Aseguramiento de Calidad de Medio y Reactivos

Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiologa ClnicaCCI-SEIMC-00Realizado: Grupo colaborador GEGMIC Fecha: 16-05-04 Versin: 1 Pg. 1/4

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CCI-SEIMC-00

RECOMENDACIONES PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO:JUSTIFICACIN Y OBJETIVOS

Concepcin Gimeno Cardona

Servicio de Microbiologa. Hospital Clnico Universitario de Valencia y Facultad de Medicina.Universidad de Valencia. Avda Blasco Ibez, 17. 46010-Valencia. Telfono: 96 3987823. Fax:96 3987836. E-mail: [email protected]


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ndice

1. CCI-SEIMC-00: Objetivos

2. CCI-SEIMC-01: Control Interno de Calidad en las fases pre y postanaltica

3. CCI-SEIMC-02: Control Interno de Calidad en medios de cultivo y reactivos

4. CCI-SEIMC-03: Relacin y uso de cepas de referencia

5. CCI-SEIMC-04: Control Interno de Calidad en equipos

6. CCI-SEIMC-05: Control Interno de Calidad en estudios de sensibilidad

7. CCI-SEIMC-06: Control Interno de Calidad en Micobacteriologa Clnica

8. CCI-SEIMC-07: Control Interno de Calidad en Micologa Clnica

9. CCI-SEIMC-08: Control Interno de Calidad en Parasitologa Clnica

10. CCI-SEIMC-09: Control Interno de Calidad en Virologa Clnica

11. CCI-SEIMC-10: Control Interno de Calidad en Serologa de las enfermedades infecciosas

12. CCI-SEIMC-11: Control Interno de Calidad en Microbiologa Molecular

13.- Anexo autores por orden alfabtico


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1. INTRODUCCIN: JUSTIFICACIN

El Grupo de Gestin en Microbiologa (GEGMIC) pretende que una de sus actividadessea la elaboracin de documentos o guas con recomendaciones sobre determinados temas decalidad que no estn claramente protocolizados ni consensuados por los microbiolgos clnicos.Muchos son los temas en que habamos pensado, pero decidimos que podamos empezar pornormalizar y documentar las pautas a seguir para el control de calidad interno. Para ello, nosreunimos un grupo de personas interesadas en estos aspectos y comenzamos la ardua tarea dedocumentar lo que de forma habitual hacemos en la mayora de los laboratorios deMicrobiologa, intentando mejorarlo, siguiendo las recomendaciones de otras sociedades, deENAC y con la colaboracin de otros grupos de estudio de la SEIMC, como MICOMED yGEMARA.

Se decidi denominar al documento como Recomendaciones para el Control de CalidadInterno en Microbiologa Clnica e identificarlo como la Gua de Calidad CCI-SEIMC. La versin1 del documento completo se repartir durante la reunin del Grupo de Gestin enMicrobiologa Clnica, que tendr lugar en Bilbao. Tras esta presentacin el documento serincluido en la pgina web de GEGMIC durante un mes para que pueda ser ledo y se hagan laspertinentes aclaraciones, consultas y modificaciones hasta obtener un documento aceptado portodos y que pueda servir como base para la acreditacin de los laboratorios de MicrobiologaClnica.

La Junta Directiva de GEGMIC agradece a los participantes el esfuerzo desarrollado enla elaboracin del documento de recomendaciones para el control de calidad interno enMicrobiologa Clnica y reconoce la gran calidad de las aportaciones. Asimismo, agradece lacolaboracin de Abbott Cientfica por la subvencin de dos reuniones de preparacin.

Decidimos dividirlo en varios captulos, uno que abarcara a las fases preanaltica ypostanaltica y subdividir la fase analtica en las distintas partes de la microbiologa. Loscaptulos desarrollados son: Control Interno en la Fase Preanaltica y Postanaltica, Control demedios y reactivos, Cepas de referencia, Control de equipos, Control interno en estudios desensibilidad, Micobacteriologa Clnica, Micologa Clnica, Parasitologa Clnica, Virologa Clnica,Serologa de las enfermedades infecciosas y Microbiologa Molecular.

Para que las revisiones peridicas de cada captulo sean factibles sin modificar laestructura del documento global, se ha editado con numeracin independiente para cadacaptulo, con un ndice general sin paginar. Cada captulo comienza desarrollando su ndiceespecfico y se estructura como mximo en tres subapartados. Los autores figuran al comienzodel captulo que en el que han colaborado y en un anexo final donde estn recogidos por ordenalfabtico.

2. OBJETO

El programa de control interno de calidad asegura que la informacin generada por ellaboratorio es exacta, adecuada y reproducible. Permite alertar a los profesionales dellaboratorio de Microbiologa Clnica de posibles resultados insatisfactorios, que pueden y debenser corregidos.

Antes de implantar un programa de control de calidad interno, el laboratorio debedefinir las estrategias de diseo e implantacin, debe definir sus especificaciones de calidadanaltica, as como seleccionar los mtodos y equipos adecuados y conocer los puntos crticospara mantener un funcionamiento estable y fiable de los procesos analticos.


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El establecimiento de un programa de control de calidad interno, permite puesmonitorizar con carcter continuo las actividades del laboratorio, la verificacin puntual de losresultados de cada lote de reactivos, de cada serie analtica, as como de los equipos. Reflejalas desviaciones del sistema sometido a control y permite la toma de decisiones.

El propsito de las presentes recomendaciones es establecer las directrices paraasegurar la calidad en los procedimientos de Microbiologa Clnica en lo que afecta tanto alprocesamiento inicial de las muestras como a los procesos analticos, incluyendo los controlesde medios y reactivos necesarios en las diversas tcnicas analticas. Asimismo, este documentoestablece las recomendaciones generales sobre la dotacin y condiciones estructuralesadecuadas para algunos aspectos de los laboratorios de Microbiologa Clnica.

3. ALCANCE

Las recomendaciones se aplicarn a los diferentes procedimientos o ensayos que serealizan para diagnosticar las infecciones en los laboratorios de Microbiologa Clnica.

4. PERSONAL

Los anlisis deben ser realizados por personal tcnico cualificado con experiencia enMicrobiologa.

La supervisin de los anlisis y la interpretacin de los resultados debe realizarse porpersonal facultativo especialista en Microbiologa Clnica.

Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiologa ClnicaCCI-SEIMC-01Realizado: Grupo Colaborador de GEGMIC Fecha: 16-05-04 Versin: 1 Pg. 1/10

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CCI-SEIMC-01

RECOMENDACIONES PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO ENLAS FASES PREANALTICA Y POSTANALTICA

Javier Aznar Martn1 y Elena Loza Fernndez de Bobadilla2

1Servicio de Microbiologa. Hospital Universitario Virgen del Roco. Departamento deMicrobiologa. Universidad de Sevilla. Apdo 914. 41080 Sevilla.2Servicio de Microbiologa. Hospital Universitario Ramn y Cajal. Carretera deColmenar, km 9. 28034 Madrid.


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ndice

ndice

Objeto

Alcance

Personal

Fase Preanaltica

Hoja de peticinCita para la toma de muestrasObtencin de las muestrasPreparacin de las muestrasTransporte de las muestrasRecepcin de las muestrasRequisitos de las muestrasCriterios de aceptacin/rechazo de las muestrasRegistro de solicitudesPreparacin de las muestrasConservacin de las muestras

Fase Analtica

Validacin clnica de los resultadosElaboracin y edicin del informeTransporte del informeDistribucin del informeRecepcin del informe

Cuadro resumen


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Objeto

El objeto de las presentes recomendaciones, tras analizar las diferentes tareas quedeben realizarse desde que se solicita una prueba al laboratorio de Microbiologa Clnica hastaque el solicitante recibe el informe, es la descripcin de las normas que garanticen la realizacinde todas las tareas de forma impecable y coordinada, teniendo en cuenta las expectativas delos profesionales que en ellas participan.

El objetivo final es asegurar que el proceso asistencial del laboratorio de Microbiologapermita obtener unos resultados de calidad, adecuando el proceso a las necesidades de losdiferentes clientes del mismo.

Alcance

Es el conjunto de actuaciones necesarias para la correcta obtencin, transporte yconservacin de las muestras, as como la elaboracin de criterios de recepcin y deaceptacin/rechazo de las mismas garantizando, al mismo tiempo, la mxima informacin deutilidad clnica para la ptima aplicacin de las tcnicas de diagnstico microbiolgico amuestras biolgicas de origen humano.

La gran cantidad de profesionales y actividades implicadas en el proceso asistencial delos laboratorios de Microbiologa Clnica exige una actuacin coordinada entre los diferentesestamentos que participan en dicho proceso, tanto de asistencia primaria como especializada,incluyendo a profesionales sanitarios y no sanitarios.Estas recomendaciones deben extenderse desde la prescripcin de un estudio por un facultativohasta la recepcin por el mismo de un informe con el resultado diagnstico.

Personal

La obtencin de las muestras debe ser realizada por personal facultativo y deenfermera siguiendo las normas recogidas en el Manual de extraccin, toma y transporte demuestras elaborado por el Servicio de Microbiologa.

El personal que realiza el transporte de las muestras debe estar habilitado para ello ytener establecida una relacin contractual que determine condiciones, custodia y tiempos detransporte, as como poseer formacin especfica para el transporte de muestras biolgicas.

FASE PREANALTICA

1.- Hoja de peticin

El documento o volante de solicitud deber ser: Simple y fcil de cumplimentar. nico para cada muestra y estudio/prueba solicitado. Que permita la identificacin inequvoca del paciente, muestra y estudio/prueba

solicitado.

Para ello, el volante de solicitud deber especificar de forma legible todos los datos deidentificacin del paciente (nmero de historia clnica, de la seguridad social o DNI, nombrecompleto y ubicacin, servicio solicitante, mdico solicitante, tipo de muestra (descripcincompleta y mtodo de obtencin), fecha y hora de recogida, diagnstico, motivo de la peticin,antibioterapia previa y precisar el estudio o prueba solicitada.


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Las pruebas solicitadas deben estar incluidas en la Cartera de Servicios del Laboratoriode Microbiologa y ser adecuadas a las caractersticas clnicas del paciente segn lasindicaciones de Protocolos consensuados, Algoritmos de Decisin, Guas de Prctica Clnica, etc.

El mdico informar al paciente, segn las instrucciones que se describen en la Carterade Servicios, sobre:

Pruebas solicitadas.Lugar y hora de la toma de muestras.Condiciones de preparacin previas para la toma de muestras.Suministro de recipientes adecuados, si fuera necesario.

En pruebas que requieran consentimiento informado: entrega y explicacin deldocumento especfico.

2.- Cita para la toma de muestras

1. Adecuada en da y hora a las necesidades del paciente.2. Registro de los datos sin errores administrativos.3. Atencin personalizada, amable y correcta.4. Indicacin del lugar y hora de la toma de muestras, as como de las condiciones de

preparacin previas.5. Suministrar recipientes adecuados si fueran necesarios.

3.- Obtencin de las muestras

1. Requisitos de los centros o salas de obtencin de muestras: rea de extracciones y toma de muestras, sala de espera para los pacientes y

servicios de higiene correspondientes. Los profesionales encargados de la extraccin y toma de muestras dispondrn de:

! Manual de extraccin, toma y transporte de muestras elaborado por el Servicio de Microbiologa.! Contenedores adecuados y en perfectas condiciones.

Horario de extracciones y recogida de muestras acorde a sus caractersticas. Normas de seguridad biolgica para la eliminacin de contenedores y elementos

potencialmente peligrosos. Normas de trabajo que garanticen la seguridad del trabajador.

2. El personal de los centros o salas de extraccin estar legalmente habilitado y demostrarsus capacidades y competencias para la toma y recepcin de muestras.

3. En general: Se comprobar siempre la correspondencia entre la solicitud y la identidad del

paciente. Se verificar si el documento de solicitud contiene todos los datos identificativos. Se rechazarn aquellas solicitudes que no estn cumplimentadas con todos los datos

imprescindibles de identificacin del paciente y pruebas solicitadas, y que no puedanser subsanadas en el momento de la extraccin.

Se registrarn los datos de identificacin de la persona que realiza la extraccin de lamuestra, la hora y la fecha de la misma, as como los incidentes que se hayanproducido.

Se identificarn los contenedores en el momento de la obtencin de la muestra,siguiendo las normas bsicas establecidas en el Manual de obtencin de muestras.


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4.- Preparacin de las muestras

1. Preparacin del envo: En el punto de extraccin se confeccionar un registro diario de recogida y

transporte de muestras en el que estn relacionados los contenedores remitidos porcada solicitud.

El registro incluir el nombre de la persona que ha preparado el envo, la hora enque se recoge y quin realiza el transporte.

Una copia del registro quedar en el centro de extraccin y otra acompaar a lasmuestras (hoja de ruta).

Al llegar al laboratorio, la persona que recoge las muestras deber firmar y hacerconstar la hora de recepcin.

2. Existir un registro de custodia legal, cumpliendo los requisitos necesarios para eltransporte de muestras, con implicaciones judiciales, segn la normativa legal vigente.

5.- Transporte de las muestras

Existir un sistema unificado de transporte de muestras entre los puntos de extracciny el laboratorio de Microbiologa.

1. Toda muestra de origen humano es potencialmente infecciosa y el transporte debeefectuarse de acuerdo a las siguientes normas:

Muestras:- Transporte en contenedores hermticos que eviten el riesgo de infeccin al personal

que los manipule y su posible contaminacin externa.- Los contenedores deben transportarse verticalmente y cerrados. El sistema de

transporte evitar la agitacin mecnica.

Neveras/contenedores:- Dotadas de relleno absorbente.- Identificacin externa de que contienen material de riesgo biolgico.- Contenedor estanco y opaco a la luz.- Mantenimiento de la temperatura adecuada para cada muestra (neveras

termostatizadas). Control de temperatura con termmetro de mxima y mnima.

El transporte debe ser lo ms rpido posible. Si no fuera as, se utilizarn condiciones depreparacin y conservacin adecuadas de acuerdo con las especificaciones de la Cartera deServicios y el Manual de extraccin, toma y transporte de muestras.

2. Deben establecerse normas de actuacin en caso de accidente o avera en el transporte, ascomo las medidas de seguridad biolgica.

3. En caso de transporte de muestras entre laboratorios, seguir las normas del laboratorio dedestino. Es responsabilidad del laboratorio de origen el cumplimiento de las normasnecesarias para garantizar que la muestra llegue en perfectas condiciones para su estudio.

4. En el transporte de las muestras se seguirn las siguientes normas especficas: Del domicilio al centro: Control de temperatura y tiempo de transporte, especificado

en la Cartera de Servicios. Del punto de extraccin perifrico al laboratorio:- Control de temperatura y tiempo de transporte, especificado en la Cartera de

Servicios. Transporte intrahospitalario:


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- Manual: Control de temperatura y tiempo de transporte, especificado en Cartera deServicios.

- Neumtico:a Evitar sistemas con paradas intermedias para disminuir aceleraciones/

desaceleraciones.b Llenar los tubos al mximo (segn instrucciones del fabricante) para disminuir la

agitacin. Entre laboratorios:- Seguir PNT del laboratorio de destino.

5. Personal que realiza el transporte: Transportista:

- Personal habilitado para el transporte de muestras con relacin contractual quedetermine condiciones, custodia y tiempos de transporte.

- Formacin especfica para el transporte de muestras biolgicas.- Actuar durante el transporte segn las normas del laboratorio.- Priorizar el transporte de muestras sobre otras tareas.

Celador/Paciente/Familiar: Se les indicarn las normas a seguir durante el transporte especificadas en la Cartera

de Servicios del laboratorio.

6.- Recepcin de las muestras

El laboratorio dispondr de un Manual de Normas de recepcin y aceptacin demuestras.1. Recepcin de muestras procedentes de centros de extraccin:

1.1. Entrega por el transportista:- El transportista entregar las muestras y los volantes de solicitud.- Firmar en la hoja de ruta y anotar la hora de entrega.- Registrar en la hoja de ruta cualquier incidencia durante el transporte.- Obtendr copia de la hoja de ruta firmada por el responsable de la recepcin, en la

que se especificar si hay rechazos y la causa.1.2. Recepcin:

- El responsable de la recepcin debe confirmar la entrega de las muestras y lassolicitudes.

- El responsable debe recoger las incidencias comunicadas por el transportista.

2. Recepcin de muestras obtenidas en el hospital, procedentes de centros de extraccin oentregadas directamente por el paciente/familiar:

- Comprobacin de la correspondencia de la muestra con la solicitud.

7.- Requisitos de las muestras

El laboratorio de Microbiologa debe determinar si la muestra cumple los requisitos paraser procesada segn el Manual. Entre otros, incluyen:

Correcta identificacin. Comprobacin de la idoneidad de la muestra para la realizacin completa de las

pruebas solicitadas. Condiciones adecuadas de transporte y conservacin.

Las muestras y/o solicitudes que no se adapten a las normas de calidad preanalticasestablecidas en el Manual sern rechazadas.


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8.- Criterios de aceptacin/rechazo de las muestras. Protocolos de decisin

Deben estar establecidos en el Manual. Las incidencias ms frecuentes y las acciones arealizar son las siguientes:

1. Muestra deficientemente identificada. Se contactar con el servicio peticionario.2. Muestra derramada. Se solicitar nueva muestra.3. Transporte/conservacin inadecuado. Se solicitar nueva muestra.

El laboratorio tendr la capacidad de rechazar una muestra o una solicitud queconsidere inadecuada para realizar un determinado diagnstico de acuerdo con losprotocolos de decisin.

Ante una solicitud oral de ampliacin de estudios siempre debe existir la autorizacinde un facultativo del laboratorio y registrarse la prueba solicitada en la peticinprevia, indicando la fecha de la ampliacin, as como el nombre del mdico que lasolicita.

Se dispondr de un sistema de registro de incidencias en el que figure la muestraimplicada, el tipo de incidencia, la persona con la que se contacta del serviciosolicitante y la resolucin de la incidencia.

9.- Registro de solicitudes

Si una muestra es apta para ser procesada, se proceder al registro de los datos delvolante de peticin, de forma manual o en soporte informtico, segn el procedimientoestablecido en el Laboratorio.

El sistema informtico de gestin del laboratorio deber cumplir unas especificacionesreferentes a fiabilidad y diferentes niveles de acceso a la informacin. Deber, asimismo,garantizar la trazabilidad y la confidencialidad de los datos (ley de proteccin de datos).

10.- Preparacin de las muestras

Clasificacin de las muestras en funcin del laboratorio o rutina de destino. Centrifugacin de las muestras segn las especificaciones de las normas internas del

laboratorio. Decapsulacin de tubos segn las especificaciones de las normas internas del

laboratorio, teniendo en cuenta los aspectos de seguridad biolgica. Preparacin de alcuotas. Identificacin del tubo principal y de las alcuotas (cdigo

de barras o identificacin propia de cada laboratorio o rutina). Preparacin de otras muestras biolgicas segn los PNT especficos para los

diferentes estudios.

11.- Conservacin de las muestras tras su procesamiento

Mantener todas las muestras (procesadas y rechazadas) a temperatura ambiente,refrigeradas o congeladas, segn los protocolos, durante un tiempo que garantice que unproblema en el procesamientoo en la interpretacin de los resultados obtenidos pueda ser solucionado recuperando lamuestra para un nuevo procesamiento (normalmente entre 1 y 3 das).


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FASE POSTANALTICA

1.- Validacin clnica de los resultados

En esta ltima actuacin antes de la entrega del informe se estudia la congruencia delresultado del informe o de varios resultados de un mismo informe, se cotejan los resultados conlos de informes precedentes y se verifica su coherencia con los datos fisiolgicos y clnicos delpaciente. Esta validacin clnica ha de realizarla un especialista en Microbiologa.

La validacin clnica incluye la repeticin o ampliacin de exploraciones.

La firma de la persona autorizada que valida el informe puede establecerse a travs desistemas electrnicos o autorizaciones escritas que garanticen la identidad de la persona quevalida.

2.- Elaboracin y edicin del informe

Una vez comprobados los resultados, el facultativo especialista en Microbiologa aportaral informe los comentarios que considere necesarios para:

Ayudar a la interpretacin de los mismos. Indicar nuevas exploraciones. Aconsejar pautas clnicas.

El informe puede ser provisional o definitivo y debe indicarse en el mismo estacircunstancia.

Todo informe de laboratorio ser editado tras ser completado por lo menos una vez.

3.- Transporte del informe

Debe garantizarse la confidencialidad de los datos en todo momento. Entrega de resultados:

Se entregarn en el plazo establecido por la Cartera de Servicios para cada prueba.Resultados urgentes: se establecer el mecanismo adecuado que garantice la recepcin

del informe, por parte del facultativo responsable del paciente, en el menor plazo posible desdesu edicin.

Instaurar sistemas que permitan entregar los resultados directamente en el destinofinal, con el fin de agilizar la entrega y evitar prdidas.

Sistemas de transporte:- Informe impreso y reparto manual. Registro donde quede constancia de la persona que haceel reparto y la que lo recibe (hoja de ruta de informes).

- Informe electrnico. Cuando el envo se realice por sistema electrnico (intranet, web, correoelectrnico, fax, impresin remota) se establecern medios alternativos en previsin de fallos endichos sistemas.

4.- Distribucin del informe

La distribucin se har de forma que se facilite la llegada rpida a su destinatario. ElCoordinador del Laboratorio implantar estrategias que eviten errores de destino,recogidas en el manual correspondiente que editar el laboratorio dentro de sudocumentacin.


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En caso de que se produzcan errores en la entrega y distribucin de resultados, estosquedarn reseados en un registro de reclamaciones para su anlisis y proposicin delas acciones correctoras pertinentes.

Si se emite un duplicado de informe, la fecha de emisin debe ser la de la impresinoriginal del mismo, haciendo constar que se trata de una copia y la fecha de la misma.

Los informes son confidenciales, por lo que el laboratorio instaurar los mecanismosque garanticen que todo el personal mantendr un estricto control de la custodia yconfidencialidad de los datos del paciente.

El laboratorio establecer los procedimientos correspondientes para garantizar latrazabilidad del proceso de informacin de los resultados.

5.- Recepcin del informe

La recepcin de los informes quedar registrada en la hoja de ruta de recepcin de losinformes.

Se comprobar la recepcin de todas las peticiones realizadas. Se registrarn las reclamaciones sobre informes no recibidos o incompletos indicando

motivo y procedencia.


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RECOMENDACIONES PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO EN LAS FASESPREANALTICA Y POSTANALTICA. CUADRO RESUMEN

Normas de obligado cumplimiento

1.- El Servicio de Microbiologa tiene que elaborar y revisar anualmente los siguientesdocumentos:a) Manual de extraccin, toma y transporte de muestras biolgicas para el diagnstico

microbiolgico.b) Cartera de servicios.c) Criterios de aceptacin/rechazo de muestras biolgicas.d) Normas de seguridad biolgica.

Estos documentos tienen que ser revisados anualmente por el Director del laboratorio.

Las modificaciones de estos documentos o la inclusin de nuevos protocolos tienen queser autorizados por el Director de Laboratorio.

Los manuales tienen que estar disponibles en todas las reas donde se realicenextracciones de muestras para diagnstico microbiolgico.

2.- En la hoja de peticin tienen que cumplimentarse todos los datos identificativos delpaciente.

Tiene que existir una identificacin inequvoca de la muestra y el volante de solicitud deestudio/prueba.

3.- En todas las reas de extraccin de muestras tiene que haber disponibilidad decontenedores estriles y de cierre hermtico.

4.- Durante todo el proceso de transporte tienen que mantenerse las condiciones deconservacin de la muestra. No se puede exceder el tiempo mximo establecido en la Carterade Servicios desde la obtencin de la muestra hasta su recepcin en el Servicio deMicrobiologa.

5.- La elaboracin de cualquier tipo de informe y su validacin clnica tienen que ser realizadosexclusivamente por un especialista en Microbiologa Clnica.

Recomendaciones

Todas las normas recogidas en el documento a excepcin de las reseadas en elepgrafe anterior.


CCI-SEIMC-02

Recomendaciones sobre el aseguramiento de la calidad demedios de cultivo y reactivos

Consuelo Miranda1 , Lorena Lpez2 , Ana Lloret Caballeria3 y Amparo Farga Marti4

1Servicio de Microbiologa. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Avda de la FuerzasArmadas s/n. Granada. 18014. Telfono 958 020465. Correo electrnico:[email protected]

2Departamento de Microbiologa. Hospital Universitario Virgen Macarena. Avd Dr. Fedriani s/n.Sevilla. 41009. Telfono 955 008138. Correo electrnico: [email protected]

3Unidad de Microbiologa. Hospital Arnau de Vilanova. Valencia. Telfono 96 3868504. Correoelectrnico: [email protected]

4Unidad de Microbiologa. Hospital Arnau de Vilanova. Valencia. Telfono 96 3868504.Correoelectrnico: [email protected]

El presente documento se distribuye como copia no controlada


ndice

Objetivo y alcance..........................................................................................................................................3

Personal ...........................................................................................................................................................3

Condiciones ambientales...............................................................................................................................3

Programa de limpieza ................................................................................................................................3

Manuales de Procedimientos ........................................................................................................................4

Control de calidad interno de los medios de cultivo preparados en el laboratorio...............................4

a) Control de los medios deshidratados y de los aditivos comerciales ..............................................4

b) Control de la preparacin de los medios de cultivo o aditivos .......................................................5

c) Control del medio preparado ...............................................................................................................5

Control de calidad interno de los reactivos preparados y comerciales empleados en el laboratorio

........................................................................................................................................................................11

Documento tcnico de utilizacin ..........................................................................................................11

Etiquetado .................................................................................................................................................11

Reactivos preparados en el laboratorio.................................................................................................11

Reactivos listos para su uso ...................................................................................................................12

Reactivos de tincin .................................................................................................................................12

Controles aceptados ................................................................................................................................13

Frecuencia de control ..............................................................................................................................13

Resumen de las recomendaciones ............................................................................................................15

Referencias....................................................................................................................................................16

Anexo 1. Listado de cepas para control de algunos Medios de Cultivo ms comunes ......................17

Anexo 2. Listado de cepas para control de los reactivos ms comunes ..............................................21


Objetivo y alcance

El objetivo de este documento es normalizar las actividades que deben realizarse en el laboratoriode Microbiologa para controlar la idoneidad de los medios de cultivo y reactivos utilizados, antesde su puesta en uso. Este control abarca tanto a los preparados en el propio laboratorio como lospreparados listos para su uso por las casas comerciales. La verificacin de los medios y reactivos,indicacin de uso y seguimiento debe estar adecuadamente documentada.

FUNDAMENTO

El control de calidad de los medios de cultivo y reactivos forma parte del programa de control decalidad interno del laboratorio de microbiologa para asegurar que la informacin generada por ellaboratorio es exacta, segura y reproducible.

Personal

La elaboracin y control de los medios y reactivos deben ser realizados por personal tcnicocualificado con experiencia en Microbiologa.La supervisin de los anlisis y la interpretacin de los resultados debe ser realizada por untitulado superior con la especialidad de Microbiologa Clnica. Como norma general es convenienteseguir estos principios:

Se debe identificar en cada laboratorio un supervisor para el control de calidad. El personal de laboratorio es responsable de rellenar los registros de control de calidad en

los formatos apropiados que han sido facilitados por el supervisor. El supervisor es responsable de la revisin mensual de los datos generados por el control

de calidad interno. El supervisor es responsable de mantener los registros de una forma organizada que

facilite el acceso y la inspeccin de los mismos. Los registros deben guardarse durante un periodo mnimo de 2 aos.

Condiciones ambientales

Las condiciones ambientales requeridas para desarrollar los ensayos relacionados con el controlespecfico de medios y reactivos son similares a las de cualquier laboratorio de Microbiologa.

Programa de limpieza

El programa de limpieza es similar al del laboratorio general de Microbiologa.


Manuales de Procedimientos

Cualquier tcnica realizada en el laboratorio debe tener su manual de procedimiento quetiene que estar disponible de forma permanente para todo el personal.

Los procedimientos deben indicar:componentes del medio/reactivo y su proporcinmodo de preparacin, envasado e identificacincontroles que deben realizarse y criterios de aceptabilidadplan y frecuencia del controlcondiciones de conservacin y caducidad.

Los procedimientos tienen que ser revisados anualmente por el Director del laboratorio. Las modificaciones de los procedimientos o la inclusin de nuevos protocolos tienen que

ser autorizados por el Director de Laboratorio.

Control de calidad interno de los medios de cultivopreparados en el laboratorio

Debe abarcar todo el proceso, no solo el control del medio ya preparado sino tambin elcontrol del medio deshidratado y los aditivos que se van a utilizar, el procedimiento de laelaboracin, el envasado, etiquetado y almacenamiento de los medios as como todos losregistros. Todas las fases del proceso han de estar perfectamente documentadas y debe mantenerseun registro detallado de todas las operaciones realizadas. Se anotarn todos los controlesrealizados, los resultados de los mismos y las medidas adoptadas as como el nombre de lapersona que realiza los controles y las medidas.

a) Control de los medios deshidratados y de los aditivos comerciales

En la recepcin:

la persona que recibe el producto:

comprobar la fecha de caducidad indicar la fecha de recepcin en el envase lo almacenar en las condiciones adecuadas

Cada vez que vayan a ser utilizados:

la persona que los vayan a utilizar comprobar:

que estn conservados en su lugar adecuado de acuerdo con las instrucciones de losmanufacturadores. fecha de caducidad que los recipientes estn perfectamente cerrados.


b) Control de la preparacin de los medios de cultivo o aditivos

Preparacin:

Los medios de cultivo y los aditivos sern preparados, envasados y almacenados siguiendoestrictamente las instrucciones de los procedimientos de trabajo o en su defecto las instruccionesde los manufacturadores.

Como normas generales hay que tener en cuenta que existen una serie de factores que afectannegativamente el buen funcionamiento de los medios:

Sobrecalentamiento de los ingredientes basales Adicin de la sangre o de otros aditivos sensibles al calor por encima de 50C Envasar menor cantidad de medio que la recomendada

Identificacin:

Cada lote de medio o aditivo preparado se marcar en su envase (placa o tubo) de formainequvoca segn se determine en el procedimiento de trabajo de cada laboratorio. Esta marcadebe permitir la identificacin del tipo de medio de que se trata, del lote y de la fecha depreparacin.

Almacenamiento:

Los medios se almacenarn en las condiciones adecuadas establecidas (T ambiente, frigorfico 2-8C o congelador 20C).Los medios en placa deben guardarse en bolsas de plstico bien cerradas.Puede afectar negativamente:

Almacenar a una T no adecuada Alternar la T de almacenamiento de T ambiente a 2-8C. Almacenar las placas en bolsas abiertas o mal cerradas. Cerrar la bolsa contenedora de las placas antes de que estas se hayan enfriado ygelificado apropiadamente

Registro:

De cada lote de medio de cultivo o de aditivo preparado se llevar un registro

c) Control del medio preparado

Sistemticamente, de todos los medios preparados en el laboratorio antes de ponerlo en uso, secontrolar:

Caractersticas fsicas (aspecto, color, excesivo n de burbujas, precipitados etc..) Esterilidad


Funcionamiento para el cual ha sido preparado: propiedades bioqumicas(diferenciales y diagnsticas), recuperacin de los microorganismos deseados einhibicin o supresin de los microorganismos no deseados Se registrarn los resultados obtenidos de estos controles as como la persona quelos ha realizado.

Control de esterilidad

Tomar una muestra del 5% de los lotes de 100 o menos placas/tubos y una muestra de 10 de loslotes de ms de 100 placas/tubos.

Incubar durante 48h a la T a la que va a ser incubado en el uso con muestra clnicas yposteriormante otras 48 h a T ambiente.

Control del funcionamiento

Consiste en comprobar la capacidad del medio de recuperar un bajo nmero de losmicroorganismos ms sensibles para los que ha sido preparado, la capacidad de inhibir un altonmero de los microorganismos que deben ser inhibidos en caso de los medios selectivos y dediferenciar los microorganismos para los que ha sido diseado en caso de los mediosdiferenciales.

El correcto funcionamiento del medio de cultivo se controlar con cepas de referencia (verCCI-03).

Procedimiento para el control del funcionamiento

Preparacin del inculo

a) Mtodo semicuantitativo: es el ms usado

Para controlar las propiedades nutritivas:Hacer una suspensin de la cepa al 0,5 Mcfarland en solucin salina. Diluir de aqu al 1/100 (0.1ml de suspensin + 9,9 ml de solucin salina). Inocular el medio con 10 microlitros de estasuspensin.

Para controlar las propiedades selectivas:Hacer una suspensin de la cepa al 0,5 Mcfarland en solucin salina. Diluir de aqu al 1/10 (0.1 mlde suspensin + 0,9 ml de solucin salina). Inocular el medio con 10 microlitros de estasuspensin.

Para controlar los medios lquidos:Hacer una suspensin de la cepa al 0,5 Mcfarland en solucin salina. Inocular el medio con 10microlitros de esta suspensin.

Para controlar las propiedades bioqumicas:Hacer como en el uso con muestras clnicas.


b) Mtodo cuantitativo: puede ser utizado para medios que requieran ms exactitud y paracomparar crecimientos en distintos medios.

El da anterior al que se va a realizar el control de calidad de los medios, preparar un cultivodel microorganismo control en BHI e incubar 18-24 horas.

El da del control:

1 .- Sacar del frigorfico las placas de los medios de cultivo que se van a controlar y dejar atemperatura ambiente durante media hora para que pierdan humedad.

2 .- Preparar una gradilla con 6 tubos, y rotularlos 1, -2, -3, -4, -5, -6. Sacar de la estufa de CO2el cultivo de la cepa control y colocarlo en el primer lugar de la gradilla ( Comprobar el crecimientopor la turbidez del caldo ).

3 .- Con pipeta y punta estril poner 500 l de solucin salina en cada uno de los tubos rotuladosde -1 a -6.

4 .- Pasar 50 l del cultivo de BHI de la cepa control al tubo rotulado 1. Desechar la punta de lapipeta. Homogeneizar con el Vortex.

6 .- Con una nueva punta estril pasa 50 l del tubo 1 al tubo 2. Desechar la punta de lapipeta. Homogeneizar con el Vortex.

7 .- Continuar haciendo diluciones, de igual forma, en los tubos 3, -4, -5, -6.

Siembra de los medios

Medios en tubo : se inocularn con la tcnica habitual utilizada en la prctica con muestrasclnicas

Medios en placa:

a) mtodo semicuantitativo: se sembrarn con asa calibrada (10 microlitros) en estra

b) mtodo cuantitativo (de Miles y Misra): dividir la tapa de la placa con rotulador en seisporciones y rotular cada una indicando las correspondientes diluciones: 106, 10-5,10-4,10-3,10-2,10-1.

Con una pipeta y punta estril tomar 10 l de la dilucin 6 y depositarlos en spot en su porcincorrespondiente de la placa. Con la misma punta seguir por este orden poniendo 10 l de cadauna de las diluciones,-5, -4, -3, -2 en sus correspondientes porciones de la placa de cultivo.


Tapar las placas y dejarlas sin invertir una media hora hasta que se hayan secado las gotas.

Incubacin de los medios

Incubar en las condiciones de tiempo, atmsfera y T indicadas para cadamedio/microorganismo.

Lectura e interpretacin de los resultados

Para cada medio/microorganismo, observar y registrar:

Cantidad de crecimiento: cuadrante al que llega el crecimiento en el mtodosemicuantitativo o dilucin en el mtodo cuantitativo.

Caractersticas de las colonias (tamao, morfologa, hemlisis etc..)

Reacciones caractersticas en medios para identificacin

Un medio es considerado que tiene un funcionamiento adecuado cuando:

se observa en l suficiente colonias con morfologa tpica de todas las cepas ensayadas.

se observa suficiente inhibicin del crecimiento del microorganismo que debe ser inhibido ysuficiente crecimiento del microorganismo deseado, en el caso de los medios selectivos.En el control de las propiedades nutritivas y selectivas puede ser til comparar cantidad decrecimiento, tamao colonial y aspecto con lotes anteriores de medios ya controlados.

se observan las reacciones tpicas y las morfologas tpicas de los microorganismos ensayadosen los medios diferenciales y de identificacin.

NOTA: puede ser til sembrar en paralelo una placa del lote nuevo y una placa del lote antiguopara comparar crecimientos.


d) Control de los Medios de Cultivo preparados por casas comerciales

1.- Se recomienda que provengan de empresas certificadas segn ISO 9000, debiendoasegurarse el laboratorio del certificado y de que la certificacin cumple todas las operacionesrelevantes, incluyendo la de suministro y entrega.

2. Los lotes de medios deben estar debidamente identificados.

3.- Los manufacturadores deben aportar, con cada lote suministrado, una evidencia delcumplimiento de las especificacines de calidad que incluya:

N de loteFecha de caducidad del productoCondiciones de conservacinControl de esterilidad y criterios de aceptabilidadControl de crecimiento e inhibicin con cepas seleccionadas para el uso del medio ycriterios de aceptabilidad indicando las cepas utilizadasFecha de la emisin de la especificacin

4. Se guardar la especificacin enviada por el fabricante para cada lote de medio.

5. Comprobar las caractersticas fsicas (color, precipitados, placas rotas, excesivo n deburbujas, colonias crecidas etc...) de todos los lotes cuando se reciben.

6. Siempre que el fabricante aporte las especificaciones de calidad adecuadas, por sus escasafrecuencia de fallos, el usuario no necesitan repetir el control del adecuado funcionamiento,de los siguientes medios:

Agar sangre (no selectivo)Agar sangre colistina nalidxicoAgar alcohol fenil etlicoAgar chocolateAgar CINAgar CLEDAgar CYE/BCYECaldo Selenito o caldo GNAgar Levine o Agar EMBAgar Hektoen

Agar XLDAgar MacConkeyAgar Manitol salAgar Sabouraud dextroseAgar Salmonella- Shigella (SS)Agar selectivos para EnterococoCaldo BHI o TSBCaldo ThioglycolatoLowestein Jensen y Mildebrook

7.- Por la razn contraria, el usuario debe repetir el control como si fueran medios preparadosen el laboratorio de:

todos los medios no citados en la lista anteriorlos medios selectivos de Neisseria spp patgenaslos medios de Campylobactercualquier medio de los listados que demuestren alguna deficiencia en la recepcino durante su uso hasta que el problema quede resuelto.

8.- A pesar de no ser obligatorio, para sentir ms confianza, el laboratorio puede decidir incluirtambin en el control del funcionamiento a los medios de cultivo que reciba de los citados en el


punto 6. Segn la carga de trabajo, una buena medida intermedia puede ser hacerlo solo enalgunos lotes elegidos aleatoriamente.

9.- Si los medios de cultivo provienen de empresas no certificadas por la norma ISO o nocumplen con las especificaciones de calidad recomendadas, el usuario debe realizar controlcompleto como para los medios preparados en el laboratorio de todos los lotes que se reciben.

10.- Cualquier deficiencia en el aspecto fsico, esterilidad, no crecimiento de la cepa deseada, o noinhibicin de la cepa no deseada, ser documentada y notificada a los manufacturadores paraque emprendan las medidas correctoras. El laboratorio mantendr el control de calidad de estosmedios hasta que el problema quede resuelto.


Control de calidad interno de los reactivos preparados ycomerciales empleados en el laboratorio

El laboratorio debe asegurarse de la idoneidad de los reactivos usados, tanto preparados en ellaboratorio como comerciales, para los distintos ensayos. La verificacin de los reactivos,indicacin de uso y seguimiento debe estar adecuadamente documentada.

Documento tcnico de utilizacin

Debe existir un documento o ficha que describa el reactivo, tanto para los preparados en ellaboratorio como para los comerciales suministrados listos para su uso. Este documento puedecontemplar cada reactivo o bien las pruebas bioqumicas para las se destina (por ejemplo: test dela catalasa en vez de perxido de hidrgeno). Debe incluir como mnimo la siguiente informacin:

- Descripcin: componentes y su proporcin. En el caso de kits comerciales bastara conreferir los elementos que lo componen segn el fabricante.

- Indicacin: para que reaccin o ensayo microbiolgico est indicado y cual es el objetivoque se persigue.

- Controles: qu controles deben usarse y criterios de aceptabilidad.- Plan y frecuencia de control- Condiciones de conservacin- Limitaciones de su uso o de interpretacin- Descripcin del tipo de lectura de los resultados y mtodo de lectura

Para los reactivos, o las tcnicas para los que estn indicados, debe existir referenciasprocedentes de documentos acreditados.

Etiquetado

Los lotes de reactivo deben estar debidamente etiquetados indicando la identidad, concentracinen el caso de reactivo preparados en el laboratorio, temperatura de conservacin, fecha depreparacin o de apertura del envase en reactivos listos para su uso y fecha de caducidadvalidada y/o periodos recomendados de almacenamiento.

Reactivos preparados en el laboratorio

En el caso de los reactivos preparados en el laboratorio, adems debe existir:

- Una ficha tcnica de elaboracin que incluya: i. Denominacin y lista de componentes, incluidos suplementos ii. Caducidad y criterios de aceptabilidad iii. Condiciones de conservacin iv. Mtodo de esterilizacin v. Control de esterilidad vi. Controles fsicos y criterios de aceptabilidad

- Un registro documentable de reactivos en los que se indique la fecha de preparacin, lavalidacin realizada y las personas responsables.


Es importante que en la elaboracin de los reactivos se utilize agua destilada o desionizada y quese incluyan controles de pH dentro de los controles fsicos.

Reactivos listos para su uso

Se considerarn todos los reactivo y componentes de un kit que no requieran manipulacin previaa su uso. Se tendrn en cuenta los siguientes aspectos especficos de este tipo de reactivos:

1. En el caso de reactivos comerciales debe registrarse documentalmente a la llegada allaboratorio: la fecha, condiciones fsicas, persona responsable de la aceptacin delproducto y conservacin.

2. Los componentes de un kit slo se podrn usar con otros kits del mismo nmero de lote,a no ser que lo especifique de otra forma el fabricante.

3. Se recomienda que exista un procedimiento en el laboratorio para el control de lasespecificaciones de los fabricantes en la utilizacin de los reactivos listos para su uso.Este control tendr como fin detectar cambios en las instrucciones de uso entre losdiferentes lotes del reactivo. El registro documentable debera incluir:

i. Persona responsable que realiza la revisnii. Denominacin del reactivoiii. Fecha de la revisin. Esta fecha deber ser coincidir con la apertura del nuevo

lote de reactivosiv. Nmero de lote al que corresponden las instrucciones revisadasv. Cambios respecto a instrucciones anterioresvi. Qu medida se ha llevado a cabo frente a un determinado cambio (eventual

modificacin del documento tcnico de utilizacin, notificacin al personal)

Reactivos de tincin

a) Los procedimientos de tincin deben controlarse y registrarse los resultados concontroles positivos y negativos. Debe llevarse a cabo el registro documental de losresultados de los controles, fecha y persona responsable:

- Las tinciones especiales y fluorescentes deberan incluir un control positivo y otronegativo en cada tanda de utilizacin.

- La tincin de Gram debe controlarse cada nuevo lote y una vez a la semana deuso.

b) En la ficha tcnica de elaboracin deber especificarse los volmenes mximosaceptados de preparacin, adems del resto de informacin que se menciona en elpunto 3. Los reactivos de tincin se mantienen a temperatura ambiente y estn sujetosa fenmenos de evaporacin, concentrando sus componentes con el paso de los das. Elvolumen preparado debe ir en relacin con el volumen utilizado cada da.

c) El laboratorio deber disponer de un procedimiento documentado para asegurarse quetodo el personal interpreta y registra el resultado de los exmenes microscpicos de lamisma manera, especialmente si se hace de forma abreviada.


Controles aceptados

a) Las cepas control deben ser cepas de referencia (ver CCI-03) y que sus caractersticaspermitan el control de la prueba microbiolgica o reactivo especfico. Para la eleccin deun determinado microorganismo control deben seguirse las recomendaciones descritas endocumentos reconocidos (ver Referencias)

b) No es aceptable la utilizacin de reactivos qumicos para el control de las reacciones en ellugar de cultivos bacterianos.

c) Los controles deben efectuarse con cultivos frescos

d) En el caso de que para el reactivo o prueba no existan controles descritos se podrdisear controles segn las recomendaciones del CCI-03.

e) En general ser suficiente con dos microorganismos de control para cada reactivo oreaccin. En la eleccin de los controles positivos se tendr que tener en cuenta si lareaccin a controlar produce resultados fuertemente positivos. En este caso se deberelegir un microorganismo bien caracterizado cuyo resultado sea dbilmente positivo y otrofuertemente positivo.

f) Si se trata de preparados comerciales debe solicitarse al fabricante evidencias de quecumplen criterios de calidad. Cuando se trate de reactivos en kits comerciales de unfabricante que disponga de un sistema de calidad reconocido, el laboratorio deberaverificar, en la validacin inicial, que el material suministrado cumple las especificacionesestablecidas con un control positivo y otro negativo.

g) Para los reactivos listos para su uso en kits se recomienda controlar la variacin de suscaractersticas a lo largo del tiempo. Para ello se podra emplear una misma muestra (opull de muestras homogneas) que se utilice en cada ensayo y evaluar estadsticamentelos resultados, controlando si la variacin de los resultados para esa muestra est dentrode un rango de 3 desviaciones estndar respecto a la media.

Frecuencia de control

La frecuencia de control con microorganismos de referencia va a depender de la naturaleza yestabilidad de los reactivos, as como de las caractersticas intrnsecas de la reaccin. Acontinuacin se exponen los reactivos ms frecuentes empleados en un laboratorio deMicrobiologa y la frecuencia de control aceptable. Para el resto de reactivos deben controlarsepor lo menos con cada nuevo vial o envase preparado o abierto.


Material Frecuencia Reactivos, discos y tiras:

CatalasaOxidasaCoagulasaBacitracinaOptoquinaONPGFactores X, V y XVBetalactamasa (ceficinasa)

Nuevo lote o vial + cada da de usoNuevo lote o vial + cada da de usoNuevo lote o vial + cada da de usoNuevo lote + una vez cada semana de usoNuevo lote + una vez cada semana de usoNuevo lote + una vez cada semana de usoNuevo lote + una vez cada semana de usoNuevo lote + cada da de uso

Antisueros Nuevo vial + una vez cada mes de uso

Kits comerciales deidentificacin

Depende del fabricante*

Deteccin de antgenosbacterianos

Nuevo lote o vial + cada da de uso

Sondas de ADN Nuevo lote o vial + cada da de uso* Si son proporcionados por fabricantes que siguen sistemas de calidad se recomienda almenos en la validacin inicial


Resumen de las recomendaciones

El laboratorio debe elaborar procedimientos documentados para la preparacin y control demedios de cultivo y reactivos.

El control de calidad de los medios y reactivos debe abarcar todo el proceso de preparacin

El control de calidad de medios de cultivo y reactivos ser supervisado por un especialista enMicrobiologa

El control de los medios preparados en el laboratorio debe incluir controles de esterilidad yfuncionamiento adecuado

Debe exigirse a las casas comerciales especificaciones sobre el cumplimiento de controles decalidad de los medios y reactivos suministrados

Para algunos medios preparados listos para su uso por casas comerciales, el usuario deberepetir el control de calidad para comprobar su correcto funcionamiento

El control de los reactivos del laboratorio deber incluir la elaboracin, recepcin,conservacin y funcionamiento con las adecuadas cepas de referencia

Se recomienda controlar la homogeneidad de los reactivos en kit dentro del mismo lote, ascomo las posibles modificaciones de las instrucciones del fabricante entre los diferentes lotes.


Referencias

Gua para la acreditacin de los laboratorios que realizan anlisis microbiolgicos. G-ENAC-04.Rev. 3. Noviembre 2002.

Quality assurance for commercially prepared microbiological culture media. Second edition 1990;Approved standard. M22- A2. NCCLS.

MacFaddin J. F. 1985. Media for Isolation-Cultivation-Identification-Maintenance of MedicalBacteria. 3rd edition; Williams & Wilkins, Baltimore, MD.

MacFaddin J. F. 2000. Biochemical Tests for identification of Medical Bacteria. 3rd edition;Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.

Miller J. M. Quality control of Media, Reagents, and Stains. In Balows A., Hausler W. J., HerrmannK. L., Isenberg H. D., and Shadomy H. J. (ed.). 1991. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. ASM,Washington, D. C. pgs. 1203-1225.

Isenberg HD (ed). 1998. Essential procedures for clinical microbiology. ASM Press. Washington, D.C.

August M. J., Hindler J. A., Huber T. W., and Sewell D. L. Cumitech 3A. Quality Control andQuality Assurance Practices in clinical Microbiology. 1990. Coordinating ed., Weissfeld A. L. ASMPress. Washington D. C.


Anexo 1. Listado de cepas para control de algunos Medios deCultivo ms comunes

MEDIOS MICROORGANISMOS RESULTADOS ESPERADOSAgar Sangre Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus Escherichia coli

Crecimiento, alfahemlisisCrecimiento, betahemlisisCrecimientoCrecimiento

Agar Sangre anaerobios (CDC)y sangre lacada no selectivo

Bacteroides fragilis Fusobacterium nucleatum Clostridium perfringens Peptostreptococcus

anaerobius

CrecimientoCrecimientoCrecimiento, BetahemlisisCrecimiento

Agar sangre lacadaGentamicina+vancomicina

Clostridium perfringens Bacteroides fragilis Escherichia coli Staphylococcus aureus

InhibicinCrecimientoInhibicinInhibicin

Agar sangre colistina nalidxico (CNA)

Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Proteus mirabilis

Crecimiento, betahemlisisCrecimiento, alfahemlisisCrecimientoInhibicin

Agar Chocolate Neisseria gonorrhoea Haemophilus influenzae

CrecimientoCrecimiento

Agar MacConkey Escherichia coli Proteus mirabilis

Salmonella Typhimurium

Crecimiento, colonias rosasCrecimiento, colonias incoloras

(poco velo)Crecimiento, colonias incoloras

Agar MaConkey sorbitol Escherichia coli E. coli O157:H7 Enterococcus faecalis

Colonias rosasColonias incolorasInhibicin

Agar de aislamientopara Haemophilus

Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae

No crecimientoCrecimiento

Agar Campylobacter Campylobacter jejuni Escherichia coli

CrecimientoNo crecimiento


MEDIOS MICROORGANISMOS RESULTADOS ESPERADOSAgar Thayer-Martin o NYC Neisseria gonorrhoeae

Neisseria meningitidis Neisseria sicca Staphylococcus epidermidis Candida albicans

CrecimientoCrecimientoInhibicinInhibicinInhibicin

Agar manitol Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Proteus mirabilis

Colonias rojas a 48hColonias amarillas a 48hInhibicin

Agar Cled Escherichia coli Enterococcus faecalis


TCBS Vibrio alginolyticus Escherichia coli

Color amarilloNo crecimiento

Medio Salmonella-Shigella Salmonella enterica

Shigella flexneri

Enterococcus faecalis Escherichia coli

Crecimiento, coloniasincoloras, con/sinprecipitado negro

Crecimiento, colonias incoloras

InhibinInhibicin parcial

Agar Hektoen Salmonella enterica

Shigella flexneri Enterococcus faecalis

Escherichia coli

Crecimiento, colonias verdescon precipitado negro

Crecimiento, colonias verdesInhibin parcial, colonias

amarillasInhibicin parcial, colonias

amarillas o salmn

Agar XLD Salmonella enterica

Shigella flexneri Enterococcus faecalis Escherichia coli

Crecimiento, colonias rojas conprecipitado negro

Colonias rojasInhibin parcialInhibicin parcial, colonias

amarillas


MEDIOS MICROORGANISMOS RESULTADOS ESPERADOSMedio BCYE- Legionella pneumophila

Legionella bozemanii Staphylococcus aureus Escherichia coli

CrecimientoCrecimientoInhibicinInhibicin

BHI caldo o TSB Escherichia coli Staphylococcus aureus


Caldo Selenito Salmonella enterica Escherichia coli

CrecimientoNo crecimiento

Thioglicolato Bacteroides fragilis Staphylococcus aureus Bacteroides vulgatus Clostridium perfringens

Crecimiento en 24 hCrecimiento en 24 hCrecimiento en 24 hCrecimiento en 24 h

Arginina dehidrolasa Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae

Color prpuraColor amarillo

Lisina decarboxilasa Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae


Ornitina decarboxilasa Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae


Citrato de Simmons Klebsiella pneumoniae Escherichia coli

Color azulColor verde

Fenilalaninadeaminasa Proteus mirabilis

Escherichia coli

Verde tras aadir clorurofrrico

No verde tras aadir clorurofrrico

Agar bilis-esculina Enterococcus faecalis Escherichia coli

Colonias negrasInhibicin


MEDIOS MICROORGANISMOS RESULTADOS ESPERADOSMedio DNAsa Serratia marcescens

Staphylococcus aureusHalo o aclaramientoHalo o aclaramiento

Urea caldo o agar Proteus mirabilis Escherichia coli

Viraje a rosaSin cambio de color

Agar Kligler o TSI Salmonella enterica

Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa

Pico alcalino, fondo cido, SH2(+), gas (+-)

Pico y fondo cido, SH2(-), gasPico y fondo alcalino, SH2

(-), gas (-)


Anexo 2. Listado de cepas para control de los reactivos mscomunes

Reactivo Cepa Reacciones esperadas

Bacitracina Streptococcus pyogenes Enterococcus faecalis

sensible: cualquier halo de inhibicin a las 24 hresistente: sin halo de inhibicin a las 24 h

Bilis, solubilidad Streptococcuspneumoniae

Enterococcus faecalis

Soluble: desaparicin de la coloniaInsoluble: colonia ntegra

CAMP reaccin Streptococcus agalactiae

Streptococcus pyogenes

Positivo: punta de flecha con hemlisis msintensa

Negativo: la hemlisis no se incrementa

Catalasa Staphylococcus aureus

Streptococcus agalactiae

Positivo: Desprendimiento inmediato de burbujasbien visibles

Negativo: Sin burbujas

Coagulasa Staphylococcus aureus Staphylococcus

epidermidis

Positivo: formacin de cogulo en 4 hNegativo: no formacin de cogulo tras 4 horas

betahemolticosestreptococos,seroagrupacin

Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus

dysagalactiae subs.equisimilis C

Enterococcus faecalis Streptococcus

dysagalactiae subs.equisimilis G

Aglutinacin con grupo A y no con los demsAglutinacin con grupo B y no con los demsAglutinacin con grupo C y no con los dems

Aglutinacin con grupo D y no con los demsAglutinacin con grupo G y no con los dems

Factores X, V yXV

Haemophilus influenzae Crecimiento alrededor del XV a las 24 h,crecimiento entre X y V a las 24 h

Haemophilus,seroagrupacin

H. influenzae tipo B Aglutinacin visible en suero anti-tipo B y no conlos dems

Hipurato Campylobacter jejuni Enterococcus faecalis

Positivo: azul prpuraNegativo: sin cambio de color o amarillo


Reactivo Cepa Reacciones esperadas

Indol Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Positivo: un anillo rojo en la superficie de la capaalclica

Negativo: no se produce color en el anilloalclico

Indol rpido Escherichia coli Klebsiella pneumoniae

Positivo: azul verdosoNegativo: sin cambio de color tras 2 min

Indoxylacetato Campylobacter jejuni Campylobacter lari

Positivo: azulverdosoNegativo: azul plido.

ONPG Escherichia coli Proteus mirabilis

Positivo: color amarilloNegativo: sin cambio de color

Optoquina Streptococcus pneumoniae Streptococcus mitis

Sensible: 14 mmResistente: 6 mm

Oxidasa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli

Positivo: color prpura en 30 s.Negativo: sin cambio de color.

PYR Enterococcus faecalis Streptococcus agalactiae

Positivo: rosa o naranja-rojoNegativo: sin cambio de color o ambar.


CCI-SEIMC-03Recomendaciones para el control de calidad interno de cepas y

material de referencia

Consuelo Miranda1 y Lorena Lpez Cerero2

1 Consuelo MirandaS. Microbiologa. H. Virgen de las Nieves. GranadaTlf. [email protected]

2 Lorena LpezDepartamento de Microbiologa. Hospital Universitario Virgen Macarena. Avd Dr. Fedriani s/n.Sevilla. 41009. Telfono 955 008138. Correo electrnico: [email protected]

El presente documento se distribuye como copia no controlada


ndicendice ................................................................................................................................................................. 2Objeto ................................................................................................................................................................ 3Alcance ............................................................................................................................................................... 3Personal ............................................................................................................................................................. 3Condiciones ambientales ................................................................................................................................. 3

Condiciones de bioseguridad ...................................................................................................................... 3Programa de limpieza .................................................................................................................................. 3

Manuales de Procedimientos .......................................................................................................................... 3Control de calidad interno de las cepas de referencia ................................................................................ 4

Obtencin de las cepas de referencia........................................................................................................ 4Mantenimiento y uso de las cepas de referencia..................................................................................... 4

Control de calidad interno de material de referencia .................................................................................. 6Obtencin de materiales de referencia microbiolgicos ......................................................................... 6Mantenimiento del material de referencia ................................................................................................ 6

Resumen de recomendaciones ....................................................................................................................... 6Referencias ........................................................................................................................................................ 6Anexo I. Lista de Instituciones de los cuales se pueden obtener las cepas de referencia................... 7


ObjetoLos programas de control de calidad aseguran que la informacin generada por el laboratorio esexacta, adecuada, trazable y reproducible. El objeto de las presentes recomendaciones es describirlos procedimientos que hay que seguir para conseguir, conservar y controlar cepas y material dereferencia para los distintos ensayos microbiolgicos.

AlcanceImplica a todas las cepas microbiolgicas y al material (muestras para extensiones en portaobjetosy sueros humanos) que van a ser utilizados como material de referencia en los controles deensayos microbiolgicos.

PersonalLos anlisis deben ser realizados por personal tcnico cualificado con experiencia en Microbiologa.La supervisin de los anlisis y la interpretacin de los resultados debe ser realizada por un tituladosuperior con la especialidad de Microbiologa Clnica.Como norma general es conveniente seguir estos principios:

Se debe identificar en cada laboratorio un supervisor para el control de calidad. El personal de laboratorio es responsable de rellenar los registros de control de calidad en

los formatos apropiados que han sido facilitados por el supervisor. El supervisor es responsable de la revisin mensual de los datos generados por el control de

calidad interno. El supervisor es responsable de mantener los registros de una forma organizada que facilite

el acceso y la inspeccin de los mismos. Los registros deben guardarse durante un periodo mnimo de 2 aos.

Condiciones ambientalesLas condiciones ambientales requeridas para desarrollar los ensayos relacionados con el control decepas y material de referencia son similares a las de cualquier laboratorio de Microbiologa.

Condiciones de bioseguridadLa inmensa mayora de las cepas de referencia estn clasificados dentro del grupo de riesgo 1 y 2.No obstante, algunas especies, especialmente dentro de Micologa (ver CCI-07), Micobacteriologa(ver CCI-06) y Virologa (ver CCI-09), requieren unas condiciones de bioseguridad de nivel 3. Portanto, todo laboratorio de Microbiologa debe disponer de un laboratorio de nivel 3 de bioseguridadsi maneja este tipo de microorganismos.

Programa de limpiezaEl programa de limpieza es similar al del laboratorio general de Microbiologa.

Manuales de Procedimientos Cualquier tcnica realizada en el laboratorio debe tener su manual de procedimiento que

tiene que estar disponible de forma permanente para todo el personal.


Debe existir un procedimiento normalizado especfico para el procesamiento de cepas dereferencia y de trabajo, as como para los materiales de referencia.

Los procedimientos tienen que ser revisados anualmente por el Director del laboratorio. Las modificaciones de los procedimientos o la inclusin de nuevos protocolos tienen que ser

autorizados por el Director de Laboratorio.

Control de calidad interno de las cepas de referencia

Las cepas de referencia son necesarias para la verificacin y validacin de los medios y reactivos,as como para la validacin y evaluacin de mtodos microbiolgicos.

Obtencin de las cepas de referenciaDebe existir un registro documentable del origen de las cepas de referencia y la forma deobtencin. Para demostrar la trazabilidad, los laboratorios deben usar cepas de referencia obtenidasde la siguiente manera:

1) Preferiblemente de forma directa a partir de una coleccin nacional o internacionalreconocida (ver Anexo I Lista de Instituciones). Debe registrarse y conservarse elcertificado de trazabilidad de la coleccin.

2) Alternativamente:- de forma directa a partir de las cepas distribuidas por el Programa de Control de Calidadde la SEIMC. Si estas cepas van a ser utilizadas posteriormente como cepas de referencia,una vez recepcionadas en el laboratorio, debern ser reconstituidas y procesadas comotales y ser subcultivadas una sola vez para obtener las cepas de reserva.- En ocasiones no existen cepas con las caractersticas requeridas que se puedan obtenerpor los procedimientos antes comentados. Excepcionalmente se pueden utilizaraislamientos clnicos que hayan sido verificadas sus caractersticas por al menos 3laboratorios de Microbiologa Clnica de Hospitales terciarios. Estas cepas deben seguir elmismo proceso de subcultivo de una cepa de referencia en el laboratorio de origen y sernvlidas nicamente en ese laboratorio.

Mantenimiento y uso de las cepas de referenciaDebe existir un registro documentable de la recepcin de las cepas de referencia, en el que seanote la fecha de llegada, condiciones de llegada, controles realizados, mtodo de conservacin ynmero de viales y personal responsable. Las cepas de referencia se reconstituirn y someterna los controles de pureza y ensayos bioqumicos que sean necesarios. Sern subcultivadas en losmedios apropiados una sola vez para obtener las cepas de reserva y las cepas de trabajo.

Las cepas de reserva deben conservarse utilizando, una tcnica que mantenga las caractersticasdeseadas de las cepas de referencia, como por ejemplo, liofilizacin, ultracongelacin (-70 C),conservacin en nitrgeno lquido, etc.

En un medio adecuado para la congelacin (por ej: Tryptic Soy Broth con glicerol 10-15% v/v)pueden mantenerse indefinidamente a 70 C y 1 ao entre 50 C y 70C. Nunca mantenercongeladas por encima de 50 C.

Todos los viales deben ser identificados con la cepa, procedencia y fecha de congelacin.

Cuando se descongelan las cepas de reserva no deben volverse a congelar y reutilizar. Por esodeben congelarse suficiente n de viales de cada cepa, para poder disponer de cepas de trabajodurante como mnimo 1 ao. Una alternativa podran ser los viales comerciales para congelacin de


cepas mediante perlas adherentes, que permiten utilizar una perla para subcultivo sin descongelarel vial.

Las cepas de trabajo se obtienen por subcultivo de las cepas de reserva en medios slidosapropiados para cada microorganismo (CTA, AS, ACH....). Estas cepas se conservarn enrefrigeracin 2-8C o a T ambiente durante un perodo de tiempo que asegure la viabilidad delmicroorganismo, no ms de un mes. Siempre se verificar la pureza y la morfologa tpica colonialdel subcultivo.

En general, las cepas bacterianas de trabajo no deben ser subcultivadas, sin embargo, pueden sersubcultivadas hasta un nmero determinado de veces (mximo 3) cuando:

- el laboratorio pueda aportar evidencias documentadas que demuestren que no se haproducido prdida de viabilidad (cuando sea importante), cambios en la actividadbioqumica y/o cambios en la morfologa.

- As lo requieran los mtodos normalizados

Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas para sustituir a las cepas de reserva.

Esquema de Utilizacin de Cepas de Referencia

Cepa de Referencia

RECONSTITUCINNo permitido

Subcultivada una sola vez(Controles paralelos de pureza y ensayos bioqumicos necesarios)

CEPAS DE RESERVACONSERVACIN POR DISTINTOS MTODOS

(liofilizacin, nitrgeno lquido, ultracongelacin rpida, etc.)(especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)

Subcultivadas una sola vez

DESCONGELACIN/RECONSTITUCIN(Controles paralelos de pureza y ensayos bioqumicos necesarios)

CEPAS DE TRABAJOCONSERVACIN POR DISTINTOS MTODOS

(en medios slidos apropiados en frigorfico 2-8C o a T ambiente)(especificar tiempo y condiciones de almacenamiento).

UTILIZACIN EN EL CONTROL DE CALIDAD Y EN ENSAYOS QUE LO PRECISEN

Todas las fases del proceso han de estar perfectamente documentadas y debe mantenerse unregistro detallado de todas las operaciones realizadas.


Control de calidad interno de material de referencia

Los materiales de referencia, como secuencias genticas y sueros, proporcionan trazabilidad endeterminados ensayos microbiolgicos y son utilizados para demostrar la precisin de losresultados, calibrar equipos, validar mtodos y permitir la comparacin de mtodos al ser utilizadoscomo patrones de referencia.

Obtencin de materiales de referencia microbiolgicosDebe existir un registro documentable del origen del material, caractersticas y forma de obtencin.Para demostrar la trazabilidad, los laboratorios deben usar material de referencia obtenido de lasiguiente manera:

3) Preferiblemente de forma directa a partir de una coleccin nacional o internacionalreconocida (ver Anexo I Colecciones reconocidas). Debe registrarse y conservarse elcertificado de trazabilidad de la coleccin.

4) Alternativamente de forma directa a partir de material distribuido por el Programa deControl de Calidad de la SEIMC.

Mantenimiento del material de referenciaLas sustancias de referencia deben almacenarse y manipularse en unas condiciones que no alterensu integridad, de acuerdo con un procedimiento documentado y el mtodo de ensayocorrespondiente.

Debe existir un registro documentable de la recepcin del material de referencia, en el que seanote la fecha de llegada, condiciones de llegada, controles realizados, mtodo de conservacin ynmero de viales y personal responsable. En general debera distribuirse en alcuotas de trabajo yalista para usar y conservarlas a la temperatura definida hasta su uso.

Resumen de recomendaciones

Referencias


Anexo I. Lista de Instituciones de los cuales se puedenobtener las cepas de referencia

Institucin Direccin1. Coleccin espaola de cultivos tipos

(CECT)Laboratorio de microbiologa de la facultad deBiologa de la Universidad de ValenciaAvda. de la Moreras, s/n. Burjasot. (Valencia)www.uv.es/cect/

2. National Collection of Type Cultures(NCTC)(Bacterias, bacterifagos, micoplasmas,plsmidos)

Central Public Health Laboratory61 Colindale Avenue, London NW9 5HT. UKhttp://cphl.phls.org.uk/divisions/cdmssd/nctc

3. Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes(CNCM)

Institut Pasteur25 Rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15.Francewww.pasteur.fr/recherche/unites/Cncm

4. Culture Collection, University of Gteborg(CCUG)(cepas tipo y secuencias 16 S ARNr)

Department of Clinical BacteriologyUniversity of Gteborg, MikrobiologenGuldhelsgatan 10, SE-413 46 Gteborg,Swedenwww.ccug.gu.se

5. National Collection of Pathogenic Fungi(NCPF)(Hongos patgenos)

Public Health LaboratoryMycological Referente LaboratoryMyrtle Road, Kingsdown, Bristol BS2 8EL. UKwww.ukncc.co.uk

6. CAB International Mycological Institute(CMICC)(Hongos aislados, distintos a patgenoshumanos y animales y, levaduras)

International Mycological InstituteBakeham laneEnglefield Green, Egham, Surrey, TW20 9TY.UK

7. National Collection of Yeast Cultures(NCYC)(Levaduras distintas a las patgenasconocidas)

Institute of Food ResearchNorwick Research ParkColney Lane, Norwich, Norfolk NR4 7 UA. UKwww.ifr.bbsrc.ac.uk/ncyc

8. National Collections of Industrial andMarine Bacteria Ltd.(NCIMB)(Bacterias no patgenas, actinomicetos yplsmidos)

AURIS Business center23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY. UKhttps://home.bt-webworld.com/ncimb

10. Culture Collection of Algae and Protozoa(CCAP)(Hongos Marinos)

SAMS Research Services Ltd.Dunstaffnage Marine LaboratoryPO Box, 3 OBAN, Argyll PA34 4AD, Scotland.www.ife.ac.uk/ccap


12. European Collection of Animal CellCultures(ECACC)(Clulas animales)

PHLS.Health Protection AgencyPorton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG. UKwww.ecacc.org.uk

14. Central Bureau Voor Shimmelcultures(CBS)(Hongos, actinomicetos)

PO Box 273, Oosterstraat 1, NL-3740 AGBaarn, Netherlands.

15. American Type Culture Collection(ATCC)

12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852,USAEn Espaa: LGC PromochemPeru, 104 Nave 308018 Barcelonawww.atcc.org

16. Microbial Strain Data Network Institute of BiotechnologyCambridge University, 307, Huntingdon Road,Cambridge CB3 OJX, UK

17. Centre de Collection du Type Microbien(CCTM)

Institut Universitaire de MicrobiologieCHUV, Rue de Bugnon 44, CH-1011Lausanne, Switzerland


CCI-SEIMC-04

RECOMENDACIONES PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO ENEQUIPOS DE USO GENERAL EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Consuelo MirandaS. Microbiologa. H. Virgen de las Nieves. GranadaTlf. [email protected]

Amparo FargaUnidad de Microbiologa. Hospital Arnau de Vilanova. Valencia. Telfono 96 3868504. E-mail:[email protected]

Ana LloretUnidad de Microbiologa. Hospital Arnau de Vilanova. Valencia. Telfono 96 3868504. E-mail:[email protected]

Lorena LpezDepartamento de Microbiologa. Hospital Universitario Virgen Macarena. Avd Dr. Fedriani s/n.Sevilla. 41009. Telfono 955 008138. Correo electrnico: [email protected]


INDICE

1. Objeto2. Alcance3. Personal4. Manual de procedimientos5. Calibracin de equipos6. Verificacin de equipos7. Mantenimiento8. Bibliografa9. Anexo1 Directrices para la calibracin y controles de calibracin10. Anexo2 Directrices para la validacin y verificacin de equipos11. Anexo3 Directrices para el mantenimiento de equipos


1. OBJETO

El objeto de este procedimiento es recoger las recomendaciones respecto al control internode calidad de los equipos de uso general en el Laboratorio de Microbiologa

1. ALCANCE

Como parte de su sistema de calidad, el laboratorio debe documentar e implantar unprograma de mantenimiento, calibracin y verificacin del funcionamiento de sus equipos

2. PERSONAL

El control de calidad de equipos debe ser realizado por personal tcnico cualificadodebidamente formado. Los procedimientos de control de calidad sern dirigidos y controlados porun especialista en Microbiologa.

3. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS

La implantacin de dicho sistema de control interno requiere inicialmente establecer:

Inventario actualizado de todos los equipos del laboratorio Identificacin nica para cada equipo, as como del estado de calibracin del mismo Registro o ficha de cada equipo con la siguiente informacin

Nombre del equipo Cdigo de identificacin Fabricante y nmero de serie Fecha de adquisicin y de puesta en servicio Estado a su adquisicin Ubicacin Procedimientos de mantenimiento y calibracin, indicando las actividades a realizar y su

periodicidad Programa de verificacin de su funcionamiento Medidas de proteccin personal en cuanto a su manejo Registro de todas las actividades realizadas

5. CALIBRACION

Deben calibrarse aquellos equipos que tengan un efecto directo sobre los resultados deuna prueba

La calibracin de estos equipos debe ser trazable a patrones nacionales o internacionales Deben obtenerse y conservarse los certificados de calibracin externa en los que deben

constar los resultados de las medidas realizadas y las incertidumbres asociadas a lasmismas

En el anexo 1 se recogen las recomendaciones de ENAC en cuanto a los requisitos yperiodicidad de las calibraciones a efectuar en el Laboratorio de Microbiologa


6. VERIFICACION Y VALIDACION

Las caractersticas registradas en la validacin inicial de los equipos debe verificarse yregistrarse peridicamente y despus de cualquier reparacin o modificacin importante

Deben especificarse para cada equipo los rangos de tolerancia admitidos, comunicndos

Aseguramiento de Calidad de Medio y Reactivos

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