Beatriz I. Livellara Medicina Transfusional Hospital Italiano de … Marcadores serologicos... ·...
Transcript of Beatriz I. Livellara Medicina Transfusional Hospital Italiano de … Marcadores serologicos... ·...
Beatriz I. LivellaraMedicina Transfusional Hospital Italiano de Buenos Aires
Hepatitis B VirusHepatitis B Virus
Hepatitis B VirusHepatitis B Virus
• HBV y HCV con la 2º causa de muerte por virus, después del HIV, en el mundo
• 40 % de la población mundial sufrió Hepatitis B
• 5% de infecciones agudas por HBV se transforman en HBV crónica
• 370 millones de personas en el mundo son portadoras de HBV crónicaportadoras de HBV crónica
• Cada año muere 1 millón de personas por complicaciones como:
Cirrosis
Falla hepática
Carcinoma Hepatocelular
Hepatitis B Características Clínicas
Hepatitis B Características Clínicas
• Período de Incubación: Promedio entre 60-90 díasRango 45-180 días
• Enfermedad Clínica(ictericia): <5 años, <10%>5 años, 30%-50%>5 años, 30%-50%
• Mortalidad: 0.5%-1%
• Infección Crónica: <5 años, 30%-90%> 5 años, 2%-10%
• Mortalidad prematura porenfermedad crónica hepática: 15%-25%
Distribución GeográficaInfección Crónica HBV Distribución GeográficaInfección Crónica HBV
HBsAg Prevalencia
≥8% - alta
2-7% - Intermedia
<2% - baja
�Alta (>8%)- riesgo de infección >60%- infecciones comunes en la infancia temprana
� Intermedia (2%-7%)
Caracteristicas de la infección crónica por HBV según prevalencia
Caracteristicas de la infección crónica por HBV según prevalencia
� Intermedia (2%-7%)- riesgo de infección 20%-60%- las infecciones ocurren en todos los grupos etáreos
�Baja (<2%)- riesgo de infección <20%- la mayoria de las infecciones ocurren en adultos en
grupos de riesgo
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Infección Aguda y Crónica HBV en EEUUInfección Aguda y Crónica HBV en EEUU
(4% ) Perinatal (24%)(4%) Niños (12%)
(1-10 años)
Infección Aguda HBV Infección Crónica HBV
(1-10 años)(8%) Adolescentes (6%)Adultos
(83%)
Adultos(59%)
Porcentaje Reportado deHepatitis B en EEUU
Porcentaje Reportado deHepatitis B en EEUU
Po
rcen
taje
(po
r 10
0,00
0)P
orc
enta
je(p
or
100,
000)
10
15
20
25
Grupos por edad (Años)Grupos por edad (Años)
Po
rcen
taje
100,
000)
Po
rcen
taje
100,
000)
Source: CDC Viral Hepatitis Surveillance Program
0-14 15-19 20-29 30-39 40+0
5
10
Incidencia de Hepatitis B aguda en
EEUU, 2002-2007
2007 2006 2005 2004 2003 2002
No. de Casos clínicos agudos reportados (NNDSS) 4519 4758 5494 6212 7526 8064
No. Estimado de casos clínicos agudos 13000 13000 15000 17000 21000 23000agudos 13000 13000 15000 17000 21000 23000
No. Estimado de nuevas Infecciones 43000 46000 53000 60000 73000 79000
Porcentaje de Infectados 4.3% - 5.6%
Numero de Personas con HVB crónicas 800,000 - 1.4 millones de personas
Numero de muertes anuales por Enf crónica de Hígado asociado con hepatitis virales 3000
En Argentina :
1- zona de baja endemicidad prevalencia de infección crónica por HBV:
es inferior al 2%, (cifras que resultan de las determinaciones que se hacen en los bancos de determinaciones que se hacen en los bancos de sangre del país en las muestras de los donantes.)
Concentración de Virus HBVin Varios Fluidos corporalesConcentración de Virus HBVin Varios Fluidos corporales
Alta ModeradoBajo/No
Detectable
sangre semen orinasangre semen orina
suero Sec. vaginal Mat fecal
exudados de heridas saliva sudor
Leche materna
• Sexual
• Parenteral
Hepatitis B Virus Modos de Transmisión
Hepatitis B Virus Modos de Transmisión
• Parenteral
• Perinatal
Transmisión horizontalTransmisión horizontal
Heterosexual*(41%)
DIV(15%)
* Incluye contactos sexuales con casos agudos, portadores y múltiples parejas .fuente: CDC Sentinel Counties Study of Viral Hepatitis
Actividad Homosexual (9%)
Contacto hogareño(2%)Trabajadores de la salud (1%)
Otros (1%)Desconocido (31%)
Transmisión Vertical
•Perinatal (95%)
Adquisión en el momento del parto o en el período perinatal por contacto del recién nacido con secreciones maternas infectadas
•Intraútero : (5%)•Intraútero : (5%)
Adquisición en el último trimestre del embarazo
Si madre HBsAg(+) y HBeAg(+) 90% de posibilidad de transmisión
Si madre HBsAg(+) y Anti HBeAg(+) 10% de posibilidad de transmisión
Organización Genómica del VHB
• S – Codifica las proteínas del AgsHB
• Core –Codifica la proteína core y el AgeHB
• Polimerasa – codifica a la
Dienstag JL. Management of Hepatitis B: A Case-Based Approach. Available at: http://www.meds.com/hepatitis/casebased/dienstag.html
• Polimerasa – codifica a la enzima ADN polimerasa con actividad de transcriptasa reversa
• X – proteina involucrada en la génesis de CHC, indispensable para replicación y propagación
Hepatitis B VirusHepatitis B Virus
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Dominio Pre S1Dominio Pre S2
Dominio S
HBe
Genoma
Polimerasa
Morfologías de la Partícula de Morfologías de la Partícula de Hepatitis BHepatitis B
Polimerasa
Hepatitis B Virión
Partícula de Dane Envoltura Filamentosa
Envoltura Esférica
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
ER
Budding
Reversetranscriptase(polimerasa)
Sangre
HepatocitoVesicular
transport
Ciclo del HBV en el Hepatocito
NúcleoTranscripción
Reparación
Reciclado paramantener cccDNAcccDNA
RNApol
Huesped
Síntesis Cadena
complementaria
síntesisCadenaMenor
Síntesis de Prot S, C, P, e
Translation
RNA(encapsulación)
RNAPre-
genomico
(polimerasa)
Ganem D. In: Fields BN et al, eds. Fields Virology. 3rd ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven; 1996:2703-2737.
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
RESPUESTA INMUNE
INMUNIDAD
CELULAR
INMUNIDAD
HUMORAL
-Ag Hbs
-Ag Hbc
-Ag HBe
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
LINFOCITOS TTTT
Suprimen expresión viral y replicación
RESPUESTA INMUNOLÓGICA y EXPRESIÓN CLÍNICA EN HEPATITIS B
� RI tolerante ALT normal
� RI eficiente Hepatitis aguda B(intensa –especifica –policlonal)
� RI deficiente Hepatitis Crónica B*� RI deficiente Hepatitis Crónica B*(débil-restringida)
� RI excesiva Hepatitis Fulminante
*Necroinflamación Cirrosis, CHC
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Infección con HBV
Hepatitis B Aguda
Con resolución
Hepatitis B Crónica o persistente
Fulminante Hepatitis crónicaPortador
Asintomático
90 % < 10 %
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Favorable (99%) (<<<< al 1%) activaAsintomático
(35%)
Cirrosis
(65%)
Carcinoma
Hepatoceclular
Primario (4%)
Marcador Significado
HBsAg marcador de infección- Infectividad
anti-HBs marcador de recuperación y/o inmunidad a la infección por HBV
anti-HBc IgM marcador de infección aguda.
anti-HBc infección presente y pasada
HBeAg indica replicación activa del virus, por lo tanto HBeAg indica replicación activa del virus, por lo tanto infectividad. Evolución
Anti-HBe pronóstico de resolución
HBV-DNA indica replicación activa del virus, más adecuado que el HBeAg especialmente en casos de mutantes. Usado principalmente para monitorear la respuesta terapéutica (CV)
Curso serológico típicoCurso serológico típicou
lou
lo
Sintomas
HBeAg anti-HBe
Total anti-HBc
Infección Aguda por HBV con Recuperación
HBV-DNA
Semanas post exposiciónSemanas post exposición
Tit
ulo
Tit
ulo
IgM anti-HBc anti-HBsHBsAg
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100
TituloTitulo
Total anti-HBc
HBsAg
Agudo(6 meses)
HBeAg
Cronico(Años)
anti-HBe
ProgresiónProgresión hacia una Infección Crónica por hacia una Infección Crónica por
HVB HVB -- Curso serológico típico
Semanas post exposiciónSemanas post exposición
TituloTitulo
IgM anti-HBc
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 Años
HBV-DNA
¿ Cómo comenzar el diagnóstico de una posible infección por HBV ?
HBsAg y Anti-HBc (total)
PosibilidadesHBsAg (+) HBsAg (-) HBsAg (-)Anti-HBc (total) (+) Anti-HBc (total) (+) Anti-HBc (total) (-)
Diferenciar Hepatitis
Aguda de Hepatitis
Crónica
Anti-HBc AisladoNo existió contacto
con el HBV
VACUNACION2 1
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Detección de Anti-HBc (total) aislado
HBsAg (-), Anti-HBc (total) (+)�Realizar Anti-HBs: si Anti-HBs(+) implica infección pasada
resuelta, paciente inmunizado.
�Si Anti-HBs (-), existen 3 posibilidades: �Si Anti-HBs (-), existen 3 posibilidades:
a) infección muy lejana con pérdida del Anti-HBs
b) paciente con replicación residual / OBI, con HBsAg (-)
c) falso positivo metodológico
En este caso: hacer 1 dosis de vacuna y medir al mes Anti-HBs:
Si Anti-HBs (+) con alto título: implica a)
Si Anti-HBs (+) con bajo título implica c), seguir plan de vacunación.
Si Anti-HBs (-), implica situación b), ver replicación residual por PCR.
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
XIX Congreso Latinoamericano de Bioquímica Clínica Chile 2010
ANTICUERPOS ANTI CORE REACTIVO
EN BANCO DE SANGRE: UN DESAFIO A RESOLVER.
Nardi MA1, Arrigo DJ1, De Cristofano MA1, Frangi E1, Bianco G2, Livellara BI1.
1Laboratorio Central – 2Hemoterapia - Hospital Italiano de Buenos Aires
Buenos Aires - Argentina
r
Resultados
• El Anti-HBc como único marcador reactivo, ha sido reportado en 0,4% a 1,7% de los donantes de Bancosde Sangre en zonas de baja frecuencia, dato coincidente con el 0,4% (61/14689) encontrado por nosotros
• Esto se podría atribuir a una reactividad inespecífica del método de detección.de detección.
• Con respecto a los portadores crónicos (Anti-HBe positivo y HBsAg negativo) encontramos un 3,7% sin movimiento de transaminasas.
• En relación a los casos de infección pasada, con pérdida de anti- HBs detectamos un 18,5% confirmadocon la presencia de anti-HBe.
Conclusión
• En base a nuestros resultados concluimos que es indispensable derivar a estos donantes al Servicio de Hepatología donde se complete el estudio de marcadores virológicos que estudio de marcadores virológicos que habitualmente no se realizan en los bancos de sangre y eventualmente definir la indicación de vacunación para hepatitis B con la finalidad de elevar el valor de los anticuerpos antiHBs.
Diferenciar Hepatitis B aguda de crónica
HBsAg (+) , Anti-HBc (total) (+)Utilizar: Anti-HBc (IgM)
�Si Anti-HBc (IgM): (+) INFECCION AGUDA
2
�Si Anti-HBc (IgM): (+) INFECCION AGUDA
�Si Anti-HBc (IgM): (-) INFECCION CRONICA
DEFINIR FASE DE REPLICACION VIRAL Y ESTADIO DE LA INFECCION CRÓNICA
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
¿Qué marcadores usar para caracterizar una Hepatitis B crónica?
Utilizar los siguientes marcadores:
�HBeAg�HBeAg�Anti HBeAg �HBV-DNA cualitativo�HBV-DNA cuantitativo.
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Hepatitis B Crónica
La utilización de los marcadores debe permitir diferenciar y estratificar a los pacientes entre las siguientes variantes:
�Hepatitis B crónica ACTIVA con HBV HBeAg (+) (cepa salvaje)�Hepatitis B crónica ACTIVA con HBV HBeAg (+) (cepa salvaje)
�Hepatitis B crónica con HBV HBeAg (-) (mutante pre-core)
�Hepatitis B crónica portador inactivo HBsAg (+) antiHbe (+)
�Hepatitis B crónica ACTIVA con HBV HBeAg (+) y anti Hbe (+) cepa mutada
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Métodos de Biología Molecular
� Determinación cualitativa del HBV – DNA:Nested – PCR
� Determinación carga viral
� Determinación genotipo: actualmente nopresentan utilidad clínica
� Mutantes pre –core y otras mutantes
� Resistencia a antivirales
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Aplicaciones
Diagnóstico PCR (cualitativa)
Pronóstico y carga viralSeguimiento (PCR) (cuantitativa)
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
PCR CualitativaPCR CualitativaMétodo no comercial (“in house” o “home made”)
� Nested PCR: doble reacción en cadena de lapolimerasa (Nested – PCR) y revelado delamplicón en geles de poliacrilamida.
�Región amplificada: gen de la proteína delcore y gen S l
�Límite de detección : lo determina el laboratorio� Resultado: - Positivo: se detecta
- Negativo: No se detectaHOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
PCR cualitativa AplicacionesPCR cualitativa Aplicaciones
� Infección aguda en estadíos tempranos
� Perfil serológico discordante
� Infección vertical
� Diagnóstico de infección en inmunosuprimidos
� Definir replicación activa en pac con patrón infcrónica
� Definir inf oculta HBV (OBI) ( Ags -): mutante deescape
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Métodos Cuantitativos HBV - DNACarga Viral
Fundamento
Amplicar HBV Monitor(Roche)
Amplificación de target
VERSANT HBV DNA 3.0
(Bayer)
Amplificación de señal
COBAS Taq ManHBV – CV(Roche)
Amplificación y detección Simultánea de target
Rango linealde medición
Manual: 1000 – 40.000.000
copias/ml
COBAS: 300 – 200.000
copias/mlo
60 – 38.000 UI/ml
2000 – 100.000.000 copias/ml
o350 – 17.850.000
UI/ml
Simultánea de target
69 – 640.200.000copias/ml
o12- 110.000.000 UI/ml
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
� Cambios CV cuando: la ≠ de las muestars analizadas es < 0,5 log → sin tto. O no respondedor� Cambios significativos de la CV cuando: la ≠ de las muestars analizadas es > 1 log → con tto.
Incidencia Acumulativa de Cirrosis Hepática Relación con nivel inicial de ADN VHB
Ind
ice
acu
mu
lati
vo d
e ci
rro
sis .4
.3
> 1.000.000
100.000 – 1.000.000
10.000 – 100.000
300 – 10.000
< 300 (no detectable)5,6
6,5
RR:
Ind
ice
acu
mu
lati
vo d
e ci
rro
sis
Iloeje UH et al. Gastroenterology 2006;130:678-686
.2
.1
01 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
años de seguimiento
2,5
5,6
Incidencia Acumulativa de Carcinoma Hepatocelular Relación con nivel inicial de ADN VHB
Ind
ice
acu
mu
lati
vo d
e C
HC
14
12
> 1.000.000
100.000 – 1.000.000
10.000 – 100.000
300 – 10.000
< 300 (no detectable)
3,5 / 3,1
12,1 / 7,9
14,8 / 13,5
Age neg, ALT normal, no cirrosis
Ind
ice
acu
mu
lati
vo d
e C
HC
Chen Ch-J et al. JAMA 2006; 295: 65-73
3
1
01 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
años de seguimiento
3,5 / 3,1
1,3 / 0,8
Genotipo HBV�Se han descrito hasta ahora 8 genotipos (A hasta H).
�Resta confirmar todavía su distribución mundial y que implicancias clínicas tendrían:– asociación con carga viral( demostrado en pacientes del
sudeste asiático (Chu & Lok Hepatology 2002:35) – Tasa de seroconversión de HBeAg– Patrones mutacionales región preCore-Core– Patrones mutacionales región preCore-Core– Severidad de la enfermedad hepática– Manifestaciones clínicas– Respuesta al tratamiento.
�Definición del genotipo: secuenciación – LIPA
�Cambio o adición de otra alternativa terapéutica
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Diferentes formas clínicasDiferentes formas clínicasDiferentes formas clínicasDiferentes formas clínicasDiferentes formas clínicasDiferentes formas clínicasDiferentes formas clínicasDiferentes formas clínicas
HepatitiscrónicaActiva
HBs Ag ⊕ > 6 mesesHbe Ag ⊕ (o Hbe Ag /anti Hbe ⊕: mutante precore)HBV DNA > 100.000 copias/ml↑ Intermitente o persistente TGPBiopsia con un Indice de activ. histológica (IAH) >4
HBs Ag ⊕
Hbe Ag Negativo /anti Hbe ⊕
-
-Portadorinactivo
Hepatitisresuelta
Hbe Ag Negativo /anti Hbe ⊕
HBV DNA < 100.000 copias/mlTGP persistentemente NBiopsia IAH < 4
HBs Ag NegativoAnti HBc ⊕ ± anti Hbs ⊕
HBV DNA no detectableTGP persistentemente N
-
-
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
TRATAMIENTOTRATAMIENTO
Objetivos:
- Suprimir por largo plazo la replicación viral
- Prevenir enfermedad hepática terminal
Indicación:
- Paciente con HB crónica y/o cirrosis por HBV con
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
- Paciente con HB crónica y/o cirrosis por HBV con
elevación de transaminasas y replicación viral
- No tratar pacientes con transaminasas
persistentemente normales
� Inmunomoduladores: INF α - 2b o 2a
� Inhibidores directos de la replicación:
- Lamivudina (LAM)
- Adefovir dipivoxil (ADF)
- Entecavir
EntryER
Budding
Recycling to
maintain stablePlus
strandsynthesis
Minusstrand
Reversetranscriptase
P protein
Bloodstream
Hepatocyte
Vesicular
transport
XX
X
Hepatocyte
nucleus
Transcription
Repair
cccDNA
cccDNA
HostRNApol
synthesisstrand
synthesis
S, C, P, e synthesis
Translation
RNApackaging
(encapsulation)
Pre-genomic
RNA
X
X
HBV crónicaHBV crónicaHBV crónicaHBV crónicaHBV crónicaHBV crónicaHBV crónicaHBV crónica
� Factores de laboratorio para evaluar tto.
- ↑ TGP (2 veces VN)- ↑ CV - HBV- Age HBV ⊕
� Monitoreo: respuesta al tto(INF - 2b, lamivudina, adefovir dipivoxil)
� Monitoreo: respuesta al tto(INF α - 2b, lamivudina, adefovir dipivoxil)
- Bioquímica: TGP N- Virológica: HBV - DNA no detectable (< 100.000 copias)
Age HBV Negativo- Completa: bioq. + virológica + histol. (↓ 2 puntos score IAH)
-
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
VACUNACION HEPATITIS BVACUNACION HEPATITIS BVACUNACION HEPATITIS BVACUNACION HEPATITIS BVACUNACION HEPATITIS BVACUNACION HEPATITIS BVACUNACION HEPATITIS BVACUNACION HEPATITIS B
� Esquema ideal: 0,1 y 6 m�Obligatoria trabajadores de la salud desde 1992� Obligatoria RN desde 01/11/00 (Res. Ministerio de Salud) dentro de las 24 hs �2003 en el país es obligatoria la vacunación para niños de 11 años como prevención antes del inicio de la
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
para niños de 11 años como prevención antes del inicio de la vida sexual.Estudio serológico previo: sólo en grupos de alto riesgo y zonas de alta endemicidad y post en grupos de riesgo� Respuesta a la vacuna disminuye con la edad � Disminuye la inmunogenicidad en obesos, tabaquistas, IS y cirróticos
• No respondedores: segundo esquema completo• Grupos de riesgo
- Homosexuales- Adictos a drogas IV
- Hetero con antecedentes de ETS y pareja múltiple- Paciente en lista de espera para TX- Paciente en lista de espera para TX- Conviviente y contacto sexual con HB aguda o crónica- Hemodializados, transfundidos- Pacientes HIV positivos- Hepatopatía crónica
• “Si sólo se protege al recién nacido con la vacuna en las primeras 12 horas de vida, la eficacia de esa protección alcanza a un 75 a 77%, en cambio si a esa vacuna se le agrega 77%, en cambio si a esa vacuna se le agrega simultáneamente la gama globulina hiperinmune al que la requiera, la protección asciende a un 97%”
MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION.