Más allá del paso de la hélice: la visualización directa de ADN nativa en solución acuosa.

Resumen

La doble hélice de ADN fue dilucidada por primera vez por JD Watson y Crick FHC hace más de medio siglo. Sin embargo, nadie podía "ver" la estructura conocida. Entre todos los métodos de observación en el espacio real, sólo la microscopía de fuerza atómica (AFM) nos permite visualizar la estructura biológicamente activa de ADN natural en el agua. Sin embargo, las mediciones de AFM convencionales causaban a menudo la deformación estructural de ADN debido a las fuertes fuerzas de interacción que actúan sobre el ADN. Además, la gran superficie de contacto entre la sonda AFM y el ADN nos impidieron imaginar características a escala sub-molecular, más pequeñas que la periodicidad helicoidal del ADN. Aquí, se muestra la observación directa de ADN de plásmido nativo en agua utilizando un AFM-de muy bajo ruido con el método altamente sensible de detección de fuerza (frecuencia de modulación AFM: FM-AFM). Nuestras micrografías de ADN vívidamente exhiben no sólo estructura general de la forma B de doble hélice en agua, sino también las estructuras locales que se desvían de las estructuras cristalográficas de ADN sin ningún daño. Por otra parte, el área de fuerza de interacción en el FM-AFM era lo suficientemente pequeño para discernir claramente grupos funcionales individuales dentro de ADN. La técnica también se aplicó a explorar las nanoestructuras de ADN sintetizados hacia la nanobiotecnología actual. Este trabajo será esencial para la consideración de la relación estructura-función de los sistemas biomoleculares en vivo y para el análisis in situ del ADN basado en nanodispositivos.

Palabras clave: ADN de doble cadena. La microscopia de fuerza atómica de modulación de frecuencia. Nanobioimagen. Nanotecnología del ADN. Autoensamblaje molecular

Desde el descubrimiento de la estructura de la doble hélice del ADN por Watson y Crick, se han realizado amplios esfuerzos por explorar las funciones biológicas basadas en la estructura del ADN. La Fuerza atómica microscópica (AFM)2 es una de las pocas herramientas de observación en el espacio real capaz de visualizar estructuras de biomoléculas en solución. Sin embargo, la estructura submolecular de doble hebra del ADN por AFM no ha tenido éxito por la pobre capacidad de controlar las fuerzas de interacción que actúan sobre el ADN;

Sólo unos cuantos investigadores reportaron imágenes de ADN de doble cadena en solución, con una resolución espacial limitada en el que ranuras de ADN de doble cadena estaban apenas resueltos. Recientemente, el AFM con método de detección de modulación de frecuencia (FM-AFM) se ha utilizado para observar más estructuras detalladas de ADN en solución. Sin embargo, no ha habido más información que la Simetría helicoidal del ADN de la forma B, que ya ha sido determinado por estudios cristalográficos. Aquí, visualizamos directamente el ADN plasmídico de circuito cerrado en una solución acuosa utilizando FM-AFM. La mayor y menor ranuras estaban claramente resueltas, y la alta sensibilidad a la fuerza nos permitió distinguir los grupos fosfatos de la columna vertebral de ADN sin la deformación de la muestra. Además, se demuestra a escala sub-molecular imágenes de cristales de ADN auto-ensamblado en una solución acuosa, que directamente se refieren a la nanotecnología del ADN. Bajo condiciones fisiológicas, la mayoría de las moléculas de DNA (dsDNA) de doble cadena adopta la conformación de la forma B. Las formas B de las moléculas de DNA (DNA de B) tienen estructuras helicoidales diestras y distintivos surcos mayores y menores, que idealmente son descritos por el modelo bien conocido de Watson – Crick del ADN. Las estructuras de la ranura en la superficie de B-DNA están estrechamente relacionadas a las funciones del gen, como formación del núcleo del nucleosoma y el control de la expresión génica de proteínas de unión a ADN. Se utilizó FM-AFM, donde se miden las fuerzas de interacción punta-muestra como el desplazamiento de la frecuencia de resonancia del uno mismo-oscilado voladizo.

Figura 1. Imágenes del FM-AFM de ADN plásmido. (A) Imagen topográfica del FM-AFM típica de la estructura superenrollada el ADN del plásmido circular cerrado (2686 de pares de bases) en solución acuosa (50 mM NiCl 2) (apoyo información figura S5). (B) imagen topográfica de FM-AFM alta resolución del plásmido ADN en solución acuosa (50 mM NiCl 2). Las flechas rojas y azules indican las posiciones de los surcos mayores y menores de B-DNA, respectivamente. Regiones de fusión locales de la DNA de plásmido se indican mediante flechas grises. Recuadro: estructura molecular de la B-ADN. (C) media perfil transversal en el eje de la hélice de ADN se mide en la zona indicada por el rectángulo blanco en (B) (apoyo información figuras S6 y S7). Las flechas rojas y azules indican las posiciones de los surcos mayores y menores, respectivamente.

Figura 2. Comparación del FM-AFM e imágenes simuladas de AFM. (A) ampliada la imagen de la zona indicada por el rectángulo blanco en la figura 1B. (B) perfil sección transversal a lo largo de la línea A-B (A), que es perpendicular al eje de la hélice. (C-E) Simular imágenes AFM de consejos suponiendo que B-ADN con un radio de 0.2 y 1.0 2.0nm. (F-H) corte

transversal de perfiles a lo largo de las líneas A-b C-E, respectivamente, que son perpendiculares a los ejes de la hélice. El perfil en (B) se superpondrá (G) (línea punteada).