Electroforesis en gel de agarosa

Bioquímica Experimental

2020-1

Q.A. Moisés Méndez Ramírez

Principio

Las moléculas (carga -) son separadas de acuerdo al tamaño cuando se someten a un campo eléctrico.

Estas migran a través de la matriz del gel al ánodo (carga +).

Cátodo

Ánodo

CARGA

PO4-

La electroforesis en gel de agarosa es una técnica que nos permite separar moléculas de ácidos nucleicos (DNA y RNA).

Electroforesis de campo pulsadoEsta técnica nos permite separar moléculas grandes de DNA (cromosomas, i.e >25 kb.), mediante la aplicación de pulsos eléctricos en posición ortogonal.

Las moléculas de reorientan cada que cambia la dirección del campo, provocando una migración en zig-zag.

Cromosomas de levadura

Procedimiento experimental

Video “DNA electrophoresis sample loading”

https://www.youtube.com/watch?v=tTj8p05jAFM

Elaboración del gel

Preparación de cámara de electroforesis

Preparación y adición de

muestra

Corrimiento electroforético

Visualización

Preparación del gel Agarosa es un polímero aislado de algas del genero Gellidium y Gracilaria que consiste en subunidades repetidas de L- y D-galactosa

Los geles de agarosa permiten separar fragmentos de entre 100 bp y 25 kb dependiendo de su concentración.

La agarosa funde de <90 a ≤50 °C dependiendo del tipo.Puede fundirse en calentamiento directo, baño o microondas.

Preparación de muestras

Para adicionar la muestra se usa solución de carga.

▪Colorantes azul de bromocresol y xylen cyanol.Monitorean el progreso de la electroforesis.

▪Glicerol (5-10%)Aumenta la densidad y permite que se mantenga en el pozo.

▪EDTA. Agente desnaturalizante que detiene reacciones enzimáticas. (Opcional).

La concentración de la muestra va de 1-10 ng de DNA por banda y no debe exceder 10 µg ya que se satura la señal.

La muestra se adiciona una vez colocado el gel en la cámara con el buffer de corrida

Preparación de la cámara y corrimiento

TIPOS DE BUFFER DE CORRIDA:

▪TAE (Tris-acetato EDTA)

Buena resolución. Bajo voltaje

▪TBE (Tris-borato EDTA)Resolución fragmentos < 3kb

▪SB (Borato de sodio)Baja conductividad. Alto voltaje

Una alta concentración de sales y una corriente elevada, producirán resistencia y calentarán el medio, afectando la resolución de las bandas en el gel.

Para correr la muestra se coloca un buffer de corrida a una concentración 1X en la cámara. Contiene sales que proporcionan fuerza iónica, facilitando la migración de las cargas.

Variables en la metodologíaHay algunas variables que pueden modificar la movilidad del DNA en los geles durante la electroforesis

▪Composición del gel de agarosa: 0.5-2.0 % agarosa

▪Buffer de corrida: TAE y TBE 1X

▪Campo eléctrico: 0.5-10 V/cm

Visualización: tinción del gelTinción con Bromuro de etidio.

Agente fluorescente que absorbe en la región de UV (300-360 nm) y puede intercalarse entre las bases del DNA.

Detección límite: 0.5-5.0 ng DNA/banda.

Usualmente se añade al gel a una concentración 0.5 µg/mL

(Mutagénico)

Visualización con otros colorantesExisten otros marcadores que permiten observar el DNA que varían en la sensibilidad y pueden ser más seguros ya que no intercalan en el DNA.

(Haines, A. et. Al. Electrophoresis 2015, 36, 941-944.)

Cosas que pueden salir mal

Voltaje inadecuado Insuficiente concentración de Iones

• Picar el pozo al cargar la muestra.

• Contaminar la muestra.• No colocar marcador.• Mala calidad de la muestra• Elevado tiempo de corrida.

(Se te fue tu muestra del gel).• Concentración errónea de

Buffers de corrida. • Exceso en la concentración

DNA.

Muestra degradada

Aplicación. Expresión cualitativa de un gen

Tres especies de TrichodermaT. atrovirideT. virens T. asperellum

Control

T. atroviride

T. asperellum

T. virens

Modificación de la arquitectura de la raíz

en maíz

¿Qué pasa en la parte aérea?Medición de expresión de transportadores SWEETs

Obtención RNA

C. Control, Ta T. asperellum, Tv T. virens y Tat T. atroviride.

RT-PCR de SWEETsde hoja

Producción cDNA

Análisis de expresión