UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE BIOLOGÍA MARINA

TESIS

Efecto in vitro del extracto etanólico de Macrocystis pyrifera sobre el

desarrollo de microepífitos.

QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO DE

BIÓLOGO MARINO

PRESENTA:

Lucero Gómez Alcalá

DIRECTOR:

Dr. Iván Murillo Álvarez

LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, DICIEMBRE DEL 2012

Agradecimientos

A mi comité revisor, Iván Murillo, Mauricio Muñoz, Francisco Nieto, Juan Manuel López y

Rafael Riosmena agradezco la oportunidad que me dieron de trabajar con ustedes, el tiempo que

dedicaron, el basto conocimiento que me compartieron, la cordialidad y su amistad. Aprovecho

también para agradecer por los trabajos de Lorena Durán y Gaël Quesseveur, los cuales fueron la

base primordial para elaborar este trabajo. Del mismo modo, agradezco a todo aquel que

compartió su conocimiento, experiencia, apoyo y amistad para terminar este proyecto que es el

inicio de algo mayor.

GRACIAS

Índice

Lista de Figuras…………………………………………………………………………………………… II

Lista de Tablas………………………………………………………………………………………........ II

Glosario…………………………………………………………………………………………………….. III

Resumen…………………………………………………………………………………………………… VII

1. Introducción…..………………………………………………………………………………………… 1

2. Antecedentes…..………………………………………………………………………………………. 5

3. Distribución y descripción de Macrocystis pyrifera…………..…………………………………...... 10

4. Justificación…..………………………………………………………………………………………… 14

5. Objetivo……..…………………………………………………………………………………………... 15

6. Metodología...………………………………………………………………………………………….. 15

6.1 Zona de estudio y recolecta de Macrocystis pyrifera…………………………………………….. 15

6.2 Obtención del extracto etanólico……………………………………………………………………. 16

6.3 Fraccionamiento inicial del extracto etanólico…………………………………………………….. 17

6.4 Evaluación de la actividad antibacteriana y anti-incrustante..…………………………………… 18

6.4.1 Ensayo de difusión en agar con discos………………………………………………………….. 18

6.4.2 Ensayo de microdilución en placa……………………………………………………………….. 20

6.5 Fraccionamiento de 06-019 41CC2F3……………………………………………………………... 22

6.6 Identificación estructural del compuesto activo………………………………………………….... 23

7. Resultados…..………………………………………………………………………………………..... 25

7.1 Actividad biológica………………………………………………………………………………….... 25

7.2 Caracterización estructural………………………………………………………………………….. 30

8. Discusión…………..…………………………………………………………………………………… 31

9. Conclusiones…………………………………………………………………………………………… 37

10. Literatura citada……………………………………………………………………………………… 38

11. Anexos………………………………………………………………………………………………… 49

II

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Macrocystis pyrifera. Al norte, se distribuye sobre las costas del Pacífico de

Norteamérica, México, EU y Alaska. Al sur tiene una distribución circunsubantártica

desde Perú hasta Cabo de Hornos en América, Sudáfrica, Australia y Nueva Zelanda……

11

Figura 2. Punta Eugenia, BCS. Sitio de colecta de M. pyrifera (mapa de Durán-Riveron,

2009).……..…………………………………………………………………………………………..

16

Figura 3. Fraccionamiento guiado por bioensayo de la fracción 06-019 41CC2 F3

derivada de la fase orgánica del extracto de M. pyrifera……………………………………….

24

Figura 4. Espectro infrarrojo de la fracción 06-019 41CC3F2. Se observan cuatro señales

principales en la zona general del espectro y pequeñas señales en la zona de la huella

dactilar, entre 600m-1

y 1400m-1

…………………...................................................................

31

LISTA DE TABLAS

Tabla I. Actividad anti-incrustante de M. pyrifera, método de dilución en

microplacas…………………………………………………………………………………

27

Tabla II. Efecto de M. pyrifera sobre el crecimiento microalgal, método de

microdilución en placa…………………………………………………………………….

28

Tabla III. Actividad antibacteriana de M. pyrifera, método de difusión en agar……. 29

III

GLOSARIO

Ácidos grasos: son biomoléculas de naturaleza lipídica que consisten en un grupo

carboxilo (polar) unido a una cadena hidrocarbonada lineal con número par de átomos

de carbono. La mayoría de los ácidos grasos encontrados en la naturaleza contienen

entre 12-24 átomos de carbono. La principal función de los ácidos grasos es como

reserva de energía.

Agar: es un polisacárido compuesto de agarosa (70%) y agaropectina, que se extrae

de algunas algas rojas. Los geles de agar son transparentes, duros y quebradizos,

sirven como coloides y espesantes, y son un valioso medio de cultivo utilizado en

bacteriología.

Agar Mueller Hinton: es un medio utilizado para realizar las pruebas de

susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aeróbicos. El Agar Mueller Hinton

cumple con los requerimientos de la Organización Mundial de la Salud y está

especificado en la FDA (Food and Drug Administration). Este medio es el

seleccionado por la NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards)

para realizar las pruebas de susceptibilidad, por su alta reproducibilidad, su bajo

contenido de substancias inhibidoras y el crecimiento satisfactorio que presentan la

mayoría de los patógenos.

Anti-incrustante: se refiere a las sustancias que tienen actividad contra organismos

involucrados en el epifitismo.

Biocidas: definidos por la legislación Europea actual, como: “las sustancias activas y

preparados que contengan una o más sustancias activas, presentados en la forma en

que son suministrados al usuario, destinados a destruir, contrarrestar, neutralizar,

IV

impedir la acción o ejercer un control de otro tipo sobre cualquier organismo nocivo

por medios químicos o biológicos.”

Biofouling: deterioro o degradación ocasionada por organismos vivos (bacterias,

algas, protozoos y crustáceos) sobre superficies tales como tuberías, tanques y

cascos de buques que se encuentran sumergidas en el agua, lo que resulta en

corrosión, obstrucción, contaminación o disminución en la eficiencia de piezas

móviles.

Bosques de kelps: son ecosistemas marinos, uno de los hábitat más productivos del

mar que ofrecen protección y alimento a una gran cantidad de organismos. Destaca la

alta tasa de crecimiento del género Macrocystis y la especie Nereocystis luetkeana.

Cromatografía: es el método físico de separación de los componentes de una

muestra. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva,

donde los componentes se distribuyen entre dos fases, una estacionaria y otra móvil.

Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase

estacionaria, lo que hace que atraviesen esta fase a distintas velocidades y así se

separan los componentes. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido y

puede estar empaquetada en una columna, extendida en una capa o distribuida como

una película.

Cromatografía en columna: donde la fase estacionaria se sitúa dentro de una

columna, y según el fluido empleado, puede ser cromatografía de líquidos o gases.

Cromatografía plana: donde la fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o

sobre papel (en papel o capa fina).

V

Epifitismo: forma de vida en donde un organismo vegetal, el epífito, utiliza como

sustrato para vivir a otro organismo vegetal. Este término se deriva de epi (sobre) y fito

(vegetal).

Epibiosis: es la relación, permanente o no, que se establece entre dos especies

diferentes en la que una sirve de sustrato de fijación para la otra, el epibionte.

También se aplica el concepto como ensuciamiento biológico, o bien, asentamiento de

algún organismo en cualquier estructura sumergida en el agua.

Espectrometría de infrarrojo: La espectrometría de infrarrojos (espectroscopia IV) es

un tipo de espectrometría de absorción que utiliza la región infrarroja del espectro

electromagnético.

Grupo funcional: Conjunto de átomos, enlazados de una determinada forma, que

presentan una estructura y propiedades físico-químicas determinadas que

caracterizan a los compuestos orgánicos que los contienen.

Metabolismo: es el conjunto de reacciones químicas que ocurren en el interior de la

célula.

Metabolismo primario: se refiere al conjunto de procesos metabólicos que

desempeñan una función esencial en el vegetal, tal como la fotosíntesis, respiración y

el transporte de solutos, los productos de este metabolismo (metabolitos primarios)

tienen una distribución universal en todas las plantas, como aminoácidos, nucleótidos,

lípidos, etc.

Metabolismo secundario: no es fundamental para el crecimiento, desarrollo o

reproducción del organismo, y sus productos, metabolitos secundarios, no poseen

una distribución universal, sin embargo se cree que la función principal es de

incrementar la probabilidad de la sobrevivencia de los organismos.

VI

Método de difusión en agar con disco: método generalmente utilizado y aprobado

por el NCCLS para efectuar las pruebas de sensibilidad.

Principios activos: es la sustancia responsable de la actividad biológica, ya sean

drogas, antibacterianos, etc. y regularmente derivan de recursos naturales para

emplearse en los fármacos, sin embargo existen principios activos sintéticos.

Productos naturales: compuestos producidos por los organismos vivos, son los

metabolitos secundarios, y se ha observado que tienen un valor terapéutico causando

algún efecto sobre los organismos vivos, actuando como antibióticos, antitumorales,

antivirales, insecticidas, sustancias citotóxicas y neurotóxicas, además de anti

incrustantes.

Protocolo de aislamiento guiado por bioensayo: metodología que consiste en el

fraccionamiento de una mezcla para aislar los principios activos, a partir de ensayos

de actividad biológica previos a cada fraccionamiento; de este modo se eligen

únicamente fracciones activas y/o las más activas.

Sensidiscos: son discos de papel filtro que se emplean para los ensayos de actividad

biológica.

Sílica: el gel de sílice es una forma granular y porosa de dióxido de silicio fabricado

sintéticamente a partir de silicato sódico. En química se usa en la cromatografía como

la fase estacionaria.

VII

Resumen

La epibiosis, o bien, el asentamiento de los organismos ya sea sobre otros organismos

o sobre estructuras creadas por el hombre, suelen tener efectos negativos, de modo

que en la acuacultura y en la transportación naval principalmente, se han valido del

conocimiento de los productos naturales que se obtienen a partir del metabolismo

secundario de algunas especies, principalmente marinos, para elaborar revestimientos

que eviten o disminuyan el encrustamiento de organismos epibiontes. Con el objetivo

de identificar metabolitos con actividad anti-incrustante en el alga parda Macrocystis

pyrifera se eligió la fracción de baja polaridad 06-019 41CC2F3 resultado del

fraccionamiento que realizó Durán-Riverol, la cual presentó actividad contra varias

cepas bacterianas. Para continuar con el fraccionamiento guiado por bioensayo, se

realizó la técnica de cromatografía en placas TLC y se estableció el sistema de

fraccionamiento para realizar la técnica de cromatografía en columna sobre sílica. En

total se realizaron dos fraccionamientos, se obtuvieron ocho fracciones y se determinó

que M. pyrifera puede inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus y Vibrio

parahaemolyticus, bacterias que están relacionadas en el microepifitismo. Mediante

espectroscopia de infrarrojo se analizó la fracción más activa y se determinó que está

compuesta por ácidos grasos.

Palabras clave: Ácidos grasos, Macrocystis pyrifera, actividad anti-incrustante,

productos naturales, cromatografía.

1

1. Introducción

El epifitismo se define como una forma de vida que ocurre cuando un

organismo, el epífito, utiliza como sustrato para vivir a otro organismo vegetal

(Borowitzka & Lethbridge, 1989). Se sabe que el epífito busca recursos tales como

espacio, refugio y alimento en los hospederos; la mayoría de las publicaciones

sugieren que estos organismos pueden tener una marcada y negativa influencia

en el alga hospedera al interferir en su susceptibilidad, en la esporulación o en la

captación de luz o nutrientes (Dixon et al., 1981; Scheibling et al., 1999). Esta

información ha hecho suponer que los epífitos tienen un efecto negativo en el

crecimiento, sobrevivencia y fecundidad del alga colonizada, cuando en realidad

no existen tales evidencias (Hepburn & Hurd, 2005). Por el contrario, se ha

demostrado una posible relación de mutuo beneficio, donde las algas proveen

protección y alimento (De Burg & Frankboner, 1978); al mismo tiempo que

aprovechan el amonio y dióxido de carbono que producen sus epífitos cuando la

concentración de estas moléculas en el ambiente se encuentra limitada (Hurd et

al., 1994; Taylor & Ress, 1988).

El fenómeno de epifitismo, sin embargo, no se restringe a los vegetales

marinos; cualquier otro organismo o superficie sólida sumergida en el mar es

susceptible a la epibiosis, o bien, al asentamiento de otras especies. Para que

cualquier comunidad biótica de bacterias, algas o invertebrados se asiente sobre

una superficie, existen varias etapas que implican en su fase inicial, un micro-

epifitismo, es decir una primera colonización por microorganismos, ya sean

2

bacterias o microalgas. La primera colonización comprende cuatro pasos: primero

los biopolímeros que están en el agua se adsorben a la superficie, luego, si hay

atracción química con alguna bacteria se da una adsorción reversible donde

únicamente hay un asentamiento en la superficie, casi inmediatamente la

adsorción es irreversible cuando la bacteria se une a la superficie con estructuras

celulares y finaliza con la formación de colonias bacterianas. Con el crecimiento

bacteriano se produce un mucílago o sustancia exopolimérica (EPS) que les

permite a los nuevos epibiontes establecerse sobre un sustrato más adecuado, y

ocurre entonces una sucesión ecológica (Bakus et al., 1986; Henschell & Cook,

1990).

Hay ciertas especies de bacterias, cuyo asentamiento tiene efectos negativos

sobre el organismo hospedero, de modo que muchos organismos en el ambiente

marino han evolucionado a mecanismos de defensa contra el asentamiento y

crecimiento de estas especies, lo que en farmacognosia se conoce como

capacidad anti-incrustante (Scardino & de Nys, 2010). La gran mayoría de

organismos sésiles, tales como esponjas, cnidarios y algas, que no presentan

formas motoras de defensa, se ven obligadas a desarrollar adaptaciones

metabólicas que les permitan sintetizar naturalmente compuestos de defensa que

les proporcionan ventajas en el ambiente marino. A la elaboración de estos

compuestos se le denomina metabolismo secundario, y a lo que resulta de él, se

conoce como metabolitos secundarios o bien productos naturales. Se define como

metabolismo secundario porque a diferencia del metabolismo primario, no es un

3

proceso fundamental para el crecimiento o reproducción del organismo, sin

embargo, los compuestos resultantes tienen un papel ecológico importante en

contra de la herbivoría, ataque de patógenos o depredadores, competencia y/o en

la protección en relación con el estrés biótico, como cambios térmicos o lumínicos

y deficiencias nutricionales (Darías-Jerez, 1998; Márquez et al., 2003; Maschek &

Baker, 2008). Por eso la ocurrencia y concentración de los metabolitos

secundarios depende de condiciones externas como el modo de vida y el hábitat;

por lo que los organismos que habiten ambientes menos estables y altamente

competitivos tienden a producir una mayor cantidad de defensas químicas (Hay &

Fenical, 1996). Por ejemplo, Bakus & Kawaguachi (1984) demostraron que los

organismos marinos tropicales tienen un potencial mayor como anti-incrustantes

que el de especies de otras latitudes. Por otra parte, Nakatsu et al. (1983), al igual

que McCaffrey & Endean (1985) observaron que organismos con superficies libres

de epibiontes contienen una mayor cantidad de compuestos derivados del

metabolismo secundario que organismos epifitados, lo que comprueba el papel

ecológico de los metabolitos secundarios.

Es por la importancia ecológica de estos organismos que se obtienen

productos naturales que no solamente son anti-epífitos o anti-incrustantes, sino

que también son valiosos para la elaboración de antibióticos, antitumorales,

antivirales, insecticidas, sustancias citotóxicas y neurotóxicas (Donia & Hamann,

2003). En los últimos cuarenta años, el auge en las investigaciones sobre la

química y actividad biológica se ha enfocado principalmente en los organismos

4

marinos, pues se ha determinado que estos contienen una gran cantidad y

variedad de metabolitos secundarios con estructuras químicas diferentes a las

encontradas en organismos terrestres y además con diferentes actividades

biológicas (Blunt et al., 2009; Faulkner, 2000); lo que probablemente se debe a las

condiciones físicas y químicas del mar.

Un recurso marino de gran relevancia son las algas, quienes han tenido una

participación muy importante en la química de productos naturales. Hoy en día se

conocen casi 3,000 compuestos derivados del metabolismo secundario de algas

marinas, que representa un 20% de los productos naturales marinos (Amsler,

2009), en donde se incluye una variedad de polisacáridos, fenoles bromados,

esteroles, polifenoles y péptidos que tienen aplicaciones alimenticias e

industriales, como alginatos, agar y carragenanos; o son de interés farmacológico

por su potencial de aplicación como moduladores en la coagulación sanguínea,

como el fucoidan; o presentan actividad anti-bacteriana, citotóxica y anti-

cancerígena (Maschek & Baker, 2008; Muñoz-Ochoa, 2010). De estos

compuestos, más de 1,100 se han extraído de las algas pardas, clase

Phaeophyceae, incluyendo terpenos, florotaninos y pequeñas acetogeninas (Blunt

et al., 2009). La mayor parte de los compuestos aislados de estas algas han sido

diterpenos lineales como el crinitol; y principalmente fenoles y meroterpenos

fenólicos derivados del floroglucinol, que son los metabolitos secundarios más

abundantes en las algas pardas, se han reportado en casi todos los órdenes y

pueden llegar a constituir hasta el 20% del peso seco del alga, además se ha

5

observado que actúan como defensa química contra la fijación de larvas de

animales marinos y bacterias (Maschek & Baker, 2008).

Dentro de las algas pardas, Macrocystis pyrifera se considera como la base

del ecosistema de los bosques de kelps cuya productividad y valor ecológico son

muy altos, ya que en estos hábitat pueden soportar hasta 270 diferentes especies.

Se sabe que tiene actividad anti-microepífita porque también experimenta una

gran variedad de condiciones ambientales que la hacen propensa al epifitismo a lo

largo de sus extensas frondas que llegan a medir hasta 50m (Zimmerman &

Kremer, 1986).

2. Antecedentes

M. pyrifera ha sido un recurso marino sumamente explotado, pues tiene

muchas aplicaciones industriales: se ha utilizado principalmente como fuente

importante para la obtención de ficocoloides, especialmente de alginatos que son

usados como agentes espesantes, gelificantes y estabilizantes; tiene una amplia

gama de aplicaciones en diversas industrias como la alimenticia, cosmética, textil,

papelera, cervecera y en medicina se emplea para obtener emulsiones,

encapsulados, pastillas e impresiones dentales (Casas-Valdéz, 2001).

Estados Unidos, México, Chile y Perú fueron los primeros en emplearla

para la obtención de alginatos; en Argentina la utilizan como alimento; y en

Australia la aprovechan en la agricultura. Mientras, otros países como Japón,

6

China, Francia o Reino Unido la importan para procesarla de distintas maneras

(Zemke-White & Ohno, 1999).

En México se empezó a cosechar esta alga desde 1958, y aunque tiene

una distribución restringida solo a la parte norte de la Península de Baja California,

que va de Isla Coronado a Isla San Martín, BC, México llegó a ser de los

principales exportadores del recurso como materia prima (Zemke-White & Ohno,

1999).

En la década de 1950’s, se determinó el primer caso de sobreexplotación

en California, EU: con una cosecha anual de aproximadamente 100 mil toneladas

en peso húmedo de M. pyrifera, se había mermado casi un 70% del recurso en

solo 50 años (North, 1987). Al dañar todo un ecosistema altamente productivo y

que además es hábitat para una amplia variedad de mamíferos, aves, peces,

invertebrados y otras algas, surge una inquietud por mantener el recurso, ya que

empezaron a haber pérdidas en otras actividades como la pesca, haciéndose

evidente que era mayor el valor económico de los organismos que crecen en los

bosques de M. pyrifera, al valor del alga cosechada.

A partir de la década de 1960´s se iniciaron varios programas de

investigación sobre M. pyrifera en California, más tarde en British Columbia, Chile

y México. En México se establece hasta 1982 el programa “Evaluación y

Aprovechamiento de M. pyrifera” por parte del Centro Interdisciplinario de Ciencias

Marinas (CICIMAR), donde se determinó la composición química de proteína, fibra

cruda, extracto etéreo, cenizas, carbohidratos e inclusive de humedad de acuerdo

7

a las condiciones ambientales, distribución y cambio estacional (Rodríguez-

Montesinos & Hernández-Carmona, 1991; Serviere-Zaragoza et al., 2002).

También se estudió la abundancia del alga en relación a la variabilidad climática,

según la temperatura superficial del agua, nivel medio del mar e índice de

surgencias. Del mismo modo, se le dio mucha importancia a los estudios

relacionados con la sobrevivencia y reclutamiento de M. pyrifera (Hernández-

Carmona et al., 2006) y el efecto que tiene sobre este proceso la disponibilidad de

nutrientes (Hernández-Carmona et al., 2001). Con el fenómeno “El Niño 1997-

1998” se evaluaron los efectos en la sobrevivencia de estadios microscópicos, en

la sobrevivencia del kelp en aguas profundas (Ladah & Zertuche, 2004), en el

reclutamiento (Ladah et al., 1999), y se abordaron técnicas de restauración del

recurso en México (Hernández-Carmona et al., 2000). Además se realizaron

investigaciones sobre el método de extracción de alginatos (Hernández-Carmona

et al., 2002), y el uso de ellos en materiales de impresión dental (Reyes-Tisnado et

al., 2004). En otros países, se enfocaron más a aspectos ecológicos (Graham et

al., 2007), se estudiaron los procesos físicos, químicos y biológicos que regulaban

la abundancia y distribución de M. pyrifera (Moreno & Sutherland, 1982; Plana et

al., 2007); mecanismos de reclutamiento del kelp (Kinlan et al., 2003) y sus

limitantes (Reed et al., 2004). Asimismo la influencia del medio ambiente (Barrales

& Lobban, 1975) y del tipo de vida multifacética (Schiel & Foster, 2006) sobre la

biología poblacional del alga así como en la estructura y organización de las

comunidades de bosques de kelp. Y en menor medida, se ha puesto interés en

8

establecer la relación de M. pyrifera con otros géneros de laminariales desde un

punto de vista evolutivo (Coyer et al, 2001).

Pero poco se había estudiado sobre el potencial biomédico de sus

metabolitos secundarios. Hasta mediados de la década de 1980´s se publicó por

primera vez la actividad biológica de un extracto de M. pyrifera (Mayer & Panick,

1984; Mayer et al., 1986), donde el extracto crudo mostró tener actividad

antitumoral, citotóxica, genotóxica y antiviral, y como se había observado actividad

en el fucoidan de otras especies de algas pardas, las investigaciones

subsecuentes se enfocaron en purificar el fucoidan, y observar si era el

responsable de la actividad antitumoral o citotóxica (Mayer et al., 1987a),

genotóxica (Larripa et al., 1987) y antiviral (Mayer et al., 1987b); además probaron

la actividad biológica del alginato de sodio y laminaran. Debido a sus resultados

negativos, concluyeron que la actividad biológica en M. pyrifera se debe a una

compleja interacción de metales y polisacáridos, por lo que no se continuó con

estudios más finos, y mucho menos con intenciones de aislar el compuesto activo,

de modo que la explotación de este recurso continuó basándose en productos

para la industria agroalimentaria, y el único interés biomédico fue en la impresión

dental y en sus propiedades espesantes.

Pero en la investigación de productos naturales es menester la constante

producción de los mismos, ya sea evaluando nuevos organismos o empleando

distintas metodologías. Por lo que M. pyrifera no deja de ser candidata para

evaluar su potencial biológico. Por el contrario, algunas evidencias de otras algas

9

con actividad antibacteriana (Culioli et al., 2008; Etahiri et al., 2001; Ganti et al.,

2006; Jennings & Steinberg, 1997; Plouguerné et al., 2008; Plouguerné et al.,

2010) sostienen que es posible que M. pyrifera posea compuestos que inhiban las

primeras etapas del micro-epifitismo, ya que se trata de especies con ecología

similar. También han surgido nuevas metodologías en el estudio de la actividad

anti-epífita, que son distintas a las de Mayer et al. (1987a) y Larripa et al. (1987),

que podrían emplearse para reanudar nuevas investigaciones con M. pyrifera

(Dhanasekaran et al., 2009; Feng et al., 2007; Hsu, 1982; Silkina et al., 2009).

Durán-Riverol (2009) evaluando el protocolo de aislamiento guiado por

bioensayo, observó entre otras algas, que M. pyrifera tiene actividad frente a

bacterias patógenas; dicho estudio dejó asentada la actividad del alga contra

Vibrio alginolyticus, V. campbellii, V. harveyi, V. parahaemolyticus, Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis y Exiguobacterium sp. La autora obtuvo 10 fracciones

cromatográficas de M. pyrifera, todas ellas con actividad biológica al menos contra

una cepa bacteriana.

Mientras, en la Universidad de Portsmouth en Reino Unido, en colaboración

con el CICIMAR, Quesseveur (2009) evalúo el efecto de 79 extractos provenientes

de 42 especies marinas colectadas en aguas del Pacífico mexicano sobre el

crecimiento de bacterias marinas y terrestres comúnmente implicadas en las

primeras etapas del proceso de colonización o asentamiento; entre las sustancias

probadas, se encontró que el extracto de M. pyrifera y las diez fracciones

10

cromatográficas obtenidas del fraccionamiento realizado por Durán-Riverol (2009)

presentaron actividad anti-epífita.

Aunque el trabajo de Quesseveur (2009) es de los primeros en considerar a

M. pyrifera como anti-incrustante, existen una gran cantidad de estudios que

demuestran la actividad en otras algas, dentro de las algas pardas que presentan

actividad contra algún tipo de microorganismo involucrado en el epifitismo, se

encuentra el trabajo de Jennings & Steinberg (1997), quienes observan que la

cantidad de florotaninos influye en la abundancia de los epífitos sobre el kelp

Ecklonia radiata. Ganti y colaboradores (2006) aislaron y caracterizaron agentes

anti-incrustantes en el alga Sargassum confusum. En el 2008, Culioli y

colaboradores encontraron en Halidrys siliquosa productos derivados de los

terpenos con actividad anti-incrustante; en el mismo año, Plouguerné et al. (2008)

extraen sustancias activas contra el micro-epifitismo de las algas invasivas

Grateloupia turuturu y Sargassum muticum. Plouguerné et al. (2010) encuentran

ácido palmítico, linoleico y palmitoleico en Sargassum muticum, además de

galactoglicerolípidos e hidrocarbonos que inhibieron el crecimiento de microalgas,

bacterias y hongos implicados en el micro-epifitismo.

3. Distribución y descripción de Macrocystis pyrifera

Macrocystis pyrifera (Figura 1) es un alga parda, pertenece al orden de las

laminariales, se caracteriza por formar densos bosques submarinos que son el

hogar de muchas especies marinas que dependen de las algas directamente para

11

la alimentación y la vivienda o indirectamente como un lugar de caza (Grant-

Burges et al., 2003).

Figura 1. Macrocystis pyrifera. Al norte, se distribuye sobre las costas del Pacífico de

Norteamérica, México, EU y Alaska. Al sur tiene una distribución circunsubantártica desde

Perú hasta Cabo de Hornos en América, Sudáfrica, Australia y Nueva Zelanda.

12

Debido a su fisiología muy variable e historia de vida, M. pyrifera ocupa una

amplia variedad de ambientes. Habita en ambos hemisferios: se localiza

principalmente a lo largo de las costas del Pacífico de Norteamérica, México, EU y

Alaska. Al sur tiene una distribución circunsubantártica que va de Perú hasta Cabo

de Hornos en América, Sudáfrica, Australia y Nueva Zelanda. En México, los

mantos de M. pyrifera se localizan en la Península de Baja California, desde Islas

Coronado (23’ 25’ N; 117’’ 15’0) hasta Bahía Asunción (27’ 08’ N; 114’’ 18’0).

Aunque esta especie prospera en aguas frías, donde la temperatura del

agua se mantiene por debajo de los 21°C, su distribución en altas latitudes parece

estar limitada por el oleaje y la baja radiación solar; mientras que los límites que

determinan su distribución en latitudes bajas parecen ser la poca disponibilidad de

nutrientes en aguas cálidas donde no ocurren surgencias y/o la competencia con

especies que son más termo-tolerantes (Grant-Burges et al., 2003).

Dentro de estos límites, su distribución lateral corresponde a cambios

abruptos en la batimetría y/o en la composición del sustrato; y su distribución

superficial se ve influida por la desecación y radiación ultravioleta principalmente,

aunque el oleaje, el pastoreo y la competencia con otras algas en las zonas más

someras también puede ser importante. Así, se encuentra desde la zona

intermareal hasta 30 m de profundidad (Grant-Burges et al., 2003).

M. pyrifera puede llegar a medir hasta más de 50 m de longitud,

dependiendo el ambiente donde se desarrolle. Su estructura (Figura 2) consiste en

un rizoide perene mediante el cual se sujeta a un sustrato generalmente rocoso;

13

de este rizoide se desprenden varias ramificaciones llamadas estipes, a lo largo de

estos se encuentran los neumatocistos que son pequeñas vesículas llenas de aire

que le sirven como flotadores; a partir de estas estructuras crecen las láminas o

filoides, los cuales miden alrededor de medio metro de largo, y todo esto compone

una fronda. Las frondas son efímeras con una vida media de aproximadamente 6

meses. Las frondas jóvenes crecen hasta la superficie, con nuevas láminas

formadas a intervalos regulares; una vez que la fronda alcanza la superficie, el

crecimiento continúa por un corto tiempo formando doseles en la superficie del

mar, luego cesa la formación de nuevas láminas y finalmente llega a la

senescencia.

Esta alga tiene una gran importancia ecológica en los lugares donde habita:

por su gran tamaño y densidad altera de manera significativa la disponibilidad de

la luz, el flujo de las corrientes oceánicas y la química de las aguas del océano en

la zona donde crecen. Su presencia es crucial para mantener la organización y

diversidad de comunidades ecológicas, por ello es considerada una especie clave

que puede albergar y dar protección a una gran diversidad de organismos,

incluyendo algas, peces, moluscos, entre otros. Además se ha determinado que

M. pyrifera posee un elevado contenido de aminoácidos esenciales y ácidos

grasos, y la calidad de sus proteínas y lípidos lo hace comparable con las de otras

fuentes vegetales (Grant-Burges et al., 2003).

14

4. Justificación

Existe desde hace mucho tiempo un esfuerzo por evitar el biofouling o

epibiosis, es decir, el asentamiento de organismos sobre superficies y estructuras

creadas por el hombre; en un inicio se comenzaron a añadir compuestos tóxicos

como mercurio, plomo, arsénico y cloro en los revestimientos de barcos y

estanques que fueron sustituidos en su mayoría por el tributilo de estaño (TBT) a

principios de 1950´s, porque tenía un menor impacto ecológico mientras

retrasaban el desarrollo de organismos adheridos a sus superficies; así las

pinturas adicionadas con TBT permitieron el ahorro en combustible y

mantenimiento, ya que permitieron intervalos entre operaciones de repintado más

largos (Barreiro et al., 2004). No obstante, seguían causando daños a la biota

marina, desde alteraciones bioquímicas hasta extinciones a escala local; se

acumulaban en los sedimentos durante años y finalmente su uso se restringió en

el 2008; el sustituto del TBT en las pinturas fue el cobre, que siguió ocasionando

problemas ambientales (Fent, 1996); por lo que se optó por el empleo de otras

tecnologías como limpiadores de agua a presión, antifouling por ultrasonido o

vibraciones, y la limpieza criogénica que consiste en pequeños cristales de hielo

seco (Fondear, 2011), sin embargo, estas tecnologías terminan teniendo costos

elevados y aplicados en la acuacultura resultaría poco práctico porque se requiere

un continuo mantenimiento. De modo que una alternativa que ofrece eficacia y

respeto con el medio ambiente además de bajo costo es la implementación de

anti-incrustantes naturales en las pinturas, tal como extractos de algas marinas.

15

Ya varios autores han incorporado estos productos en pinturas y otros

revestimientos; aunque hace falta definir la química de los extractos utilizados

(Grant-Burges et al., 2003). Por consiguiente es necesario continuar con el

aislamiento e identificación de los principios activos, que si bien, representan un

desafío académico, también representan el más exitoso acercamiento al

descubrimiento de nuevas moléculas para el beneficio de la humanidad (Lock,

2011).

5. Objetivo

Identificar metabolitos presentes en el extracto etanólico de Macrocystis

pyrifera que inhiban el crecimiento de organismos involucrados en el

microepifitismo sobre estructuras sumergidas en cuerpos de agua dulce y/o

marina.

6. Metodología

6.1 Zona de estudio y colecta de Macrocystis pyrifera.

El material algal fue recolectado en aguas superficiales en Punta Eugenia,

Municipio de Mulegé, Baja California Sur (Figura 2) en agosto de 2006. El material

algal recolectado fue identificado in situ como M. pyrifera por el Dr. Rafael

Riosmena Rodríguez del Laboratorio de Botánica Marina de la Universidad

Autónoma de Baja California Sur.

16

Figura 2. Punta Eugenia, BCS. Sitio de colecta de M. pyrifera (mapa de Durán-Riveron,

2009).

6.2 Obtención del extracto etanólico.

Después de lavar y eliminar los epífitos conspicuos y ser secado al sol, se

realizó el extracto crudo con etanol destilado (EtOHd) en las instalaciones del

CICIMAR. Se obtuvo el extracto etanólico a partir de la maceración de 5.6 kg de

M. pyrifera con 8 L de EtOHd en una primera extracción, y con 7 L del disolvente

17

recuperado en una segunda extracción. Después de filtrar el sobrenadante y

concentrar a sequedad con rotavapor a presiones bajas y temperaturas de 40°C,

resultaron 306.7 g de extracto etanólico.

6.3 Fraccionamiento inicial del extracto etanólico

Del extracto obtenido, mediante filtración simple sobre papel, se obtuvo 29

g de una porción de sales insolubles en EtOHd y 277 g de extracto orgánico libre

de sales; este último sirvió para obtener tres fracciones: fase orgánica, emulsión y

fase acuosa. Por la actividad que presentó contra Vibrio campbellii y V.

parahaemolyticus, en el trabajo descrito por Durán-Riverol (2009), la fase orgánica

se sometió a extracción en fase sólida utilizando diclorometano (CH2Cl2) y EtOHd

como disolventes en mezclas con creciente polaridad, obteniendo 5 fracciones

(06-019 41 EFS2 Fn); de las cuales la fracción de baja polaridad 06-019 41 EFS2

F1, se seleccionó para ser fraccionada en búsqueda de principios activos. A partir

de un tercer fraccionamiento, se obtuvieron 10 fracciones (06-019 41CC2 Fn)

según la polaridad.

Una parte de estas fracciones se conservaron en el CICIMAR, y se evaluó

su actividad antibacteriana. Otra parte de las fracciones se enviaron a la

Universidad de Portsmouth para su evaluación anti-incrustante contra bacterias y

microalgas.

18

6.4 Evaluación de la actividad antibacteriana y anti-incrustante

Se determinó la actividad antibacteriana por el método de difusión en agar

con disco en un medio sólido, descrito y realizado por Durán-Riverol (2009). La

actividad anti-incrustante se evaluó mediante la técnica microdilución en placas,

realizada por Quesseveur (2009).

6.4.1 Ensayo de difusión en agar con discos

Los microorganismos probados mediante este ensayo fueron Vibrio

alginolyticus (X56576), V. campbellii (ATCC 25920), V. harveyi (ATCC 14126), V.

parahaemolyticus (ATCC 17802), Staphylococcus aureus (ATCC BAA-42),

Bacillus subtilis (ATCC 6051), Escherichia coli (ATCC BAA-196), obtenidas de la

American Type Culture Collection: http://www.atcc.org/. Exiguobacterium sp. fue

aislada de Artemia sp. por Carmona-Pérez (2006). Todas las cepas fueron

preservadas a -70°C con 50% de glicerol hasta el momento de reactivarse.

Para reactivar las cepas, fueron sembradas en agar marino [1 g de extracto

de levadura (DIFCO), 5 g de peptona de carne (DIFCO), 15 g de Bacto agar

(DIFCO) en 1 L de agua de mar artificial (Coral Reef)] y sembradas en agar

infusión cerebro-corazón (BHI) (DIFCO) y agar tripticaseina-soya (TSA) (DIFCO)

respectivamente las bacterias marinas y no marinas. Posteriormente se incubaron

durante 24 h. Una vez transcurrido el período de incubación, se sembraron en

19

tubos de agar inclinado (dos tubos de trabajo y uno de reserva) en agar marino.

Se incubaron nuevamente durante 24 h y posteriormente fueron almacenados a

11°C.

Para la preparación de inóculos, se sembraron cultivos masivos en agar; se

utilizó agar marino para las bacterias marinas y agar infusión cerebro-corazón

(BHI) (DIFCO) y agar tripticaseina-soya (TSA) (DIFCO) para las bacterias no

marinas, y se incubaron durante 24 h. Una vez obtenida suficiente biomasa

bacteriana de cada especie, se tomó una parte de ella con un hisopo estéril y se

suspendió en solución salina estéril (2.5% NaCl para bacterias marinas, y 0.85%

para bacterias no marinas), hasta obtener una densidad óptica de

aproximadamente 1.00 UA, a una longitud de onda 585 nm.

Con cada especie bacteriana se inocularon masivamente placas de agar

Muller-Hinton (Merck ®) (2.5% NaCl), sobre las cuales se colocaron los

sensidiscos con los extractos de prueba y los controles positivos y negativos.

Estas placas se dejaron a temperatura ambiente (24ºC aproximadamente) por 1.5

h para permitir la difusión del compuesto en el agar y posteriormente se incubaron

a 30°C por 24 h. El efecto sobre las bacterias fue registrado como negativo

cuando no se observó inhibición del crecimiento y en los casos positivos, las

zonas de inhibición alrededor de cada disco fueron medidas en mm.

Para los sensidiscos, se emplearon discos de papel filtro Whatman No. 4,

de 8 mm, esterilizados en autoclave, se impregnaron con aproximadamente 2 mg

de los extracto/fracción/compuesto a probar, diluidos en los disolventes

20

apropiados. La preparación se llevó a cabo en campana de flujo laminar

desinfectada con benzal, sobre papel aluminio lavado con etanol, para asegurar la

esterilidad. En esas condiciones los discos se dejaron evaporar y se almacenaron,

a -18°C por un período no mayor a 48 h. De igual manera se prepararon controles

negativos con los disolventes puros utilizados y controles positivos con el

antibiótico comercial Terramicina ® (oxitetraciclina), cápuslas de 500mg Pfizer.

6.4.2 Ensayo de microdilución en placa

En este ensayo, fueron evaluadas tres bacterias marinas: Polaribacter

irgensii (ATCC 700398), Pseudoalteromonas elyakovii (ATCC 700519) y Vibrio

aestuarianus (ATCC 35048); tres bacterias terrestres: Escherichia coli (ATCC

23176), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) y Staphylococcus aureus (ATCC

25923); y tres microalgas de agua dulce: Fragilaria crotonensis, Cosmarium sp. y

Scenedesmus armatus, todas ellas obtenidas de la colección de la Universidad de

Portsmout.

La actividad de cada extracto se probó a cinco diferentes concentraciones

(0.1, 1, 10, 25 y 50 g/mL) con el fin de evaluar la Concentración Inhibitoria

Mínima (CIM). Las concentraciones se obtuvieron siguiendo un protocolo de

dilución en serie: la primera concentración de 1 mg/mL; consecuentes fueron de

100 y 10 g/mL; de 100 g/mL se obtuvieron concentraciones de 25 y 50 g/mL y

de 10 g/mL se obtuvieron las concentraciones de 0.1, 1 y 10 g/mL. Así, se

21

evaluó la CIM por el método de dilución utilizando placas para microdilución de 96

celdas.

Para los ensayos de actividad anti-bacteriana, se utilizó el medio de cultivo

para bacterias marinas que se preparó con 5 g de peptona diluida en 1 L de agua

de mar filtrada y estéril (10 m, Whatman); y para bacterias terrestres, el medio

que se utilizó estaba compuesto de un caldo nutritivo CM 0067 No. 2 de 25 g/mL

(Oxoid). Las bacterias se incubaron durante 5 días a 30°C para determinar la

densidad bacteriana por espectrometría con el método de Amsterdam (1996);

todos los medios de cultivo se inocularon con la misma cantidad de bacterias de

cada cepa y se dejaron incubar a temperatura constante de 30°C.

Para los ensayos de actividad anti-microalgal, se elaboró un medio de

cultivo compuesto de macronutrientes WC (calcio, sodio, magnesio, potasio,

carbonato y fosfato), micronutrientes y vitaminas disueltas en agua destilada

estéril. Por su parte se dejaron incubar las microalgas en una cámara de

incubación a 25°C, con iluminación constante durante 3 semanas; para inocular

los medios de cultivo con una misma concentración, se midió la concentración de

clorofila a mediante métodos espectrofotométricos y la ecuación de Strickland y

Parson (1968); se dejaron incubar durante 2 semanas a 30°C.

Para probar cada extracto se realizaron 6 réplicas de cada una de las

concentraciones obtenidas además de los dos controles, uno sin extracto y otro

con metanol para probar el efecto del disolvente; de modo que por cepa hubo 42

ensayos (7 x 6). Así se comparó la turbidez de los tubos control con los del

22

extracto para evaluar la actividad anti-bacteriana y anti-microalgal, y dependiendo

el número de réplicas activas, el criterio para calificar la actividad fue de la

siguiente manera:

0 a 2 de las 6 réplicas = sin actividad

3 ó 4 de las 6 réplicas = - (inhibidora) ó (activadora) +

5 ó 6 de las 6 réplicas = - - (inhibidora) ó (activadora) + +

6.5 Fraccionamiento de 06-019 41CC2F3

La fracción de baja polaridad 06-019 41CC2F3 se obtuvo en el tercer

fraccionamiento de M. pyrifera, a partir de 06-019 41 EFS2 F1 derivada de la fase

orgánica (Anexo I); y se eligió para continuar su fraccionamiento por la actividad

que mostró frente a Vibrio alginolyticus, V. campbellii, V. parahaemolyticus y

Staphylococcus aureus; por el rendimiento (0.767 mg) y por su apariencia

aceitosa.

Primero se determinó la solubilidad de la fracción en CH2Cl2 utilizando

aproximadamente 1 mg de la muestra; luego se estableció el patrón de

fraccionamiento de la muestra en cromatografía en placas (TLC) y se fraccionó por

cromatografía en columna sobre sílica (60ª230-400 mesh ASTM) con una relación

muestra adsorbente de 1:100 (76.7 mg de muestra); la elución fue realizada con

hexano:diclorometano (Hex:CH2Cl2) con una relación (5:5); y continuó con un

gradiente de polaridad de diclorometano:metanol (CH2Cl2:MeOH) iniciando

(CH2Cl2 100%), (98:2), (95:5), (9:1) (8:2) (7:3) y se lavó con MeOH (100%).

23

Simultáneamente se realizó una cromatografía en capa fina, y se determinaron 8

fracciones que fueron sometidas a la prueba de actividad contra la bacteria

Staphylococcus aureus (como se describe en la sección 6.4.1). Se decidió hacer la

prueba únicamente para las fracciones de mediana polaridad: 06-019 41CC3 F3,

CC3 F4, CC3 F6 y CC3 F7, tomando como criterio el perfil cromatográfico, la

apariencia y el rendimiento de la fracción.

Se continuó con el fraccionamiento de 06-019 41CC3F4 por ser la fracción

más activa, esta vez la relación muestra-adsorbente fue de 1:200 (con 9.4 mg de

muestra). La elusión fue realizada con CH2Cl2 100% y continuó con un gradiente

de polaridad CH2Cl2:MeOH (98:2), (95:5), (9:1) y (8:2). Mediante cromatografía en

capa fina se determinaron 4 fracciones: 06-019 41CC4 F1, CC4 F2, CC4 F3 y CC4

F4. Se evaluó la actividad de 06-019 CC4F2 y 06-019 41CC4F3 contra Vibrio

parahaemolyticus como se describe en la sección 6.4.1, las cuales resultaron ser

muy parecidas en cromatografía de capa fina. El proceso de fraccionamiento a

partir de 06-19 41CC2F3 se desglosa en la Figura 3.

6.6 Identificación estructural del compuesto activo

Este análisis se realizó por espectroscopia de infrarrojo (IR); las fracciones

analizadas fueron 06-019 41CC4 F2 y CC4 F3. El espectro (IR) se obtuvo en las

instalaciones del laboratorio de Farmacognosia Marina en la Universidad

Autónoma de Baja California Sur con un espectrómetro Paragon 500 FT-IR en

forma de película sobre pastilla de Bromuro de potasio con dominio del tiempo por

24

transformada de fourier. Y la estructura molecular se determinó comparando el IR

contra tablas de frecuencias de absorción para determinados grupos funcionales.

Figura 3. Fraccionamiento guiado por bioensayo de la fracción de baja polaridad

06-019 41CC2 F3 derivada de la fase orgánica del extracto de M. pyrifera.

CC4 Si-gel fase normal 60 230-400 Relación muestra:sílica 1:200 CH2Cl2 100%; CH2Cl2:MeOH (98:2, 95:5, 9:1, 8:2)

06-019 41 CC2 F3 76.7 mg

CC3 Si-gel fase normal 60 230-400 Relación muestra:sílica 1:100 CH2Cl2 100%; CH2Cl2:MeOH (98:2, 95:5, 9:1, 8:2, 7:3)

F1 0.96 mg

F2 2.33 mg

F8 2.36 mg

F4 9.4 mg

S. aureus

F3 19.2 mg S. aureus

F7 22.79 mg S. aureus

F5 3.89 mg

F6 11.5 mg S. aureus

F2 29.5 mg

V. parahaemolyticus *11.6 mm

F1 3.2 mg

F3 24.2 mg

V. parahaemolyticus *11.5 mm

F4 3.5 mg

IR: Ácidos grasos

*8.3 mm *13.1 mm *12.6 mm *9.1 mm

25

7 Resultados

7.1 Actividad biológica

Se determinó que M. pyrifera es un alga capaz de sintetizar varios

compuestos activos contra organismos marinos, terrestres y dulceacuícolas, tanto

bacterias Gram-positivas como Gram-negativas. Si se analizan las Tablas, se

observa que en general las fracciones fueron más activas contra organismos

marinos, y no se observó que exista una especificidad de acción de las sustancias

de acuerdo a la naturaleza de la cepa bacteriana por ser Gram-positiva o Gram-

negativa. Aunque sí se observó que diferentes fracciones tuvieron diferente

actividad sobre cada microorganismo.

La fase orgánica del extracto etanólico de M. pyrifera inhibió el crecimiento

de las bacterias Vibrio campbelili, V. parahaemolyticus, Poliaribacter irgensii, V.

aestuarianus y Pseudoalteromonas elyakovii; y promovió el crecimiento de las

microalgas Fragilaria crotonensis y Scenedesmus armatus.

El extracto etanólico (06-019) no fue activo contra ninguna bacteria

terrestre, sin embargo, varias fracciones del extracto etanólico de M. pyrifera

inhibieron a Enterobacter aerogenes y Staphylococcus aureus. En la Tabla I

vemos que las fracciones 06-019 41CC2F6 y CC2F9 fueron activas contra E.

aerogenes, y en la Tabla III se observan las fracciones 06-019 41CC2F1, CC2F5,

CC2F7, CC2F8, CC2F9 y CC2F10 que inhibieron a S. aureus. Por su parte, las

fracciones 06-019 41CC2F3, CC2F9 y CC2F10 promovieron el crecimiento de

26

Cosmarium sp. a pesar de que no se determinó actividad en esta cepa por parte

del extracto etanólico (Tabla II). Escherichia coli fue la única bacteria que mostró

resistencia tanto al extracto como a las fracciones de M. pyrifera (Tabla III).

En la Tabla III se puede observar que el extracto etanólico de M. pyrifera

promovió el crecimiento algal de Scenedesmus armatus a distintas

concentraciones, y las fracciones 06-019 41CC2F2, CC2F3 y CC2F10,

contrariamente, inhibieron su crecimiento a concentraciones de 10 y 25 g/mL.

Con respecto a la fracción 06-019 41CC2F3, en la Tabla I se muestra la

actividad contra V. aestuarianus, en la Tabla III se muestra la actividad contra las

bacterias Vibrio parahaemolyticus, V. campbellii, V. alginolyticus, Exiguobacterium

y Staphylococcus aureus mediante el ensayo de difusión en agar por disco. Sin

embargo, en la Tabla I, con el método de dilución en microplacas, no presenta

actividad contra S. aureus. En la Tabla II se muestra que inhibe el crecimiento de

la microalga Scenedesmus armatus, pero tiene un efecto positivo sobre el

crecimiento de Fragilaria crotonensis y Cosmarium sp.

A partir del fraccionamiento de 06-019 41 CC2F3, se obtuvieron 8

fracciones (06-019 41 CC3Fn1-8). Y solamente se evaluó la actividad contra

Staphylococcus aureus de cuatro de estas fracciones, las cuales presentaron

distinta intensidad inhibitoria, lo que se muestra en la Tabla III. Donde también se

observa cómo en 06-019 41CC3F4 y 06-019 41CC3F6 la actividad se incrementó

en comparación con la fracción 06-019 41 CC2F3, y sin embargo, disminuye con

la fracción 06-019 CC3F3.

27

Se obtuvieron cuatro fracciones a partir de 06-019 41 CC3F4 (fracción más

activa contra S. aureus). Dos de estas fracciones (06-019 41CC4F2 y CC4F3)

inhibieron el crecimiento de V. parahaemolyticus, con un halo de inhibición de 11.5

mm. No se evaluó la actividad de las fracciones 06-019 41 CC4 F1 y 06-019 41

CC4 F4 porque en el caso de la primera fracción, la TLC no mostró que hubiera un

compuesto evidente; y la segunda fracción mostró ser una mezcla muy compleja,

y con poco rendimiento.

Tabla I. Actividad anti-incrustante de M. pyrifera, método de microdilución en placa.

Bacterias terrestres Fracción de M. pyrifera

Concentración mínima

inhibitoria g/mL

E. coli

E. aerogenes 06-019 41CC2F6 0.1

06-019 41CC2F9 10

S. aureus

06-019 41CC2F1 0.1

06-019 41CC2F5 25

06-019 41CC2F7 10

06-019 41CC2F8 50

06-019 41CC2F9 1

06-019 41CC2F10 0.1

Bacterias marinas

P. irgensii 06-019 0.1

P. elyakovii 06-019 0.1

V. aestuarianus

06-019 0.1

06-019 41CC2F1 1

06-019 41CC2F2 10

06-019 41CC2F3 0.1

06-019 41CC2F4 1

06-019 41CC2F5 0.1

06-019 41CC2F6 10

06-019 41CC2F7 0.1

06-019 41CC2F8 0.1

06-019 41CC2F9 0.1

06-019 41CC2F10 0.1

28

Tabla II. Efecto de M. pyrifera sobre el crecimiento microalgal, método de microdilución en

placa.

Nota:Un signo (+) significa que promueve el crecimiento, un signo (-) significa que lo inhibe; y el

número de signos refiere al número de réplicas que fueron promotoras o inhibidoras; un signo

equivale a 3 ó 4 réplicas activas y dos signos equivale a 5 ó 6 réplicas.

Microalgas Fracción de M. pyrifera Concentración activa

g/ mL

Efecto sobre el crecimiento

F. crotonensis

06-019 0.1 +

06-019 41CC2F1 10 +

06-019 41CC2F2

0.1 +

1 +

10 ++

25 ++

50 ++

06-019 41CC2F3

01 ++

1 ++

10 ++

25 ++

50 ++

06-019 41CC2F4

0.1 +

1 +

10 +

25 +

50 +

06-019 41CC2F5

1 ++

10 +

25 +

50 +

06-019 41CC2F6

01 +

1 +

10 +

25 +

50 +

06-019 41CC2F7

0.1 +

1 +

10 +

25 +

50 +

06-019 41CC2F10 25 ++

50 ++

Cosmarium sp.

06-019 41CC2F3 50 ++

06-019 41CC2F4 50 ++

06-019 41CC2F10

0.1 +

1 +

10 +

25 ++

50 ++

S. armatus 06-019 0.1 +

29

1 +

10 +

25 +

50 +

06-019 41CC2F2 10 - -

25 - -

06-019 41CC2F3 50 - -

06-019 41CC2F10 25 - -

50 - -

Tabla III. Actividad antibacteriana de M. pyrifera, método de difusión en agar.

Nota: El número es el diámetro promedio del halo de inhibición expresado en mm. NA significa que

no se observó actividad; el signo (-) significa que no se evaluó la actividad de las fracciones para la

cepa bacteriana.

Fracción S. aureus V. para V. algino Exiguobact E. coli V. campb

06-019 41CC2F1 9 11 8.3 11 NA 7.8

06-019 41CC2F2 10.5 11.5 9.5 17 NA 10.3

06-019 41CC2F3 11 11 9.5 14 NA 9

06-019 41CC2F4 14.5 8.5 7.6 11.5 NA 7.5

06-019 41CC2F5 10 8 NA 10.5 NA 7.5

06-019 41CC2F6 10.5 NA NA 12 NA NA

06-019 41CC2F7 14 9.5 8 20.5 NA 9

06-019 41CC2F8 13 9.5 8.5 20.5 NA 9

06-019 41CC2F9 9.5 8 7.5 16.5 NA 8

06-019 41CC2F10 7.5 NA NA 13 NA NA

06-019 41CC3F3 8 - - - - -

06-019 41CC3F4 12.5 - - - - -

06-019 41CC3F6 12 - - - - -

06-019 41CC3F7 9 - - - - -

06-019 41CC4F2 - 11.5 - - - -

06-019 41CC4F3 - 11.5 - - - -

30

Después de las pruebas bacterianas se obtuvo el espectro en infrarrojo (IR)

de 06-019 41 CC4 F2 y 06-019 41 CC4 F3, las cuales presentaron mucha similitud

en la TLC, y aunque ambas eran aún mezclas, la cantidad de muestra no permitía

continuar con el fraccionamiento y los ensayos de actividad biológica.

7.2 Caracterización estructural

De las señales observadas en el espectro de infrarrojo (IR) se distinguen

cuatro bandas de absorción principales en la zona general del espectro: la primera

se encuentra a 3432 m-1, que corresponde a la tensión de grupos OH. Dos

señales más se observan a 2930 m-1 y 2850 m-1: la primera señal, 2930 m-1, indica

el estiramiento asimétrico de enlaces C-H en los alcanos (CH3), y la señal 2850 m-

1 indica estiramientos simétricos en los enlaces del grupo metilo (Silverstein et al.,

2005). También se identificó una absorción en 1713 m-1, la cual puede atribuirse a

carbonilos en general, a esteres o ácidos carboxílicos (Silverstein et al., 2005).

En la zona denominada “huella dactilar”, aparecen, las señales 1244 m-1 y

1176 m-1, las cuales indican la presencia ya sea de alcanos, alcoholes, esteres,

eteres y/o ácidos carboxílicos (Silverstein et al., 2005).

31

Figura 4. Espectro infrarrojo de la fracción 06-019 41CC3F2. Se observan cuatro

señales principales en la zona general del espectro y pequeñas señales en la zona

de la huella dactilar, entre 600m-1 y 1400m-1.

Estas evidencias aunadas a la apariencia y baja polaridad de la fracción,

sugieren que se trata de algún derivado de ácido graso.

8 Discusión

Aunque ya se había reportado en el alga parda M. pyrifera actividad

citotóxica, antiviral, antitumoral (Mayer & Panick, 1984), antibacteriana (Durán-

Riverol, 2009) y anti-incrustante (Quesseveur, 2009), este estudio es de los

primeros en tratar de aislar y averiguar el tipo de compuesto específico que inhibe

32

el crecimiento de dos bacterias: la bacteria terrestre (Gram-positiva)

Staphylococcus aureus y la bacteria marina (Gram-negativa) Vibrio

parahaemolyticus, ambas involucradas en el micro-epifitismo y en infecciones

graves en humanos. En el trabajo precedente, Durán-Riverol (2009) dejó

comprobada la existencia de compuestos en M. pyrifera que inhiben el crecimiento

de varias cepas bacterianas, tanto Gram-positivas como Gram-negativas: S.

aureus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, Exiguobacterium y V. campbellii. Los

halos de inhibición fueron relativamente iguales para las bacterias, por lo tanto no

existe una especificidad de acción evidente en relación a la naturaleza de la cepa

bacteriana Gram-positiva y Gram-negativa.

Por su parte, Quesseveur (2009), indica que M. pyrifera posee compuestos

que inhiben el desarrollo de bacterias marinas y terrestres y puede ser promotora

y/o inhibidora del crecimiento microalgal. En dicho estudio, las bacterias marinas

mostraron más sensibilidad a más fracciones de M. pyrifera y a concentraciones

más bajas que las bacterias terrestres, lo cual parece razonable porque

pertenecen al mismo ecosistema.

La actividad biológica que presenta el extracto etanólico y las fracciones de

M. pyrifera es diferencial sobre cada microorganismo; así se observan fracciones

que inhiben el crecimiento de más de una cepa y microorganismos que son

sensibles a varias fracciones diferentes. Esto se debe a que por el proceso de

purificación de compuestos activos mediante el protocolo de aislamiento guiado

por bioensayo, las sustancias activas se van separando y concentrando en ciertas

33

fracciones, y es por eso que algunas fracciones inhibieron el crecimiento de

microorganismos que el extracto crudo de M. pyrifera no inhibió, ya que en 2

g/mL de extracto crudo existe el principio activo en menor porcentaje que en las

fracciones; por eso también el diámetro del halo de inhibición contra S. aureus es

mayor en ciertas fracciones que en el resto, incluyendo la fracción de procedencia.

Esto podría representar un problema porque empleando un método no muy

sensible, y utilizando bajas concentraciones del principio activo, puede pasar por

desapercibida la actividad en el extracto.

Otro efecto que se observa por la concentración de la sustancia activa es

con las microalgas, específicamente con Scenedesmus armatus, ya que su

crecimiento se vio promovido por el extracto crudo y sin embargo, inhibido por tres

de sus fracciones. Lo que estimula el crecimiento de la microalga es la alta

concentración de auxina y citocinina en M. pyrifera (Stirk et al., 2004), que son

hormonas reguladoras del crecimiento vegetal, y al momento de fraccionar, los

compuestos con actividad inhibitoria se concentran (Bhakuni & Rawat, 2005).

Así como puede surgir una fracción activa contra una cepa que no haya

sido sensible al extracto crudo por cuestiones de concentración, puede que en el

fraccionamiento ninguna de las fracciones obtenidas presente la actividad del

extracto sobre alguna bacteria, como Poliaribacter irgensii y Pseudoalteromonas

elyakovii; entonces se puede decir que se pierde la actividad porque los principios

activos tienen grupos funcionales reactivos que al reaccionar originan

subproductos inactivos, o porque la actividad biológica se debe precisamente a la

34

sinergia entre los componentes de la mezcla, entonces al separarla, los

compuestos individuales no son activos (Bhakuni & Rawat, 2005).

Se obtuvo el espectro infrarrojo de 06-019 41CC4F2 y CC4F3 aunque no

eran compuestos puros, sin embargo el bajo rendimiento de la muestra no

permitía continuar con los fraccionamientos, y el espectro mostró varias señales

con las que se infiere que es un ácido graso.

Se sabe que los ácidos grasos en los seres vivos vienen en pares de

carbonos y los más comunes van de los 14-24 carbonos, y mientras más larga la

cadena es menor la solubilidad y más sólido el compuesto. En el trabajo de Rosell

& Srivastava (1987), donde queda establecida la actividad antibacteriana de

ácidos grasos de algas pardas, se identificaron en su mayoría ácidos grasos mono

y poli-insaturados de 18 y 20 carbonos, que además de ser los más abundantes

eran los que tenían mayor actividad. Entonces, basándonos en las señales del IR,

concluimos que se trata de ácidos grasos, y tomando en cuenta las

observaciones de Rosel & Srivastava (1987), determinamos que probablemente

se trata de un compuesto de cadena hidrocarbonada entre 14-24 carbonos,

porque las fracciones tenían una apariencia aceitosa y eran de olor agradable.

Determinando así que a partir de una serie de fraccionamientos de 06-019 CC2F3

(fracción poco polar derivada de la fase orgánica de M. pyrifera) se obtienen

ácidos grasos que presentan actividad contra Vibrio parahaemolyticus y

Staphylococcus aureus.

35

La mayoría de los estudios que reportan actividad anti-incrustante en algas

pardas se enfocan en la bioactividad de los florotaninos, sin embargo, se han

aislado otros compuestos anti-incrustantes de Phaeophyceae (Plouguerné et al.,

2010), como terpenos de algunas especies de Dictyota (Schmitt et al., 1995;

Barbosa et al., 2007). En este trabajo se encontraron ácidos grasos con actividad

antibacteriana, lo cual no es nuevo en algas pardas; Rosell & Srivastava (1987)

demostraron la importancia de los ácidos grasos como anti-incrustantes con

ácidos grasos insaturados derivados de Desmaresteia ligulata, al igual, Katsuoka

& colaboradores (1990) aislaron galactosil y sulfoquinovosil-diacilgliceroles de las

algas Costaria costata y Undaria pinnatifida, que exhibieron actividad anti-

macroepífita contra el bivalvo Mytilus edulis. Y en investigaciones más recientes,

Ganti & colaboradores (2006), demostraron la actividad anti-incrustante de los

derivados de ácidos grasos y ácido ftálico en el alga parda Sargassum confusum.

Plouguerné et al. (2010), aislaron compuestos identificados como ácidos grasos y

galactoglicerolípidos que exhibieron actividad anti-incrustante en Sargassum

muticum, así como hidrocarburos saturados y poli-insaturados con interesante

actividad antibacteriana, antifúngica y anti-microalgal.

Dichos estudios recalcan el rol que tienen los ácidos grasos en la ecología

de las algas; porque en realidad se consideran productos del metabolismo

primario, y que tienen funciones esenciales en los seres vivos: su función principal

en las algas es la reserva de energías y brindar soporte a las paredes celulares

formando parte de la estructura de fosfolípidos y gucolípidos en las membranas

36

biológicas; aunque también hay derivados de ácidos grasos que actúan como

hormonas o mensajeros intracelulares, y algunos ácidos grasos dirigen a las

proteínas hacia posiciones en las membranas (Stryer, 1995). Sin embargo, ahora

destaca su papel en la ecología del alga, ya que se ha demostrado que es mayor

la actividad biológica de los ácidos grasos que la de los mismos florotaninos (Deal

et al., 2003).

La función ecológica de los ácidos grasos en M. pyrifera puede explicarse

considerando precisamente la ecología del alga. M. pyrifera es parte de un

ecosistema muy complejo, que son los bosques de kelps; debido al gran tamaño

de las algas y a su densidad poblacional, las condiciones fisicoquímicas de las

aguas en la zona donde crecen estas algas, se alteran de manera significativa,

como la disponibilidad de luz, la concentración de nutrientes y el flujo de la

corriente. Al disminuir considerablemente el flujo de la corriente, M. pyrifera es

más propensa al epifitismo porque es aprovechada como sustrato y refugio para

organismos bentónicos y como alimento para toda una comunidad (Zimmerman &

Kremer, 1986). También la competencia por espacio y por recursos obliga a M.

pyrifera a biosintetizar metabolitos que funcionen como defensa ante la

colonización de organismos incrustantes y/o para conferir una ventaja competitiva

en poblaciones muy densas (Grant-Burges et al., 2003). Estas sustancias o

metabolitos con capacidad anti-incrustante pueden aislarse para generar

alternativas a los biocidas tóxicos que se utilizan como anti-incrustantes en las

pinturas y revestimientos de estructuras navales y de acuacultura para el control y

37

prevención del biofouling con tecnologías que respeten al medio ambiente (Grant-

Burges et al., 2003). Así ya se ha reportado un gran número de compuestos anti-

incrustantes que provienen de organismos marinos, desde corales, moluscos,

equinodermos, piel de ballena o tiburón y algas, cuya aplicación en pinturas y

revestimientos han tenido resultados positivos, sin embargo hace falta determinar

la estructura de los compuestos activos, pues es el siguiente paso a la síntesis de

moléculas activas en laboratorios (Bhosale et al., 2002; Scardino & de Nys, 2010).

9. Conclusiones

El alga parda Macrocystis pyrifera posee actividad antibacteriana y anti-

incrustante; también puede inhibir y/o promover el crecimiento microalgal.

Macrocystis pyrifera es capaz de sintetizar varios compuestos activos

contra organismos marinos, terrestres y dulceacuícolas; e inhibe por igual a

bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

Macrocystis pyrifera posee ácidos grasos en fracciones de baja polaridad,

que inhiben el crecimiento de Vibrio parahaemolyticus, bacteria implicada en el

microepifitismo.

38

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11. Anexos

Anexo 1. Inhibición del crecimiento de S. aureus con las fracciones 06-019

41CC3 F3, CC3 F4, CC3 F6 y CC3 F7.

Anexo 2. Inhibición del crecimiento de V. parahaemolyticus de las fracciones 06-

019 41CC4 F2 y CC4 F3.