ANÁLISIS DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOSANTIGUOS

Andrea SMERLING Eduvigis SOLÓRZANO, Nancy DÍAZ, Rafael MONTIEL,Eduard CHIMENOS y Assumpció MALCOSA

Introducción

Ya sea como jefe de tribu, curandero, chamán, mago o médico, a lo largo de la historia el hombreha adoptado diferentes formas y métodos para enfrentarse, conocer y combatir la enfermedad. Ha sidola curiosidad, el interés o el instinto de supervivencia lo que aún hoy moviliza a mirar tanto haciadelante como hacia atrás en busca de respuestas. Conocer las enfermedades en el pasado, la morbilidad,el impacto en el ecosistema y los cambios evolutivos hasta llegar a la patología actual son argumentos desuficiente peso para sustentar su interés en investigarlos (Campillo, 1993: 21-37)

La importancia del estudio de las diferentes lesiones asociadas a los dientes radica no solo en elconocimiento de la salud buco-dental de una determinada población, sino en la información que aportaal conocimiento de la dieta y hábitos existentes tanto de las poblaciones actuales como antiguas yprehistóricas (Perea e. al. 2000)

La caries es la más común de las enfermedades dentales y es referida con relación a laspoblaciones arqueológicas con llLás frecuencia que otras lesiones buco-dentales (Roberts y Manchester,2000). Otras alteraciones dentales comúnmente descritas son los depósitos de sales cálcicas en el cuello yen algunas porciones de la corona de los dientes, producto de la mineralización de la placa bacteriana,constituyendo auténticos cálculos. Su presencia se constata en todas las épocas (Campillo, 1993;Linossier et al. 1996: 1005-1014) e indudablemente influye en el desarrollo de la enfermedad periodontal.Estudiar el desarrollo de las enfermedades infecciosas orales a través del tiempo mediante laobservación de la caries, el cálculo dental y su relación con los agentes microbianos qLle las producenpuede proporcionar una valiosa información respecto al origen y subsistencia de estos procesos(Chilenos y Martínez, 1998: 25-33).

Los estudios paleodontológicos, al igual que la mayoría de estudios paleoantropológicos sonprincipalmente morfológicos. Sin embargo, en las últimas dos décadas, el análisis de ADN se haconvertido en una herramienta efectiva, versátil y accesible para Lm numeroso grupo de científicos.Actualmente, el reciente desarrollo biotecnológico permite recoger diferentes datos genéticos depoblaci<mes antiguas utilizando restos arqueológicos. Este nuevo campo de investigación presenta todaslas potencialidades para poder contribuir sustancialmente a la comprensión de nuestra historia evolutiva(Capella et al. 2003: 59-64). La capacidad de las biomoléculas en el hueso yen los dientes de sobrevivirlargos períodos de enterramiento ha brindado esta oporttmidad.

ADN antiguo

El estudio de secuencias de ADN obtenido de organismos extintos, ADN antiguo (aDNA), abrenuevas posibilidades en la recuperación de información genética proveniente del pasado, dando laoportunidad de analizar la evolución molecular a través de largos períodos de tiempo. Actualmente elgrado de desarrollo de esta disciplina ha generado un campo autónomo dentro de la moderna biologíamolecular, definiéndose corno "arqueología molecular" (Cooper y Wayne 1998: 49-53; Taylor, 1996: 283­285).

En general, se trata de un material genético muy degradado, fragmentado y susceptible decontaminarse con ADN moderno, por lo que se aplican métodos particularmente delicados que

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permiten, a pesar de la naturaleza de las muestras, recuperar pequeños fragmentos de ADN,habitualmente menores de 200 pares de bases (pb). Por ello resulta necesario establecer criterios estrictosde esterilización que garanticen la autenticidad de los resultados obtenidos, siendo imprescindible unlaboratorio exclusivamente dedicado al trabajo de aDNA y la consecuente separación física de losprocesos de pre-PCR, que implica la extracción y preparación de la reacción de amplificación y post-PCRdestinado al análisis de las muestras amplificadas (Ibídem).

Las dificultades inherentes a la utilización de PCR al amplificar pequeñas cantidades de ADNdañado están siendo aún consideradas, en particular el riesgo de contaminación y accidentes en elproceso de amplificación, dando lugar a resultados falso-positivos (Martínez et al. 1999: 195-213; Paabo,1989: 1939-1943; Paabo et al. 1989: 9709-12). Se han llevado a cabo numerosas adaptaciones en losprocedimientos de extracción de ADN, eliminación de inhibidores a través de pasos de purificación yprotocolos de PCR con la finalidad de aumentar la calidad y cantidad del producto amplificado (Pusch etal. 2002: 351-364; Montiel, 2001; Malgosa et al. 2005)

Streptococcus mutans

La caries dental es, actualmente, una de las enfermedades más prevalentes que padece el hombremoderno. Esta prevalencia ha ido aumentando progresivamente con el avance de la civilizacióncoincidiendo con el incremento en el consumo de azúcar de caña y harinas refinadas (Roberts yManchester, 2000; Lerman, 1942: 29-36).

Décadas de estudios epidemiológicos, bioquímicos y experimentales con animales han implicadoa Streptococcus mutans como el principal agente causal de la caries dental humana. Aunque 200-300especies bacterianas se encuentran asociadas a la placa dental, solo la presencia del Streptococcus mutansha sido consistentemente ligada a la formación de la caries (Sato et al. 2003: 66-69; Lindhe, 2001; Dzaganaet al. 2002: 14434-14439). La elevada potencialidad cariogénica de S. mutans es parcialmente atribuible asu capacidad de acumularse sobre los dientes mediante la formación de glucanos extracelulares(dextranos) sintetízados a partir de la sacarosa, predominantemente polímeros, que se forman a partir deuna mitad de la molécula de sacarosa por glicosiltransferasas presentes en la superficie delmicroorganismo.

El Streptococcus mutans es un gran productor de la enzima dextranasa (Dex), la cual hidroliza lasuniones de las moléculas de glucanos sintetizados por la glucosiltransferasa Por consiguiente, la Dexsería un importante factor de virulencia (Morisaki et al. 2002: 223-227; Igarashi et al. 2001: 341-348;Igarashi et al. 1996: 294-298). Precisamente el gen responsable de este enzima se ha utilizado confrecuencia para identificar y diferenciar el Streptococcus mutans. Recientemente, la utilización de lareacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la secuencia genética de la dextranasa ha sidodesarrollada y aplicada con éxito para la identificación de este microorganismo (Redmo et al. 2003: 24-29;Igarashi et al. 1996: 294-298).

El objetivo de este trabajo consiste en optimizar la técnica de extracción y amplificación del ADNde Streptococcus mutans antiguo a partir de restos antiguos, siendo este integrante del grupo mutans elorganismo principalmente implicado en el desarrollo de la caries y componente de la placa bacteriana. Apartir del material genético extraído en distintas muestras se pretende observar la eventualhomogeneidad o heterogeneidad de las secuencias

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Material y métodos

Muestras

Se han analizado un total de 24 muestras pertenecientes a distintas series arqueológicas españolascustodiadas en el laboratorio de Paleoantropología de la Universidad Autónoma de Barcelona:

S'Illot des Porros (Mallorca): siglo VI-II aC.Can Reiners (Mallorca): siglo VII.Esglesia San Pere (Terrassa, Barcelona): siglos V-XII.Colección UAB (Granollers ,Barcelona): principios de siglo XX).Además, dos grupos dentales de:Tlatelolco: Ciudad de México, Post-clásico Tardío, siglo XV- principios del siglo XVI.Los Olmos: Hidalgo,Colonial Tardío, siglo XIX.

Los dientes presentaban distintas lesiones: caries oclusal, caries cervical, dentina periférica a caries(dentina desorganizada) y cálculo, obteniéndose el material de cada una de ellas.

Prevención de contaminación

Se tomaron estrictas precauciones para evitar la contaminación durante los procesos deextracción y PCR para garantizar la fiabilidad de los resultados. Los mismos fueron realizados enlaboratorios independientes diferenciando proceso de extracción y post-PCR. Los reactivos fueronpreparados con soluciones estériles e instrumental de vidrio, siendo todo el material autoclavado dosveces e irradiado con rayos UV (254 nm) antes de su utilización. La manipulación durante todo el trabajoen laboratorio se realizó con guantes desechables, que se fueron cambiando frecuentemente en losdiferentes pasos durante todo el proceso, indumentaria estéril y mascarillas. En todos los proceso deextracción y de amplificación fueron incluidos controles de contaminación.

Extracción de ADN, Tratamiento de las muestras

Dado que el objetivo primordial de este trabajo ha sido la optimización de una técnica quepermita amplificar ADN de Streptococcus mutans de restos antiguos, algunos pasos fueron modificándosea lo largo de todo el estudio en función de los resultados, con el objeto de aumentar la eficiencia delmétodo.

Este trabajo se realizó siguiendo la metodología básica y utilizada habitualmente en ellaboratorio de ADN antiguo de la Unidad de Antropología, Departamento de Biología Animal, BiologíaVegetal y Ecología. UAB (Malgosa et al. 2005). Las extracciones se realizaron en grupos de 3 a 6 muestrasy un control negativo que contiene solo los reactivos (blanco de extracción o KE), para el control de lacontaminación.

Obtención de las muestras

Las muestras de caries, dentina y cálculo dental se obtuvieron dentro de una campana de flujolaminar, utilizando un juego de instrumental diferente (fórceps, fresas redondas para instrumentalrotatorio, pinza de algodón) para cada una de las muestras (Figs. 1, 2 Y3). El cálculo dental se obtuvo de

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forma manual, utilizando curetas Gracey de periodoncia; la caries y la dentina con instrwnentalrotatorio: piedras de diamante y fresas redondas de carburo de tungsteno.

El aislamiento de ADN se realizó por una lisis previa con EDTA (quelante de cationes divalentes)para desestabilizar las membranas e inhibir las DNAsas, y un detergente que produce finalmente la lisisde la membrana citoplasmática (SDS), constituyendo esto el tampón de extracción, al cual se le incorporaproteinasa K (Rodríguez et al. 2002: 80-88). Siguiendo este principio, se colocaron 5 mI de tampón deextracción y 50 111 de proteinasa K en cada tubo, incluyendo el blanco de extracción (KE), el cual se tratócomo una muestra más. Algunas de las muestras se lavaron con EDTA previo a la colocación deltampón. Las muestras fueron incubadas a 37° durante toda la noche.

La extracción de ADN se realizó en tres pasos con fenal, fenal-cloroformo y cloroformo, Esteproceso se consigue mediante cinco etapas de centrifugación de entre 45 y 60 minutos en el cual loslípidos quedan en el fenal (fase orgánica), los ácidos nucleicos en la fase acuosa y las proteínas en lainterfase. El cloroformo contribuye a retirar todo el fenal de la fase acuosa. Posteriormente se realiza elfiltrado y la concentración utilizando centricón 30 (Millipore®). El extracto así obtenido se almacena a4°C durante 3 días quedando preparado para su amplificación mediante PCR.

Los primers utilizados han sido diseñados en nuestro laboratorio a efectos de este trabajo. Setrata de un fragmento de 12~ pb específico para la especie S. mutans, que se corresponde con el gen de ladextranasa. Los primers fueron diseñados con el programa PrimerDesign v. 1.10 (Napiwotzki, 1995) Laselección final de los primers se basó en el análisis de primer-dimers, utilizando el programa Primer(Montiel, 2001) y verificando las posibilidades de hibridación con secuencias de otras especies medianteel programa BLAST 2.2.9 (Altschul et al. 1997: 3389-3402) en el GenBank.

El proceso de PCR se llevó a cabo siguiendo los principios bifásicos de amplificación adaptadospara aDNA. El programa del termociclador consistió de un ciclo inicial de desnaturalización de 5minutos a 94° C, 39 ciclos de desnaturalización de 50 segundos a 94° C, 1 minuto a temperatura de"annealing" (hibridación o emparejamiento de primer) optimizada entre 54 y 56° C y finalmenteestandarizada en 55°; y 1 minuto de extensión a 72° C, terminando con un ciclo de extensión final de 5minutos a 72° C, finalizando con la temperatura de almacenamiento a 4° C. El producto amplificado fueanalizado por medio de electroforesis en gel de agarosa a13% y visualizado a través de UV. (Fig. 4)

Secuencias del producto amplificado

El producto de PCR obtenido fue purificado con el fin de eliminar los residuos del tampón deextracción así como de los primers, siguiendo la metodología de Montiel (2001), modificandotemperaturas y tiempos, lo que contribuyó a obtener un producto purificado de mejor calidad. Elproducto purificado, se secuenció en el Servicio de Secuenciación de la Unidad de Microbiología de laUAB, utilizando un secuenciador automático Alf-express (Phannacia) (Fig. 5). Las secuencias fueronalineadas utilizando la base de datos del GenBank (NCBI) con el programa BLAST (Ibidem)www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi.

Resultados

Al ser ésta la primera experiencia en el aislamiento de ADN de S. mutans en restos antiguos,muchos de los pasos del protocolo de extracción fueron modificándose a fin de obtener mejoresresultados. Se realizaron 8 extracciones en grupos de entre 3 y 6 muestras. La temperatura dehibridación de los primers o annealing se estipuló en 55° C y 2111 de ADN en suspensión, como elvolumen indicado a utilizar en las amplificaciones.

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Una vez confirmada la posibilidad de recuperar el ADN del microorganismo, los procedimientosse orientaron a mejorar la calidad del producto final.

Limpieza previa de la muestra

Un grupo de extracción de 5 muestras no se lavaron con hipoclorito de sodio antes de comenzarel procedimiento; solo fueron limpiadas con un cepillo de dientes y aclaradas con agua destilada, paraeliminar los restos de material provenientes de la excavación, en estos casos, no se obtuvo resultadospositivos. Tal vez, restos de material orgánico de la excavación actuaron como inhibidores del la PCR, yde esta forma inutilizaron las muestras.

Estas muestras también se amplificaron con primers específicos de diferentes fragmentos deADN mitocondrial (humano) especialmente diseñados para aDNA (125 pb) con el fin de verificar lapresencia de ADN (careciendo de importancia el origen de éste) y así constatar de que las muestrasfueran viables y considerarlas como resultados negativos, pero tampoco hubo resultados, confirmandola hipótesis de la presencia de gran cantidad de sustancias inhibidoras de la PCR. La metodologíautilizada fue ligeramente distinta y podría haber influido en la eficiencia de la extracción.

El lavado con EDTA tampoco fue determinante en la obtención de resultados.

Respecto al volumen del extracto

En algunos casos el volumen final de extracción superaba el volumen ideal. Tal vez partículas demuestra que no hubieran sido lo suficientemente disueltas en el tampón de extracción obstruyeron partede la membrana del centricón 30 impidiendo de esta forma un total filtrado. Se decidió re-concentrarestas muestras. Este proceso consiste en repetir la fase de centrifugado en iguales condiciones. En estepaso, si bien se obtiene un ADN más concentrado, también se corre el riesgo de aumentar laconcentración de los inhibidores de la PCR, además, otro riesgo de la reconcentración es el de lacontaminación. Es por esto que es preciso reconcentrar también el blanco de extracción. Como se hacitado anteriormente, el blanco de extracción para el control de la contaminación es tratado como unamuestra más.A pesar de estas consideraciones, de las tres muestras reconcentradas dos amplificaron con muy buenasbandas. Esto podría indicar que la reconcentración sería una opción a tener en cuenta. Cuando elvolumen de la muestra sobrepasara excesivamente los 25¡.11, y si los resultados no fueran óptimos, laposibilidad de no perder estas muestras justificaría el riesgo de una reconcentración.

Reamplificación

Tres de las muestras que resultaron positivas se re-amplificaron, a fin de conseguir mejor calidadde bandas. Este proceso consiste en volver a someter el producto ya amplificado al termociclador (PCR)con iguales características (master mix y programa de PCR), no obstante, los resultados no fueronsignificativos.

Resultados finales

De un total de 24 muestras, de las cuales 5 fueron inutilizadas por la presencia de inhibidores, seobtuvieron resultados positivos en 11

8 de las muestras que resultaron positivas, se purificaron y fueron secuenciadas. Las secuenciasobtenidas se introdujeron en la base de datos BLAST para alinearlas con las secuencias del S. mutans y

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de otros microorganismos depositados en esta base de datos, resultando secuencias homólogas sólo conel Streptococcus mutans en un 95%.

Discusión

El ADN acumula daños bioquímicos con el transcurso del tiempo y en consecuencia la moléculase degrada, alterándose la secuencia y la información genética (Lanteri y Contalonieri). Algunos autoresafirman que la asociación íntima del ADN con moléculas más resistentes puede protegerlo de ladegradación. Diversos análisis confirman la capacidad del ADN para asociarse con superficiesminerales, y que esta unión puede conferirle una protección hasta 100 veces mayor contra las DNAsas.Por lo tanto, el ADN no se perdería con la mineralización en el proceso de fosilización, sino que seríaabsorbido en los minerales que reemplazan a las biomoléculas. En concreto se ha propuesto (persson,1992: 33-34; Tuross, 1993; Nielsen et al. 1994) que el ADN se preserva mejor en tejidos con alto contenidode hidroxiapatita. El ADN presenta una gran afinidad por este compuesto (Sambrook et al. 1989) al quepodría unirse con gran rapidez, quedando protegido de las enzimas líticas. Esto podría explicar por quéel ADN sobrevive mejor en los dientes (Gusta et al. 1994: 13) ya que el esmalte y la dentina presentan unalto contenido de hidroxiapatita

En principio, el ADN'recuperado de dientes puede proceder tanto del propio individuo como deaquellos agentes bacterianos que colonizan la cavidad bucal por lo que es posible "a priori" identificarbacterias de la flora bucal como Streptococcus mutans. La identificación molecular de microorganismosestá basada en diferentes estudios en los cuales se ha demostrado que es posible la recuperación dematerial genético antiguo de organismos patógenos en suficiente calidad y cantidad utilizando primersespecíficos y obteniendo productos de amplificación de aproximadamente 100-200 pb que proporcionanuna alta sensibilidad técnica para detectar aDNA (Perea et al. 2002; Zink et al. 2003: 359-367; Baron et al.1996: 667-671; Zink et al. 2001: 355-356; Montiel et al. 2003: 413-414; Solórzano et al. 2003).

De todas las bacterias bucales, los estreptococos han sido los más exhaustivamente estudiados.Actualmente es indiscutible el rol de Streptococcus mutans en el inicio y avance de la caries dental(Linossier et al. 1996: 1005-1014; Sato et al. 2003: 66-69; Lindhe 2001; Dragana et al. 14434-14439; Morisakiet al. 2002: 223-227; Igarashi et al. 2002: 193-196; 2001: 341-348; 1996: 294-298; Redmo et al. 2003: 24-29).Distintos estudios han demostrado la especificidad en la obtención de ADN de Streptococcus mutans enmuestras actuales utilizando primers que amplifican fragmentos del gen de la dextranasa (Morisaki et al.2002: 223-227; Igarashi et al. 2002: 193-196; 2001: 341-348; 1996: 294-298; Redmo et al. 2003: 24-29).

La molécula de dextranasa esta constituida por un péptido (Sp), una región estable (CR) y dosregiones variables (nVR y cVR). La región estable es la responsable de la actividad enzimatica, y seobserva homología de esta región con el resto de Streptococci (S. dowenei, S. salivarius, S. sobrinus, etc)(Igarashi et al. 2001: 341-348). En contraste, las regiones variables no presentan homología, el tamaño denVR y eVR es diferente entre las especies y no son funcionalmente importantes (Morisaki et al. 2002: 223­227; Igarashi et al. 2002: 193-196; 2001: 341-348). Así pues las diferencias en la constitución de ladextranasa permiten obtener un producto amplificado específico de Streptococcus mutans, en estasregiones.

La región amplificada (344-467) no presenta homologías significativas con secuencias de ningunaotra especie, según análisis con el programa BLAST 2.2.9 (Altschul et al. 1997: 3389-3402) en el GenBank.En este gen, aparentemente no existen dominios conservados, según análisis con el programa üRFFinder del NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/ gorf.html). Sumado a esto, la alineaciónde las secuencias obtenidas a partir del producto amplificado con respecto al genoma de Streptococcusmutans, utilizando la base de datos BLAST (Altschul et al. 1997: 3389-3402)(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) presenta una homología del 95%.

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Estos resultados pueden considerarse válidos teniendo en cuenta las condiciones experimentalesestrictas del laboratorio que permiten evitar riesgos y garantizar los resultados.

En primer lugar, se han tomado medidas de prevención de contaminación con ADN demicroorganismos modernos, de la inhibición de la Taq polimerasa durante el proceso de PCR y de laamplificación de productos no específicos: esterilización extrema de todo el material, lavado de lasmuestras con hipoclorito de sodio yagua antes de su manipulación, y procesamiento paralelo denumerosos blancos de control. Debe tenerse en cuenta además que en el laboratorio de aADN de la UABjamás se había trabajado con Streptococcus mutans antes de esta experiencia.

En base a estos resultados estamos en condiciones de afirmar que el aislamiento de ADN deStreptococcus mutans en restos antiguos es posible. Dado que no se ha manipulado jamás informacióngenética de este microorganismo en nuestro laboratorio, los resultados positivos obtenidos se deben a lapresencia de ADN en las muestras procesadas. Por otro lado, las modificaciones realizadas al protocolode extracción del laboratorio de aDNA de la U.AB. con la finalidad de optimizar la recuperación deADN de Streptococcus mutans mejoraron la calidad del producto amplificado.

Hasta la fecha no se ha encontrado en la literatura ninguna prueba que especifique la obtenciónde ADN de bacterias de la cavidad bucal en restos antiguos. Dado que el aislamiento de ADN deStreptococcus mutans en estos restos es posible, se establece en el presente estudio experimental el primerprecedente del aislamiento de este microorganismo en restos antiguos.

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562

APORTACIONES, METODOLOGÍAS Y DESARROLLO TECNOLÓGICO. OTROS ESTUDIOS, OTRAS ÉPOCAS

Figura 1

Figura 2

Figura 3

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ANÁLISIS DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS ANTIGUOS

Figura 4

Figura 5

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