Análisis metodológico para la extracción de ADN ......El ADN de la célula eucariota se encuentra...
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS SEDE OCOZOCOAUTLA Análisis metodológico para la extracción de ADN metagenómico en muestras coprológicas humanas Tesis Que para obtener el título de Químico Farmacobiólogo PRESENTA: Ivar Jasiel Torres Romero Director interno: M.C. Raúl Edgardo Cruz Cadena. Universidad Autónoma de Chiapas Directores externos: Dr. Héctor Ochoa Díaz-López, Dra. Orquídia Guadalupe Méndez Flores. El Colegio de la Frontera Sur Ocozocoautla de Espinosa, Chiapas; agosto de 2018.
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS
SEDE OCOZOCOAUTLA
Análisis metodológico para la extracción de ADN
metagenómico en muestras coprológicas humanas
Tesis
Que para obtener el título de
Químico Farmacobiólogo
PRESENTA:
Ivar Jasiel Torres Romero
Director interno:
M.C. Raúl Edgardo Cruz Cadena.
Universidad Autónoma de Chiapas
Directores externos:
Dr. Héctor Ochoa Díaz-López,
Dra. Orquídia Guadalupe Méndez Flores.
El Colegio de la Frontera Sur
Ocozocoautla de Espinosa, Chiapas; agosto de 2018.
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Reconocimientos
El presente trabajo se realizó en las instalaciones del laboratorio de Salud y laboratorio de
Genética de ECOSUR y con el financiamiento de un proyecto de investigación a cargo del
Dr. Héctor Ochoa Díaz-López, Investigador Titular “C” del Departamento de Salud de El
Colegio de la Frontera Sur Unidad San Cristóbal.
Todo el material de laboratorio así como equipo y reactivos fueron proporcionados por tal
institución, incluyendo un apoyo de beca al tesista durante el tiempo requerido para la
realización de este proyecto de tesis.
El proyecto se realizó con la colaboración de alumnos y docentes de la Escuela de Ciencias
Químicas Sede Ocozocoautla de la Universidad Autónoma de Chiapas en el municipio de
Ocozocoautla de Espinosa, Chiapas; así mismo bajo la asesoría técnica de la Dra. Orquídia
Guadalupe Flores Méndez y de la M. en B. Pilar Elena Núñez Ortega en la Unidad San
Cristóbal de El Colegio de la Frontera Sur.
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Índice
I. Resumen .............................................................................................................................. 7
II. Introducción ....................................................................................................................... 8
III. Marco Teórico ................................................................................................................ 10
3.1 Ácidos Nucleicos ........................................................................................................ 10
3.2 Métodos de extracción ................................................................................................ 14
3.3 Pureza de ácidos nucleicos ......................................................................................... 15
3.4 Análisis moleculares ................................................................................................... 15
IV. Antecedentes Metodológicos ......................................................................................... 17
4.1 Uso de detergentes (CTAB y SDS) ............................................................................ 17
4.2 Uso de disolventes orgánicos ..................................................................................... 17
4.3 Metagenómica ............................................................................................................ 18
V. Planteamiento del Problema ............................................................................................ 20
VI. Hipótesis ......................................................................................................................... 21
VII. Justificación .................................................................................................................. 21
VIII. Objetivo General .......................................................................................................... 22
IX. Objetivos específicos ...................................................................................................... 22
X. Metodología ..................................................................................................................... 22
10.1 Participantes y muestra ............................................................................................. 22
10.2 Materiales, equipos y reactivos. ............................................................................... 24
10.3 Extracción de DNA. ................................................................................................. 25
10.4 Cuantificación de DNA. ........................................................................................... 26
10.5 Electroforesis en Gel de Agarosa ............................................................................. 27
XI. Resultados ...................................................................................................................... 27
11.1 Características generales de los participantes y la muestra ...................................... 27
11.2 Normalidad de la muestra ......................................................................................... 28
11.3 Cuantificación de ADN ............................................................................................ 28
11.4 Pureza de ADN ......................................................................................................... 29
11.5 Electroforesis en gel de agarosa ............................................................................... 32
XII. Discusión ....................................................................................................................... 32
XIII. Conclusiones ................................................................................................................ 35
XIV. Referencias .................................................................................................................. 36
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Anexo 1. ............................................................................................................................... 39
Cuestionario ...................................................................................................................... 39
Anexo 2 ................................................................................................................................ 40
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I. Resumen
En años recientes se han realizado descubrimientos sobre la microbiota intestinal y su
relación con enfermedades y síndromes metabólicos en los humanos, además de que
regulan algunas funciones fisiológicas como la respuesta inmune y señalización molecular.
Estos descubrimientos han sido posibles mediante análisis moleculares de nueva generación
como la metagenómica. Para realizar estos estudios se utiliza material genético a partir de
la materia fecal humana, que es de recolección no invasiva para el donador. La extracción
de ADN se vuelve difícil de realizar debido a la diversidad de material genético contenido
en la muestra, por lo que es importante instaurar un método que asegure la extracción de
ADN de alto rendimiento para realizar estudios moleculares como el análisis
metagenómico. El objetivo de este trabajo fue analizar la metodología de extracción de
ADN haciendo un comparativo entre dos tipos de detergentes utilizados en la lisis celular
para determinar cuál de los dos demuestra un mejor desempeño en el proceso de extracción.
La comparación se hizo con base a la concentración y pureza de ADN obtenido por medio
de espectrofotometría y la calidad cualitativa de ADN determinada por electroforesis en gel
de agarosa. Los detergentes utilizados fueron CTAB y SDS. Los resultados demostraron
que el CTAB es un detergente con mayor rendimiento para la extracción de ADN
metagenómico.
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II. Introducción
El ser humano, no se encuentra solo, ya que mantiene una relación estrecha con una gran
cantidad de organismos microscópicos que lo acompañan a lo largo de su vida. Al conjunto
de estos microorganismos se le denomina microbiota, incluyendo la información genética
contenida en el ácido desoxirribonucleico (ADN) de los mismos (Garrigues, 2017).
El tracto respiratorio, digestivo y la piel son las partes del cuerpo que conservan relación
constante con los microrganismos del medio ambiente manteniéndose el equilibrio
microbiano. El tracto digestivo contiene la microbiota más compleja y se encuentra
distribuida en diferentes proporciones a lo largo de sí mismo, habiendo relación de ésta
microbiota con el sistema inmune, que aunque no está claramente definida, se han
observado cambios significativos en presencia de infecciones, terapia antibiótica,
tratamiento con antiácidos y supresión del sistema inmunológico (Schiffrin y Blum, 2002).
De manera habitual, siempre se había utilizado el cultivo de microorganismos en agares con
nutrientes específicos para su aislamiento y posteriores estudios, basándose en las
características bioquímicas de los microorganismos. Sin embargo, hoy en día se ha
demostrado que algunos microorganismos intestinales no pueden ser cultivados de manera
tradicional, siendo exclusivamente detectados mediante su huella genética por medio de
técnicas moleculares (del Campo et al, 2018).
En años recientes, el ADN es parte del objeto de estudio de la biología molecular. Esta
rama de la ciencia, se ha vuelto una herramienta molecular poderosa para el estudio de los
microorganismos que no son cultivables de manera tradicional (Tateishi y Sugimoto, 2018).
El estudio del gen 16s ARNr ha permitido conocer a fondo la taxonomía microbiana,
permitiendo una hábil y rápida identificación de poblaciones de microorganismos
pertenecientes a comunidades microbianas para una amplia gama de objetivos en la
investigación científica y en específico, competentes a las ciencias de la salud, como el
estudio de agentes patógenos al ser humano (Rodicio y Mendoza, 2004).
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Lo antes mencionado conlleva al desarrollo constante de métodos para la extracción de
ADN. Sin embargo, es necesario adecuar la metodología a las características de la muestra
para cumplir con el objetivo planteado. El ADN que se obtiene a través de un método de
extracción debe de ser de buena calidad para asegurar la viabilidad en procedimientos
moleculares subsecuentes (Muhammad et al, 2012), debido a que cualquier otra molécula
que se encuentre en el material extraído, como polisacáridos, proteínas, y restos fenólicos
interfieren de manera directa en el rendimiento del ADN.
El uso de solventes orgánicos permite extraer una mayor cantidad de ADN con alta
eficiencia por la capacidad de disolver compuestos moleculares que envuelven el ADN
(lípidos, proteínas y otras macromoléculas). Sin embargo, se requiere previamente de una
lisis celular adecuada para facilitar la acción de los disolventes orgánicos volviendo a ésta
lisis celular un paso crítico para la correcta elección del detergente y así obtener la mayor
cantidad de ADN posible sin que éste sufra alteración alguna.
El cetiltrimetil bromuro de amonio (CTAB) y el dodecil sulfato de sodio (SDS) son sales
orgánicas con actividad detergente que se utilizan de manera común en protocolos para
extracción de ADN. Ambos detergentes denotan cierta versatilidad en su uso, permitiendo
ser modificables para satisfacer las necesidades de extracción propias de cada muestra en
función a sus características estructurales. El CTAB es de naturaleza catiónica, por lo que
puede ser más afín a la naturaleza aniónica del ADN y en contraste, el SDS es de naturaleza
aniónica. En este trabajo se realiza un comparativo del funcionamiento de cada detergente
en la extracción de ADN.
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III. Marco Teórico
3.1 Ácidos Nucleicos
Los ácidos nucleicos son moléculas que forman parte de los seres vivos en las cuales se
resguarda la información pertinente para dirigir y controlar las funciones características de
la célula como parte funcional de un organismo vivo. Esta información se encuentra
contenida en cromosomas y al conjunto de esta, se conoce como información genética
(Salazar et al, 2016). Existe un orden para el acomodo de los ácidos nucleicos y está dada
en función a la naturaleza de la célula: eucariota o procariota.
La célula procariota es menos compleja en cuanto a estructura que la célula eucariota en el
orden vegetal, fungi y animal, puesto que este último tipo de célula contiene una variedad
de compartimentos internos completamente separados entre sí y con funciones específicas.
De manera general, las principales características de la célula eucariota diferentes a la
procariota son:
Un núcleo delimitado por una membrana y ubicado comúnmente en el
área central de la célula conteniendo la información genética.
Una cantidad de organelos rodeados cada uno por una membrana a modo
de compartimientos con funciones especializadas flotando sobre el
citoplasma.
Múltiples cromosomas lineales, a diferencia del cromosoma circular único
de un procariota.
Existen diferencias químicas y estructurales que dan origen a dos tipos de ácidos nucleicos:
desoxirribonucleico y ribonucleico; ambos presentes en células procariotas y eucariotas.
Salazar et al (2016) esquematizan los componentes químicos principales de los ácidos
nucleicos (Fig. 1):
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Las bases nitrogenadas que se encuentran en el ADN son: adenina (A), guanina (G),
citosina (C) y timina (T). En el ARN se encuentra: adenina, guanina, citosina y uracilo (U).
Estas bases nitrogenadas son de dos tipos: purinas (A y G) y pirimidinas (C, T y U).
(A)
(B)
Fig. 1 Composición química y estructural de los ácidos nucleicos. Tres son los componentes químicos
de la unidad básica llamada nucleótido (A) que conforman los ácidos nucleicos. Las bases nitrogenadas
que comúnmente se encuentran en los ácidos nucleicos son 5, que pueden ser de naturaleza purina o
pirimidina (Salazar et al 2016).
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La polimerización de nucleótidos da como resultado la formación de una molécula de ARN
o ADN. El enlace característico de esta polimerización es fosfodiéster y se esquematiza en
la figura 2. Además, los ácidos nucleicos se categorizan en cromosómicos, y plasmídicos.
Fig. 2 Acomodo estructural de los ácidos nucleicos. Parte de la cadena de polinucleótidos del ADN. En el
recuadro se muestra la base de azúcar (pentosa) y pirimidina correspondiente al ARN. El enlace fosfodiéster
se produce con la unión covalente entre un grupo hidroxilo en el carbono 3’ (OH-) de la pentosa y uno
fosfato (PO4-); éste último se une con el carbono 1’ de la pentosa perteneciente al siguiente nucleótido.
El empaquetamiento y acomodo de estas moléculas en los organismos difiere en función
del tipo de célula. Mientras que la célula procariota contiene una membrana externa y un
citoplasma con un cromosoma circular, iones, sales inorgánicas, azúcares y demás
elementos necesarios para la maquinaria celular; la célula eucariota mantiene el ADN
dentro del núcleo empacado en varios cromosomas.
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El ADN de la célula eucariota se encuentra formando complejos llamados nucleosomas,
que consisten en el enredo de la molécula de ADN sobre sobre un conjunto de proteínas
histónicas para dar origen a la cromatina (Fig. 3).
La célula procariota, que no contiene núcleo ni organelos delimitados por membranas,
mantiene un área llamada nucleoide y es ahí en donde se encuentra el único cromosoma de
ADN (Griswold, 2008). Esta macromolécula está compactada alrededor de 1000 veces
Fig. 3 Estructura de la cromatina. El ADN se envuelve
alrededor de un octámero de histonas para formar
nucleosomas. Los nucleosomas están conectados por
tramos de ADN enlazador. Esta estructura básica de
nucleosomas se pliega en una estructura similar a una
fibra de aproximadamente 30 nm de diámetro. Estas
fibras de 30 nm se compactan adicionalmente en
estructuras de orden superior, que no se han caracterizado
en detalle (Jansen y Verstrepen, 2011).
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mediante la formación de dominios de asa, gracias a la interacción del ADN con proteínas
estructurales tipo histonas (Noom et al, 2007).
Los ácidos nucleicos están cargados de manera negativa y las bases nitrogenadas sirven
como donadores y aceptores de electrones para realizar la unión con otras bases por puentes
de hidrógeno y determinar así su estructura helicoidal (Saenger, 1984).
El ADN es una molécula estable en solución acuosa; sin embargo, es posible desnaturalizar
la molécula haciendo manipulación de la temperatura, el pH, y la fuerza iónica (Tateishi y
Sugimoto, 2018). Ha sido demostrado por Legoff et al. (2006), que el resguardo de ácidos
nucleicos para estudios posteriores asegura la estabilidad de la molécula cuando la
temperatura de almacenamiento es de por lo menos 4ºC.
3.2 Métodos de extracción
Los ácidos nucleicos se han convertido en poderosas herramientas biológicas, así como
nanotecnológicas. Este hecho ha convertido al método de extracción y de purificación un
punto crítico en la obtención de resultados experimentales reproducibles (Tateishi y
Sugimoto, 2018). Hoff-Olsen et al, (1999) establecieron que los métodos comunes para la
extracción de ADN son:
Por medio de disolventes orgánicos, para solubilización de biomoléculas
acompañantes (lípidos, proteínas, polisacáridos);
Uso de columnas inorgánicas o métodos con silica, por medio de carga
electrostática;
Uso de kits comerciales, que es una combinación de solventes orgánicos y columnas
inorgánicas; y
Extracción diferencial.
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Todos los métodos de extracción siguen de manera general tres pasos principales (Elkins,
2013): 1) lisar la célula, 2) separar el ADN de otros componentes celulares, y 3) finalmente,
aislar el ADN. (Legoff et al , 2006).
Para efectuar la lisis celular, es necesario el uso de sales orgánicas con actividad detergente
para irrumpir con las membranas de la célula y que el material genético quede libre. Una
sal inorgánica que permita, en solución a su componente catiónico, la unión con los ácidos
nucleicos para capturarlo y posterior a ello ser precipitados. Un compuesto orgánico que
permita disolver
3.3 Pureza de ácidos nucleicos
La pureza de los ácidos nucleicos es determinada por mediciones espectrofotométricas a
diferentes longitudes de onda (260 nm, 280 nm y 230 nm) permitiendo además la
determinación de su concentración en ng/µl. Los índices obtenidos por las lecturas de la
absorbancia a 260nm, 280nm y 230 nm (índices A260/280 y A260/230) son utilizados de
manera común para evaluar la pureza ácidos nucleicos teniendo un rango óptimo de entre
1.8 a 2.0 (A260/280) y 1.5 (A260/230) (Wilfinger et al, 1997).
3.4 Análisis moleculares
Para diversos estudios moleculares, la extracción de DNA es primordial y se necesita elegir
la metodología adecuada en función a ciertos criterios, como lo explican Sandoval et al
(2013):
Tipo de ácido nucleico que se va a extraer: ADN de cadena sencilla (ADNss),
DNAds, ARN total, ARN mensajero (ARNm) o ARN ribosomal (ARNr).
Organismo origen del ácido nucleico: mamíferos, plantas, procariotas o virus.
Fuente del ácido nucleico: cultivo celular, tejido (generalmente biopsia), sangre
(leucocitos), expectoración, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera.
Técnica en que se utilizará el ácido nucleico extraído: según el uso que vaya a tener
el ácido nucleico los requerimientos de rendimiento, pureza y tiempo de extracción
16
variarán acorde a la metodología que se vaya a aplicar, como retrotranscripción,
PCR, clonación, Northern blot, Southern blot, etcétera).
Estas metodologías emergentes son herramientas que han permitido revolucionar el estudio
de comunidades microbianas en diferentes ramas de la ciencia, como en la microbiología
ambiental y de alimentos (González et al, 2011). Usadas en la metagenómica y aplicadas a
la salud, también se han permitido describir taxonómicamente a comunidades que
conforman el microbioma humano y permitido gran avance como si se respondiera a:
¿quiénes están allí? y ¿qué están haciendo? (Genti, 2013)
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IV. Antecedentes Metodológicos
4.1 Uso de detergentes (CTAB y SDS)
El cetiltrimetil bromuro de amonio (CTAB) es una sal de uso común en protocolos para
extracción de ADN por su fácil adaptación al tipo de material biológico a utilizar
(Khumallambam et al, 2013) y el dodecil sulfato de sodio (SDS), también ha demostrado su
versatilidad ya que es utilizado de manera común en muestras con diferentes orígenes:
sólidos, líquidos y suelo marino. El uso de CTAB y SDS se fundamenta en la capacidad de
lisis celular por su alta concentración de sales (Biddle et al, 2006).
Después de haber hecho la lisis celular se debe utilizar un solvente orgánico que permita la
separación de ácidos nucleicos y otras biomoléculas como proteínas y lípidos propios de la
célula. Después de este paso es necesario la precipitación del mismo, siendo el alcohol
isopropílico una opción para ello (Vengadesh et al, 2016).
4.2 Uso de disolventes orgánicos
La mezcla Fenol-Cloroformo (1:1, v/v) usada para la extracción de ácidos nucleicos, en
conjunto, presentan una alta eficiencia en el proceso de desnaturalización de proteínas, aun
mayor que por separado, manteniendo la integridad molecular tanto para el ARN como para
el ADN (Perry et al, 1972). En ocasiones el alcohol isoamílico es utilizado para evitar la
formación de espuma proveniente de los componentes proteicos y lipídicos de la muestra.
De manera general, este tipo de extracción se basa en la capacidad para separar una mezcla
de moléculas en una mezcla inmiscible de dos líquidos con diferentes densidades por lo que
es una excelente opción para la extracción de los ácidos nucleicos.
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4.3 Metagenómica
La metagenómica es un campo nuevo en la identificación de microorganismos
pertenecientes a una comunidad utilizando metodologías diferentes a las convencionales
(cultivo directo en laboratorio). En recientes años se han desarrollado metodologías para el
estudio en masa de comunidades de microorganismos a partir de su DNA permitiendo su
caracterización taxonómica y proporcionando información relevante para estudios
ecológicos. A estos abordajes integrativos de poblaciones y comunidades se denomina
Metagenómica (Bonilla et al, 2008). Derivado de esto, la metagenómica resulta una
extensión de la genómica (Hernàndez et al, 2014), representando una estrategia que
interconecta el procesamiento de la muestra, la secuenciación del DNA y su análisis
funcional, valiéndose de tecnologías genómicas y herramientas genéticas (Fig. 2).
El análisis metagenómico se inicia al obtener ADN de una comunidad que mediante bases
de datos ya establecidas por estudios previos como el National Center of Biotechnology
Information (NCBI, 2018) que permiten secuenciar el genoma de comunidades en masa. La
secuenciación a su vez debe ser comparada con genomas de referencia como el del Human
Microbiome Project (Institute for Genome Sciences, University of Maryland School of
Medicine, 2018), ambicioso proyecto en el que se determinó la secuenciación de genomas
microbianos de sujetos sanos; o la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Kanehisa
Laboratories, 2018) que contiene una larga lista de secuencias genéticas de múltiples
organismos; y también con el uso de Basic Local Alignement Search Tool (NCBI, 2018)
que permite la comparación biológica de secuencias para la búsqueda de similitud con
bases de datos con la NCBI, calculando diferencia significativa.
La identificación se realiza mediante la secuenciación del gen ARNr 16S, ya que es la
macromolécula que desde el inicio de los años 70’s le permitió a Carl Woese hacer un
reacomodo taxonómico de lo procariotas (Olsen y Woese, 1993) y se mantiene vigente para
la identificación de agentes no cultivables por los métodos tradicionales. La técnica de PCR
(polymerase chain reaction) es comúnmente utilizada para la amplificación de fragmentos
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de ácidos nucleicos, por lo que también se relaciona de manera estrecha con la
identificación de microorganismo por medio de estas técnicas moleculares.
Una vez efectuada la secuenciación, la clasificación se puede realizar mediante el
agrupamiento de esta información en unidades operacionales taxonómicas (Sokal & Sneath,
1963), que se utilizan de manera común en los análisis filogenéticos (OTU por sus siglas en
inglés: operational taxonomic unit). El uso de estas OTU’s permite definir la entidad
biológica a la que pertenece cada miembro de la comunidad bacteriana en estudio.
Este es el proceso comúnmente seguido en el análisis metagenómico, como el que se ha
utilizado para la identificación de la microbiota humana y que se esquematiza en la figura
4.
Fig. 4 Análisis metagenómico del microbioma humano. Existen diversos tipos de análisis para determinar
las comunidades que conforman la microbiota humana. En esta imagen se señalan algunos de los más
comunes. Modificado de Maxam y Gilbert (1977).
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Existen más de 1000 especies identificadas actualmente en el tracto digestivo y por medio
de estudios metagenómicos se ha sugerido la asociación de esta microbiota con
enfermedades como el síndrome de colon irritable, enfermedad de Crohn, Diabetes Mellitus
del tipo 2 y obesidad (Alias Sankar et al, 2015).
V. Planteamiento del Problema
Existe un alto nivel de dificultad para la extracción de ADN metagenómico a partir de
heces fecales de humano por la naturaleza de la muestra, ya que se encuentra material
genético de restos alimenticios (células animales y vegetales) así como del propio
organismo.
En la actualidad existen kits comerciales que permiten la extracción de ADN
metagenómico a partir de materia fecal. Estudios recientes han comparado el rendimiento
de estos kits de casas comerciales e incluso han logrado optimizar metodologías para la
extracción de ADN con el propósito de obtener material genético de alta calidad para
estudios moleculares posteriores. Sin embargo, existe una amplia gama de diferencias en el
ADN extraído, generando la necesidad de elegir de manera minuciosa y cuidadosa el tipo
de kit a utilizar con base en los propósitos de investigación, además de que los costos
derivados del uso de kits comerciales son elevados en contraste con la metodología en la
que se usan disolventes orgánicos como fenol y cloroformo.
Por lo antes mencionado, es necesario instaurar un método que permita la extracción de
ADN metagenómico a bajo costo y de alta pureza y rendimiento que asegure la viabilidad
del mismo en estudios moleculares subsecuentes, como la secuenciación genética y PCR
entre otros.
La metodología propuesta en este trabajo de investigación, además de utilizar disolventes
orgánicos, evalúa el rendimiento de dos detergentes con naturaleza electrolítica diferente
(catiónica vs aniónica) por lo que cabe preguntar: ¿Existe una diferencia entre usar CTAB
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de naturaleza catiónica, y el SDS de naturaleza aniónica, en la extracción de ADN
metagenómico a partir de heces de humano?
VI. Hipótesis
Existe una diferencia entre el uso de CTAB y SDS para la extracción de ADN a partir de
heces humanas debido a la naturaleza catiónica del CTAB y aniónica del SDS,
repercutiendo, tales características, en la cantidad y calidad del ADN obtenido por cada uno
de los métodos.
VII. Justificación
El ser humano tiene una amplia comunidad microbiana en el tubo digestivo, denominando a
ésta como microbiota intestinal (Wang et al, 2017). El desequilibrio existente en la
microbiota intestinal ha sido relacionado con la patogenia de algunos desordenes de la
salud, incluyendo los metabólicos, gastrointestinales y cáncer (Kyu Yeon y Myung-Shik,
2015). Así mismo, la microbiota intestinal es capaz de modular la reserva de moléculas
lipídicas, lipopolisacáridos, producir ácidos grasos de cadena corta a partir de los alimentos,
además de regular la respuesta inflamatoria y señalización de insulina.
La importancia de extraer ADN metagenómico a partir de heces radica en el hecho de que
el 50% de la materia fecal está compuesta por microorganismos bacterianos de los filos:
Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria y Proteobacteria, siendo que los dos primeros
predominan en individuos sanos, representando alrededor del 90% de la microbiota total
(Mai y Draganov, 2009). Sin embargo, la composición de esta comunidad microbiana se
modifica dinámicamente a consecuencia y en favor del mantenimiento de condiciones
metabólicas patológicas, por lo tanto, es necesario estudiarla para obtener los patrones de
referencia específicas para poblaciones humanas particulares, como los habitantes de
Chiapas.
Por medio de estudios metagenómicos se ha logrado analizar la información genética de
microorganismos que no son cultivables por métodos tradicionales. El uso de heces como
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muestra para la obtención de ADN metagenómico se realiza por la sencillez en el proceso
de recolección y por ser un método exploratorio de característica no invasiva. Además de lo
antes mencionado, es necesario establecer un método que sea óptimo en la extracción de
ADN al asegurar una alta concentración y pureza del mismo, para permitir la viabilidad de
la muestra en estudios moleculares posteriores.
VIII. Objetivo General
Analizar dos métodos de lisis celular mediante detergentes diferentes (CTAB vs SDS) para
la extracción de ADN metagenómico a partir de heces de humano.
IX. Objetivos específicos
- Comparar cuantitativamente la calidad y cantidad del ADN metagenómico obtenido
de cada método de lisis realizado.
- Diferenciar cualitativamente la calidad del ADN metagenómico obtenido por las
metodologías.
X. Metodología
10.1 Participantes y muestra
Se eligió como donadores de muestra a estudiantes universitarios que cursan la carrera de
Químico Farmacobiólogo en la Escuela de Ciencias Químicas con Sede en Ocozocoautla de
la Universidad Autónoma de Chiapas. El propósito de obtener muestra de la población
antes mencionada fue para fines prácticos del proyecto, es decir, debido a la formación
académica de los participantes se infirió que la apertura para la participación sería amplia.
Los criterios de inclusión fueron:
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- Estudiantes universitarios de 20 a 25 años cumplidos, que estuvieran dispuestos a
donar la muestra fecal y firmar la carta de asentimiento. El criterio de rango etario
se basó en la clasificación de adulto joven, que es donde se alcanza la madurez
física, obteniendo la función óptima de los sistemas biológicos (CDC, 2015).
- La consistencia de la muestra fecal deberá de ser el tipo 3 o 4 según la carta Bristol
para la clasificación de heces humanas (Fig. 3).
Los criterios de exclusión fueron:
- Sujetos que hayan ingerido medicamentos de naturaleza antimicrobiana en el último
mes.
- Sujetos que hayan presentado o que estén cursando con cuadro infeccioso del tracto
digestivo durante el último mes.
- Muestras que NO sean del tipo 3 y 4 en la escala Bristol para la clasificación de
heces.
Se hizo firmar a los donadores la carta de asentimiento (Anexo 1) modificada del INSP
(2013), acorde a la Guía de para la Incorporación de Aspectos Éticos en los Protocolos de
Fig. 5 Escala Bristol para la clasificación de heces humanas. Modification de Central and North West
London NHS Foundation Trust. (NHS, 2015).
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Investigación del Comité de Ética para la Investigación (ECOSUR, 2011), y se diseñó un
cuestionario (Anexo 1) que se aplicó en la sala de cómputo de la Escuela de Ciencias
Químicas, Sede Ocozocoautla de la Universidad Autónoma de Chiapas un día antes de la
recepción de muestra de heces. Al analizar los resultados del cuestionario y habiendo
obtenido las muestras fecales, se seleccionaron 6 muestras adecuadas para cumplir con los
objetivos de este protocolo.
La muestra fecal se recolectó en frasco estéril de polipropileno. Se mantuvo en
crioconservación (-40 °C) hasta su uso, en las instalaciones del laboratorio de salud del
Colegio de la Frontera Sur Unidad San Cristóbal.
10.2 Materiales, equipos y reactivos.
Tubo eppendorf de 2.0 ml y 1.5 ml
Pipetas automáticas (volumen variable)
Puntas para pipetas automáticas estériles (azul, amarilla y blanca)
Centrífuga para microtubos, con refrigeración y aceleración de hasta 12000
x g
Baño María
Sistema de espectrofotometría con luz UV en micro-gota (NanoDrop™ 2000
de Thermo Scientific™).
Transiluminador con luz UV y sistema de documentación digital.
CTAB 2% (NaCl 1.4 M; EDTA 50mM, pH 8.0; Tris 100 mM, pH 8.0; PVP
180 mM)
SDS 2% (Na2HPO4 1mM, pH 7.0)
Agua estéril
Cámara para electroforesis horizontal
TAE
Solución de EtBr
Cabe señalar que todos los materiales y reactivos fueron financiados y proporcionados por
el Dr. Héctor Ochoa Díaz-López y los experimentos fueron realizados de manera alterna en
el laboratorio de salud y de genética.
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Los equipos utilizados para la determinación cuantitativa y cualitativa de ADN fueron
proporcionados por el laboratorio de genética, ambos laboratorios ubicados en el Colegio
de la Frontera Sur Unidad San Cristóbal.
10.3 Extracción de DNA.
Se colocaron 200 mg de muestra en tubo eppendorf y se adicionó 1000 µl de solución
salina isotónica estéril. Se mezcló por ayuda de vortex durante 5 minutos. Posterior a la
mezcla se hicieron alícuotas, colocándose 200 µl de sobrenadante en tubos eppendorf
nuevos de 2ml.
Se utilizaron dos sales orgánicas con actividad detergente para separar ADN de moléculas
proteicas de manera respectiva. Para la muestra tratada con CTAB se colocó: 1200 µl de
CTAB al 2% (NaCl 1.4 M; EDTA 50mM, pH 8.0; Tris 100 mM, pH 8.0; PVP 180 mM).
Para la muestra tratada con SDS se colocó: 1200 µl de SDS 2% (Na2HPO4 1mM, pH 7.0)
de manera respectiva.
Posterior a la adición de los detergentes a las muestras, se mezclaron con vortex hasta
disolver en lo sumo posible.
Se incubó en baño María a 60°C durante 40 minutos y posterior a ello se realizó una
segunda incubación durante 30 minutos. Las muestras fueron mezcladas con ayuda de un
agitador eléctrico (100 rpm) mientras se procedía con la incubación a temperatura
ambiente.
Las muestras incubadas se centrifugaron durante 10 minutos a 8000 x g (fuerza g).
Posterior al proceso de centrifugación se utilizó el sobrenadante para proseguir con el
protocolo. Se rescataron en tubo eppendorf de 2ml, 600 µl de sobrenadante.
26
Se colocaron 1200 µl de solución Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamílico (FCI, 25:24:1) a
cada uno de los tubos con muestra. Se mezcló por inversión hasta homogenizar las
muestras.
Las muestras homogenizadas se centrifugaron durante 10 minutos a 8000 x g.
Posterior a la centrifugación, se rescató la fase superior obtenida de cada tubo (400 µl de
lisado para CTAB y 200 µl de lisado para SDS 2% de manera respectiva) en un tubo
eppendorf nuevo de 1.5 ml y se adicionó 600 µl de isopropanol frío a cada tubo con
muestra. Se homogenizó por inversión y se llevó a centrifugación durante 30 minutos a
8000 x g manteniendo una temperatura constante de 4ºC. Posterior a ello, se descartó el
sobrenadante y se procedió a seguir trabajando con el pellet obtenido.
Se adicionaron 700 µl de etanol (70%) al pellet, se homogenizó y se llevó a centrifugación
durante 10 minutos a 8000 x g. Después del procedimiento se descartó el sobrenadante y se
dejó secar el pellet para eliminar por evaporación en tres fases: 1) 20 minutos a Tº
ambiente, 2) 5 minutos a 60 ºC en baño María y 3) 20 minutos a Tº ambiente.
Una vez eliminado el etanol, se hidrató el pellet obtenido con 30 µl de agua inyectable y se
cuantificó el ADN contenido en cada tubo.
Es necesario hacer mención que, para el análisis comparativo, se modificó el detergente
para la lisis celular (CTAB vs SDS) basándose en uno de los métodos utilizados por Tien et
al (1999) para la comparación de métodos de extracción de DNA en muestras sólidas.
10.4 Cuantificación de DNA.
Se utilizó un espectrofotómetro de UV de espectro completo para la cuantificación y
evaluación de la pureza del DNA extraído. El equipo utilizado fue NanoDrop™ 2000 de
Thermo Scientific™. La metodología empleada fue conforme al manual de usuario
previamente establecido por el proveedor.
27
Se leyeron las absorbancias a tres diferentes longitudes de onda: 280 nm, 260 nm y 230 nm
de manera respectiva para obtener las proporciones de absorbancia 260/280 y 260/230 y se
determinó de este modo la pureza de ácidos nucleicos como lo estipula Wilfinger et al,
(1997).
10.5 Electroforesis en Gel de Agarosa
Se evaluó la calidad del ADN cuantificado por medio de electroforesis en gel de agarosa (9
cm de largo) al 0.7 %. El voltaje utilizado es de 80 V, 300 A, durante 30 minutos. Se utilizó
Tris, acetato y EDTA (TAE 1X) como buffer de corrida.
Para visualizar la calidad del DNA extraído se utilizó Bromuro de Etidio 1% y el Software
KODAK con cámara fotográfica de la misma marca interfasada con transilumunador. El
revelado del gel de agarosa se realizó sumergiendo el gel durante 15 minutos en bromuro
de etidio y posteriormente se llevó al transiluminador para captura y digitalización de la
imagen.
XI. Resultados
11.1 Características generales de los participantes y la muestra
De los 40 estudiantes universitarios invitados a participar en este estudio, se obtuvo la carta
de asentimiento de 32. De la encuesta realizada, únicamente se obtuvo la participación de
18 estudiantes, de los cuales solo 12 pudieron recolectar y entregar la muestra.
Los motivos por los que algunos participantes no entregaron la muestra requisitada fueron
diversos:
Imposibilidad fisiológica para recolectar la muestra en el horario acordado
Olvido por parte del participante para entregar la muestra
28
Negativa posterior al llenado de encuesta y carta de asentimiento
Finalmente, utilizando los criterios de inclusión y exclusión, se utilizó la materia
fecal de 7 donadores, de los cuales 4 pertenecían al género femenino (Tabla 1). Además, de
acuerdo con la carta Bristol para la clasificación de heces, 6 muestras (85.7%) se
codificaron dentro del tipo 3 y 1 muestra (14.3%) dentro del tipo 4.
MUESTRA ID GENERO EDAD TIPO DE MUESTRA
1 F 20 años 3 2 F 20 años 3 3 M 22 años 4 4 F 21 años 3 5 M 20 años 3 6 F 22 años 3 7 M 24 años 3
Tabla 1. Características generales de los participantes y la muestra.
La población donadora de muestra presentó una edad promedio de 21.2±1.49 años, con una
edad mínima de 20 años y máxima de 24 años.
11.2 Normalidad de la muestra
El ADN extraído de las siete muestras fecales fue analizado espectrofotométricamente y las
variables consideradas en el estudio (concentración de ADN, pureza A280/260 y pureza
A260/230), mostraron mediciones con distribución paramétrica normal (T student, p>0.05).
11.3 Cuantificación de ADN
De las mediciones realizadas a las 7 muestras, se obtuvo una concentración media de
432.42±211.77 ng/µl al utilizar CTAB y una concentración media de 373.36±178.56 ng/µl
utilizando SDS. Se encontró que no existe una diferencia en la cuantificación entre el uso
de CTAB y SDS para la extracción de ADN (p>0.05). En el gráfico 1 se observa la
29
similitud de concentración obtenida entre ambos métodos al utilizarlos en la extracción de
ADN.
0200
400
600
C T AB
S D S
C u a n tif ic a c ió n d e A D N
C o n c e n tra c ió n (n g / l)
Gráfico 1. Comparación de las concentraciones obtenidas al utilizar CTAB y SDS como agentes lisantes en la
extracción de ADN a partir de muestras fecales de humano. Los valores representan a la media de
concentración ± SEM, utilizando t student para datos pareados.
11.4 Pureza de ADN
De las mediciones de absorbancias a 230 nm, 260 nm y 280 nm se obtuvieron los
índices A260/280 y A260/230. Para el índice A260/280 se obtuvo una media de 1.98±0.05
utilizando CTAB en la extracción y una media de 1.52±0.10 utilizando SDS. Con respecto
al índice A260/230 se obtuvo una media de 1.35±0.2 con CTAB y una media de 0.9±0.14
utilizando SDS.
30
Gráfico 2. Medición de los índices A260/280 (A) y A260/230 (B) para determinar la pureza del ADN
obtenido por cada uno de los detergentes (CTAB y SDS). Los valores representan la media±SEM utilizando t
student para datos pareados.
Se observó una notable diferencia (p<0.05) de pureza de ADN (Gráfico 2), siendo que el
detergente CTAB permitió una mayor concentración de ADN en la muestra, disminuyendo
A
B
31
así la contaminación por proteínas, glúcidos y fenoles, de acuerdo a los índices A260/280 y
A260/230, respectivamente.
Al organizar las mediciones por género (Tabla. 2), se obtuvo una concentración de ADN
promedio de 412.24±208.17 ng/µl de ADN con CTAB y 345.14±88.57 ng/µl con SDS
entre los individuos masculinos y con respecto a los femeninos, 446.05±124.67 ng/µl con
CTAB y 394.53±207.03 ng/µl con SDS.
CONCENTRACIÓN (ng/µl) A260/280 A260/230
CTAB SDS CTAB SDS CTAB SDS
MASCULINOS 412.24±208.17 345.14±88.57 2.01±0.01 1.58±0.13 1.41±0.08 0.95±0.19
FEMENINOS 446.05±124.67 394.53±207.03 1.96±0.05 1.48±0.04 1.31±0.23 0.86±0.10
GLOBAL 432.42±211.77 373.36±178.56 1.98±0.05 1.52±0.10 1.35±0.2 0.90±0.14
Tabla 2. Valores de concentración y pureza del ADN obtenido en el proceso de extracción. Los valores están
representados con la media±SEM utilizando t student para datos pareados.
En la tabla 2, también se muestra la diferencia existente entre los métodos de extracción
con respecto a pureza de ADN. No existe diferencia entre los tratamientos para el caso de la
cuantificación de ADN obtenido.
32
11.5 Electroforesis en gel de agarosa
De la electroforesis en gel de agarosa se obtuvieron 7 imágenes, que son representadas en la
figura 6. En todas las imágenes obtenidas se observó el mismo comportamiento para ambos
tratamientos utilizados en la determinación cualitativa del ADN extraído.
XII. Discusión
El uso de CTAB o SDS en la extracción de ADN, no parece influir en la concentración de
ADN obtenido mediante la metodología de este protocolo. Esto pudiera ser debido a que
como explica Biddle et al (2006), los detergentes con altas concentraciones de sales
permiten que la lisis celular se efectúe de manera óptima.
Derivado de lo que se observa en las figuras 7A y 7B, se asume que la calidad de ADN
obtenido por medio de CTAB es notoriamente mayor que el SDS, pudiendo explicarse por
la capacidad que tiene el CTAB de separar moléculas de diferente índole como
polisacáridos y polifenoles, de las moléculas nucleicas propias del ambiente celular, como
Fig. 6 Electroforesis en gel de agarosa. Fotografía
representativa de los geles obtenidos a partir de la
electroforesis en agarosa al 0.7% (Buffer TAE 1X). En los
carriles 1 y 2 se encuentran las muestras control. En los
carriles 3, 4 y 5 se muestra ADN de la misma persona
extraído en diferentes experimentos tratada con CTAB y los
carriles 6, 7 y 8 tratada con SDS. Las bandas que se
observan se encuentran en el rango de 23 Kbp,
correspondientes al peso molecular del ADN genómico.
MPM=Marcador de peso molecular, CN=Control negativo.
33
lo menciona Khumallambam et al, (2013), moléculas que son fácilmente encontradas en la
materia fecal de humano.
Asimismo, en las mismas imágenes, el ADN obtenido por medio del SDS se observa dentro
del pozo de carga, pudiendo suponer que el ADN extraído probablemente esté unido a otras
moléculas orgánicas, confiriendo mayor envergadura molecular e impidendo el paso del
ADN a través de la agarosa durante la electroforesis. Esto es comprobado con las
mediciones de pureza determinadas por los índices A260/280 (contaminación por proteínas
y fenoles) y A260/230 (contaminación por lípidos y polisacaridos).
Con respecto a la pureza del ADN obtenido y determinada por los índices A260/280 y
A260/230, al hacer uso de CTAB, se obtiene una mayor pureza, inclusive cuando las
mediciones obtenidas se dividen en grupos de género (Fig. 6B y Fig. 6C). Existe una mayor
estabilidad en las mediciones obtenidas para ambos ìndices cuando se utiliza CTAB.
Posiblemente, el hecho de que el CTAB contenga mayor cantidad de sales y una mayor
concentración de las mismas, sea un factor importante al momento de explicar este
comportamiento, puesto que como lo explica Wilfinger et al, (1997), las condiciones
electrolíticas son importantes para alcanzar índices óptimos al momento de medir la pureza
de ácidos nucleicos.
Se encontraron diversas limitaciones al momento de recolectar la muestra. No toda la
población invitada accedió a participar en el estudio. De los que accedieron a participar, se
comprometieron a entregar su muestra 35 individuos y llegada la fecha de entrega solo
pudieron recolectar la muestra 12 personas. De estas personas que entregaron la muestra,
algunas no llenaron la encuesta de manera correcta haciendo que el estudio no pueda
ahondarse o no pueda profundizar para hacer algún otro tipo de correlaciones con sus
hábitos cotidianos y algunos otros aspectos que se encuentran en el cuestionario utilizado
(ANEXO 1).
Si se desea realizar investigación sobre la microbiota característica de alguna población en
específico, es necesario que la sensibilización con respecto a la importancia del estudio esté
34
bien aclarada en los participantes para evitar este tipo de limitaciones, porque para fines de
este estudio, la cantidad de muestras procesadas sirvieron únicamente para valorar un
método de extracción.
Cabe mencionar, que para los objetivos planteados en este trabajo, la extracción de ADN
utilizando CTAB permite obtener una alta concentración de ADN (incluso mayor que
algunos kit comerciales) y de óptima pureza. Sin embargo, una manera de poder asegurar
que el ADN es apto para análisis molecular posterior, es efectuar PCR con algún gen
constitutivo, asegurando así el uso de esta metodología en la caracterización de microbiota
en poblaciones de interés específico.
Asimismo, sería de utilidad para fines de investigación, proponer un método de extracción
en donde se tome en cuenta el uso conjunto de ambos detergentes para determinar la
eficiencia de ambos en la extracción de ácidos nucleicos.
35
XIII. Conclusiones
El análisis efectuado a la metodología de extracción propuesta en el trabajo de
investigación, dio a conocer que el CTAB es un detergente con mejor desempeño que el
SDS en la extracción de ADN a partir de heces fecales de humano.
A pesar de que no existe diferencia entre la cantidad de ADN obtenido con ambos métodos,
la calidad se ve afectada directamente, debido a que la pureza del ADN obtenido es mejor
cuando se utiliza CTAB que cuando se utiliza SDS en el proceso de lisis celular.
La calidad determinada de manera cualitativa por medio de electroforesis en gel agarosa
permite definir que el ADN obtenido al usar CTAB es notablemente mejor que el obtenido
por SDS. El ADN obtenido es genómico, con un peso molecular de aproximadamente 23
Kpb.
36
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39
Anexo 1.
Cuestionario
Nombre:
Semestre que cursas actualmente:
Sexo:
Edad:
Lugar de Origen:
Especifica por favor tu estatura (cm) y peso actual:
Especifica el tiempo, en meses o años según corresponda, que llevas radicando en el
estado de Chiapas:
En los últimos 30 días, ¿has ingerido algún tipo de antibiótico? Especificar nombre.
En los últimos 30 días, ¿has ingerido algún tipo de antiácidos o laxantes? Especificar
nombre.
Especifica con números la cantidad aproximada de agua que ingieres en el día.
Ejemplo: 1.5 L
¿Con qué frecuencia consumes vegetales?
R= NUNCA / < 1-3 x mes / 1x semana / 2-4 x semana / 5-6 x semana
¿Con qué frecuencia consumes frutas?
R= NUNCA / < 1-3 x mes / 1x semana / 2-4 x semana / 5-6 x semana
Consumo de bebidas alcohólicas y frecuencia.
Por favor menciona si ingieres bebidas alcohólicas, así como la frecuencia con la que lo
haces. Ejemplo: Por lo menos una vez al mes / Por lo menos 1 vez a la semana.
¿Realizas algún deporte de manera regular?
Si tu respuesta es afirmativa, especifica por favor la frecuencia y tiempo con la que lo
realizas. Ejemplo: Si - Futbol - 3 veces por semana. Si la respuesta es negativa basta con
poner No.
¿Consumes tabaco?
Por favor menciona si consumes tabaco, así como la frecuencia y número de cigarrillos al
día o semana con la que lo haces. Ejemplo: Si - Por lo menos una vez al mes / Por lo menos
1 vez a la semana. Si la respuesta es negativa basta con poner No.
Si eres mujer, ¿utilizas algún medicamento hormonal como método anticonceptivo?
Indica el número de evacuaciones diarias y a la semana y características según escala
de Bristol:
40
Anexo 2
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS
SEDE OCOZOCOAUTLA
EL COLEGIO DE LA FRONTERA SUR
Carta de Asentimiento
Hola mi nombre es Ivar Jasiel Torres Romero, soy egresado de la casa de estudio
a la que perteneces y junto con un equipo de profesionales trabajo en un proyecto de
investigación que servirá para la estandarización de un método de extracción de DNA
metagenómico. Actualmente se trabaja la parte experimental en El Colegio de la Frontera
Sur en San Cristóbal de las Casas, Chiapas. La siguiente fase del proyecto es la recolección
de muestras y para ello quiero pedirte que me apoyes en responder una encuesta vía
electrónica y proporciones además de información personal, algunos hábitos y una muestra
fecal.
Toda la información que proporciones, así como la muestra nos ayudará a alcanzar
el objetivo del proyecto. Asimismo, se hace de tu conocimiento que esta información será
tratada de manera confidencial. Esto quiere decir que no se compartirá a nadie tus
respuestas ni resultados, sólo lo sabrán las personas que forman parte del equipo de este
estudio.
Si aceptas participar, te pido que por favor pongas una (X) en el cuadro de abajo que
dice “Sí quiero participar” y escribe tu nombre completo en donde corresponde.
Sí quiero participar
Nombre: __________________________________________
Nombre y firma de la persona que obtiene el
asentimiento: ______________________________________________________________
Fecha: _______ de ______________ ____. Observaciones:
________________________________________________________________
Análisis comparativo de dos metodologías para la extracción de DNA
metagenómico de origen coprológico en humanos.
