5

Análisis Cuantitativo de la población Linfoide T en la Espondilitis Anquilosante C. F. García, J. Escobar, C. Hanabergh, F. Chalem

El objetivo de esta investigación fue realizar el análisis cuantitativo de la población linfoide T de sangre periférica en la espondilitis anqui-losante. Fueron cuantificadas la población lin-foide T total y las subpoblaciones ayudadora/ inductora y citotóxica/supresora en un grupo de 11 pacientes con espondilitis anquilosante, que fue comparado con un grupo control de 20 individuos normales y con un grupo de 11 pacientes con artritis reumatoidea. Los grupos de estudio fueron caracterizados mediante las pruebas de tipificación de HLA-B27 y factor reumatoideo. Se estableció la existencia de una tendencia al aumento en el porcentaje prome-dio de linfocitos T CD8+ y a la disminución en la relación CD4/CD8 en el grupo espondilitis anquilosante comparado con el grupo control. Este aumento puede obedecer a la activación de clonos con función citotóxica dirigida con-tra componentes del tejido conectivo de las ar-ticulaciones sacroilíacas y vertebrales. Los re-sultados obtenidos sugieren la participación de la citotoxicidad mediada por células en la pato-génesis de la espondilitis anquilosante.

INTRODUCCION La espondilitis anquilosante es una forma infla-

matoria, crónica y progresiva de artritis seronega-tiva de las articulaciones sacroilíacas, vertebrales

Dr. Carlos F. García R.: Departamento de Patología y Laboratorios, Fundación Santa Fe de Bogotá; Sr. Jaime Escobar L.:Estudiante Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia; Sta. Cecilia Hanabergh A,: Bacterióloga, Universidad Javeriana; Dr. Fernando Chalem: Profesor Asociado de Medicina y Reumatologia, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia; Jefe Departamento de Medicina Interna, Fundación Santa Fe de Bogotá.

Solictud de separatas al Dr. García.

y periféricas (1). Compromete el cartílago articu-lar y el tejido conectivo de la cápsula articular, el anillo fibroso discal y los tejidos de inserción os-teoligamentosa y el periostio.

Existe una marcada correlación entre el desa-rrollo de la espondilitis anquilosante y la expre-sión del aloantígeno de histocompatibilidad HLA-B27: 95% de los paciente con espondilitis anqui-losante posee el alelo HLA-B27 que sólo existe en el 7% de los individuos normales (2-4). La es-pondilitis anquilosante se asocia con un determi-nante antigénico común a todos los subtipos del antígeno HLA-B27 y no con un determinante anti-génico específico de un subtipo particular (5).

La patogénesis de la espondilitis anquilosante ha sido relacionada con la infección entérica por Klebsiella pneumoniae (6). Ha sido propuesta la existencia de una reactividad cruzada entre antí-genos de Klebsiella pneumoniae y el antígeno HLA-B27, o una modificación del antígeno HLA-B27 inducida por un factor soluble derivado del microorganismo (6-10).

Los resultados en relación con las alteraciones cuantitativas y funcionales de la población linfoi-de T de sangre periférica en la espondilitis anqui-losante son contradictorios. Se ha informado una disminución en el porcentaje de linfocitos (11), células linfoides T (11), células T CD4+ (ayuda-doras/inductoras) (11, 12), células T CD8+ (cito-tóxicas/supresoras) (11) y en la relación CD4/CD8 (12). Existe disminución de la respuesta prolifera-tiva (11) y de la actividad supresora (13) de célu-las T inducida por Concanavalina A y en la res-puesta proliferativa de la técnica de cultivo mixto de linfocitos autólogos (Mixed Lymphocyte Reac-tion) estimulada por la fracción enriquecida para monocitos o para linfocitos B (11).

Acta Médica Colombiana Vol 14 N°1 - Enero-Febrero 1989

6 C.F. García y Cols.

Nuestro objetivo fue realizar un estudio cuanti-tativo de la población linfoide T de sangre perifé-rica en pacientes con espondilitis anquilosante.

MATERIAL Y METODOS Pacientes y Controles: El análisis cuantitativo

de la población linfoide T (CD5+) y las subpobla-ciones ayudadora/inductora (CD5+ CD4+) y cito-tóxica/supresora (CD5+ CD8+) fue realizado en un grupo de 11 pacientes con diagnóstico confir-mado de espondilitis anquilosante (fase activa o inactiva), constituido por nueve hombres y dos mujeres cuyas edades oscilaban entre 20 y 59 años (promedio 34 años), que fue comparado con un grupo de 21 individuos sin evidencia clínica de enfermedad articular inflamatoria, constituido por 16 hombres y cinco mujeres cuyas edades oscila-ban entre 23 y 58 años (promedio 37 años), y con un grupo de 11 pacientes con diagnóstico confir-mado de artritis reumatoidea constituido por ocho hombres y tres mujeres cuyas edades oscilaban entre 22 y 60 años (promedio 39 años). En el gru-po de espondilitis anquilosante ninguno de los pa-cientes recibía tratamiento con glucocorticoides.

Métodos: Los grupos de pacientes e individuos control fueron caracterizados mediante la tipifica-ción del aloantígeno de histocompatibilidad HLA-B27 (prueba de microlinfocitotoxicidad por ex-clusión con azul de tripan al 0.3%); prueba cua-litativa y cuantitativa para factor reumatoideo (método de Singer-Plotz, Látex RA-Laboratorios Achebe, y ORTHO RA Test, Ortho Diagnostic Systems); prueba cualitativa (método de aglutina-ción de partículas de látex) y cuantitativa (técnica de inmunonefelometría, sistema ICS Beckman Inc.) para proteína C reactiva; y evaluación de la velocidad de sedimentación globular (método de Wintrobe-una hora).

Para cada grupo se realizó el recuento total y diferencial de leucocitos de sangre periférica y la cuantificación de células de la población linfoide T (porcentaje relativo y cantidad absoluta obteni-da a partir del recuento total de leucocitos) y célu-las de las subpoblaciones ayudadora/inductora y citotóxica/supresora.

La cuantificación de células linfoides T de san-

gre periférica fue realizada sobre una fracción de células mononucleares enriquecida para células linfoides. Una muestra de sangre venosa heparini-zada (16 ml) fue incubada por 30 minutos a 37°C con 100 mg de hierro carbonilo (para eliminar cé-lulas fagocíticas) y centrifugada a través de un gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (densi-dad 1,077 g/dl) a 2000 r.p.m. por 15 minutos. Las células de la interfase fueron separadas, lavadas 3 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) enriquecida con suero fetal bovino (SFB) al 10%, resuspendidas en un volumen final de 1 ml y sometidas a recuento total (azul de tripan) y diferencial (violeta de cresilo). Esta fracción estu-vo constituida por 96% de células linfoides, 3% de células monocitoides y 1% de leucocitos poli-morfonucleares.

La fracción de células mononucleares enrique-cida para células linfoides fue resuspendida a una concentración de 200.000-300.000 células en 5 microlitros de PBS-SFB-10%-azida de sodio 0.01%. Esta suspensión celular fue incubada por 30 minutos a 4°C con 50 microlitros de anticuer-po monoclonal anti-CD5 (Leu 1), anti-CD4 (Leu 3ab) o anti-CD8 (Leu 2a) (Beckton Dickinson Inc) a la dilución de trabajo, lavada 3 veces con PBS-SFB-10%-azida de sodio 0.01% e incubada por 30 minutos a 4°C con anticuerpo anti-Ig murina conjugado con isotiocianato de fluoresceína (GAM-FITC Coulter Clone), lavada cuatro veces con PBS-SFB-10%-azida de sodio 0.01% y resus-pendida en 2 microlitros de glicerina al 80%.

El porcentaje de células reactivas con los anti-cuerpos monoclonales fue establecido por recuen-to de células fluorescentes y no fluorescentes con un microscopio de luz ultravioleta (leitz Dialux 20 EB). Fueron contadas 240 células en promedio en cada placa. Los resultados fueron analizados utilizando la prueba "t" de Student de significan-cia estadística para muestras apareadas (progra-ma Statistical Package for Social Sciences).

RESULTADOS En el grupo espondilitis anquilosante (Tablas 1

y 4) 73% (8/11) fue positivo para la prueba de tipificación de HLA-B27, 82% (9/11) fue positivo

Linfocitos T en espondilitis anquilosante 7

para la prueba de proteína C-reactiva (concentra-ción promedio 31.8 mg/L) y el 100% de los pa-cientes presentó un aumento en la velocidad de sedimentación globular (>20 mm/h). Un paciente fue positivo para la prueba de factor reumatoideo (concentración 64 Ul/ml).

En el grupo artritis reumatoidea (Tablas 2 y 4) 64% (7/11) fue positivo para la prueba de factor reumatoideo, 64% (7/11) fue positivo para la prueba de proteína C-reactiva (concentración pro-medio 53.66 mg/L) y 54% (6/11) presentó un aumento en la velocidad de sedimentación globu-lar (>20 mm/h). Ningún paciente fue positivo para la prueba de tipificación de HLA-B27.

En el grupo control (Tablas 3 y 4) 4.8% (1/21) fue positivo para la prueba de tipificación de HLA-B27; 4.8% (1/21) fue positivo para la prueba de proteína C-reactiva (concentración 15.90 mg/L) y ninguno de los pacientes fue positivo para la prue-ba de factor reumatoideo. La velocidad de sedi-mentación globular fue inferior a 20 mm/h en to-dos los individuos.

Existe una diferencia estadísticamente signifi-cativa en el resultado de la prueba de tipificación del aloantígeno HLA-B27 (p < 0.001), prueba para proteína C-reactiva (p < 0.001) y velocidad de Acta Med Colomb Vol 14 N°1 - 1989

8 C.F. García y Cols.

Tabla 4. Caracterización de pacientes y controles.

sedimentación globular (p < 0.001) entre el grupo espondilitis anquilosante y el grupo control.

Existe una diferencia estadísticamente signifi-cativa en el resultado de la prueba de factor reu-matoideo (p < 0.001), prueba para proteína C-re-activa (p < 0.05) y velocidad de sedimentación globular (p < 0.05) entre el grupo artritis reuma-toidea y el grupo control.

En el grupo espondilitis anquilosante (Tabla 5) se encontró disminución en el porcentaje prome-dio de linfocitos (p < 0.05), aumento en el porcen-taje promedio de polimorfonucleares neutrófilos

(p<0.05), tendencia al aumento en el porcentaje promedio de células T CD8+ (p = 0.116) y a la disminución en la relación CD4/CD8 (p = 0.117) comparados con el grupo control (Tabla 6). No existe diferencia estadísticamente significativa en la cantidad absoluta promedio de linfocitos entre los grupos espondilitis anquilosante y control.

Existe disminución en el porcentaje promedio de linfocitos, aumento en el porcentaje promedio de polimorfonucleares neutrófilos, y disminución en el porcentaje promedio de células linfoides T totales en el grupo artritis reumatoidea (Tabla 7) comparado con el grupo control (Tabla 6).

Cuando el grupo espondilitis anquilosante se compara con el grupo artritis reumatoidea se ob-serva que existe un aumento en el porcentaje rela-tivo promedio de células linfoides T totales (p < 0.05) y de células T CD8 (P<0.05) y una tenden-

Linfocitos T en espondilitis anquilosante 9

cia a la disminución en la relación CD4/CD8 (p = 0.121) en el grupo espondilitis anquilosante.

DISCUSION Las pruebas de tipificación de HLA-B27, fac-

tor reumatoideo, proteína C-reactiva y velocidad de sedimentación globular definen claramente los tres grupos estudiados. Se confirma la prevalen-cia en la expresión del aloantígeno HLA-B27, y la seronegatividad para el factor reumatoideo en la espondilitis anquilosante, así como la existencia de factor reumatoideo sérico en un alto porcentaje de los pacientes con artritis reumatoidea. Se esta-blece también la existencia de un aumento en la velocidad de sedimentación globular en el estado de inflamación característico de la espondilitis anquilosante y de la artritis reumatoidea.

En el grupo control un individuo (4.8%) fue positivo para la prueba de tipificación HLA-B27; este porcentaje es semejante a la prevalencia (7%) reportada para el aloantígeno de histocompatibili-dad en la población normal (2). En el grupo es-pondilitis anquilosante un paciente fue positivo para la prueba cualitativa de factor reumatoideo presentando, sin embargo, una baja concentración (64 Ul/ml, correspondiente a una dilución 1/80).

Estudios previos han establecido la existencia

de alteraciones cuantitativas en la población lin-foide T de sangre periférica en la espondilitis an-quilosante. Ha sido informada una disminución en el porcentaje de células linfoides (11), de linfoci-tos T (11), de linfocitos T CD4 (11-12) y CD8 (11) y en la relación CD4/CD8 (12).

Nuestros resultados establecen la existencia de disminución en el porcentaje relativo promedio de linfocitos, con aumento en el porcentaje relativo promedio de polimorfonucleares neutrófilos en los pacientes con espondilitis anquilosante y artritis reumatoidea. Esta neutrofilia relativa, cuya causa posible es el estado de inflamación característico de estas entidades, da lugar a una linfopenia rela-tiva.

Encontramos una tendencia al aumento en el porcentaje promedio de células T CD8+ y a la dis-minución en la relación CD4/CD8. Esta tendencia podría hacerse estadísticamente significativa al estudiar una muestra más amplia, en la cual los pacientes sean clasificados de acuerdo con la fase de actividad de la enfermedad. Ya ha sido reporta-do un aumento en el porcentaje relativo de células linfoides T CD8+ durante la fase activa de la en-fermedad en la espondilitis anquilosante (14); este hallazgo apoya nuestros resultados.

Los resultados obtenidos sugieren que un au-mento en la subpoblación citotóxica/supresora traduce el estado de activación de clonos con fun-ción citotóxica contra componentes del tejido conectivo periarticular. Esta activación podría ser consecuencia de una modificación antigénica de estos componentes estableciendo una alteración en el proceso de síntesis y renovación del colá-geno.

Esta posibilidad es apoyada por el hallazgo re-ciente de que linfocitos T citotóxicos específicos, inducidos por estimulación de células mononuc-leares de sangre periférica de individuos norma-les HLA-B27+ con células mononucleares de sangre periférica de pacientes con espondilitis anquilosante HLA-B27+, lisan células mononu-cleares de sangre periférica de pacientes con es-pondilitis anquilosante HLA-B27+, pero no célu-las mononucleares de sangre periférica de indivi-duos normales HLA-B27+ ó HLA-B27- o de

Acta Med Colomb Vol 14 N°1 - 1989

10 C.F. García y Cols.

pacientes con espondilitis anquilosante HLA-B27-(15).

Se pueden producir linfocitos T citotóxicos con una especificidad similar, activando in vitro célu-las de individuos normales HLA-B27+ con célu-las autólogas modificadas por antígenos de reacti-vidad cruzada derivados de cepas bacterianas (15). La modificación del antígeno HLA-B27 por in-teracción con estos antígenos podría dar lugar en individuos genéticamente susceptibles, a la acti-vación de linfocitos T citotóxicos que podrían li-sar células blanco que portan el antígeno HLA-B27. La destrucción de células del tejido conectivo por estos linfocitos T citotóxicos podría provocar una reacción inflamatoria de las articulaciones sacroilíacas y vertebrales.

Cuando el grupo espondilitis anquilosante se compara con el grupo artritis reumatoidea se ob-serva un aumento en el porcentaje relativo prome-dio de células T CD8, y una tendencia a la dismi-nución en la relación CD4/CD8 en el grupo es-pondilitis anquilosante; este resultado permite concluir que no existe un mecanismo inmunopa-togénico común para estas formas de artritis, puesto que las alteraciones por nosotros observa-das comprometen variables diferentes en cada uno de los grupos.

En resumen, los datos obtenidos a partir del análisis cuantitativo de la población linfoide T de sangre periférica en la espondilitis anquilosante indican la existencia de una tendencia al aumento en el porcentaje relativo promedio de células T CD8 (subpoblación citotóxica/supresora) en un grupo de 11 pacientes con espondilitis anquilos-ante comparado con un grupo de 21 individuos control y un grupo de 11 pacientes con artritis reu-matoidea. Este resultado sugiere la posible partici-pación de la citotoxicidad mediada por células T dirigida contra componentes celulares del tejido conectivo de las articulaciones sacroilíacas y ver-tebrales en la patogénesis de la espondilitis anqui-losante.

SUMMARY The purpose of this work was to quantify

peripheral blood T lymphoid population in Anky-

losing Spondylitis. Total T lymphocytes and sub-populations of helper/inducer and cytotoxic/su-ppressor T cells were quantified in a group of 11 patients with Ankylosing Spondylitis. The results were compared with that obtained in 21 normal controls and 11 patients with Rheumatoid Arthritis. The study groups were characterized through HLA typing and rheumatoid factor testing. A tendency towards an increase in the mean percentage of CD8+ T lymphocytes and towards a decrease in the CD4/CD8 ratio in the Ankylosing Spondylitis group compared with the control group was esta-blished. This increase could depend on the activa-tion of clones with cytotoxic function directed against connective tissue components of the sac-roiliac and vertebral joints. The results obtained suggest participation of cell mediated cytotoxicity in the pathogenesis of Ankylosing Spondylitis.

AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Dr. Edgar Rodríguez y al Sr. Rafael Morantes de

la División de Salud Comunitaria de la Fundación Santa Fe de Bogotá, por su asesoría en el análisis estadístico de los resultados obtenidos. A la licenciada Leyla Mora, por su colaboración en la obtención de las muestras utilizadas. A la Licenciada Ana María Ordóñez, por su colaboración en la realización de la prueba cuantitativa de proteína C-reactiva. A la licenciada Gloria Pacheco por su colaboración en la realización de la prueba cuantitativa de factor reumatoideo. A los Laboratorios Roche por la donación de los reactivos para la realización de la prueba nefelométrica para proteína C-reactiva y a Hoechst de Colombia por la donación de los reactivos para la realización de las pruebas de proteína C-reactiva y factor reumatoideo.

REFERENCIAS 1. Kidd B, Mulle M, Frank A, et al. Disease expression of ankylosing

spondylitis in males and females. J Rheumatol 1988; 15: 1407-1409. 2. Sstrominger JL. Biology of the human histocompatibility leukocyte

antigen (HLA) system and a hypothesis regarding the generation of au-toimmune diseases. J. Clin. Invest 1986; 77:1411-1415.

3. Suárez-Almazor ME, Russel A, Lecler CQ. S. Ankylosing spondyli-tis in families with two distinct B27 haplotypes: a selective association. Arthritis rheum 1986; 29: 1510-1514.

4. Wagner P, Mau W, Zeidler H. et al. HLA-B27 and clinical aspects of ankylosing spondylitis: results of prospective studies. Immunol Rev 1985; 86: 93-100.

5. Breur-Vriesendorf P, Dekker-Saeys AJ, Ivenayi P. Distribution of HLA-B27 subtypes in patiens with ankylosing spondylitis: the disease is associated with a common determinant of the various B27 molecules. Ann Rheum Dis 1987; 46: 353-356.

6. Ebringer A, Baines M, Ptaszynska T, Spondylarthritis, Uveitis, HLA-B27 and Klebsiella. Immunol Rev 1985; 86:101-116.

7. Trull AK, Ebringer R, Panayi GS. et al. Immunoglobulin A antibod-ies to Klebsiella pneumoniae in ankylosing spondylitis. Scand J Rheu-matol 1983; 12: 249-253.

8. Geczy AF, Alexander K, Bashir HV. A factor(s) in Klebsiella culture filtrates specifically modifies an HLA-B27-associated cell-surface component. Nature 1980; 283:782-784.

9. Gecxy AF, Prcndergaast JK, Sullivan JS. HLA-B27, molecular mim-

Linfocitos T en espondilitis anquilosante 11

icry, and ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis 1987; 46: 171-172. 13. Vinje O, Dobloug JH, Forre O, et al. Immunoregulatory T cells in the 10. Schwimmbeck PL, Yu DT, Oldstone MB. Autoantibodies to HLA-B27 peripheral blood of patients with Bechterew's syndrome. Ann Rheum

in the sera of HLA-B27 patients with ankylosing spondylitis and Reiter's Dis 1982; 41 :41-46. syndrome. J Exp Med 1987; 166: 173-181. 14. Liu HC. Immunological aberrations in ankylosing spondylitis patients.

11. Liu HC. Lymphocyte aberrations in ankylosing spondylitis. Chung Hua Chung Hua Min Kuo Wei Sheg Wu Chi Mien I Hsueh Tsa Chin 1984; 17: Min Kuo Wei Sheg Wu Chi Mien I Hsueh Tsa Chin 1985; 18: 1-7. 19-24.

12. Tramaloni C, Maccari G, Zannini R, et al. Lymphocyte subpopula- 15. Geczy AF, McGuian LE, Sullivan JS. et al. Cytotoxic T lymphocytes tions in two cases of ankylosing spondylitis. G Clin Med 1984; 65: against disease associated determinant(s) in ankylosing spondylitis. J 427-432. Exp Med 1986; 932-937.

Acta Med Colomb Vol 14 N°1 - 1989