LB para 3

tiempos, teniendo en cuenta que en el tiempo inicial se agregó una mínima cantidad de inóculo diluida.

- Para ello, en tubos eppendorf con 90 µL de H2Od estéril se realizó 8 diluciones, agregando a la primera 10 µL de muestra de cada grupo.

- Este procedimiento se realizó también a los 3 y 7 días de incubación a 15 °C.

• Aislamiento de cepas degradadoras crecidas en los grupos expuestos a fenantreno Las cepas que se seleccionaron y lograron desarrollarse en presencia de fenantreno en cada grupo, fueron aisladas en placas Petri con LB para su posterior análisis.

• Identificación de las cepas degradadoras La identificación de las cepas degradadoras se realizó mediante secuenciación del DNA ribosomal 16s (empresa Macrogen Korea) para lo cual se amplificó mediante PCR el gen en cuestión utilizando partidores adecuados. .

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Resultados obtenidos

Gráfico 1: Absorbancia Cepa 38C en diferentes medios (1 mes de incubación)

Gráfico 2: Crecimiento cepa 38C en distintas concentraciones de fenantreno

Gráfico 3: Crecimiento en el tiempo de grupos bacterianos

Serie 1: 38C medio con fenantreno

Serie 2: 38C medio con glucosa

Serie 3: Control negativo

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Gráfico 3: Crecimiento grupos bacterianos en medio con fenantreno

2 4 6 8106

107

108

109

101 0

grupo 1grupo 2grupo 3grupo 4grupo 5

días de cultivo

UF

C/m

l

Imagen 1: Turbidez cepa 38C medio fenantreno (1 mes de incubación)

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Imagen 2: Cepas aisladas desde los grupos de bacterias crecidas en medio con fenantreno

•

•

•

•

Imagen 3: Visualización de plásmidos

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Análisis y discusión de los datos

Gráfico 1: Absorbancia de cepa 38C en diferentes medios (1 mes de incubación) El análisis del gráfico nº1 se realiza teniendo en consideración una longitud de onda de 600nm, puesto que es posible determinar la turbidez de la muestra. Haciendo referencia a la misma, se observa una similitud de crecimiento entre las muestras 38C medio con fenantreno (en azul) y 38C medio con glucosa (en rojo), además de una ausencia de crecimiento en el control (en verde). Se esperaba que el cultivo con medio glucosa creciera eficientemente. Sorprendentemente, la cepa 38C creció en proporciones similares en medio con fenantreno. El experimento deja de manifiesto que la cepa 38C puede metabolizar el fenantreno como única fuente de carbono y es realmente eficiente durante periodos extensos de tiempo, teniendo en cuenta que la medición se realizó al mes de incubación. Gráfico 2: Crecimiento de Cepa 38C en diferentes concentraciones fenantreno Considerando a la cepa 38C una bacteria capaz de degradar fenantreno, se realizaron 3 diferentes concentraciones del hidrocarburo en 5mL de medio. El gráfico muestra un inesperado comportamiento en las concentraciones más bajas de fenantreno, a diferencia de la concentración más alta, donde a medida que pasaron los días, aumentaron considerablemente las colonias presentes. El resultado de crecimiento en bajas concentraciones es atribuido a la poca fuente de energía y carbono para el crecimiento de las bacterias, y posiblemente a una filtración de medio ocurrida durante la incubación en shaker de ambas muestras. Gráfico 3: Crecimiento en el tiempo de grupos bacterianos

*Considerando que el crecimiento de la cepa degradadora encontrada con anterioridad se hizo notar en un periodo prolongado, y los datos comprenden el crecimiento de bacterias en 9 días, a partir del gráfico se puede determinar:

- Del grupo número 1: Se visualiza un brusco aumento de unidades formadoras de colonias en el tiempo. Teniendo en cuenta que el análisis se realizó en un periodo de 9 días, su crecimiento fue exitoso. Complementando los datos numéricos; imágenes del tubo contenedor del primer grupo, muestran bastante turbidez con respecto al tubo control. El repentino aumento experimentado entre el cuarto y sexto día probablemente se deba a la capacidad de asimilar el hidrocarburo inicialmente y su posterior uso como fuente de energía para crecer.

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- Del grupo 2: Considerando que en los primeros días de incubación este grupo presentó la menor cantidad de colonias, existen buenos resultados de crecimiento, puesto que aumentan progresivamente las colonias por mL de muestra en el tiempo. - Del grupo número 4: Existe un incremento de colonias de forma gradual en el tiempo. Con ello, se verifica que las cepas metabolizan el hidrocarburo para poder crecer, y probablemente si se exponen a contaminación más tiempo, el aumento sea mucho más notable. - Del grupo número 3 y 5: La probabilidad de que las bacterias permanezcan en latencia durante la exposición a fenantreno existe, por lo que el mínimo aumento que presentaron dichos grupos, podría corresponder a la hipótesis mencionada. Además, en estos últimos grupos se encontró sola una cepa viviente en cada grupo, a la semana de incubación. Imagen 2: Cepas Degradadoras Aisladas

Las cepas encontradas capaces de metabolizar el fenantreno como única fuente de carbono fueron en total 12.

Once diferentes cepas correspondientes a los grupos de bacterias; en el primero se visualizaron 3 cepas, en el segundo 2, en el tercero 3, en el cuarto 2 y en el quinto solo 1.

En el posterior estudio, probablemente la lista disminuya, pero sí se puede comprobar que las cepas encontradas metabolizan de alguna manera el hidrocarburo, puesto que la única forma de crecimiento era utilizándolo como fuente de energía.

Imagen 3: Visualización de Plásmidos

La imagen correspondiente a la electroforesis, muestra 12 cepas que fueron utilizadas en la búsqueda de cepas degradadoras, y un control positivo que corresponde a la cepa E. Coli GSH, cepa mutante con plásmido (Segunda columna, desde izquierda a derecha). El resultado muestra que ninguna cepa analizada presenta plásmidos.

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Conclusiones

• En base a los resultados obtenidos, se valida la hipótesis y se cumplen los objetivos planteados.

• Doce cepas antárticas psicrófilas son capaces de metabolizar el fenantreno como única fuente de carbono a corto plazo.

• La cepa 38C presenta la mejor propiedad de crecimiento y degradación de fenantreno.

• En periodos prolongados, la cepa 38C utiliza el fenantreno como eficaz fuente de energía, y podría ser aplicada en biorremediación de aguas en zonas de bajas temperaturas.

Proyecciones

De 53 diferentes cepas de bacterias antárticas psicrófilas no descritas, se encontraron 12 capaces de metabolizar el fenantreno y aumentar sus colonias a lo largo del tiempo con el hidrocarburo como única fuente de carbono.

De ellas, la cepa bacteriana con mejores resultados correspondió a la cepa 38C, bacteria que no tiene plásmidos y presenta un crecimiento eficiente en altas concentraciones de fenantreno en medio acuoso. Además, diferentes pruebas con la cepa afirman que los mejores resultados se obtienen a largo plazo y por ende, las probabilidades de utilizarla en biorremediación de aguas son altas.

- La investigación experimental continuará su desarrollo con la profundización en el estudio de las cepas con potencial biotecnológico:

- Se realizará un análisis de genes de metabolización de fenantreno mediante PCR y secuenciación de los amplificados utilizando vías metabólicas degradadoras previamente descritas en organismos mesófilos. De este modo se espera confirmar la presencia de estas rutas metabólicas en las bacterias seleccionadas. Además se espera comprender las características de las proteínas de metabolización de fenantreno que funcionan a bajas temperaturas en las cepas seleccionadas mediante comparación con las proteínas de cepas que crecen a temperaturas más altas (mesófilas). - Determinar el potencial de degradación de las cepas aisladas, bajo diferentes criterios de estrés, pH y nutrientes del medio, temperaturas y concentraciones del hidrocarburo. - Diseño de proyecto de biorremediación de aguas contaminadas con cepas aisladas. - Aplicación de bacterias antárticas degradadoras encontradas en la investigación, en biorremediación de agua contaminadas en zonas del mundo con condiciones adversas; por su capacidad de acción en medios con pocos nutrientes y a extremas temperaturas.

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Cronograma de Actividades

Actividades Julio Agosto Septiembre Octubre

Semanas 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 Búsqueda de información

Selección del tema

Formulación de hipótesis y objetivos

Trabajo en laboratorio

Reformulación de objetivos

Redacción del informe

Obtención de resultados

Revisión del informe por científico y

profesora asesora

Bibliografía

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