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La polimerasa anidada Reaccin en Cadena

Nested PCR se desarroll para aumentar tanto la sensibilidad y especificidad de

PCR ( Haqqi, 1988). Se emplea dos pares de cebadores de amplificacin y dos

rondas de PCR. Tpicamente, un par de cebadores se usa en la primera ronda de

PCR de 15-30 ciclos. Los productos de la primera ronda de amplificacin acontinuacin, se someten a una segunda ronda de amplificacin usando el segundo

conjunto de cebadores, que hibridan con una secuencia interna a la secuencia

amplificada por el primer conjunto de cebadores. El aumento de la sensibilidad

surge de la alta totals nmero de ciclo y el aumento de la especificidad surge de la

hibridacin de la segundo conjunto de cebadores a secuencias que slo se

encuentra en los productos de primera ronda, por lo tantola verificacin de la

identidad del producto de primera ronda. La principal desventajade PCR anidada

es la alta tasa de contaminacin que puede ocurrir durante la transferencia de

productos de primera ronda al segundo tubo para la segunda ronda deamplificacin. Esto se puede evitar ya sea por la separacin fsica de la mezclas de

amplificacin de primera y de segunda ronda con una capa de cera o aceite, o

mediante el diseo de protocolos de amplificacin de un solo tubo. En la prctica,

la sensibilidad mejorada proporcionada por protocolos de PCR anidadas rara vez se

require en aplicaciones de diagnstico, y la identidad de un producto de

amplificacin es generalmente confirmado por hibridacin con una sonda de cido

nucleico.

Polimerasa Multiplex Reacci

n en CadenaEn la PCR multiplex, dos o ms conjuntos de cebadores diseados para la

amplificacin de diferentes objetivos se incluyen en la mezcla de reaccin misma

( Chambeln,1988).Con esta tcnica, ms de una secuencia diana en una clnica

espcimen se pueden coamplificar en un solo tubo. Los cebadores utilizados en

reacciones Multiplex deben ser seleccionados cuidadosamente para tener el

recocido similar, similares temperaturas y deben ser no complementaria a la otra

para evitar dmeros de cebadores y reacciones ineficientes. Multiplex PCR son ms

complicados de desarrollar y son a menudo menos sensible que la configuracin de

un solo cebador de PCR, pero permiten m

ltiples objetivos a ser detectados a partirde una sola espcimen en una reaccin.

Una nueva plataforma prometedora para el anlisis de PCR multiplex es el Sistema

xMAP. El sistema incorpora un xMAP internamente un proceso patentado para

microesferas de poliestireno de tinte con dos fluorocromos espectralmente

distintas. Mediante el uso de proporciones precisas de estos fluorocromos, se crea

una matriz que consta de 100 conjuntos de microesferas diferentecon direcciones

espectrales especficas. Cada conjunto de microesferas puede poseer una diferencia

del reactivo en su superficie. Para el anlisis de cidos nucleicos, sondas de

oligonucletidos seran unidas covalentemente a la superficie de las microesferas

por carbodiimida. Debido a que cada conjunto de microesferas se pueden distinguir

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por su direccin espectral, los conjuntos se pueden combinar, permitiendo hasta

100 analitos diferentes a medirse simultneamente en un solo recipiente de

reaccin. Un tercer fluoro-cromo acoplado a una molcula informadora cuantifica

la interaccin biomolecular, accin que se produce en la superficie de las

microesferas.Las microesferas son interrogados individualmente en un lquido que fluye

rpidamente a medida que pasan por dos lseres separados en el flujo Luminex

xMAP citmetro. Un procesamiento de seales digitales de alta velocidad clasifica

cada microesfera sobre la base de su direccin espectral y cuantifica la reaccin en

su superficie.

Miles de microesferas se investigan por segundo, lo que resulta en un sistema de

anlisis capaz de analizar e informar hasta 100 diferentes reacciones en un nico

recipiente de reaccin en unos pocos segundos.

Ensayos de multiplex que se ejecutan en la plataforma Luminex suelen consistir entres pasos principales: la amplificacin de cidos nucleicos por PCR, se dirigen

extensin especfica,y el lquido de bolas de serie de decodificacin ( Merante de

2007).

Despus de la amplificacin PCR, la amplicones se mezclan con un segundo

conjunto de cebadores etiquetados para cada objetivo.

Si el objetivo estpresente, el cebador etiquetado se extendera travs de una

proceso llamado extensin especfica de destino.Durante esta extensin es una

etiqueta incorporado en el producto de extensin. Las perlas de colores se aaden a

identificar los productos de extensin marcados y etiquetados. Unido a cada

colorante de color hay un oligonucletido complementario a la secuencia de

etiqueta para cada objetivo. Las muestras se colocan entonces en el flujo Luminex

xMAP donde las perlas son ledas por dos lseres de color. Uno se identifica con

laser del color de la cuenta y el otro lser detecta la presencia o ausencia

de un producto de extensin del etiquetado en una perla.

Otra tecnologa prometedora para mayor orden multiplex PCR es la

Matriz de pelcula desarrollada por Idaho Technology, Salt Lake City, Utah. Es un

Sistema completamente automatizado, integrado, y la autocontenido en el

laboratorio.

La porcion pelicular de la bolsa tiene estaciones para la lisis celular, la

purificacin de cidos nucleiocos, transcripcin inversa para detectar dianas de

ARN, primera etapa de PCR multiplex PCR, y una serie de hasta 120 informes de

terminacin de la segunda etapa de PCR anidados.

Despus de la extraccin y purificacin de cidos nucleicos de la muestra sin

procesar, la Matriz de pelcula lleva a cabo una PCR multiplex anidada que se

ejecuta en dos etapas. Durante la primera etapa PCR, la Matriz de pelcula realiza

una sola reaccin masiva y multiplexada. Los productos de la primera etapa PCR

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se diluyen a continuacin y se combinan con una mezcla maestra fresca sin

imprimacin (cebadores).

Parte del volumen de esta segunda solucin de mezcla maestra se distribuyen a

cada uno de los pocillos de la matriz. Cada pocillo de la matriz se prespotted con

un nico conjunto decebadores. En la segunda etapa, el pequeo volumen PCR serealiza en modo singleplex en cada pocillo de la matriz. A pesar de que este

ensayo utiliza PCR anidada, toda la prueba se lleva a cabo dentro de una bolsa

sellada, eliminando de este modo la contaminacin por arrastre. El uso de la

amplificacin y la curva de fusion de datos, el software de la matriz de pelcula

genera automticamente un resultado para cada objetivo. Una Matriz de pelcula

para la deteccin de 20 patgenos respiratorios diferentes esten desarrollo.

PCR en tiempo real se describen mtodos mediante los cuales la amplificaci

n de

la diana y etapas de deteccin se producen simultneamente en el mismo tubo

(homogneo).

Estos mtodos requieren termocicladores especiales con ptica de precisin que

puede controlar la emisin de fluorescencia de los pocillos de muestra. El COM-

software informtico apoyar el termociclador monitorea los datos a lo largo

la PCR en cada ciclo (cintica) y genera un grfico de amplificacin de

cada reaccin. Un grfico de amplificacin tpico se muestra en la Figura 66-3. los

grfico de amplificacin muestra la seal de fluorescencia normalizada de la

reportero (Rn) en cada n

mero de ciclo. En los ciclos iniciales hay pocacambio en la cantidad de fluorescencia. Esto define la lnea de base de la trama.

Un aumento por encima de la lnea de base indica la deteccin de la PCR

acumulado producto. Un umbral de fluorescencia fijo puede establecerse por

encima de la lnea de base para llamar muestras positivas. El ciclo de PCR en el

que la fluorescencia de la muestra pasa el umbral se define como el ciclo

umbral(CT). Hay un relacin lineal inversa entre el logaritmo de la concentracin

objetivo inicial

cin y la CT. Alternativamente, el nmero de ciclo correspondiente a la

cambio de velocidad mxima en la fluorescencia, la segunda derivada mxima,

tiene

una relacin similar a la concentracin objetivo inicial.

En el formato ms simple, se detecta producto de PCR ya que se produce

utilizando

colorantes fluorescentes que se unen preferentemente al ADN de doble hebra

(dsDNA). SYBR Green I es un tal tinte que se ha utilizado en esta aplicacin

cin ( Morrison, 1998). En el estado no unido, la fluorescencia es relativamente

bajo, pero cuando se unen al ADN de doble cadena de la fluorescencia es mucho

mayor. los

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Colorante de unin a ADN se unira cualquier ADN de doble cadena y por lo

tanto se unirtanto

productos especficos y no especficos de PCR igual de bien. La especificidad de la

la deteccin se puede mejorar a travs del anlisis de curvas de fusin. A medida

que latemperatura se eleva lentamente, las dos cadenas de amplicn se funden aparte

y la cantidad de fluorescencia disminuye. Los datos se transforman y

analizadas por el trazado de la primera derivada de la fluorescencia en el eje yy

la temperatura en el ejex-.El producto amplificado especfico tendruna

caracterstico pico de fusin a su temperatura de fusin predicha (T

metro

),

mientras que los dmeros de cebadores y otros productos no especficos deben

tener unaT diferente

metro

o dar picos ms amplios ( Ririe, 1997).

La especificidad de la PCR en tiempo real tambin se puede aumentar mediante la

inclusin de

sondas de hibridacin en la mezcla de reacciones. Estas sondas se marcan

con colorantes fluorescentes o con combinaciones de fluorescente y un extintor

colorante. En el 5 'nucleasa ensayo (TaqMan) PCR, la 5'-3' exonucleasa

de Taq ADN polimerasa se utiliza para escindir una hibridaci

n improrrogablesonda durante la fase de extensin del cebador de PCR ( Holanda, 1991). Esta

enfoque utiliza doble etiquetado sondas de hibridacin fluorognico. una

fluorescencia

colorante ciento sirve como reportero y su espectro de emisin se inactiva por la

segundo colorante fluorescente. La degradacin por nucleasa de la hibridacin

sonda libera el colorante indicador, lo que resulta en un aumento de su pico de

fluoruro

rescent emisin ( Higo.66-4). El aumento de la emisin fluorescente indica

que especfica producto de la PCR se ha hecho y la intensidad de la fluorescencia

se relaciona con la cantidad de producto ( Heid, 1996). Especificidad se

incrementa

porque la seal se genera slo cuando el cebador y la sonda estn obligados a

la misma cadena molde.

La transferencia de energa por resonancia de fluorescencia (FRET) sondas

tambin puede ser

utilizado para detectar el producto de PCR como se genera ( Lay, 1997). Este

metodo

requiere dos sondas de oligonucletidos especficos de secuencia especialmente

diseados.

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Estas sondas de hibridacin se hibridan una junto a la otra en el producto

molcula. Como se muestra en Figura 66-5, El extremo 3 'de una sonda se marca

con

un colorante donante y el extremo 5 'de la otra sonda se marca con un aceptor

colorante. El colorante donante es excitado por una fuente de luz externa y, enlugar de

emisor de luz, transfiere su energa al tinte aceptor por un proceso llamado

TRASTE. El colorante aceptor excitado emite luz a una longitud de onda ms larga

que

el colorante donante no unido y la intensidad de la emisin de luz colorante aceptor

es proporcional a la cantidad de producto de PCR.

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