Universidad Católica de la Santísima ConcepciónFacultad de Medicina, Escuela de MedicinaDepto. De Ciencias Básicas y MorfologíaLaboratorio de Bioquímica

PRÁCTICO N° 3 - 4

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Integrantes: Susana CórdovaDafne Del Mauro

Alessio EspinozaValentina Fuentes

Carrera: Medicina Sección: I

Fecha de realización: 12 y 19 de mayo, 2010Fecha de entrega: 2 de junio, 2010

Docentes encargados: BQ Mirna Munoz, M.Sc. Dr. Reginald Del Pozo, Ph.D.

Introducción

Es fundamental que el organismo catalice reacciones de manera eficaz y selectiva, las multiples reacciones bioquímicas que ocurren en el cuerpo requieren de un tiempo de realización óptimo, de lo contrario, si transcurren de manera muy lenta no son eficaces. La velocidad de reacción es, entonces, de gran importancia y esta determinada por catalizadores biológicos como son las enzimas.

Las enzimas son en su mayoría proteínas que catalizan una reacción disminuyendo su energía de activación, están en el centro de todos los procesos biológicos, actuando en la degradación de moléculas de nutrientes, conservación y transporte de energía y síntesis de macromoléculas. Catalizan una reacción disminuyendo su energía de activación y aumentando 1 millon de veces más la velocidad de reacción.

En condiciones óptimas de temperatura y pH, se unen de manera especifica a su sutrato y son estas interacciones no covalentes las que liberan energía libre que dan estabilidad y disminuyen la energía de activación haciendo más favorable y rápida la reacción.

La velocidad de reacción (micromoles de producto formado por unidad de tiempo) es directamente proporcional a la concentración de sustrato si esta es muy pequeña, luego se vuelve constante cuando la concentración de sustrato es saturante. alcanzando Vmax. Cuando la concentración de sustrato es saturante, la concentración de enzima también influye en la velocidad de reacción, haciéndose Vmax si están todos los sitios activos ocupados.

Conforme a lo anterior, analizaremos la hidrólisis del bifosfoglicerato de sodio catalizado por la enzima fostatasa alcalina, y el comportamiento que se aprecia al variar la concentración de sustrato y de enzima y como influyen estas variantes en la formación de producto y velocidad de reacción.

Objetivos:

Comprender la cinética enzimática de la reacción del bifosfoglicerato catalizado por fosfatasa alcalina, entendiendo que variables como la concentración

de sustrato y la concentración de enzima afectan y determinan la velocidad enzimática.

Aplicar y entender la ecuación de Michaels y Menten y la de Dobles Reciprocos para la determinación experimental de Vmax y Km.

Manejar conceptos químicos de absorvancia y espectofotometria, que nos permitirán deducir la concentración de producto.

Darse cuenta de la importancia de llevar a cabo de manera correcta el método experimental, entendiendo que cualquier error durante el procedimiento será fundamental en los resultados.

Resultados

1. Resultados práctico N° 3: Curva de progreso de una reacción enzimática.

a) Cálculo de los μmoles de fosfato (PO4H-2) liberado en los distintos tiempos de incubación, utilizando la lectura del estándar.

1° Se calcula la absorbancia promedio del estándar:

Abs x = Std 1+Std 2

2=0,334+0,367

2=0,350

Como la concentración de producto (PO4H-2) liberado es proporcional a la absobancia obtenida:

|std|x[std ] =

|tubo|x[ tubox ]

|std|x[std ] =

0,3501μmol /ml

=0,350

Luego [tubox] ¿|tubox|0 ,350

Ej.: [tubo3]=0,2840,350

=¿ 0,811μmol /ml

De esta forma se calcularon los μmoles totales PO4H-2 para cada uno de los tubos.

b) Cálculo de μmoles de fosfato en 5 min para cada tubo.Se obtienen mediante la siguiente fórmula:

μmoles5min =μmoles totales tubox -μmoles totales tubox-1

Ej.: Para el tubo 4

μmoles5min=1,254 μmoles−0,811μmoles=0 ,443μmoles /5min

En los tubos con diferencia de 10 min el valor obtenido se divide por 2.

Las concentraciones y valores de absorbancia obtenidos se resumen en la siguiente tabla:

Tabla 1. Resultados de los cálculos de μmoles de producto a partir de la absorbancia de cada uno de los tubos con diferentes tiempos de incubación. También se resumen las concentraciones de producto formado en cinco minutos.

Gráfico 1. Se muestra el desarrollo de la curva de concentración de producto formado en relación al avance de la reacción de la fosfatasa alcalina en el tiempo. Datos obtenidos de la Tabla 1.

Gráfico 2. Corresponde al gráfico de velocidad (abscisa) y tiempo (ordenada), donde se refleja el descenso de la velocidad enzimática a medida que avanza el tiempo de la reacción. Datos obtenidos de la Tabla 1.

2. Resultados práctico N°4: Efecto de la concentración de sustrato y de enzima en la velocidad de reacción.

a)Efecto de la concentración de β-glicerofosfato de sodio (sustrato) sobre la velocidad de la reacción catalizada por la fosfatasa alcalina.

Se calcularon los μmoles de fosfato utilizando la lectura promedio del estándar de fosfato y aplicando la formula:

μmoles PO4H−2 tubox=

|tubox||std|x

Absorbancia promedio estándar= 0,3855

Los valores obtenidos corresponden a la velocidad inicial de la reacción para cada concentración de sustrato, ya que se expresa en μmoles de fosfato liberado por 10 minutos de incubación.

Los resultados de absorbancia y velocidad inicial para cada tubo se resumen en la siguiente tabla:

Tabla 2. Corresponde a los resultados de velocidad inicial correspondientes a las diferentes concentraciones de sustrato.

Gráfico 3. Corresponde al grafico velocidad versus concentración de sustrato, donde se puede apreciar el efecto de la concentración de β-glicerofosfato sobre la velocidad de reacción de la fosfatasa alcalina, manteniendo constantes pH, tiempo de incubación, concentración de enzima y concentración de activadores. La reacción sigue la cinética de Michaelis-Menten. Datos obtenidos de la Tabla 2.

Matemáticamente la curva de velocidad v/s concentración de sustrato se puede expresar según

la ecuación de Michaelis-Menten: V i=V máx× [S ]Km+ [S ]

Mediante el gráfico 3 se puede obtener el valor aproximado de Km y Vmáx: 0,9 mM y 2,8 μmoles/10min respectivamente.

Como se dijo anteriormente este es un cálculo aproximado en donde no hay mucha precisión debido a que se obtiene directamente de la gráfica.

Para obtener los valores exactos de Km y Vmáx se utiliza la ecuación de “dobles recíprocos” de Lineweaver-Burk, donde la ecuación general

quedaría así: 1V i

=K m

V máx×

1S+ 1V máx

Gráfico 4. Corresponde al gráfico también llamado de los Dobles Recíprocos, en donde se utilizan los valores inversos de velocidad y concentración de sustrato que se encuentran en la Tabla 2.

Según los datos obtenidos en el práctico (Tabla 2) nos resultó la siguiente ecuación de la recta:

y=0,3859x + 0,2593

En consecuencia Vmáx será:

1V máx

=¿ 0,2593

Vmáx= 1

0,2593=¿3,856 μmoles PO4H-2/10 min

El Km lo podemos calcular mediante la pendiente de la recta:

KmV máx

=¿ 0,3859

Km=¿ 0,3859 x V máx

Km=¿ 0,3859 x 3,856 = 1,488 μmoles

b) Efecto de la concentración de la fosfatasa alcalina sobre la velocidad de hidrólisis de β-glicerofosfato de sodio.

Se calcularon los μmoles de fosfato utilizando la misma lectura promedio del estándar de fosfato y fórmula que se utilizó en la experiencia anterior.

μmoles PO4H−2 tubox=

|tubox||std|x

Los resultados de resumen en la siguiente tabla:

Tabla 3. Corresponde a los valores de velocidad obtenidos a partir de la lectura promedio del estándar de fosfato, cuando sólo se utiliza como variable la concentración de enzima en condiciones saturantes de sustrato.

Gráfico 4. Corresponde al gráfico velocidad versus unidades de enzima (ml), donde se puede apreciar el efecto del aumento en la concentración de fosfatasa alcalina. Se observa que cuando la concentración de sustrato es saturante, la velocidad es directamente proporcional a la concentración de la enzima, manteniendo constante todos los demás factores, tales como pH, temperatura (37°C), etc.

Conclusión y discusión:

Debemos señalar que con cada actividad realizada durante el trabajo práctico logramos cumplir los objetivos propuestos, rigiéndonos y guiándonos a través de los procedimientos establecidos, utilizando estándares y blanco para cálculos de resultados obtenidos. Este informe se basó de 2 prácticos correspondientes al 3 y 4, en los cuales utilizamos los mismos materiales, pero su metodología fue distinta, pues la intención era comprobar la variación en la velocidad de una reacción química enfrentada a enzimas después de un cierto tiempo y los factores influyentes en la velocidad de reacción para la obtención de producto. Es así como en ambos casos preparamos una incubación que contenía tampón de glicina (pH 9.4), sustrato B-glicerofosfato, agua destilada, a temperatura de 37º C constante y la solución de la enzima que se vertía posteriormente a una pre-incubación con molibdato (ácido) con el fin de detener la reacción a distintos tiempos y medir la variación de producto liberado, en este caso fosfato libre, utilizando espectrofotómetro para su medición y de esta manera, en el caso del práctico 3,observar la variación en la velocidad de reacción respecto del tiempo en que actúa. Fue así como utilizamos estándares de fosfato para calcular la cantidad de producto respecto del valor de absorbancia obtenido que, logramos concluir observando el gráfico 1, por medio de la línea de tendencia trazada la cual justifica que los puntos no se encuentre todos dentro de la línea curva de representación, que a medida que transcurre el tiempo la reacción química va progresando y la cantidad de producto generada cada vez aumenta más,llegando a un punto en que alcanza su equilibrio, en donde su concentración no aumenta más debido a que el producto proviene del sustrato de la reacción, y éste último va disminuyendo. Además podemos deducir respecto del gráficoproducto en función del tiempoque existe una relación directamente proporcional durante el tiempo en que el sustrato es saturante, y que la curva comienza a aplanarse transcurrido un tiempo alcanzando de esta manera el equilibrio(1).Sin embargo, debemos mencionar que durante el desarrollo ocurrieron variaciones menores respecto

de la toma enla cantidad de material requerida materiales como en el caso de los estándares debido a que a pesar de utilizar instrumentos de precisión, no siempre fueron obtenidas con la precisión justa con la que debiesen haberse obtenido.Respecto del grafico 2 donde analizamos la velocidad de la reacción respecto del tiempo transcurrido se puede concluir que la velocidad no varía durante el tiempo en que el sustrato es saturante, puesto que la velocidad inicial corresponde al número de moles de producto formado por unidad de tiempo, medidos antes de que se haya formado suficiente producto para permitir que ocurra la reacción contraria (2), pero decae continuamente cuando la concentración de sustrato es menor, hasta finalmente hacerse cero, llegando al equilibrio de la reacción (3).

En elpráctico 4, utilizando los mismos materiales que la actividad anterior a través de otros procedimientos pero utilizando estándares y blanco de igual forma para obtener los resultados de análisis, esta vez para observar cómo influye la concentración de sustrato y la concentración de enzima en la velocidad de una reacción enzimática, para lo cual en el primer caso el resto de factores debe mantenerse constante, ya sea el pH, la concentración de enzima, concentración de activadores, entre otros para poder observar de esta manera, el fenómeno ocurrido cuando analizamos la velocidad de una reacción en función de la cantidad de sustrato. A partir del grafico 3, podemos deducir mediante los valores obtenidos que a concentraciones de sustrato relativamente bajas, la velocidad inicial aumenta casi linealmente con el incremento de concentración de sustrato, a medida que está concentración va aumentando los sitios activos de las enzimas se van ocupando, en el momento en que la mitad de los sitios activos se ven ocupados, la velocidad corresponde a la mitad de la velocidad máxima y podemos definir Km, como la concentración de sustrato a la cual al velocidad de la reacción se hace la mitad de su valor máximo, a medida que esta concentración aumenta comienzan a saturarse, no quedando enzima libre para reaccionar por lo que un aumento en la concentración de sustrato ya no influye , esto se refleja en la zona aplanada que se produce una vez alacanzadala velocidad máxima de reacción(4). En el caso del gráfico 4, utilizando la gráfica de dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk, utilizando

los mismos valores del gráfico anterior, fue posible determinar de manera más precisa los valores de Km y Vmáx empleando valores recíprocos de velocidad inicial y concentración de sustrato.

Enla última actividad correspondiente al análisis de la concentración de enzima respecto a la velocidad de reacción, y a partir del gráfico 5, se deduce que cuando la concentración de sustrato es saturante, la totalidad de la enzima se encuentra como complejo enzima-sustrato, en estos casos la velocidad de la reacción (Vmáx) es directamente proporcional a la concentración de enzima observándose un gráfico lineal, siempre y cuando se mantengan las condiciones constantes para que ocurra, ya sea conservando el pH, temperatura, entre otras( 5).

Podemos concluir de esta manera que las enzimas son proteínas complejas que producen un cambio químico específico en otras sustancias, sin que exista un cambio en ellas mismas, sino más bien reduciendo la energía de activación acelerando la reacción y de esta manera obtener sustancias simples útiles a partir de complejas. Las enzimas, por tanto, son esenciales para todas las funciones corporales y se encuentran en la boca (saliva), el estómago (jugo gástrico), los intestinos (jugo pancreático, jugo y mucosa intestinal), la sangre y en cada órgano y célula del cuerpo.(6)

Bibliografía

(1),(3),(5) Muñoz. M, Del Pozo. R, Guía de Trabajos Prácticos, Carrera de Medicina 2010, Universidad Católica de la Santísima Concepción,Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica.

(2),(4)Nelson, D; Cox, M. Lehninger Principios de Bioquímica, Tercera Edición,Ediciones Omega, 2000, Barcelona, España.

(6)http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002353.htm