Universidad Católica de la Santísima ConcepciónFacultad de Medicina, Escuela de MedicinaDepto. De Ciencias Básicas y MorfologíaLaboratorio de Bioquímica

PRÁCTICO N° 2

PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS

Integrantes: Susana CórdovaDafne Del Mauro

Alessio EspinozaValentina Fuentes

Carrera: Medicina Sección: I

Fecha de realizacion : 5 de mayo, 2010Fecha de entrega: 12 de mayo, 2010

Docentes encargados : BQ Mirna Munoz, M.Sc. Dr. Reginald Del Pozo, Ph.D.

1. Resumen

El objetivo de este laboratorio fue evidenciar las propiedades de las proteínas mediante su reacción con diversas sustancias y en diferentes condiciones. Se realizaron 3 experimentos en laboratorio: Identificación de aminoácidos con ninhidrina; estos al tener sus grupos aminos libres reaccionan con esta sustancia produciendo un compuesto azul violáceo. Para esto, se utilizaron una solución neutra de aminoácidos y otra caseína que fueron mezcladas cada una con 0.5 ml de solución alcohólica de ninhidrina, además de un control (agua destilada mas ninihidrina). La muestra de aminoácidos dió resultado positivo mientras que la de caseína se consideró negativa al tener una unión más débil con el reactivo. En el segundo experimento se 4 tubos con soluciones expuestas a agentes desnaturalizantes como el acido tricloroacético al 10%(p/v) y temperaturas elevadas (baño maría). Los primeros dos tubos contenían caseína la cual, expuesta al calor no se vió afectada, pero si precipitó al estar en contacto con el ácido; los otros dos tubos contenían agua destilada que se expusieron a los mismos agentes, con resultados negativos. En el último experimento expusimos la caseína a 9 soluciones de diferentes pH, a fin de encontrar su punto isoeléctrico al cual precipita, el cual resultó 4,55.

2. Introducción

Las proteínas son una de las macromoléculas más importantes que conforman nuestro cuerpo, ya que realizan diversas funciones. Por lo tanto el estudio de sus propiedades es y seguirá siendo un medio importante para conocer los efectos que producen sus alteraciones y los posibles métodos de tratamiento. Están compuestas por la asociación de aminoácidos mediante un enlace peptídico.

Hoy en día es posible secuenciar los aminoácidos que componen a una proteína, con el fin de conocer su estructura y propiedades, ya que existe para cada proteína un segmento de DNA que codifica la información que especifica su secuencia de aminoácidos, lo cual ha significado un gran avance para el reconocimiento de algunas enfermedades provocadas por el mal funcionamiento de algunas proteínas, puesto que la secuencia de sus aminoácidos determina la función que lleva a cabo una proteína.

Uno de los métodos de reconocimiento de aminoácidos utilizado en el laboratorio y que será

analizado en el presente informe, es la reacción de éstos con Ninhidrina, esta sustancia actúa desaminando el aminoácido y formando un aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original, ninhidrina reducida, dióxido de carbono y amoniaco. Este último se une con otra molécula de ninhidrina y con la ninhidrina reducida formando un producto de color azul o púrpura.

La estructura de las proteínas está íntimamente ligada a su función, por tanto cualquier agente que la dañe también afectará su función. La pérdida de la estructura tridimensional que es suficiente para originar la pérdida de la función se denomina desnaturalización. Entre los agentes que la producen se encuentran los detergentes, el calor por sobre los 50°C, los cambios bruscos en el pH (ácidos y bases fuertes); los cuales rompen los enlacen no covalentes que estabilizan su estructura.

Las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero, al cual se le denomina punto isoeléctrico. Las proteínas en este punto presentan su máxima posibilidad para ser precipitadas al disminuir su solubilidad, debido a que hay menos repulsiones intermoleculares y esto facilita su agregación. En el práctico de laboratorio se aprovechó esta propiedad para determinar el punto isoeléctrico de la caseína.

Dentro de los objetivos que se plantea alcanzar en este informe se encuentran:

Diferenciar aminoácidos de proteínas, según su reacción con ninhidrina.

Demostrar que los daños en la estructura por agentes como el calor y los ácidos fuertes, como el acido tricloroacético, producen la desnaturalización de las proteínas y precipitación.

Comprender por qué la caseína en su punto isoeléctrico se hace menos soluble, además de la incidencia que tiene el pH sobre ésta.

Entender la importancia del correcto uso del material de laboratorio.

3. Materiales

Tubos de ensayo, vaso precipitado 200 ml y 50 ml, trípode, gradilla, mechero Bunsen, propipetas (verde, azul), pipeta de 10, 1 y 5 ml, pinza metálica, rejilla, fósforos, marcador permanente, vórtex, cronometro.

Reactivos:

Solución alcohólica de ninhidrina al 0.1% Solución neutra de aminoácidos 0.1 M Solución neutra de caseína: 0.5 g de

caseína en 100 ml de buffer fosfato 0.1 M pH 7.0}

Muestra proteica Acido tricloroacetico (TCA) al 10% p/v} Caseína al 0.5% en acetato de sodio 0.1 M Acido acético 1M Agua destilada

4. Métodos

Método Experimental N°1: Identificación de aminoácidos por la reacción de Ninhidrina y su diferenciación con las proteínas:Se preparan 3 soluciones.

Tubo 1. 2,5 ml de sol. Neutra de aminoácidos Tubo 2. 2,5 ml Sol neutra de caseína Tubo 3. 2,5 agua destilada. A los 3 tubos agregar 0.5 ml de sol. Alcohólica de ninhidrina. Agitar en el vórtex y finalmente someter a baño María por 3 minutos, observar resultados.

Método Experimental N ° 2: Reconocimiento de proteínas por reacciones de precipitación por desnaturalización por calor y ácido tricloroacético:Se rotulan 4 tubos de ensayo.

Tubo 1. 0.5 ml de muestra proteica. Tubo 2. 0.5 ml de agua destilada. Tubo 3 0.5 ml de muestra proteica + 0.5 ml de TCA 10% Tubo 4 0.5 ml de agua destilada + TCA 10%. Agitar en el vórtex y luego calentar a baño María durante 3 minutos, observar resultados.

Método Experimental N°3: Determinación del punto isoeléctrico de la caseína:

Se rotulan 9 tubos de ensayo. En el primero se mezclan 3.2 ml de ac. Acético 1M + 6.8 ml de agua destilada, mezclar en el vórtex. A los 8 tubos restantes se le agregan 5 ml de agua destilada. Luego se toman 5 ml del primer tubo y se agregan al segundo, continuar asi hasta completar los 9 tubos de manera que se vayan diluyendo. Eliminar del último tubo 0.5 ml por exceso. Finalmente adicionar a todas las muestras 1 ml de sol de caseína en acetato de sodio 0.1M, anotar el efecto inmediato y el observado 15 minutos después.

5. Resultados:

Método Experimental N°1: Identificación de aminoácidos por la reacción de Ninhidrina y su diferenciación con las proteínas:

Tabla 1. Soluciones con reacción de ninhidrina, y colores obtenidos.

Componentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3Sol. neutra de aminoácidos

2.5 ml - -

Sol. neutra caseína

- 2.5 ml -

Agua destilada - - 2.5 mlSol. alcohólica ninhidrina

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Resultados x ox ox = positivoo = negativoResultados:

Tubo 1: -morado = 1 min.-morado intenso =2 min.-morado violáceo =3min.

Tubo 2:-café = 1 min-pálido morado (error por caseína muy concentrada, debería dar lila claro)

Tubo 3: sin color.

Método Experimental N°2: Reconocimiento de proteínas por reacciones de precipitación por desnaturalización por calor y ácido tricloroacético.

Tabla 2. Soluciones para reconocimiento de proteínas por precipitación

Componente Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Muestra proteica

0.5 ml - 0.5 ml -

Agua destilada

- 0.5 ml - 0.5 ml

TCA 10% - - 0.5 ml 0.5 mlResultados:

- Agitación en vórtex:Tubo 1 = opalescenteTubo 2 = opalescenteTubo 3 = turbo blanquecinoTubo 4 = opalescente

- A baño María por 3 min:Tubo 1 = opalescenteTubo 2 = opalescenteTubo 3 = precipitado blanco inmediatoTubo 4 = opalescente

Método Experimental N°3: Determinación del punto isoeléctrico de la caseína:

Tabla 3. Determinación de punto isoeléctrico para caseína y resultados obtenidos.

ComponenteT 1

T2

T 3

T 4

T5

T 6

T 7

T 8

T 9

pH cada tubo

3.5 3.8 4.1 4.4 4.7 5.0 5.3 5.6 5.9

Agua destilada (ml)

6.8 5 5 5 5 5 5 5 5

Ácido acético 1M (ml)

3.2 - - - - - - - -

Vol. Solución a agregar al tubo siguiente (ml)

5 5 5 5 5 5 5 5 5

5 ml

Resultados inmediatos O + + +x +x + + o oResultados después de 15 min.

O + x xx xxx x++

+ o o

o = no cambia+ = opalescenciax = precipitado

Se aprecia que la caseína se torna insoluble en su punto isoeléctrico precipitando. El punto isoeléctrico corresponde al promedio de los pH donde se produce la precipitación de la proteína (tubos 4 y 5)Punto isoeléctrico = (4.4+4.7)/2 = 4.55

7. Conclusión y discusión

La temática del práctico numero 2, hace referencia a las propiedades de las proteínas. Hemos realizado tres experiencias que nos aportaron clara evidencia acerca de las características de estas macromoléculas. Es fundamental tener presente, para la conclusión de nuestros resultados, que las proteínas dependen de su estructura tridimensional, es decir, de acuerdo a su conformación primaria adquieren un orden espacial. La cadena polipeptídica de cada proteína está compuesta por un número determinado de aminoácidos dispuestos espacialmente, unidos por enlaces peptídicos, enlaces disulfuro, puentes de hidrógeno,

interacciones hidrofóbicas, puentes salinos, y fuerzas de Van der waals. Un pequeño cambio en la secuencia de aminoácidos ocasionará cambios en su estructura acarreando la consecuente pérdida de su actividad biológica. Cada aminoácido de una proteína está en su lugar, con un propósito determinado, en su conjunto le confieren a las proteínas sus propiedades de especificidad. Otra propiedad de las proteínas que analizaremos en este práctico, corresponde a la solubilidad. Las proteínas globulares, por ejemplo, son solubles en agua, producto de que sus radicales polares o hidrófilos se disponen hacia el exterior formando puentes de hidrogeno con el agua. De la misma forma, sus radicales hidrófobos se ubican hacia el interior de la proteína, estabilizando la estructura en su interacción con el medio. La solubilidad varía dependiendo del tamaño, de la forma, de la posición de los radicales, y como veremos en el práctico, del pH. Un proceso importante que desarrollamos fue la desnaturalización de una proteína, que consiste en la pérdida de su estructura tridimensional, es producto de una variación significativa en la temperatura, la presión, la electronegatividad, el pH, etc. que tiene por consecuencia la ruptura de los puentes de hidrogeno que mantienen la estructura secundaria y terciaria, es así como las proteínas se transforman en fibras insolubles en agua. Si las condiciones expuestas a nuestra muestra son suaves, el proceso puede ser reversible. Si en cambio, el proceso es más drástico, el resultado es definitivo, por tanto irreversible.

Para una clara comprensión de los resultados vamos a dividir nuestra experimentación en 3 procesos independientes. Con el fin de analizar por separado las distintas propiedades proteicas que en cada ensayo nos vimos enfrentados.

El primer procedimiento involucra 3 tubos con distinta muestra que nos arrojan resultados diversos, expuestos en la Tabla 1.

Antes de empezar nos planteamos hipótesis que esperamos corroborar al momento de la experimentación: para el tubo 1, dedujimos que la reacción arrojaría un resultado positivo (coloración azul-violáceo), pues la ninhidrina reacciona específicamente oxidando el n-terminal de la cadena polipeptídica del aminoácido, reduciéndose

a si misma y liberando amoniaco y dióxido de carbono. Para el tubo 2 concluimos que la muestra iba a arrojarnos un resultado negativo, por la baja afinidad de parte de la ninhidrina con las soluciones proteicas, como lo es la Caseína. Para el tubo tres indujimos un resultado negativo pues en el agua destilada la ninhidrina no tiene con que reaccionar.

Nuestras hipótesis se vieron corroboradas en el paso de la experimentación. Los tubos 1 y 3 se ajustaron a lo esperado, mientras que el tubo 2 nos arroja un resultado diverso que nos obliga a plantear conclusiones al respecto. Si el procedimiento no reconoce proteína ¿por qué presenta una coloración lila después de 3 minutos en baño María? En este paso del procedimiento presentamos un error de preparación de la muestra de caseína, la cual se nos fue entregada en una concentración mayor a la empleada generalmente en este tipo de reacción. Frente a este error no podíamos hacer nada más que continuar con el procedimiento, ya que no está considerado el paso de medir concentración ni el paso de dilución. Por tanto al respecto concluimos, que la muestra de caseína responde negativamente a la ninhidrina puesto que en las proteínas gran parte de los grupos amino de sus aminoácidos constituyentes se encuentran bloqueados por los enlaces covalentes, por lo cual sólo el NH3 del amino terminal y algunos de los aminoácidos básicos reaccionan dando un tono violeta muy débil.Experimento 2:Toda proteína presenta una solubilidad respeto al medio con el que interactúa, esta propiedad viene dada por su conformación espacial y la integridad de sus distintos niveles estructurales. Cuando alteramos la estructura secundaria y terciaria, la proteína pierde su funcionalidad, este proceso lo llamamos desnaturalización. Los agentes desnaturalizantes con que trabajamos en esta oportunidad son: un medio ácido proporcionado por el acido tricloroacético al 10%(p/v) y temperaturas elevadas producto del baño María a que sometimos las muestras. Los 4 tubos que preparamos nos permitieron deducir lo siguiente:Tubo 1: la muestra proteica expuesta al calor durante 3 minutos no presenta ningún tipo de alteración, no se ven cambios de tonalidad ni precipitación. Exponemos la muestra a 3 minutos más si obtener resultado alguno. Deducimos que el agente desnaturalizante, en este caso el calor aplicado, no es suficiente para lograr una desnaturalización total. Los procesos más efectivos para lograr una desnaturalización son medio acido o alcalino fuerte, temperaturas elevadas y tiempo

prolongados; en nuestro experimento sólo cumplimos con una condición de las expuestas, por tanto la desnaturalización no se lleva a cabo completamente y los enlaces disulfuro por su fuerza covalente, permanecen intactos.

Tubo 2: No presenta ninguna sustancia que desnaturalizar, el agua destilada expuesta al calor solo se evapora.

Tubo 3: En esta muestra presentamos dos agentes desnaturalizantes, la temperatura elevada y el medio ácido (TCA) con lo cual obtenemos una desnaturalización más efectivas y detectable por los efectos visibles. Al agitar en vórtex obtenemos una mezcla turbia y blanquecina que durante el baño María precipita de inmediato. Por lo tanto la desnaturalización se lleva a cabo y la muestra proteica pierda toda actividad biológica y propiedades físico-químicas.

Tubo 4: No presenta reacción, obtenemos como resultado el ácido diluido en agua. Con una concentración menor a la que poseía en una primera instancia

Para el procedimiento 3 utilizamos caseína, que es una proteína característica de la leche.

Sabemos, a priori, que el punto isoeléctrico de una proteína coincide con su estado menos soluble, por tanto en muchos casos, precipita por su incapacidad de reaccionar con el medio que la contiene por su carga neta 0. En cambio, a medida que aumentamos o disminuimos el pH, la proteína se tornará más soluble.

Este procedimiento nos permitió obtener el punto isoeléctrico de la caseína, observando en soluciones de distinto pH, en cuales la proteína precipitaba.

Los resultados más fiables de valorar, son los segundos (ver tabla 3) donde el precipitado de proteína pasa de estar en una fase en suspensión a decantar en el fondo del tubo. Las muestras donde obtuvimos mayor precipitado, correspondieron a la número 4 y 5, con pH 4.4 y 4.7 respectivamente. Sin embargo, la mayor cantidad de precipitado la obtuvimos en el tubo 5. Deducimos por tanto, que el punto isoeléctrico se encuentra entre los valores de pH 4.4 y 4.7. Esto nos da como promedio 4.45, no obstante con el fin de redondear y considerar la

mayor precipitación, es que concluimos que la caseína posee un pI de 4.6 (valor que se ajusta al real). A medida que nos alejamos de este valor la solubilidad aumenta, por lo tanto, en los valores de pH más extremos obtenemos soluciones transparentes u/o opalescentes débiles, donde la proteína cargada eléctricamente, no forma agregados.

Las propiedades proteicas definen la función que desempeñará en el organismo una proteína en particular, cualquier alteración en su conformación, punto isoeléctrico o el medio en donde se desenvuelven, ocasionará un cese de su actividad biológica. El conocer dichas características nos aseguran mantener nuestro organismo en un estado de equilibrio, velando por el buen desempeño de todos sus componentes. Tenemos completa certeza que un alza de temperatura corporal de tan solo 3 grados con respecto a los parámetros normales (36.5 C) y mantenido por un tiempo determinado, puede provocar daños graves a la salud del paciente, en otras palabras, desnaturalización de las proteínas. El pH fisiológico que mantiene nuestro organismo corresponde a 7.4, un alza o diminución de esta medida ocasionará un desajuste en el desempeño proteico. Las proteínas de transporte, de regulación, estructurales, etc. se presentan en una determinada concentración, alteración en estos niveles pueden ser causas de afecciones graves. El conocimiento claro y preciso de todos estos parámetros, nos asegurará una clara comprensión del aspecto bioquímico de las patologías, las cuales nos veremos enfrentados en nuestra práctica profesional.

8. Bibliografía:

Muñoz. M, Del Pozo. R, Guía de Trabajos Prácticos, Carrera de Medicina 2010, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica.

Nelson, D; Cox, M. Lehninger Principios de Bioquímica, Tercera Edición, Ediciones Omega, 2000, Barcelona, España.