Bloque de Practicas 1 Analisis Instrumental

Laboratorio de Análisis Instrumental

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FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL

BLOQUE DE PRACTICAS 1

Carreras: Biotecnología y Químico Farmacéutico Biólogo

Chávez Rodríguez Nallely Jiménez Caballero Luis

Morales Cedillo Rodrigo Villalobos Mario

9 de Septiembre de 2013


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Practica “0”: Reacción de yodato potásico por el hidrógeno sulfito de sodio en presencia de almidón Introducción Antes de comenzar hay que definir que el pH es una medida de acidez/alcanilidad de una solución acuosa a determinada temperatura, que tiene un rango de 0 – 14. (Prichard, E., 2003). De acuerdo a la predicción en las reacciones se forma el complejo almidón -pentayoduro para determinar de acuerdo a la concentración de los reactivos y la temperatura aplicada, se vera afectada la reacción. (Durán, C., 2010). Las reacciones redox se producen por la transferencia directa de electrones, donde intervienen un agente oxidante y uno reductor, donde ordinariamente se tienen el carácter bimolecular. Los mecanismos estequiometricos dependen de si los centros de reaccionan sin modificación de sus esferas de coordinación o de si la reacción debe ir acompañada por una sustitución de ligando. (Duward, F., 1998)

Fig.1 Arcoíris esperado con la metodología presentada a continuación. (Duran, C., 2010.) Objetivo General

• Determinar de acuerdo a un experimento cualitativo de colorimetría el porcentaje de errores que puede tener un analista.

Especifico


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• Reafirmar conceptos de: Rx. Redox, Rx. De dismutacion, e indicadores de pH.

Metodología Se puso una gota de los indicadores de fenolftaleína, tomolftaleína y 4 nitrofenol en cada una de las 7 cubetas de espectrofotómetro, respectivamente para tener una serie de soluciones en diferentes vasos y se etiquetaron estos como A, B y C; en dischos vasos se vertieron 0.5ml de la disolución preparada de hidrógeno sulfito de sodio (NaHSO3), y en el segundo se vertió la misma cantidad disolución pero esta vez de Yodato de Potasio (KIO3); al final con los indicadores vertidos así como las disoluciones se observó si hubo un cambio de coloración, en el cual a por medio de distintivas cantidades el resultado final debía ser un arcoíris mostrando las diferentes ondas a las que se puede leer en un espectrofotómetro. Resultados

Imagen 1. “Arcoiris” obtenido de la conjunción de diales de todos los equipos.* *Nota: No se pueden reportar cantidades exactas, ya que ningún equipo registro a grandes rasgos el volumen agregado de reactivo.


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Discusión de resultados La reacción se produjo en varias etapas, las cuales fueron: 1ª Etapa: Los iones hidrogensulfito (HSO3

-) reducen a los iones yodato (IO3-) a iones yoduro (I-) según la reacción

donde se determina la velocidad de la reacción total. La estequiometria de la reacción indica que se consumen más rápidamente los iones HSO3

- . Cuando se agotan los iones I- que se han producido reaccionan con los iones IO3- sobrantes. (Durán, C., 2010) 2ª Etapa: Los iones yoduro producidos en la primera reaccionan con los iones yodato en exceso produciendo yodo (I2).

Esta reacción es muy rápida y el I2 producido reacciona con el almidon para producir un complejo almidon-pentayoduro que presenta un color azul oscuro casi negro. La aparición de este complejo indica que la primera etapa de la reacción se ha completado y ha tenido lugar la segunda. (Durán, C., 2010) Reacción completa

Después de realizar el experimento y compararon resultados donde se concluyó que debido a la falta de precisión en la concentración de indicador no se pudieron


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obtener los resultados esperados durante el experimento, ya que se obtuvieron muchas tonalidades de verde, tanto así como amarillos por lo que se tuvo que recurrir al control de pH y tratar de obtener la coloración adecuada la cual a final de cuentas no logro ser obtenida debido a lo previo dicho, también se pudieron apreciar varios rojos y anaranjados e inclusive se obtuvo un rosado el cual no se encuentra dentro de los colores del arcoíris lo cual ponía en duda el experimento y fue lo que al mismo tiempo nos llevó a la conclusión de que la falta o exceso de indicador en las soluciones fueron las culpables del tropiezo del experimento mas sin embargo se pudo obtener una diferente gama de coloridos para dar a ejemplo a como es el espectro electromagnético el cual se usa en un espectrofotómetro. Conclusión Se contemplo de manera exacta una variación en los resultados de todos, quedando en evidencia los diferentes métodos que se usaron, que de sobremanera inexactos, e ineficientes. Referencias

• Prichard, E. (2003) Practical Laboratoy Skills Training Guides: Measurement of pH, Cambridge, United Kingdom.

• Durán, C. (2010), Reacciones encadenadas : del reloj de yodo al arco iris químico, Revista Eurela sobre enseñanza y divulgación de las ciencias, Vol. 8 (1), p.p. 105-‐110.

• Duward, F., (1998) Química Inorgánica, Barcelona, España, Ed. Reverté.


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Práctica 1: Evaluación del funcionamiento y uso de distintos sistemas de medición de volúmenes Introducción Precisión Describe la reproducibilidad de los resultados, es decir, la concordancia entre los valores numéricos de dos o mas mediciones repetidas o que se han efectuado “exactamente de la misma forma”. En general, la precisión de un método analítico se obtiene con facilidad mediante la simple repetición de la medida. Se utilizan tres términos para describir la precisión de un conjunto de datos repetidos: desviación estándar, varianza y coeficiente de variación. (Skoog, D., 2008). Exactitud Describe si un resultado experimental es correcto expresado como la cercanía de la medición a un valor verdadero, o aceptado. La exactitud es un termino relativo en el sentido de que un método es exacto o inexacto dependiendo en gran medida de las necesidades del científico y de las dificultades del problema analítico. (Skoog, D., 2008). Errores aleatorios Siempre que en una misma muestra se repiten las mediciones analíticas, se obtiene una dispersión de los datos, que se le conoce como errores indeterminados o aleatorios. (Skoog, D., 2008). Errores personales Son aquellos que se introducen en una medición como consecuencia de los criterios que debe adoptar un analista. (Skoog, D., 2008). Objetivo General

o Identificar a través de mediciones de rutina, los errores que presenta el analista.

o Conocer el uso adecuado de pipetas de vidrio y de pipetas semiautomáticas para evaluar de que manera es eficiente su funcionamiento.


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Especifico o Calcular el CV, la DS, y el % de error, en base a los datos obtenidos en la

metodología. o Reafirmar conceptos: exactitud, precisión, error, desviación estándar,

coeficiente de variación, etc. Metodología

Resultados

A) Peso-volumen con pipeta semiautomática

Peso del Volumen

Gramos

4,89 4,89 9,77 4,88 14,65 4,88 19,52 4,87 24,40 4,88

EVALUACION DEL USO Y

FUNCIONAMIENTO DE SISTEMAS DE

MEDICIÓN

• A) PESO-‐VOLUMEN CON PIPETA SEMIAUTOMÁTICA • 1. Colocar un recipiente coulter-‐counter de 20 ml en una balanza analítica y pesarlo. • 2. Con la pipeta semiautomática medir 50 µL de agua y depositarla en el recipiente. • 3. Registrar el peso del volumen y multiplicarlo por 1000 (1 µL = 1 mg) • 4. Repetir 19 veces los puntos 2 y 3 • 5. Calcular el CV y el % de error • 6. Comparar los resultados del CV y el % de error con otros compañeros que hayan usado la misma pipeta.

• B) PESO-‐VOLUMEN CON PIPETAS DE VIDRIO • 1. Colocar un recipiente coulter-‐counter de 20 ml en una balanza analítica y pesarlo. • 2. Con la pipetas terminal y subterminal de 1 ml medir 1 ml de agua, depositarla en el recipiente y registrar el peso del volumen en gramos. • 3. Repetir 19 veces el punto 2. • 4. Calcular el CV y el % de error. • 5. Comparar los resultados del CV y el % de error, con otros compañeros que

• c) EVALUACIÓN DE LA MEDICIÓN A TRAVÉS DE DILUCIONES • 1. Seleccionar 20 tubos y las pipetas adecuadas para hacer dilución 1:25 de la solución. • 2. Hacer una dilución 1:25 de dicromato de potasio al 5 % con agua destilada • 3. Repetir el paso 2 diecinueve veces con las mismas pipetas • 4. Mezclar cuidadosamente cada tubo • 5. Leer la absorbencia a 510 nm, después de ajustar el espectrofotómetro con agua • 6. Calcular el promedio, la desviación estándar y el coemiciente de variación con las absorbencias.


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29,28 4,88 34,20 4,92 39,11 4,91 43,99 4,88 48,91 4,92 53,78 4,87 58,66 4,88 63,59 4,93 68,47 4,88 73,34 4,87 78,49 5,15 83,11 4,62 91,20 8,09 96,26 5,06

Tabla 1 Datos registrados del peso de agua utilizando Pipeta semiautomática

Desviación estándar

Coeficiente de variación

Promedio % de error

.7387 10.58 5.006 45.82 B) Peso-volumen con pipeta de vidrio

Peso del Volumen

Gramos

9,78 9,78 19,42 9,64 29,02 9,6 38,62 9,6 48,22 9,6 58,82 10,6 68,02 9,2 78,22 10,2 88,42 10,2 98,78 10,36 108,42 9,64 118,02 9,6


9

128,22 10,2 138,62 10,4 148,82 10,2 158,02 9,2 168,78 10,76 178,42 9,64 188,62 10,2

Tabla 2 Datos registrados del peso de agua utilizando Pipeta de Vidrio



Promedio % de error

.4524 4.55 9.927 8.85 C) Evaluación de la medición a través de diluciones

Numero de

Disolución

Abs 590 nm

1 0,01 2 0,012 3 0,011 4 0,006 5 0,009 6 0,002 7 0 8 0,007 9 0,004 10 0,004 11 0,004 12 0,004 13 0,004 14 0,004 15 0,003 16 0,003 17 0,004 18 0,005


10

19 0,005 20 0,004

Tabla 3. Numero de diluciones de Dicromato de potasio a 590nm



Promedio % de error

.0030 .5858 .0052 41.4 Discusión de resultados El error de medición obtenido con respecto al permitido fue alto debido al uso incorrecto de pipetas. En el caso de las pipetas graduadas para leer el menisco sin error, el aparato volumétrico debe estar en la posición vertical y los ojos del analista deben encontrarse a la altura del menisco.

Fig.1.0 Representación de lectura para el caso de pipetas volumétricas.

Para el caso de pipetas automáticas un factor que intervino fue el uso correcto del material, debido a que se debe limpiar con un papel la punta para retirar el exceso. (Brand, 2008).


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Fig.1.1 representación grafica de precisión y exactitud. (brand, 2008). A)Tanto en la tabla como en la gráfica 1 se puede determinar que obtuvimos un erros sistemático ya que gran parte de los puntos van hacia un cierto lado de la gráfica, así mismo el porcentaje de error obtenido en este experimento es del 45.82%, este es un porcentaje demasiado alto ya que para que sea confiable el dato no debe de sobrepasar el 3%, se piensa que el error más que nada fue de la persona a la hora de maniobrar con la pipeta. B) En el experimento B determinamos que el erros obtenido es Aleatorio ya que presenta cierta tendencia la gráfica en ciertos rangos, el valor mínimo aceptable para que estos datos sean confiables es del 5% y dado que obtuvimos un porcentaje de error del 8.85% podemos denotar que esta fuera del valor real la medición, estos factores pueden deberse a diferentes factores tanto a la hora de maniobrar la pipeta, pudo ser también las condiciones de la propipeta así como si el experimentador agrego o no la última gota de esta y/o limpio el exceso de material en la punta C) En este experimento se obtuvo un porcentaje de error del 45.82%, es un valor demasiado alto y muy alejado del valor real, así mismo la lectura de este debió de ser en 510 nm, sin embargo se leyó a 590 nm por error del encargado del


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experimento, dado que el rango de lectura en el espectrofotómetro cambia se piensa que dichas lecturas mostradas en la tabla 3 son inadecuadas, sin embargo se comparó con las lecturas del equipo B de la sección 3 y se obtuvo un error aleatorio y se cree que fue por parte del experimentador y así también por parte de la exactitud de la pipeta ya que se tomó un volumen mínimo de la muestra y se realizó con una pipeta de 1 mL en lugar de una micro pipeta, por ende el rango de error aumenta Conclusión Para la medición de volúmenes, los errores no solo dependen del instrumento, sino principalmente del analista; por tal motivo es importante capacitar al personal sobre el uso adecuado del material (en este caso de medición, para manipular los anualitos de forma adecuada y ofrecer un resultado eficaz y confiable. Referencias

o Brand, (2008). Información sobre la medición de volumen. Brand. pp.21 o Skoog, D., (2008), Principios de Análisis Instrumental. Mc Graw Hill.

España., p.p. 967 – 980.


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Practica 2: Determinación de proteínas por el método de lowry Introducción El método de Lowry es una técnica calorimetría basada en la cuantificación de los grupos fenólicos, que permite valorar el aminoácido de tirosina, único aminoácido fenólico de las proteínas. (Gil A., 2010).

Este método utiliza tres sistemas para producir coloración por la presencia de proteínas. En primer lugar el Cu+, forma complejos de coordinación con dos enlaces peptídicos consecutivos de proteínas, dando lugar a un compuesto coloreado azul y en segundo lugar el compuesto es capaz de reducir al reactivo de Folin-Ciocalteu (acido fosfotungstico y fosfomolibdico) dando un color más azulado. Por último el reactivo de Folin también reacciona con los residuos de tirosina de la cadena polipeptidica, produciendo un color azul por la reacción de fosfomolibdato en medo básico (Roca P., 2003).

Entre las ventajas de este método se encuentran que es muy sensible, se ve menos afectado por la turbidez de la muestra, es más especifico que la mayoría de otros métodos, relativamente simple. (UAM,2008).

Objetivo General

! Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico

Especifico ! Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la

exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry para analizar las ventajas y desventajas con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas

! Analizar el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color para identificar el mecanismo mediante el cual interfieren en la reacción. Conocer y


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aplicar conocimientos fundamentales de química analítica para la elaboración de curvas de calibración.

! Analizar los efectos de los interferentes en este método. ! Determinar y analizar los resultados considerando precisión y exactitud

Metodología

NOTA: TODAS LAS REACCIONES ANTERIORES FUERON LEÍDAS A 590 nm. Resultados

Tubo No.

Cantidad de proteína (µg)

A 590 Serie a Serie b

1 .1 0.002 -.056 2 .2 .046 -.074 3 .3 .057 -.004 4 .4 .083 .020 5 .5 .117 .044

Tabla 1. Curva de calibración de albúmina Método de Lowry

Ecuacion de la Recta : Y = 0.276X – 0.0191

Pendiente = 0.0.276

CURVA DE CALIBRACIÓN Se preparó una serie de

tubos contenida en la tabla 1 del manual de prácticas de Análisis Instrumental pp.15 Se cubrieron los tubos con

papel parafilm. NOTA:El tubo 6 es el blanco.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se prepararon 10 tubos en

las mismas Condiciones que el tubo 3 de la tabla 1 del manual de prácticas de

Análisis Instrumental pp.15

INTERFERENCIAS DEL MÉTODO

Se prepararon 5 tubos en las mismas Condiciones que el

tubo 3 de la tabla 1 del manual de prácticas de

Análisis Instrumental pp.15 y se añadió 0.1mL de las soluciones interfetentes

contenidas en la Tabla 1 del Manual de Prácticas pp.16.


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Ordenada al orígen = 0..0191 Coeficiente de correlación = 0..971 La curva no cumple la ley de Bauger y Beer

• La pendiente indica el valor de abencia molar • El eje de Y indica la distancia recorrida por la radiación de onda • El coeficiente de correlación indica si los datos obtenidos son confiables

Tubo No.

Absorbencia590

Hb Cantidad de proteína

(µg) 1 .031 1.8X^-4 2 .035 1.96X10^-4 3 .032 1.85X10^-4 4 .025 1.59X10^-4 5 .034 1.92X10^-4 6 .047 2.39X10^-4 7 .033 1.88X10^-4 8 .036 1.99X10`-4 9 .042 2.21X10^-4

10 .044 2.28X10^-4

Tabla 2. Réplicas para el análisis estadístico

Confiabilidad del 95% 1.83X10^-4 – 2.13X10^-4 Promedio 1.98X10^-4

S 2.41X10^-5 S^2 5.84X10^-10 cV 0.121

Tabla 3. Análisis Estadístico, Limite de Confianza del 95%

Numero de

Tubo Sustancia Abs 590nm

Hemoglobina µg de Proteina

1 Tris 1M, pH 7.0 0 .0692 2 Glicerol 1% .320 1.2286 3 Detergente Comercial

1% .422 1.5981

4 DOdecil Sulfato de Sodio 1%

.472 1.7793

5 Acido Tricloroacetico .420 1.5909


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5%

Tabla 4. Efecto de algunas Sustancias no Proteicas en el Método de Lowry Discusión de resultados De la curva de calibración se pudo determinar que no se llevaba a cabo la ley de Baouger y Beer ya que la absorbencia aumentaba al aumentar la concentración de esta sin tener un parámetro definido, además nuestro factor de correlación fue de 0.971 esto nos da a entender que su confiabilidad es elevada, sin embargo no es lo suficientemente bueno para ser aceptado, las razones por las cuales se pudieron deber esto pudo ser desde el principio al medir los reactivos y colocarlos en los tubos así como también pudo ser la preparación de los reactivos Las absorbencias fueron calculadas con la ecuación de la recta de la curva de calibración y nos dieron los resultados dados en la tabla 4, obteniendo diferentes masas de proteínas en cada uno como se muestra Conclusión Los métodos presentan diferencias significativas, sin embargo, habrá una variación en los resultados dependiendo de la proteína que se este estudiando. Además de presentar los típicos errores por parte del investigador. Referencias

o Gil A. (2010).Tratado de Nutrición Tomo II. Editorial Panamericana. México. Pp.539

o Roca P. (2003).Bioquímica técnicas y métodos. Editorial Hélice. España.pp.130

o UAM (2008).Cuantificación de proteínas, obtenido el 6 de Septiembre del 2013 a las 18.50 en: http:// docencia.izt.uam.mx/hgm/metodos/documentos/ppt/cuantificacion%2520de%2520proteinas.ppt


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Práctica 3: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD Introducción Un método rápido y preciso para determinar la concentración de una proteína es esencial en muchos campos de estudio, el ensayo que se adapta a esta descripción ser conoce como el ensayo, o método, de Bradford, que consiste en teñir de azul de Coomassie G250 a la proteína, la forma catiónica del teñido, en la que predomina el ensayo acido de la solución, tiene una longitud de onda máxima de 470, y en contraste, la forma aniónica del teñido, el cual se une a la proteína, tiene una longitud de onda leíble máxima de 595 nm, (Bradford, M., 1976). Objetivo General

" Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.

Especifico " Determinará si hay diferencia estadística significativa en la precisión y

exactitud respecto al método de Lowry para analizar las ventajas y desventajas con respecto a otros métodos en la cuantificación de proteínas.

" Analizar el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color para identificar el mecanismo mediante el cual interfieren en la reacción.

Metodología

NOTA: TODAS LAS REACCIONES ANTERIORES FUERON LEÍDAS A 595nm.

CURVA DE CALIBRACIÓN

Se preparó una serie de tubos contenida en la tabla 1 del manual de prácticas de Análisis Instrumental pp.15

Se cubrieron los tubos con papel parafilm.

NOTA:El tubo 6 es el blanco.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se prepararon 10 tubos en las mismas

Condiciones que el tubo 3 de la tabla 1 del

manual de prácticas de Análisis Instrumental pp.

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INTERFERENCIAS DEL MÉTODO

Se prepararon 5 tubos en las mismas Condiciones que el tubo 3 de la tabla

1 del manual de prácticas de Análisis

Instrumental pp.15 y se añadió 0.1mL de las

soluciones interfetentes contenidas en la Tabla 1 del Manual de Prácticas

pp.16.


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Resultados

Tubo Mg proteína Serie A Serie B 1 .1 0.451 0.381 2 .2 0.666 0.629 3 .3 0.859 0.8 4 .4 0.979 0.992 5 .5 1.01 1.035

Tabla 1 (arriba) y 2 (abajo) Curva de Calibración de Albumina Método Bradford

Pendiente 1.671 Ordenada al Origen 0.3637

Coeficiente de Correlación 0.9576

Con los datos obtenidos de Absorbancia y concentración de cada medición se realizó la curva de calibración, la cual mostro un coeficiente de variación del 0.9576, valor muy cercano a 1, por lo tanto indica que existe una muy buena relación de tipo lineal entre la concentración y la Absorbancia Esta curva no cumple con la ley de Bouger y beer ya que su correlación es de .09576 que a pesar se elevado no entra dentro de los parámetros permitidos de esta.

Tubo Abs(590 nm) Mg de proteína(albumina) 1 1.326 0.6582 2 1.351 0.6731 3 1.334 0.6630 4 1.343 0.6680 5 1.278 0.6295 6 1.385 0.6935 7 1.380 0.6905 8 1.401 0.7031 9 1.506 0.7659 10 1.603 0.8239 Promedio .06969 DS .0573 Varianza 3.29X10^-3 CV .0822 Lim Confianza 0.6612 – 0.732


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Tabla 2. Replicas para el análisis Estadístico

Tabla 3. Efecto de Algunas Sustancias no Proteicas en el método de Bradford Discusión de resultados De la curva de calibración se pudo determinar que no se llevaba a cabo la ley de Bouger y Beer ya que la absorbencia aumentaba al aumentar la concentración de esta sin tener un parámetro que definido , además nuestro factor de correlación fue de 0.957 esto nos da a entender que su confiabilidad es elevada, sin embargo no es lo suficientemente bueno para ser aceptado, las razones por las cuales se pudieron deber esto pudo ser desde el principio al medir los reactivos y colocarlos en los tubos así como también pudo ser la preparación de los reactivos Las absorbencias fueron calculadas con la ecuación de la recta de la curva de calibración y nos dieron lso resultados dados en la tabla 2, obteniendo diferentes masas proteicas en cada uno como se muestra teniendo casi todos los tubos dentro del intervalo permitido calculado de proteínas en estas Así mismo se realizaron las 10 interferencias dando en algunas una absorbencia de cero, esto pudo ser por diversas razones tanto en la mala manipulación del reactivo como hacer mal los cálculos o incluso error del encargado del experimento, sin embargo, dentro de este método que fue el de Bradford consta de mayor sensibilidad y es en un punto de vista de los mejores a utilizar ya que la

Tubo Sustancia Abs(590 nm) Mg proteína 1 Tris pH 7 1.488 0.7312 2 Glicerol 1% 1.526 0.7539 3 Detergente 1% 0 0 4 Dodecil sulfato de

sodio 1% 0.857 0.3536

5 Ácido tricloroacetico 5%

1.549 0.7647

6 Fenol 1.576 0.7839 7 Mercatoeptanol 1.557 0.7725 8 Tris pH 10 1.506 0.7420 9 Urea 0 0

10 (NH4)2SO4 0 0


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reacción tarda solo 5 minutos en terminar y esta misma tiene 1 hora promedio de “vida” estable Conclusión Se demostró la sensibilidad ya mencionada del método, asi mismo que cada error cometido nos alejo más de nuestro resultado optimo, perdiendo fiabilidad en los resultados. Y donde las interferencias demostraron que la robustez de este método se ve mermada, por estos agentes químicos. Referencias

! Bradford, M. M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantiation of Microgram Quantities of protein utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. P.p. 9-10

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