SCMIMC

Societat Catalana de Malalties Infeccioses i Microbiologia Clínica. Febrer 2010

Mateu EspasaMicrobiologia, UDIAT-CD

Corporació Sanitària Parc Taulí

ANTIBIOGRAMA MOLECULAR PEL DIAGNÒSTIC DE LA RESISTÈNCIA

EN TUBERCULOSI

SCMIMC

ANTIBIOGRAMA MOLECULAR TBI. OBJECTIU:

Conèixer possible utilitat antibiograma molecular en TB

II. INTRODUCCIÓ:

Gens associats a resistència

Situació epidemiològica resistència (Mundial/Catalunya)

III. AVALUACIÓ TÈCNIQUES EXISTENTS:

Tècniques amplificació àcids nucleics-hibridació

Avantatges vs Desavantatges

IV. CONCLUSIONS:

Tècniques detecció directa fiables

Genotip vs fenotip sensibilitat

SCMIMC

BASES MOLECULARS RESISTÈNCIA IFÀRMAC GEN /

PROTEÏNA ACCIÓ MUTACIONS FREQÜÈNCIA

MUTACIONS

ISONIAZIDA katG / catalasa-

peroxidasa

activació isoniazida • codó 315 (AGC-ACC: Ser-Thr).

• deleccions parcials del gen.

30-50%

inhA / reductasa

transportadora grups acil-enoil

síntesi àcids micòlics paret

micobacteriana, enzim NADH

depenent. Àc. nicotínic

bloqueig de la zona d’ unió

NADH

• zona reguladora del gen, extrem

5’ (zona d’unió del ribosoma) -

posició -15 (C*T).

• mutacions gen estructural.

15-30%

zona intergènica oxyR-ahpC

oxyR - gen regulador

ahpC - activitat peroxidasa

En MTC inactius per

mutacions de base

• presència de mutacions en la

zona intergènica - activació

síntesi gen ahpC. Mutacions de

compensació - mutacions katG

5-10%

kasA / sintetasa transportadora de grups alkil

síntesi àcids micòlics paret

micobacteriana

• mutacions en els codons 66,

269, 312, 413.

(dubtosa la seva relació amb

resistència)

5%

SCMIMC

BASES MOLECULARS RESISTÈNCIA IIFÀRMAC GEN /

PROTEÏNA ACCIÓ MUTACIONS FREQÜÈNCIA

MUTACIONS

RIFAMPICINA rpoB / síntesi

subunitat β ARN

polimerasa

Transcripció - síntesi

protèica • zona codons 432-458:

c. 456 (Ser-Leu) / c. 451

(His-Lys) / c. 441 (Val-Asp)

95%

PIRAZINAMIDA pncA /

pirazinamidasa

activació pirazinamida,

medi àcid • mutacions o deleccions

en una zona de 186aa.

70%

ETAMBUTOL embB / arabinosil

transferasa - proteïna

transmembrana

transport àcids micòlics

- síntesi paret

micobacteriana

• codó 306 (Met-Ile/Val) 50-70%

ESTREPTOMICINA rrS / 16S ARNr traducció - síntesi

protèica • nucleòtids 530 i 915 -

zona interacció proteïna

12S rib.

5-10%

rpsL / proteïna ribosomal 12S

Traducció - síntesi

protèica • codons 43 i 88 (AAG-

AGG; Lys-Arg)

50-60%

QUINOLONES gyrA / subunitat A ADN girasa

superenrollament ADN • mutacions zona 40aa -

codons 90-94

40-80%

SCMIMC

Resistència apareix des de introducció d’antibiòtics antiTB.

Dècada ‘90 brots MDR-TB → “Emergència Mundial” (OMS-1993)

4th WHO Antituberculosis Drug Resistance report (2002-2007)

50% de MDR-TB → Xina i India.

7% de MDR-TB → Rússia.

Major proporció de MDR en casos nous Països ex-URSS

Azerbaijan (22,3%) i Moldàvia (19,4%).

XDR-TB → 37 països (països ex-URSS >25 casos)

EPIDEMIOLOGIA MUNDIAL RESISTÈNCIES TB

CASOS NOUS CASOS TRACTATS GLOBAL

R total 17% (8-12) 35%(24-46) 20% (16-24)

INH-R 10%(8-12) 27.7% (19–37) 13%(16-24)

MDR-TB 3%(2-4) 15%(10-21) 5%(4-7)

SCMIMC

EPIDEMIOLOGIA MUNDIAL RESISTÈNCIES TB

SCMIMC

EPIDEMIOLOGIA MUNDIAL RESISTÈNCIES TB

SCMIMC

PREVALENÇA RESISTÈNCIA CATALUNYA (2005-07)

Tractats (n=310)Nous (n=4.566)

Registre de Catalunya – Departament de Salut (Anna Rodés)

Soques INH i/o RMP resistents: nous – n=165 / tractats – n=34

SCMIMC

INH (n=92) RMP (n=19)Diana No. Soc. % Diana No. Soc. %

inhA 24 26,1 rpoB 17 89,5

katG 44 47,8 Wild Type 2 10,5

inhA + katG 3 3,3Mutació més freqüent

S531LWild Type 21 22,8

Mutacions més freqüentsC15T (katG) i S315T1 (inhA)

MDR (n=18)Diana No. Soc. %

rpoB 16 88,9

inhA 3 16,7

katG 15 83,3

PREVALENÇA RESISTÈNCIA CATALUNYA (2005-06):Mecanismes Genètics Resistència

INH-R potencialment detectables 77%RIF-R (MDR-TB) potencialment detectables 90%

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES I.Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

Ruiz M. et al. J Clin Microb, 2004, 42(4).

Direct Detection of Rifampin- and Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis in

Auramine-Rhodamine-Positive Sputum Specimens by Real-Time PCR.

• 205 mostres clíniques BK positiu (108 pacients/17 soques resistents)

• Detecció resistència INH (katG/inhA): sensibilitat global 54%! i especificitat 100%.

• Detecció resistència RIF (rpoB) sensibilitat i especificitat 100%. DETECTA 100% MDR-TB.

Marin M et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48.

Rapid direct detection of multiple rifampin and isoniazid resistance mutations in

Mycobacterium tuberculosis in respiratory samples by real-time PCR.

• Optimització PCR temps real per detecció resistència a RIF (rpoB) i INH (katG) en mostra clínica.

• Bona sensibilitat per mostres BK+ i 100% especificitat.

Espasa M, et al. J Antimicrob Chemother. 2005, 55(6).

Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of

Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicin using fluorogenic probes.

• 226 mostres clíniques BK positiu i negatiu (181 pacients/55 soques resistents)

• Detecció resistència INH (katG/inhA): sensibilitat 95% (50% global) i especificitat 100%.

• Detecció resistència RIF (rpoB) sensibilitat i especificitat 100%.

• Sensibiltat en la detecció global de resistència 74% pacients resistents.

“Casolans” mostres clíniques: Sondes d’ADN fluorescents

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES II.Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

Aragón LM. et al. J Antimicrob Chemother 2006. 57.

Rapid detection of specific gene mutations associated with isoniazid or rifampicin

resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates using non-fluorescent

low-density DNA microarrays.

• Estudi de 46 soques resistents: 41 INH-R (katG/inhA) i 16 RIF-R (rpoB).

• Soques INH-R, concordància 100% per katG i 95% per inhA. Global INH-R 62%

• Soques RIF-R, concordància 93.8% per rpoB.

“Casolans” soques MTB: “Low Cost and Density (LCD) Microarrays”

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES III.Tècniques amplificació ADN

Pietzka AT. et al. J Antimicrob Chemoterap 2009, 63.

Rapid identification of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates

by rpoB gene scanning using high-resolution melting curve PCR analysis.

• Estudi de 49 soques MDR-TB. Avaluació només RIF-R (rpoB).

• Sensibilitat del 95.9% , especificitat del 100% i VPN/VPP del 100%.

“Casolans” soques MTB: “High Resolution Melting (HRM) curves”

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES IV.Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

Helb D. et al., J.Clin.Microb. 2010,48(1).

Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and RifampinResistance by Use of On-Demand, Near-Patient Technology.

Cepheid Announces New Diagnostic Technology to Aid World Efforts inHalting the Spread of Mycobacterium tuberculosis (TB)

Estudi sensibilitat (107 mostres Vietnam):

100% sensibilitat BK+

71% sensibilitat BK-

100% especificitat

Estudi detecció Rif-R (64 mostres Uganda):

100% sensibilitat (9 soques Rif-R)

100% especificitat

Comercials mostres clíniques: “GenXpert® MTB/Rif (Chepeid)”

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES V.Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

Comercials mostres clíniques II: “INNOLIPA Rif.TB® (Innogenetics)”

Traore H. et al. J Clin Microbiol. 2006 44(12).

Direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA and rifampin resistance in

clinical specimens from tuberculosis patients by line probe assay.

Tortoli E. et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2007 26(1).

Use of the INNO LiPA Rif.TB for detection of Mycobacterium tuberculosis DNA directly in

clinical specimens and for simultaneous determination of rifampin susceptibility.

Quezada CM. et al. J Clin Microbiol. 2007 45(9).

Implementation validation performed in Rwanda to determine whether the INNO-LiPA

Rif.TB line probe assay can be used for detection of multidrug-resistant Mycobacterium

tuberculosis in low-resource countries.

Ogwang S. et al. BMC Infect Dis. 2009 26(9).

Comparison of rapid tests for detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis

in Kampala, Uganda.

Acuna-Villaorduna C. et al. Clin Infect Dis. 2008 47(4).

Cost-effectiveness analysis of introduction of rapid, alternative methods to identify

multidrug-resistant tuberculosis in middle-income countries.

Ling DI. et al. Eur Respir J. 2008, 32(5).

GenoType MTBDR assays for the diagnosis of MDR-TB: a meta-analysis.

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES VI.Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

Bang D. et al. J Clin Microb, 2006, 44(7).

Rapid Genotypic Detection of RIF and INH-R M.tuberculosis Directly in Clinical Specimens.

Somoskovi A. et al. J Clin Microb, 2006, 44(12).

Use of Smear-Positive Samples To Assess the PCR-Based Genotype MTBDR Assay for Rapid,

Direct Detection of the M.tuberculosis Complex as Well as Its Resistance to INH and RIF.

Hilleman D. et al. Int J Tuberc Lung Dis, 2006, 10 (9).

Application of the Genotype MTBDR assay directly on sputum specimens.

Hillemann D. et al. J Clin Microb, 2007, 45(8).

Evaluation of the GenoType MTBDRplus Assay for Rifampin and Isoniazid susceptibility

Testing of Mycobacterium tuberculosis Strains and Clinical Specimens.

Lacoma A. et al. J Clin Microb, 2008, 46(11).

Genotype MTBDRplus Assay for Molecular detection of riframpin and isoniazid resistance in

M.tuberculosis strains and clinical samples.

Miotto P. et al. J Clin Microbiol, 2008, 46

Genotype MTBDRplus: a further step toward rapid identification of drug-R M.tuberculosis.

Barnard M. et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2008, 177.Rapid molecular screening for multidrug-resistant tuberculosis in a highvolume public

health laboratory in South Africa.

Nikolayevskyy V. et al. BMC Clin Pathol 2009, 9(2).

Performance of the Genotype® MTBDRPlus assay in the diagnosis of tuberculosis and drug

resistance in Samara, Russian Federation.

Comercials mostres clíniques: “Genotype® MTBDR/plus (HAIN)”.

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES VII.Comparació tècniques ràpides fenotípiques/mol.leculars

Bwanga F., et al. BMC Infectious Diseases 2009, 9(67).

Direct susceptibility testing for multi drug resistant

tuberculosis: A meta-analysis

META-ANÀLISIS LITERATURA DE TÈCNIQUES FENOTÍPIQUES i

GENOTÍPIQUES DIRECTES EN MOSTRA CLÍNICA

1. FENOTÍPIQUES:

Nitrate Reduction Assay (NRA) – 4 treballs

Microscopic Observation Drug Susceptibility (MODS) – 6 treballs

2. GENOTÍPIQUES:

Genotype MTBDR i MTBDRplus (HAIN®) – 3 i 5 treballs

Bona correlació de totes per detecció de INH-R, RIF-R I MDR-TB.

Fenotípiques són menys complexes i barates.

Genotípiques són més ràpides.

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES VIII.Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

Comercials mostres clíniques: “Genotype® MTBDRplus/INNOLIPA® Rif.TB”

Estudis a diferents països amb diferents realitats

epidemiològiques de TB.

Tots els treballs amb sensibilitat, especificitat, VPP i VPN

>90% per la detecció de soques MDR(mostres BK+).

Utilitat en mostres contaminades i soques perdudes.

Existeix un percentatge (5-10%) de mostres amb possibles

infeccions mixtes de soques sensibles i resistents –

implicacions clíniques?.

Prova diagnòstica proposada per OMS/FIND/CDC.

Falta treball d’intervenció clínica (en curs??).

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES IX.Aplicació clínica antibiograma molecular

O’Riordan P. et al. PLOS ONE, 2008, 3(9).

Rapid Molecular Detection of Rifampicin Resistance Facilitates

Early Diagnosis and Treatment of Multi-Drug Resistant

Tuberculosis: Case Control Study.

ESTUDI RETROSPECTIU DE LA UTILITAT DEL DIAGNÒSTIC

MOLECULAR DE MUTACIONS EN EL rpoB EN PACIENTS

DIAGNOSTICATS DE TB (REGNE UNIT).

Detecció molecular mutacions rpoB de rutina desde 1997 si BK+:

42 casos MDR-TB i 14 amb resultat rpoB diagnòstic precoç 6-7

setmanes.

Tendència a menor letalitat i complicacions si diagnòstic precoç.

Probable impacte econòmic.

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES. ResumTotes les tècniques són vàlides per diagnòstic i detecció

resistències en mostra clínica, sobretot MDR-TB i BK+.

Mostres baciloscopia positiva (elevada transmisibilitat):

• Sensibilitat >95% pel diagnòstic de tuberculosis.

• Sensibilitat >90% pel diagnòstic de MDR-TB.

• Sensibilitat 70-95% pel diagnòstic de INH-R, però >95% en els

casos amb R d’alt nivell (katG).

Mostres baciloscopia negativa (menor transmissibilitat):

• Sensibilitat 50-70% pel diagnòstic de tuberculosis.

• Poc estudiat per l’estudi de resistències, és necessari “trencar-s’hi

les banyes”?? Passaria per uns criteris clínics molt clars.

• Poc bacilífers menor transmissibilitat.

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES. AVANTATGES

Rapidesa en la detecció de possibles resistències

(2-7 dies vs 40-50 dies), sobretot BK positius.

Possible influència positiva en l’epidemiologia:

Adequació del tractament dins la primera

setmana de diagnòstic. Evitariem possibles

transmissions per TB mal tractades, nous casos?

Adequació de les pautes de profilaxis.

Evitariem possibles futurs casos nous resistents?

SCMIMC

AVALUACIÓ TÈCNIQUES. DESAVANTATGESLimitació en la detecció de resistències a isoniazida:

Kits comercials NO inclouen gens INH (INNOLIPA Rif.TB/GenXpert RIF/TB)

30-40% soques amb mecanismes genètics de resistència desconeguts, però

pot venir cobert per:

Detecció de resistència en quasi tots els casos de MDR.

Soques monoresistents amb baixa resistència a INH quina implicació té en el tractament?.

Tecnologia “cara”???? i “sofisticada (països baixa renta)”?.

“Baixa prevalença” de resistència en el països amb baixa-mitja

incidència – és útil? Podria evitar casos nous mantenir prevalença?

Ampliació a altres antibiòtics per diagnòstic XDR-TB tècniques

en avaluació: GenoType® MTBDRsl-HAIN, LCR microarrays (TB-BCN).

Continuarà sent necessari fer el fenotip (antibiòtics no detectats).

SCMIMC

POLÍTIQUES ORGANISMES INTERNACIONALS

ORGANITZACIÓ MUNDIAL DE LA SALUT (OMS), 2008

CENTER FOR DISEASE CONTROL (CDC), 2009

SCMIMC

CONCLUSIONSSI QUE ÉS ÚTIL, I S’HAURIA D’UTILITZAR

L’ANTIBIOGRAMA MOLECULAR, SOBRETOT PER LA

DETECCIÓ DE SOQUES MDR-TB.

POTSER FALTARIEN ESTUDIS D’INTERVENCIÓ?:

VALIDAR-NE LA SEVA UTILITAT CLÍNICA EN LA PRESSA

DE DECISIONS TERAPÈUTIQUES (tots els pacients amb

sospita TB o grups de risc de resistència).

POSSIBLE IMPACTE EPIDEMIOLÒGIC: prevenir o curar?

POSSIBLE IMPACTE ECONÒMIC.

SCMIMC

Societat Catalana de Malalties Infeccioses i Microbiologia Clínica. Febrer 2010

Mateu EspasaMicrobiologia, UDIAT-CD

Corporació Sanitària Parc Taulí

ANTIBIOGRAMA MOLECULAR PEL DIAGNÒSTIC DE LA RESISTÈNCIA

EN TUBERCULOSI