DEFICIENCIA DE ADHESION LEUCOCITARIA BOVINA (BLAD) Trabajo presentado por Manuel Felez en la asignatura de Biotecnologa aplicada a la patologa molecular Profesora coordinadora : Pilar Zaragoza Fernndez ndice:Descubrimiento e importancia de la enfermedad...............2 Sntomas y lesiones............................................................2 Base gentico-fisiolgica de la enfermedad.......................3 Diagnstico de la enfermedad............................................7 Tratamiento de la enfermedad..........................................10 Bibliografa.......................................................................10

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B.L.A.D.Descubrimiento e importancia de la enfermedadLa deficiencia de adhesin leucocitaria bovina, ms conocida como BLAD (bovine leuckocyte adhesion deficiency) es una granulocitopata bovina que fue descrita por primera vez en una vaquilla Holstein Friesian por Hagemoser et al. (1983) en EEUU. Esta patologa se caracteriz por una susceptibilidad aumentada a la accin de agentes infecciosos durante los dos aos de vida del animal. Estos autores documentaron en el animal estudiado una funcin alterada de los neutrfilos. Pese a una alta neutrofilia era incapaz de iniciar una respuesta inflamatoria. Posteriormente Nagahata et al. (1987) describieron en Japn una enfermedad similar, caracterizada por un sndrome granulocitoptico, que afect a terneros y vaquillas Holstein Friesian descendientes de ganado proveniente de EE.UU. El BLAD es una grave enfermedad desde el punto de vista econmico. Esta enfermedad gentica ha llegado a causar por s sola tan grandes prdidas econmicas, que la declaracin de los heterocigotos destinados a la reproduccin es de obligado cumplimiento. Afecta fundamentalmente a la raza Holstein Friesian, la raza lechera ms productiva a nivel mundial. Tambin se han descrito enfermedades similares en otras especies. En humanos se llama LAD (deficiencia de adhesin leucocitaria), y el CLAD observado en los perros de la raza Setter irlands tambin presentan sntomas muy parecidos.

Sntomas y lesionesLos sntomas de esta enfermedad no se manifiestan hasta el sptimo da despus del nacimiento. Hasta entonces, los terneros pueden parecer totalmente sanos, pero tras la primera semana de vida, comienzan los siguientes sntomas y lesiones: - Anorexia, caquexia y retrasos en el crecimiento - Infecciones bacterianas continuas y fiebre elevada - Dermatitis, lceras de decbito y alopecias - Neutrofilia progresiva y muy temprana en el curso de la enfermedad - Neumona crnica - Hipertrofia de los ganglios linfticos superficiales - lceras e inflamaciones granulomatosas de las membranas mucosas orales y gingivitis - Diarrea crnica recurrente - Muerte alrededor de las siete semanas, aunque en algunos casos pueden sobrevivir durante meses Tras la muerte, en la necropsia a nivel macroscpico se puede observar lo siguiente: - Adenitis y necrosis de ganglios linfticos en la mayora de las vsceras, particularmente en el mesenterio - Pielonefritis granulomatosa - Serositis en rumen

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Mucosa necrosada en leon, con hiperplasia de folculos linfoides, e infiltracin de clulas plasmticas, linfocitos y macrfagos Edema en las reas paracorticales del encfalo Congestin esplnica y calcificaciones en el estroma y vasos esplnicos

Y profundizando un poco ms, a nivel microscpico, hallaramos: - Ausencia de neutrfilos en la lmina propia de tejidos inflamados - Macrfagos con estructuras citoplsmicas con restos bacterianos - Hiperplasia mieloide granuloctica - En los vasos sanguneos del hgado, rin, corazn, pulmn, glndulas salivares, abomaso y encfalo aparece una marcada leucocitosis neutroflica - Marcada retencin neutroflica en el bazo

Base gentico-fisiolgica de la enfermedadPara comprender un poco el mecanismo de esta enfermedad, deberemos recordar algunos mecanismos fisiolgicos vistos en otras asignaturas. Cuando un tejido del organismo de un vertebrado sufre alguna infeccin o lesin, se produce una inflamacin para combatir el agente causal del dao, si lo hubiese, y para reparar el tejido afectado. Por un lado, se produce una vasodilatacin, con aumento de la permeabilidad capilar, lo que supone que entre al tejido fluido rico en complemento, inmunoglobulinas, y otras protenas sricas. Tambin se origina una coagulacin sangunea local: las clulas endoteliales son inducidas a expresar molculas que desencadenan la cascada enzimtica de coagulacin sangunea, de modo que los capilares quedan ocluidos. Esto es importante como mecanismo para evitar que el microorganismo entre a circulacin y se disemine a todo el cuerpo. Mientras tanto, el fluido que se ha vertido al espacio tisular desde el plasma transporta al patgeno, bien solo o englobado por clulas fagocticas y presentadoras de antgeno, por la linfa hasta los ganglios linfticos regionales, donde se va a iniciar la respuesta inmune especfica. Por otro lado, el endotelio produce molculas de adhesin celular. Ello hace que aumente la capacidad de los leucocitos polimorfonucleados (fundamentalmente neutrfilos) y de los monocitos a adherirse a dicho endotelio, lo que les llevar a la extravasacin (paso al tejido inflamado). Una vez fuera del vaso, dichas clulas fagocticas migran bajo el estmulo de las citoquinas quimioatrayentes, hasta que llegan al foco de la infeccin. La extravasacin de los leucocitos ocurre en cuatro fases: - Fase de rodamiento: los leucocitos primero interactan de modo dbil con las clulas endoteliales (van "rodando" de una clula a otra). Esta primera interaccin se debe a contactos entre carbohidratos de glucoprotenas del leucocito (como la s-LeX) y la E-selectina de las clulas endoteliales, inducida por el TNF-.

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Adhesin ms fuerte, debida ahora a interacciones entre las molculas de ICAM-1 tambin inducidas por el TNF-a en el endotelio y molculas de integrinas del leucocito (como la LFA1). Lo interesante aqu es resaltar que normalmente la interaccin entre ICAM-1 y LFA-1 es dbil, pero que la IL-8 secretada por macrfagos tisulares cercanos al endotelio induce un cambio conformacional en la LFA-1 del fagocito circulante que aumenta enormemente su afinidad hacia la ICAM-1. Diapdesis: el fagocito pasa entre dos clulas endoteliales, y entra al tejido. Migracin del leucocito fagoctico hasta el lugar de infeccin bajo el influjo de citoquinas quimioatrayentes.

Aunque aparentemente sencillo, ste es un proceso complejo cuya eficacia depende de numerosos factores. En primer lugar, debe haber leucocitos. Los leucocitos tienen que ser llamados mediante unas seales qumicas que previamente han tenido que producir otras clulas, y stos han de ser capaces de detectar dicho estmulo. Despus, se tienen que adherir a la pared del vaso y realizar la diapdesis. Una vez fuera del vaso, deben migrar al lugar donde se encuentra la infeccin y ser capaces de combatirla. Un fallo en cualquiera de estos pasos y el proceso de la inflamacin se podra ver drsticamente alterado. En el caso de esta enfermedad, el paso que falla es la adhesin al endotelio vascular. Las responsables de las adhesiones entre las clulas son unas glicoprotenas llamadas molculas de adhesin celular. Estas molculas se dividen en 5 familias: cadherinas, super gen inmunoglobulinas, selectinas, proteoglicano, e integrinas. Un defecto en una protena de esta ltima familia es el causante del BLAD.

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Las integrinas son unas protenas heterodimricas transmembrana formadas por dos cadenas polipeptdicas unidas no covalentemente. Se unen a diferentes ligandos y transmiten seales a travs del citoesqueleto. Estas molculas son receptoras de matriz y son expresadas en una variedad de clulas hematopoyticas y no hematopoyticas. Su expresin se regula por la diferenciacin celular y por el estmulo inflamatorio, y stas modulan funciones celulares especficas: - Crecimiento - Maduracin - Migracin - Proliferacin - Citotoxicidad - Fagocitosis De toda la familia de las integrinas, el grupo de molculas cuya alteracin originaran el BLAD son las -2-integrinas (Leu-CAM o CD11/CD18), que slo se expresan en leucocitos. stas intervienen en: - Funciones leucocitarias - Quimiotaxis de fagocitos - Adhesin de leucocitos a sustratos - Fagocitosis de microorganismos opsonizados - Adhesin leucocitaria al endotelio activado Cada una de estas molculas contiene dos subunidades, y , asociadas no covalentemente, con una estructura 11. Todas estas glicoprotenas comparten una subunidad idntica (CD18) y se distinguen inmunolgicamente por su subunidad , designada CD11a, CD11b y CD11c, para LFA-1, Mac-1 y p150.95, respectivamente. El BLAD se debe a un defecto de la expresin de la protena CD18, por una secuencia anormal del gen, que origina la falta de la subunidad en una integrina 2 de las membranas de los neutrfilos aislados de animales enfermos. Al realizar la secuenciacin de la protena CD18 se observa que en el alelo raro, aparecen dos puntos de mutacin, una silenciosa y una transicin que origina la sustitucin de una adenina por una guanina. Los textos no coinciden en el lugar exacto del cambio de base en el que sucede dicha mutacin, aunque todos coinciden que es en el aminocido 128 de la secuencia de la protena donde repercute la mutacin, originando el cambio de una glicina por el cido asprtico. Se trata de una mutacin autosmica recesiva (no he encontrado el cromosoma donde sucede) que cumple perfectamente las leyes mendelianas al tener una penetrancia y expresividad completas. As que si cruzsemos un animal sano con otro portador, la mitad de la descendencia sera sana y la otra mitad portadora, por lo que se podra controlar la enfermedad dirigiendo bien los cruces entre portadores. Sin embargo, si llegasen a cruzarse dos portadores, el 25% de la descendencia manifestara la enfermedad y morira. El hecho de intentar controlar los cruces siempre es un riesgo de que una lnea reproductora pueda originar casi la mitad de los portadores de una cabaa, como sucedi en Estados Unidos a mediados de los noventa con la descendencia de C.M Ivanhoe Bell.

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Diagnstico de la enfermedadPara realizar el diagnstico de enfermos y portadores, la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988) acoplada a la digestin con enzimas de restriccin (RFLP) ha demostrado que identifica inequvocamente el genotipo del ganado en un locus determinado (Kehrli et al., 1990; Shuster et al., 1992; Tammen et al., 1996; Felmer y Butendieck, 1996). En primer lugar, se deber proceder a la toma de muestras. Podremos optar entre coger una muestra de sangre, de semen, o de leche, dependiendo del estado del animal. Si tomsemos muestra de sangre, la obtendramos de la vena coccgea. La sangre debera ser entera, por lo que tendramos que aadir EDTA como coagulante, ya que el citrato sdico o la heparina ejercen un efecto indeseable para el ADN a la hora de amplificarlo. El semen lo obtendramos directamente de alguna de las pajuelas de inseminacin que se hubiesen preparado del animal. Tambin se podra tomar muestra de leche de una vaca en lactacin. En este caso deberamos coger dos muestras: una para la posterior extraccin de ADN, utilizando bicromato potsico como conservante, y otra muestra para enviarla al laboratorio de referencia, conservada con bronopol, para conocer los distintos parmetros de composicin de la leche de cada individuo, especialmente del nmero de clulas somticas. Una vez obtenidas las muestras, extraeremos el ADN de ellas. A partir de una muestra de sangre, tendremos dos mtodos de extraccin: el mtodo standard y el mtodo rpido. El mtodo standard se basa en seguir una serie de centrifugaciones y agitaciones que aslen los leucocitos y daen su membrana para posteriormente 7

extraer su ADN con lavados de alcohol etlico y resuspendiendo en tampn T.E. En el mtodo rpido, diseado por OSTA y cols., (1994), se realizan sucesivos lavados con tampn N.E. con centrifugaciones tras cada lavado. Cuando tenemos los leucocitos disgregados, digerimos el precipitado con el alcohol y lo conservamos a muy bajas temperaturas. Cuando lo descongelemos para utilizar ese ADN, deberemos hacerlo a temperaturas prximas a 0C. Si la muestra la tomamos de semen, existen tres mtodos de extraccin de ADN: mtodo standard, mtodo rpido A y mtodo rpido B. El mtodo standard es muy similar al citado anteriormente para la sangre, con la particularidad de que trabajaremos con tubos que tengan las paredes siliconadas para que no perdamos los espermatozoides en el proceso. En el mtodo rpido A, la muestra se lava y centrfuga con NaCl y despus se resuspende en una solucin de NaOH y DITHIOTREITOL para luego someterla a 100C durante 10 minutos. Una vez hecho esto, se resuspende en tampn TrisClH para neutralizar la muestra, y se recoge el sobrenadante. El mtodo rpido B, como el mtodo rpido de la muestra de sangre, tambin estara destinado para conservar en congelacin. En el caso de que la muestra sea de leche, slo existe el mtodo rpido. En este caso, se comienza centrifugando la muestra para eliminar la grasa y el suero y quedarnos con las clulas. Luego se efectan los lavados con el tampn, se resuspende en una solucin de digestin a temperaturas muy bajas y una vez digerida se sube la temperatura a 99C para inactivar la proteinasa K. Finalmente, se vuelve a congelar a temperaturas bajo cero para su conservacin. Una vez extrado el ADN, se amplifica in vitro mediante PCR. Para ello utilizaremos agua pura, tampn de Taq polimerasa, Cl2Mg, los dNTPs, la Taq DNA polimerasa, y los cebadores. En este caso, las secuencias de los cebadores, en direccin 5-3, sern las siguientes: 5 TCCGGAGGGCCAAGGGCTA 3 5 GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG 3 Tampoco olvidaremos aadir unas gotas de aceite mineral para evitar la evaporacin de la muestra. El proceso se iniciar con una temperatura de unos 94C para la desnaturalizacin del ADN, y luego cada ciclo estar formado por tres fases: desnaturalizacin (94C 30 segundos), hibridacin (56C 60 segundos) y extensin (72C 30 segundos). Una vez realizados los ciclos deseados, se reducir la temperatura a 4C hasta que se extraigan los tubos del termociclador, para conservar el material amplificado. Finalmente, realizaremos la digestin del producto realizado y la visualizacin de los resultados. En este caso, para diferenciar las variantes allicas, se utilizan dos enzimas de restriccin: Taq I y Hae III. Taq I reconoce en el alelo normal la secuencia que contiene la base que puede mutar y slo cortar cuando el alelo no est mutado. Por ello, en el homocigoto normal aparecern 2 bandas en la electroforesis posterior, 3 aparecern en el heterocigoto, y una en el homocigoto mutado. En el caso de Hae III, tiene 2 puntos de unin. Uno es la secuencia en la que se produce la mutacin y, a diferencia de Taq I, cortar cuando tenga lugar el cambio de base. En la otra secuencia reconocida por Hae III (que es la misma secuencia que la de la mutacin, slo que en otro lado del gen), como es una zona estable, cortar prcticamente siempre por ah. De

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este modo, en el homocigoto normal aparecern 2 bandas, en el heterocigoto aparecern 4 y en el homocigoto mutante aparecern 3.

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Tratamiento de la enfermedadLa enfermedad en s, a nivel individual no se puede curar; sin embargo, s se podra prevenir en la poblacin, haciendo una seleccin negativa contra el alelo defectuoso. Si un individuo destinado a la reproduccin es portador de BLAD, el propietario est obligado a declararlo. Aun as, no es tan fcil erradicar dicha enfermedad, puesto que los individuos que la portan han sido muy seleccionados y son muy productivos, por lo que mientras quepa la posibilidad de intentar dirigir los cruces para no tener homocigotos enfermos, los propietarios anteponen la rentabilidad de su ganado.

Bibliografa: FELMER D., Ricardo, BUTENDIECK B., Norberto, BUTENDIECK B., Brbara et al. DETECCIN DE UN DEFECTO GENTICO EN BOVINOS MEDIANTE UNA PRUEBA DE ADN. Agric. Tc. [online]. ene. 2001, vol.61, no.1 [citado 10 Mayo 2007], p.42-50. Disponible en la World Wide Web: . ISSN 0365-2807. Arch. Zootec. 49: 505-508. 2000 OBTENCIN DE DNA PARA EL ESTUDIO DE BLAD EN TOROS DE ARGENTINA Y ESPAA Schifferli, C.2, M. Villaroel1, M.V. Arruga1, Molculas Adhesin. T.M. MsC Juan Luis Castillo N. Departamento de Especialidades Mdicas Facultad de Medicina Universidad de Concepcin http://www.inflamacion.co.cl/pdf/adhesion.pdf Curso de Inmunologa General Enrique Inez Pareja Departamento de Microbiologa Universidad de Granada http://66.102.9.104/search?q=cache:jNNLcW6zttkJ:www.ugr.es/~eianez/inmuno/cap_1 7.htm+fases+de+la+extravasaci%C3%B3n+de+neutr%C3%B3filos+diap%C3%A9desi s&hl=es&ct=clnk&cd=1&gl=es DETECCIN DE PORTADORES DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS MEDIANTE BIOTECNOLOGA GENTICA. APLICACIN A UN EJEMPLO CONCRETO: BLAD (DEFICIENCIA DE ADHESIN LEUCOCITARIA BOVINA) Memoria presentada por D. Francisco Jos Vzquez Bringas para optar al grado de Licenciado en Veterinaria. Zaragoza. 1994

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