biología molecular aplicada

Lic Arantza Roselló Lic Antonella Limone Lic Wilhelm Izaguirre

• A.C Aristóteles «la herencia biológica implicaba alguna forma de transmisión de padres a hijos»

• 1865 Análisis de las mutaciones, transmisión de los caracteres y las bases moleculares de la herencia (Mecanicista)

• Tendencia reduccionista a los problemas biológicos

• Vertiente estructuralista, (estructura atómica de las macromoléculas)

• Vertiente informacionista, (información se transfiere entre generaciones).

• 1933 los problemas biológicos (experimentación directa), Físicos nucleares

• 1950-1953 Material Genético ADN

• 1956 Dogma Central Biología Molecular (Watson y Crick)

• A mediados del siglo XX, (conocimiento del material genético)

• A comienzos de la década de 1970 los problemas biológicos pueden y deben ser explicados desde un punto de vista molecular

"Agarré el volante de mi coche serpenteando por una carretera iluminada por la luna, al

norte de California Redwood"

Mullis, K. The Unusual origin of the Polymerase Chain Reaction. American Scientific, 1990: 56-65.

• Kary Mullis (1983)

• Anemia Falciforme (gen)

• Medicina Forense

• Licencia Exclusiva ROCHE (1991)

• Premio Nobel Quimica (1993)

• Replicación ADN

Historia

• FUNDAMENTO:• Amplificación --- fragmento molde ADN• Reacción enzimática• Gran número de copias diana

• HERRAMIENTAS:• Polimerasa Bacteriana, Moldes Sintéticos

• ESTRATEGIA:• Utilizar cambios de temperatura

Reaccion en Cadena de la Polimerasa

• ELEMENTOS NECESARIOS:– Agua libre de nucleasas– Catión Divalente (MgCl2)– Desoxinucleótidos (dNTP´s)– Sol. Amortiguadora y sales (Buffer)– Oligonucleótidos (Primer)– Enzima Termoresistente (Ej: Taq Polimerasa)– Fragmento de ADN (Muestra)

Viljoen, G. Nel, L. Crowther, J. Molecular Diagnostic PCR Handbook. Springer, 2005.

Viljoen, G. Nel, L. Crowther, J. Molecular Diagnostic PCR Handbook. Springer, 2005.

PCR Convencional PCR Tiempo Real

• Detección segmento específico ADN

• Tamaño (pares de bases)• PCR punto final (fase constante)• Post-PCR (Tiempo)

• Detección ADN• Cuantificación ADN• Fluorescencia (Diagrama

Jablonski)• Fases tempranas

(Exponencial)

Viljoen, G. Nel, L. Crowther, J. Molecular Diagnostic PCR Handbook.

Springer, 2005.

http://ru.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Nucleic-Acid-Amplification-and-

Expression-Profiling/qRT-PCR/Real-Time_PCR-Misc/Real-Time-PCR-vs-Traditional-PCR.html

La mejor opción?

• Aumento precisión diagnóstica

• Diagnóstico Temprano

• Predecir Riesgo de Enfermedad

• Reduce Costos Diagnostico

• Reduce Tiempo Permanencia Hospitalaria

• Herramienta Complementaria

• Menor cantidad muestras

• Sensibilidad

• Especificidad

• Rapidez

• Simplicidad

Procesos de CalidadProcesos de Calidad

•Diagnóstico Diagnóstico

•InvestigaciónInvestigación

La mejor opción?

Aseguramiento Calidad

Aseguramiento Calidad

• Preparación de la Muestra (Pre-PCR)• Amplificación (PCR)• Detección productos PCR (Post-PCR)

• Tiempo Real• Punto Final• Secuenciación

AutomatizaciónAutomatización

(EAN) Manual(EAN) Manual

ResultadosResultados

•LIS (Interfase)LIS (Interfase)

•Transcripción (Error Transcripción (Error Sistemático)Sistemático)

•Correcto Análisis Correcto Análisis (Médico-Anaista)(Médico-Anaista)

•Tiempo Real

•Punto Final

•Mantenimiento

•Operación continua (Agregar muestras)

•Operación “overnight”

•Confiabilidad (Error Sistemático)

•Calidad Muestra

•Transporte Muestra

•Que? Como?

QCQC

• Diagnóstico Presuntivo• Datos Paciente• Historial

Aseguramiento de la Calidad

• 30 muestras ciegas (5 Laboratorios)• Detección correcta (1 laboratorio)• Sensibilidad 50%-100% (4 Laboratorios)• Especificidad 30%-80% (4 Laboratorios)• CONCLUSION: Mejorar metodología, Controles de Calidad

Banda Doble o Sencilla (1000 – 1600 bp)

Banda Doble Patrón Monomórfico (700 bp)

C.albicans C.dubliniensis

Patrón Monomórfico (500 bp)

Banda Doble (600 - 700 bp)

RAPD con el oligonucleótido CAND-RMarcador: Lambda ADN/Hind III (Carril 1) Controles: ATCC 90028 C. albicans (Carril 2), S636 C. dubliniensis (Carril 11)

Epidemiología Molecular de Candida spp en Pacientes VIH Seropositivos y con SIDA en Venezuela

•Coloración ziehl nielssen / Cultivo / PCR dot blot (1000 pacientes)

•Costo total screening Coloración-cultivo / coloración-PCR (US$ 5,635,760 versus US$ 1,498, 660 - incluidos gastos paciente y servicios médicos).(4,137,100$ Ahorro)

• El costo para un diagnostico correcto es 50,773$ / 13.749$

•Fluorescencia Directa / Cultivo Viral / PCR múltiplex

•Menos costoso PCR múltiplex, por investigación (300$ ahorro)

•1800 muestras al año (520,629$ ahorro)

J. Clin. Microbiol. September 2009 vol. 47 no. 9 2812-2817

BMC Infectious Diseases 2009; 9:216

•Conocimiento Genomas (virus, bacterias, hongos)

•Comportamiento Patógenos (mecanismos virulencia, defensa)

•Medicina Preventiva Relman, D. Microbial Genomics and Infectious Diseases. N Engl J Med 2011;365:347-57

Relman, D. Microbial Genomics and Infectious Diseases. N Engl J Med 2011;365:347-57

“¿Por qué esta magnífica tecnología científica, que ahorra trabajo y nos hace la vida mas fácil, nos aporta tan poca felicidad? La repuesta es está, simplemente:

porque aún no hemos aprendido a usarla con tino”. Albert Einstein 1879-1955