Biología molecular 01-1
Transcript of Biología molecular 01-1
MÓDULO 1 Introducción a las herramientas para la
detección de ácidos nucleicos (PARTE I)
Herramientas moleculares I: parámetros y validación para el diagnóstico bioquímico
Dr. Diego Chouhy
INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO
Sala de preparación de reactivos
Preparación de reactivos para la PCR
Preparación de la mezcla de PCR
Sala de preparación de muestras
Procesamiento de muestras clínicas.
Aislamiento de ácidos nucleicos
Agregado de ácidos nucleicos a los tubos de reacción de PCR
Sala de amplificación y detección
PCR (termocicladores) Detección de los productos amplificados
Pipetas Microcentrífuga Vortex
Pipetas Microcentrífuga
Pipetas Microcentrífuga Cicladores térmicos Cubas de electroforesis Fuentes de poder Transiluminador UV Microondas
OBTENCIÓN - sangre entera anticoagulada con EDTA - plasma / suero - líquido cefalorraquídeo - biopsia - etc
ETAPAS EN EL PROCESAMIENTO
MÉTODOS MOLECULARES
CONSERVACIÓN - dentro de las 24 horas: 2 - 8°C - más de 24 horas congelar a –20°C o –70 °C.
EXTRACCION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
1- REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA
2- AMPLIFICACIÓN
3- DETECCIÓN
MÉTODOS MOLECULARES
AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
AMPLIFICACIÓN DE LA SEÑAL
AMPLIFICACIÓN DE LA SONDA
Branched DNA signal amplification (bDNA)
Ligase Chain Reaction (LCR)
Amplificación Isotérmica
TMA NASBA 3SR SDA LMPA
Amplificación No Isotérmica
Standard PCR RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR real time PCR
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
KARY MULLIS 1985: PCR
1993: PREMIO NOBEL DE QUÍMICA
Amplificación Génica
Luego de 30-40 ciclos ≈ 109 – 1012 copias
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Luego de 30-40 ciclos ≈ 109 – 1012 copias
La PCR es una metodología que consiste en la amplificación enzimática en ciclos repetidos de un fragmento específico de ADN utilizando la enzima
ADN polimerasa termoestable (Taq)
La amplificación in vitro del ADN se logra en tres pasos básicos:
1).-Desnaturalización del ADN a copiar (molde o diana) mediante el incremento de la temperatura (92-95°C).
2).-Hibridación de los cebadores al ADN molde mediante la disminución de la temperatura a la temperatura de anillado de los cebadores (55-65°C).
3).-Copia de las cadenas delimitadas por los cebadores. Se consigue elevando la temperatura de la reacción a la óptima de la ADN polimerasa utilizada.
N=1 N=2 N=4
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Oligonucleótidos (cebadores) Tampón (Buffer) ADN Polimerasa termoestable Desoxinucleótidos (dNTPs) Cloruro de Magnesio (MgCl2) ADN molde
Reacción en Cadena de la Polimerasa
COMPONENTES DE LA PCR
COMPONENTES DE LA PCR
Secuencias cortas de ADN (18 - 24 nucleótidos) que flanquean el fragmento a amplificar y actúan como iniciadores (“cebadores”) de la polimerización.
1- Oligonucleótidos
Necesario para crear las condiciones óptimas para la actividad de la ADN polimerasa. A menudo contienen Tris-HCl, KCl, y a veces, MgCl2.
2- Tampón (Buffer)
Sustrato necesario para la formación de las cadena de ADN. Unen iones Mg2+. Para 1.5 mM de MgCl2, la [dNTPs] ideal es de 200 μM. Pequeños incrementos en la [dNTPs] pueden inhibir la reacción porque atraparan los iones Mg2+ necesarios para que la ADN-polimerasa funcione. Si cambiamos la [dNTPs] es importante tener en cuenta que existe una relación entre las cantidades de MgCl2 y las de dNTPs en la reacción.
3- Desoxinucleótidos (dNTPs)
Reacción en Cadena de la Polimerasa
La [MgCl2] afecta a la incorporación de dNTPs, la actividad polimerasa y temperatura de hibridación del híbrido cebador-ADN templado. [MgCl2] Especificidad de la reacción. [MgCl2] Eficiencia de la reacción
A: 0,5 mM - B: 0,8 mM - C: 1,5 mM D: 2,0 mM - E: 2,5 mM - F: 3,0 mM
Efecto de la concentración de MgCl2
4- Cloruro de Magnesio (MgCl2)
Producto final debe estar limpio y libre de cualquier residuo de buffers. Estos productos residuales pueden inhibir la acción de la enzima o
modificar la concentración salina del buffer de reacción. Inhibidores en la muestra (Columnas vs Técnicas manuales de extracción)
5- ADN molde
Reacción en Cadena de la Polimerasa
COMPONENTES DE LA PCR
COMPONENTES DE LA PCR
Dirección de polimerización 5’-3’. Solamente añaden desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a una cadena cebadora ya existente unida a una cadena molde. No inicia síntesis de ADN de novo.
6- ADN Polimerasas
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Pfu ADN polimerasa
Taq ADN polimerasa Hot Start Taq ADN polimerasa
Mix de enzimas
http://www.thermoscientificbio.com
PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIÓN
Componente Volumen Concentración final
Tampón (buffer) 10X 5 µl 1X
dNTP 2 mM 5 µl 0.2 mM
Cebador sentido (10 pmol/µl)
0.5-5.0 µl 0.1-1.0 µM
Cebador antisentido (10 pmol/µl)
0.5-5.0 µl 0.1-1.0 µM
MgCl2 25 mM 2-8 µl 1-4 mM
ADN templado 5 µl 10 pg – 1 µg
Taq ADN polimerasa 5 U/µl 0.2-0.5 µl 1.0-2.5 U
H2O (libre de nucleasas) hasta 50 µl
Volumen Total 50 µl
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Paso Temperatura Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 95ºC 3-5 min. 1
Desnaturalización 95ºC 30-60 seg.
25-40 Anillado 50-68ºC 30-60 seg.
elongación 72ºC 30-60 seg.
Elongación final 72ºC 5-10 min. 1
PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIÓN
Reacción en Cadena de la Polimerasa
ARN
ADNc
Retrotranscripción, M-MLV
PCR, Taq cebadores
RT-PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa
En esta modificación de la PCR se incluyen dentro de la misma reacción de amplificación múltiples pares de cebadores específicos para diferentes dianas, por lo que se produce una co-amplificación de diferentes dianas. Esta modificación tiene las siguientes ventajas: se pueden testear grandes regiones de una única secuencia de
ADN en busca de alteraciones o modificaciones. se pueden testear segmentos no relacionados del genoma diana. se pueden incluir controles internos de amplificación de la muestra. se puede testear una misma muestra contra diferentes patógenos.
200 pb 300 pb 500 pb
Electroforesis
200 pb
300 pb
500 pb
PCR
PCR multiplex
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Desventaja: Mayor probabilidad de contaminación. No es recomendable la apertura del 1° tubo de amplificación (sobre todo en laboratorios de
diagnóstico clínico), ya que durante la transferencia se producen aerosoles que pueden contaminar reacciones sucesivas. Para evitar esto se han desarrollado alternativas a fin de evitar la transferencia de un tubo a otro tras la 1° amplificación.
500 pb
250 pb
1ª amplificación
2ª amplificación
Nested-PCR o PCR anidada
Ventajas: Mejor sensibilidad. Se puede detectar una sola copia de
la diana sin necesidad de hibridar con sondas marcadas.
Mejor especificidad. La re-amplificación con el par de
cebadores internos sirve para verificar la especificidad de la primera ronda de amplificación.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Los procesos de amplificación y detección se producen simultáneamente. Disminución del riesgo de contaminación. Por detección fluorescente se puede medir la cantidad de ADN sintetizado en
cada momento durante la amplificación . Posibilidad de cuantificación La emisión de fluorescencia producida en la
reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.
Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos: Agentes intercalantes: fluorocromos que aumentan la emisión de fluorescencia al unirse al ADN de doble hélice. Baja especificidad. Sondas de hibridación específicas: sondas marcadas con 2 fluorocromos (un donador y un aceptor) y el fenómeno de Transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET).
Real time-PCR o PCR en tiempo real
Reacción en Cadena de la Polimerasa
DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
1- Electroforesis
Separación de moléculas Matriz tamponada (agarosa, acrilamida) Separación de moléculas mediante el uso
de un campo eléctrico
“Electro” se refiere a la electricidad y “foresis” (del griego phoros) significa “trasladar”.
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
Agarosa Tampón o Buffer de corrida Tampón o Buffer de carga (Loading Buffer) Visualización
Reacción en Cadena de la Polimerasa
1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
Polisacárido extraído de algas. Electroforesis rápida, pero con una resolución limitada. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentración. Un fragmento de ADN migra a diferentes velocidades a través de los geles según la concentración de agarosa.
AGAROSA
1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
La movilidad electroforética del ADN está afectada por la composición y la fuerza iónica del medio. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. Con elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. Generalmente el gel se funde y el ADN se desnaturaliza.
BUFFER DE CORRIDA
Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentración de 50 mM (pH 7,5 – 7,8). EDTA vs degradacion enzimática. Debido a la carga negativa del ADN, la migración en la corrida es hacia el ánodo (color rojo).
Reacción en Cadena de la Polimerasa
1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
BUFFER DE CARGA
Xylene cyanol Migra a aprox. 4Kb Azul de bromofenol Ayuda a visualizar que la muestra este migrando en el gel. Migra a aprox. 200 - 400 pb (depende del porcentaje de la agarosa) GLICEROL Añade densidad a la muestra.
incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace hacia el
ánodo a una velocidad previsible.
Añadir color a la muestra
aumentar la densidad de las muestras para que el ADN caiga
uniformemente en el pocillo
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Aplicar 80 V
De 30-40 min
1- Electroforesis
CARGADO DE MUESTRA
Reacción en Cadena de la Polimerasa
1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
VISUALIZACIÓN
Para cuantificar y/o visualizar el ADN se utilizan agentes colorantes fluorescentes, los cuales aumentan notablemente su emisión cuando se unen a la doble hélice. Son agentes intercalantes que se introducen entre las bases del ADN. Generalmente son policíclicos aromáticos, hidrofobos y planares:
BROMURO DE ETIDIO
Reactivo mutagénico, por lo que se deben trabajar con equipo de seguridad.
El material contaminado con ellos generalmente se trata con nitrito sódico y ácido hipofosforoso para su degradación.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
1- Electroforesis
DETECCIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO
1. Colocar gel sobre un transiluminador, encender la lámpara de UV 2. Visualizar bandas de ADN 3. Tomar fotografía 4. Determinar el peso molecular de las bandas
Marcador de peso molecular
Reacción en Cadena de la Polimerasa
DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
2- Enzimoinmunoanálisis
AMPLIFICACIÓN CON CEBADORES BIOTINILADOS
PCR
B
B
B
Reacción en Cadena de la Polimerasa
DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
2- Enzimoinmunoanálisis
HIBRIDACIÓN CON SONDA ESPECÍFICA
B
F
F
B +
CAPTURA EN MICROPLACA DEL HÍBRIDO
Microplaca revestida con Estreptavidina
F
B
Reacción en Cadena de la Polimerasa
DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
2- Enzimoinmunoanálisis (EIA)
DETECCIÓN COLORIMÉTRICA DEL HÍBRIDO
Microplaca revestida con Estreptavidina
F
B
peroxidasa Reactivo
cromóforo NEGATIVO
POSITIVO
F
B
Reacción en Cadena de la Polimerasa
EIA-PCR - Amplificación NO isotérmica de ácidos nucleicos
Concentración y Purificación del ARN diana • Centrifugado a alta velocidad • Eliminación de componentes plasmáticos (por lavado)
Paso 1
Amplificación • Retrotranscripción (RT) • Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Paso 2
Detección • Hibridización • Revelado colorimétrico
Paso 3
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Centrifugar 1 hora
1000 µL
600 µL
GuSCN Lysis Buffer + CI
Mix, Incubar 10 min
Centrifugar 15 min
Retirar SN
800 µL
Isopropanol
Lavar Pellet, Centrifugar 5 min
Retirar SN
1 ml
70% Ethanol 200 µL HCV
Resuspender Pellet
50µL
100 µL
Plasma
Tubos con Master Mix
HIV
HBV
Diluyente de muestra
EIA-PCR - Amplificación NO isotérmica de ácidos nucleicos
Reacción en Cadena de la Polimerasa
FIN DE LA PARTE 1 – MÓDULO I