Aprovechamiento biotecnológico de la melaza de caña de azúcar para la

7/22/2019 Aprovechamiento biotecnológico de la melaza de caña de azúcar para la

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Aprovechamiento biotecnológico de la melaza de caña de azúcar para laproducción de ácido láctico utilizando Lactobacillus Rhamnosus

1Castro, G. B., 1Bustos, V.G., 2 Ramírez J, A.

U.A.M. Mante – UAT. Cd. Mante, Tam..2 Dpto.de Ciencia y Tecnología, U.A.M. Reynosa-Aztlán –UAT. Reynosa, Tam.

[email protected]

Palabras clave: Melaza de caña de azúcar, Ácido láctico, subproductosKey words: sugar cane molasses, lactic acid, by-product

RESUMEN

La melaza (miel final), representa una alternativa para la producción biotecnológica deácido láctico, principalmente por su alto contenido en azúcares, así como por su bajocosto. El objetivo de este trabajo fue determinar la mayor producción de ácido lácticousando como fuente de carbono la miel final, utilizando diferentes concentraciones deazúcares totales (20,30, 40 g/L). Así, se probaron también diferentes métodos para suesterilización. Para evaluar la melaza como fuente de carbono, se establecieroncomparaciones con resultados obtenidos en fermentaciones utilizando la fórmulacompleta del medio general de Lactobacillus. Las concentraciones de los compuestosorgánicos se determinaron por HPLC usando un detector de índice de refracción. Lascondiciones y resultados con los que se obtuvieron buenos rendimientos de ácidoláctico fueron: Melaza (azúcares totales 40 g/L), la producción máxima de ácido láctico

fue de 12.3 g/L y se presentó a las 48 horas de la fermentación, cuando la melaza fueesterilizada por filtración.

ABSTRACT

The molasses (final honey), represents an alternative for the biotechnologicalproduction of lactic acid, principally for his high place contained in sugars, as well as forhis low cost. The objective of this work was determine the major lactic acid productionusing as source of carbon the final honey, using different concentrations of total sugars(20,30, 40 g/L). This way, different methods were proved also for his sterilization. To

evaluate the molasses as source of carbon, comparisons were established by resultsobtained in fermentations using the complete formula of Lactobacillus general way. Theconcentrations of organic compounds was analyzed using an HPLC using a detector ofindex of refraction. The conditions and results with which there were obtained goodyields of lactic acid were: Molasses (total sugars 40 g/L), the maximum lactic acidproduction was 12.3 g/L and appeared at 48 hours of the fermentation, when themolass was sterilized by filtration.



INTRODUCCIÓN

Actualmente, uno de los principales problemas a nivel mundial en las agroindustrias, esla gran cantidad de desechos o subproductos orgánicos, que se obtienen delprocesamiento de la materia prima, estos residuos representan una fuente muy amplia

de contaminación y rica en nutrientes, principalmente carbohidratos, que pueden serutilizados como materias primas para la obtención biotecnológica de sustancias de altovalor comercial, proporcionando un valor agregado al cultivo, como es el caso de laproducción de ácido láctico o xilitol a partir de hidrolizados de caña de azúcar, paja desorgo o maderas blandas, ácido cítrico utilizando concentrados de remolacha, alcoholetílico de melaza de caña de azúcar, entre otros.

Los residuales y subproductos de la industria azucarera son relativamentecontaminantes, al mismo tiempo que contienen una gran cantidad de nutrientesorgánicos e inorgánicos que permiten su reciclaje en la elaboración de otros productoscomo son alimento para ganado, así como en la producción industrial de tableros

aglomerados, papel, cartón, etc.

Uno de los principales residuales de esta industria son las mieles o melazas finales quees el subproducto de la fabricación o refinación del azúcar crudo. La melaza esampliamente utilizada como materia prima para las fermentaciones tales como laproducción del etanol y ácido láctico debido a su abundancia y precio bajo comparadocon otra materias primas disponibles. La producción del ácido láctico por fermentaciónes interesante debido a la perspectiva de usar las materias primas baratas. Lasfuentes del carbono para el proceso de fermentación del ácido láctico pueden ser laglucosa, la maltosa, la sacarosa o materias primas como melaza y suero de queso oalgunos subproductos agrícolas (Bulut y col, 2004).

Su interés radica en varios aspectos, siendo uno de los más destacados su aplicaciónen la industria alimentaria, debido a sus propiedades como acidulante y conservante, otambién a su intervención durante la fermentación láctica en procesos como lafabricación del yogurt (Parajó y col., 1995a) o la elaboración de quesos.

La producción de ácido láctico puede abordarse por vía química a partir deacetaldehído, como por vía biotecnológica, a partir de disoluciones de azúcares. Enesta investigación se estudió el aprovechamiento biotecnológico de la melaza o mielfinal subproducto de la industrialización de la caña de azúcar para la producción de

ácido láctico, determinando las condiciones adecuadas de fermentación que permitanun alto rendimiento, utilizando Lactobacillus rhamnosus.

MATERIALES Y METODOS

L. rhamnosus NRRL B-445 fue obtenido del National Center for Agricultural ResearchService Culture Collection (Peoria Illinois, USA). La melaza (miel final) fueproporcionada por el Ingenio azucarero de Xicoténcatl: Compañía azucarera del RioGuayalejo, S.A. de C.V. (Xicotencatl, Tamaulipas, México).



Caracterización de la melaza (miel final)

Se determinó el contenido de sólidos pesando aproximadamente 5 g de melaza encada uno de tres crisoles previamente secados en el horno (Blue M., modelo OV-500-2)durante 24 horas y de peso conocido; los crisoles se metieron al horno durante 48

horas a 105 °C. El contenido de cenizas se determinó utilizando crisoles de porcelanasecados por 24 horas en el horno a 105 °C. La muestra utilizada fue de 1 gaproximadamente y se incineró en una mufla a 550 °C , hasta alcanzar peso constante.

Determinación de compuestos orgánicos

Los compuestos orgánicos (glucosa, fructosa, sacarosa, ác. láctico, etc.) se analizaronpor cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) (Hewlett Packard) utilizando unacolumna de intercambio iónico (Transgenomic ION-300), bajo las siguientescondiciones: un flujo de 0.400 mL/minuto, 10 µL de muestra, temperatura 20 °C y 93

bar de presión y como fase móvil se utilizó una disolución de H2SO4 0.005 N.

Determinación de la concertación de biomasa

La concentración de biomasa se determinó mediante la recta de calibración de biomasaque relaciona concentraciones de biomasa en g/L, con valores de absorbencia medidospor espectrofotómetro a 460 mn (Espectrofotómetro Shimadzu UV-1601 con celda decuarzo 5 mL).

Preparación del inóculo

El inóculo se preparó utilizando la fórmula del medio general de Lactobacillus propuestapor Mercier, cuya composición se aprecia en el Cuadro1, para el crecimiento debacterias en medio liquido, utilizando matraces Erlenmeyer de 250 mL; el medio seacidificó con HCl hasta alcanzar un pH de 5.85 (Potenciómetro COLE PARMER,modelo 05669-20), se incubaron a 45 °C, durante 24 horas (Shaker Mult-TierEnvironmental, INNOVA 4900, new Brunswick scientific co. inc. edition, New JerseyUSA.); la concentración de biomasa se midió en el espectrofotómetro a 460 nm.

Preparación del medio de cultivo

Se probaron diferentes métodos de esterilización, utilizando concentraciones de 20, 30y 40 g/L de azúcares totales de miel final aproximadamente. Como medio nutritivo seutilizó el medio general de Lactobacillus MRS, que se preparó colocando 50 mL delmedio en matraces Erlenmeyer de 250 mL, y se adicionó con 50 mL de disoluciones demelaza, obteniendo un volumen final de 100 mL.

Así, para neutralizar el ácido láctico producido, se adicionó CaCO3 en unaconcentración de 20, 30 y 40 g/L a los matraces con medio nutritivo. Los métodos de

esterilización fueron los siguientes: en el primer método, el medio nutritivo se esterilizóen autoclave a 121 °C durante 20 minutos, mientras que la dilución de melaza se



esterilizó por filtración a vacío (Bomba de vacío SIEMENS, modelo FE-1500L)utilizando filtros millipore, estériles, con poro de 0.22 um.

En el segundo método, la dilución de melaza y el medio nutritivo se mezclaron en unsolo matraz y se esterilizó en autoclave a 121 °C por 20 min.

En el tercer método, la dilución de miel y el medio nutritivo se esterilizaron porseparado en autoclave a 121 °C durante 20 minutos y todos se inocularon con 10 mLde inóculo denso todo esto, bajo campana en condiciones estériles (CampanaLABCONCO de luz UV visible).

Los experimentos se llevaron acabo en agitadores orbitales, a 200 r.p.m. y a unatemperatura de 45 °C, temperatura óptima de Lactobacillus Rhamnosus.

Preparación de la muestra

Se tomaron 0.5 mL de muestra en tubos de ensayo con punta de pipeta estériles bajocampana en condiciones estériles, se centrifugaron durante 20 minutos a 3000 r.p.m. a21 ºC; el líquido sobrenadante se vertió en tubos de ensayo plásticos con tapón, ysobre balanza analítica se diluyó con agua destilada, con un factor de diluciónaproximado a 10. La muestra diluida se filtró utilizando jeringas de 5 mL y acrodiscosde 0,45 µm y se pasó a viales para su análisis por HPLC.

Análisis de datos

Los datos fueron procesados utilizando el programa Microsoft Office, Excel 2003, paraobtener los resultados de las concentraciones de los compuestos orgánicos, así, comola representación gráfica de las cinéticas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La composición de la miel final fue: sólidos totales 23.2 %, humedad 36.7 %, cenizas5.6 %, azúcares totales 866.3 g/L de los cuales, glucosa 93.76 g/L, fructosa 143.94 g/Ly sacarosa 628.59 g/L. El contenidos de cenizas fue ligeramente más bajo que los

presentados por Wee Y.-J. y col (2004) para la melaza de azúcar, la cual también fueutilizada para la producción de ácido láctico por fermentación, utilizando Enterococofaecalis, mientras que la humedad es significativamente más alta, además, el contenidode azúcares totales es considerablemente mayor al publicado por estos mismosautores.

En la Figura 1 se muestran los resultados obtenidos a partir de la fermentación conmedio general de Lactobacillus utilizando 20 g/L de glucosa, con una concentracióninicial de biomasa de 0.241 g/L, donde se aprecia como la glucosa fue rápidamentetransformada a ácido láctico, alcanzando una concentración máxima de 8.5 g/L a las 24horas.



En la Figura 2 se aprecia la cinética de fermentación utilizando disoluciones de fructosaa una concentración de 40 g/L aproximadamente. Se observa que la fructosa esconsumida en su totalidad a las 24 horas, presentándose la máxima producción deácido láctico en este mismo tiempo que equivale a 15.3 g/L, así también se observaque al desaparecer la fructosa, la concentración de ácido láctico empieza a descender,

lo que hace suponer que el L. rhamnosus utiliza el ácido producido, como nutriente.

En la Figura 3 se presenta la cinética de fermentación utilizando la fórmula del mediogeneral de Lactobacillus con una concentración de sacarosa de 40 g/L, así podemosapreciar que la producción máxima de ácido láctico fue aproximadamente de 12.06 g/Ly se presentó a las 96 horas. Cabe destacar que la sacarosa no se consumió en sutotalidad y la concentración de ácido láctico no desciende, sino que va en aumento.Comparando esta cinética con las anteriores, podemos afirmar que utilizandodisoluciones de sacarosa, la cinética de fermentación se vuelve mucho mas lenta y porlo tanto más costosa, lo que se debe a que la sacarosa es un carbohidrato mascomplejo y por lo tanto mas difícil de metabolizar.

Analizando las figuras anteriores (1, 2, 3), en el caso de la glucosa, ésta fue consumidacompletamente, presentando una concentración menor a lo presentado por Bulut S. ycol (2004) quienes obtuvieron una concentración de ácido láctico de 60%, en el caso dela Sacarosa; igualmente, la producción de ácido láctico es por debajo de lo obtenidopor estos investigadores, aunque el comportamiento tanto de la glucosa como de lasacarosa son muy similares.

En la Figura 4 se muestra la cinética de fermentación utilizando diluciones de miel finalesterilizada por filtración en una concentración aproximada de 20 g/L de azúcares, así,se observa que a las 48 horas de la fermentación, los azúcares son consumidos casien su totalidad, mientras que la producción máxima de ácido láctico se presenta a las24 horas con una concentración de 7.4 g/L.

Comparando los resultados obtenidos utilizando sólo el medio general de Lactobacillusse observa que, aunque el consumo total de azúcares se presenta en el mismoperiodo de tiempo, la producción de ácido láctico es menor a la producida utilizandosólo la formula del medio general de Lactobacillus con disolución de glucosa; de igualmanera, al comparar el comportamiento de la sacarosa con la fermentación dedisolución de la misma, se observa un comportamiento muy similar, ya que es esteazúcar el que más tarda en ser consumido.

En la Figura 5 se presenta la cinética donde se utilizaron concentraciones de melaza de20 g/L, en la cual se puede apreciar la concentración máxima de ácido lácticoproducido que para este caso fue de 5.4 g/L a las 24 horas, el consumo de azúcares escasi por completo a las 48 horas de la fermentación, a excepción cantidades trazas defructosa..

En la Figura 6 se presentan los resultados obtenidos durante la fermentación donde seutilizó una concentración de 20 g/L de azúcares de miel final. La melaza se mezcló conlos nutrientes del medio y se esterilizaron en autoclave, la producción máxima de ácidoláctico fue de 7.4 g/L

a las 24 horas.



En las figuras 4, 5 y 6, la cinética de fermentación fue rápida, y la producción de ácidoláctico es mayor a la alcanzada por S. Bulut y col., (2004), cuya fermentación fue hechacon melaza pasteurizada utilizando Rhizopus oryzae, la concentración de melazautilizada fue mayor a la de este estudio 75 g/L, aunque al utilizar una concentraciónmayor (400 g/L) la producción de ácido láctico también aumentó (40 g/L).

Una vez analizados los tres tratamientos de la malaza, se observó que el método másadecuado según el comportamiento de los azúcares y la concentración de ácido lácticofue el de esterilización por filtración.

La producción de ácido láctico es mucho menor a la presentada por Wee Y.-J. y col (2004), con una mayor concentración de melaza (equivalente a 68-170 g de azúcartotal) utilizando enterococus faecalis. Aksu Z. y col, (1986), utilizaron Lactobacillusdelbrueckii NRRL B445 y obtuvieron una producción de ácido láctico de 83%, sinembargo, estas cinéticas son lentas comparadas con este estudio, presentando sumáxima producción a las 90 horas. Aunque varios estudios en la producción de ácido

láctico de la melaza fueron reportados, la mayoría de los resultados sobre laproductividad producida son valores relativamente bajos, (Monteagudo J.M y col 1994,Kotzamanidis Ch, 2002). Por otra parte, los tratamientos previos adicionales de lamelaza, pudieron ser necesarios para realzar la eficacia de la fermentación, porque lamelaza contiene metales pesados a un cierto grado (hierro, cinc, cobre, manganeso,magnesio, calcio, etc.), que pudo inhibir el crecimiento de la célula, afectar el medio,pH, y hacer inactivo las enzimas asociadas con la formación del producto (Roukas T,1998). Sin embargo, esos pasos adicionales para el tratamiento previo soneconómicamente desfavorables porque pueden complicar los procesos defermentación.

En la Figura 7 se presentan los resultados de la fermentación de azúcares de la melazausando 20 g/L de azúcares totales donde la producción máxima de ácido láctico sepresentó a las 24 horas y fue de 6.32 g/L, las muestra se tomaron a este intervalo detiempo, así, la concentración de glucosa y fructosa a las 24 horas es nula, mientras queel consumo de sacarosa es más lento.

En la Figura 8 se presentan los resultados de la cinética de fermentación dedisoluciones de miel final utilizando una concentración de azúcares de 30 g/L; seobserva que la producción máxima de ácido láctico fue a las 24 horas, con unaconcentración de 9.74 g/L.

En la Figura 9 se presentan los resultados obtenidos en la cinética de fermentación dedisoluciones de miel final utilizando una concentración de 40 g/L de azúcares totales,así, en la figura se puede observar que la producción máxima de ácido láctico es de12.3 g/L y se obtuvo a las 48 horas, igualmente se puede apreciar que laconcentración de glucosa y fructosa es nula a este mismo tiempo, mientras la sacarosase consume más lentamente a partir de las 48 horas, la concentración de ácido lácticoempieza a bajar, igual como ocurre con la fermentación de disoluciones de glucosa yfructosa.



CONCLUSIONES

Concentraciones de 30 g/L de melaza pueden producir buenos rendimientos de ácidoláctico con L. rhamnosus a las 24 horas. Al utilizar 40 g/L de melaza, aunque aumentala concentración en la producción de ácido láctico, también aumenta el tiempo de

fermentación hasta 48 horas.

La melaza obtenida del proceso de producción de azúcar, tras ser sometida a unproceso de esterilización por filtración puede ser utilizada para llevar a cabofermentaciones para la obtención de ácido láctico utilizando la bacteria Lactobacillusrhamnosus.

En general, los estudios llevados a cabo en esta investigación muestran que lautilización de melaza obtenida del proceso de producción de azúcar puede ser unaalternativa viable para rebajar el precio total del ácido láctico obtenido por víabiotecnológica, así como una forma de reducir el impacto ambiental generado por los

residuos producidos por el sector azucarero.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aksu, Z.; Kutsal, T. (1986). Lactic acid production from molasses utilizing Lactobacillusdelbrueckii and invertase together. Biotechnol. Lett . 8: 157-160.

Bulut S.; Elibol M.; Ozer D. (2004). Effect of different carbon sources on l (+) -lacticacid production by Rhizopus oryzae. Biochemical Engineering Journal 21: 33–37

Chahal, S. P. (1989). Lactic acid. En: “Ullmann´s Encyclopedia of Industrial Chemistry”.VCH Verlag. Berlín.

Hofvendahl, K.; Akerberg, C.; Zacchi, G. (1999 a). Simultaneous enzymatic wheatstarch saccharification and fermentation to lactic acid by Lactococcus lacti s. Appl.Biochem. Biotechnol. 52: 163-169.

Kotzamanidis Ch, Roukas T, Skaracis G. (2002). Optimization of lactic acid productionfrom beet molasses by Lactobacillus delbrueckii NCIMB 8130. World J MicrobiolBiotechnol; 18:441–8.

Monteagudo JM, Rodríguez L, Rinc´on J, Fuertes J. (1994). Optimization of theconditions of the fermentation of beet molasses to lactic acid by Lactobacillusdelbrueckii . Acta Biotechnol; 14:251–60.

Parajó, J. C.; Alonso, J. L.; Santos, V.; Moldes, A. B. (1995.a). Producciónbiotecnológica de ácido láctico: aspectos generales. Alimentación Equipos yTecnología., 15(1): 91-100.

Wee YJ, Yun JS, Park DH, Ryu HW. (2004). Biotechnological production of l(+)-lacticacid from wood hydrolyzate by batch fermentation of Enterococcus faecalis. Biotechnol

Lett ; 26:71–4.



TABLAS Y FIGURAS

Cuadro 1. Fórmula del medio general de lactobacillus.

COMPONENTE CONCENTRACIÓN

Glucosa 20 g/LExtracto de levadura 5 g/L

Peptona 10 g/L

Na3C6H5O7 2H2O 2.27 g/L

K2HPO4 2 g/L

Tween 80 1 g/L

MgSO4 7H2O 0.58 g/L

MnSO4 H2O 0.12 g/L

FeSO4 7H2O 0.05 g/L

C2H3O2Na 8.2 g/L

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Tiempo (hrs)

C o n c e n t r a c i ó n g / L

Glucosa Ác. Láctico

Figura 1. Fermentación con disoluciones de glucosa 20 g/L de azúcares totales, consumo de glucosay producción de ácido láctico.



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Tiempo (hrs)


Fructosa Ác. Láctico

Figura 2. Fermentación con disoluciones de fructosa 40 g/L de azúcares totales, consumo defructosa y producción de ácido láctico.

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Tiempo (hrs)


Sacarosa Ác. Lactico

Figura 3. Fermentación de disoluciones de sacarosa 40 g/L de azúcares totales, su consumo yproducción de ácido láctico.



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Glucosa Fructosa Sacarosa Ác.Láctico

Figura 4. Cinética de fermentación de disoluciones de miel final esterilizada por filtración (20 g/L deazúcares totales), consumo de glucosa, fructosa y sacarosa, y producción de ácido láctico.

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C

o n c e n t r a c i ó n g / L

Glucosa Fructosa Sacarosa Ác. Láctico

Figura 5. Cinética de fermentación de disoluciones de miel final esterilizada en autoclave (20 g/L de

azúcares totales), consumo de glucosa, fructosa y sacarosa, y producción de ácido láctico.



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Figura 6. Cinética de fermentación de disoluciones de miel final mezclada con el medio yesterilizados en autoclave (20 g/L de azúcares totales), consumo de glucosa, fructosa y sacarosa, yproducción de ácido láctico.

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Figura 7. Cinética de fermentación de disoluciones de miel final (20 g/L de azúcares totales).



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c e n t r a c i ó n g / L



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