Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis.
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Análisis Citométrico de la Función
Plaquetaria: Técnicas de Análisis
ESTUDIO CLINICO DE LA HEMOSTASIA: INTEGRACION DE FUNCION PLAQUETARIA Y COAGULACION
• El estado actual del conocimiento de la hemostasia, su regulación y su patología exige incluir el análisis de la función plaquetaria en el estudio de los fenómenos prohemorrágicos y protrombóticos.
• El desarrollo actual de la citometría de flujo la convierte en una tecnología de elección para ese fin.
• La disponiblidad de técnicas citométricas en sangre entera potencia el valor diagnóstico y pronóstico de la citometría de flujo en el estudio clínico de la hemostasia.
LA PREGUNTA CLAVE:¿HAY VIDA MAS ALLA DE ESTE HISTOGRAMA?
LA RESPUESTA:HAY VIDA (SIN NUCLEO) MAS ALLA DE ESTE HISTOGRAMA!!!
LAS DIEZ MEJORES “EXCUSAS” PARA NO ESTUDIAR LA FUNCION PLAQUETARIA POR CITOMETRIA DE FLUJO
• Los citómetros de flujo son para analizar leucocitos.
• Las plaquetas son demasiado pequeñas para ser detectadas.
• Las plaquetas sólo se pueden estudiar en forma de PRP.
• Las plaquetas se activan con mucha facilidad.
• No hay marcadores fenotípicos de plaquetas.
• Hay demasiados marcadores fenotípicos de plaquetas.
• Pero si en la Hemostasia lo importante es la coagulación...
• Pero si ya se usa un contador de plaquetas...
• Pero si ya se usa el agregómetro...
• Pero si ya las estudian en el Centro de Transfusiones...
ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA
• Permite estudiar la función plaquetaria en condiciones cuasi-fisiológicas
• La manipulación mínima previene la activación artefactual de plaquetas
• Evita la pérdida potencial de subpoblaciones plaquetarias
• Requiere pequeños volúmenes de muestra (pocos microlitros de sangre)
• Permite el análisis simultáneo de plaquetas y otras células sanguíneas
ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA
PE
L
+ADP
+ADPBASAL
BASAL
WB PRP GFP WP Positive control
0
20
40
60
80
100
*
*
*
% P
late
lets
CD
62P*
ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: CITOMETRIA FUNCIONAL VERSUS AGREGOMETRIA
ADP
SS Log
FS
Log
CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS
Hasta ahora, el análisis citométrico de
plaquetas más habitual es el de anticuerpos
antiplaquetarios:• Autoanticuerpos
• Aloanticuerpos:
• Inmunofenotipo de HPA-1a
• Detección de anticuerpos maternos y fetales anti-
HPA-1a
• Analisis de IgG asociadas a plaquetas en
trombopenias
• Analisis de IgG asociadas a plaquetas en
aloinmunización
• Cross-match de plaquetas
• La función plaquetaria también se puede analizar
ampliamente en sangre entera por citometría de flujo• Activación plaquetaria in vivo• Reactividad plaquetaria in vitro• Interacciones plaqueta-plaqueta• Interacciones plaquetas-leucocito• Interacciones plaquetas-eritrocito• Liberación de micropartículas procoagulantes• Alteraciones en el recuento de plaquetas• Alteraciones en la morfología de la plaqueta• Maduración normal y patológica de la plaqueta• Monitorización del tratamiento antiagregante
CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
ANALISIS DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
• La preparación y el procesamiento de la muestra deben
ser cuidadosos para mantener las funciones intrínsecas
• Las condiciones del análisis citométrico se deben
adaptar para acotar la población de plaquetas
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
RBC
Plaquetas
• La extracción debe realizarse en reposo y con el
mínimo traumatismo
• Se recomienda desechar los primeros mL de muestra
• La sangre entera se debe anticoagular con citrato
• Las muestras se diluyen (1:100) para minimizar la
formación de agregados plaquetarios
• Se utiliza un anticuerpo monoclonal contra una proteína
constitutiva de la superficie de la plaqueta para identificar
y seleccionar la población plaquetaria
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
• Preparar todos los reactivos necesarios anticipadamente• Dispensar la sangre sobre anticoagulante• Diluir la sangre (antes de 30 min) con el tampón adecuado• Opciones de ensayo:
Þ Fijar MarcarÞ Activar Fijar MarcarÞ Activar Marcar FijarÞ Marcar Activar FijarÞ Marcar y activar simultáneamente Fijar
• Diluir en tampón adecuado o fijador• Analizar p0or citometría de flujo
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
Muestras fijadas
• Ventajas:• Fácil de realizar antes de 30
minutos de la toma de muestra• Mejor estimación estática del
estado de activación plaquetario
• Desventajas:• Impide estudiar las respuestas de
activación plaquetaria• Algunos epitopos se pueden
alterar por el fijador
Muestras frescas
• Ventajas:• Posibilidad de medir la
activación plaquetaria in vivo y la reactividad plaquetaria a varios agonistas
• Desventajas:• La preparación es crítica debido
a la activación espontánea de las plaquetas con el tiempo
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
• En ausencia de agonistas exógenos se determina el estado de activación in vivo de las plaquetas circulantes
• La adición de un agonista permite analizar la reactividad in vitro de las plaquetas circulantes.
+ADPBASAL
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
• Los agonistas más utilizados para la estimulación
de plaquetas son:
• Agonistas fuertes: Trombina y TRAP
• Agonistas débiles: ADP, Colágeno, Tromboxano A2
• Ionóforos de Calcio: Ionomicina, A23187
• Esteres de forbol: PMA
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
BASAL COLLAGEN
ADP THROMBIN
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
[ Ca2+
[
= 100 nMPlaqueta en
reposo
Plaqueta
activada
STD
gránulos densos
mitocondrias
gránulos a
Ca2+ en sangre = 10.000 en citosol
Ca2+
Ca2+
Canales específicos
GPIIb/IIIa
Ca2+
STD
GD
• La respuesta plaquetaria se puede estimar con:
•Anticuerpos monoclonales contra marcadores de
activación
•Fluorocromos específicos de funciones bioquímicas
•Parámetros morfológicos asociados a cambios
funcionales
CD62P
Con
taje
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
Parámetro
Ca libre citosólico 2+
Actina G
Cambio detectado
Aumento reversible
Polimerización a Actina F
Marcador Citométrico
FLUO-3 AM
Falacidina
Faloidina
Cambios en FS
Cambios en SS
Emisión de Fluorescencia
Aumento reversible
----
Aumento reversible
Tamaño
Granularidad
Aumento o Disminución
Desgranulación
PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
Mepacrina
Parámetro Cambio detectadoMarcador
CitométricoEmisión de
Fluorescencia
Gránulos densos(Número)
Complejosgp IIb/IIIa(Número)
Complejosgp b/V/IX(Número)
Liberación delcontenido
Disminución ensuperficie
Aumento ensuperficie
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
Disminución
Disminución
Aumento
PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
Parámetro Cambio detectadoMarcador
CitométricoEmisión de
Fluorescencia
Complejosgp IIb/IIIa
Complejosgp IIb/IIIa
Complejosgp IIb/IIIa
Complejosgp IIb/IIIa
Conformaciónalterada
Conformaciónalterada
Unión deligandos
Expresión deLIBS y RIBS
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
contra ligandos
Anticuerposespecíficossimultáneos
Anticuerposespecíficos
contra neoepítopos
Aumento
Aumento
Aumento
Modificación dela resonancia de
fluorescenciaFRET
PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
Parámetro Cambio detectadoMarcador
CitométricoEmisión de
Fluorescencia
Fosfolípidosaniónicos
Aumento Aumento
Aumento
Aumento Aumento
Aumento
Factores de lacoagulación
CD62P(P-Selectina)
CD63(gp53)
Aumento
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
contra V y VIIIa
Annexina V
Aumento
PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
CD107a(LAMP-1)
CD 107b(LAMP-2)
Gp40
CD40L
Parámetro Cambio detectadoMarcador
CitométricoEmisión de
Fluorescencia
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
Detección de plaquetas activadas in vivo:• Objetivos:• Detección de plaquetas activadas circulantes• Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico
• Aspectos metodológicos:• El análisis se efectúa en sangre completa periférica• Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE• Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC• Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Detección de plaquetas activadas ex vivo:• Objetivos:• Determinación de la respuesta a agonistas exógenos• Estimación del riesgo protrombótico o prohemorrágico• Monitorización de tratamientos antiplaquetarios• Caracterización del perfil de activación plaquetaria
• Aspectos metodológicos:• El análisis se efectúa en sangre periférica• Activación con agonistas plaquetarios: ADP, trombina, etc.• Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE• Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC• Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
TUBO MUESTRA Agonista CD41-PE+CD62P-FITC
Solución Stop(Tyrode a
+4°C)0 40µL None 10µL + 5µL 2 mL
1 36µL 4µL of 50µMADP
10µL + 5µL 2 mL
2 36µL 4 µL of100µMTRAP-6
10µL + 5µL 2 mL
TIEMPO 10 min37°C
5 min37°C
Análisis en+/- 15 minutos
Análisis de laActivación
ex vivo
Análisis de la activación
in vitro
Procedimiento típico de un ensayo de activación plaquetaria
Anticuerpos CD41/GPIIb
Clone Bindingconditions
Epitope resistantto fixation
Special effect Forms andPart. No
P2 Only whenCD41 isnaturally
complexed toCD61 (GPIIIa)
Yes
Blocks thebinding offibrinogen toplatelets;inhibitsaggregation
IM0145
IM0718 Biot
IM0649 FITC
IM1416 PE
SZ22 CD41 evendissociatedfrom CD61
ND
None
IM0539
IM0720 Biot
IM1756 FITC
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Clone Bindingconditions
Epitope resistantto fixation
Special effect Forms andPart. No
SPAN12 Only on intactThrombin
receptor, i.e.before theactiation ofthrombin
No
Inhibitsthrombin-activation
IM2086
IM2583 PE
WEDE15 Both on intactand thrombin-
cleavedreceptor No
None
IM2085
IM2584 PE
Anticuerpos contra el receptor de trombina
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
0.00 0.25 0.50 0.75 1.000
50
1006D1 (GP1b)AK1 (GP1b/IX)FMC25 (GPIX)S12 (P-selectin)PAC110E5 (GPIIb-IIIa)OKM5 (CD36)
5.0
[Thrombin] U /ml
Perc
ent o
f Max
imal
Fluo
resc
ence
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Expresión de P-selectina (CD62P):
CD62P-FITC
+ ADPBASAL
+ADP
BASAL
FS
log
CD62P-FITC
Con
taje
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Inducción de la activación:• Objetivos:·Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico·Monitorización de tratamientos antiplaquetarios·Caracterización del perfil de activación plaquetaria
• Aspectos metodológicos:·El análisis se efectúa en sangre periférica·Activación con agonistas específicos·Identificación con CD41, CD49 o CD61 con PE·Medida cinética de la liberación de calcio con Fluo-3 o Fluo-4
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Inducción de la activación:
+ADP
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Inducción de la activación:
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
Medida de la expresión de superficie procoagulante:
• Objetivos:• Cuantificación de la expresión de fosfatidilserina en la
superficie de la plaqueta activada
• Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación
Aspectos metodológicos:
• El análisis se efectúa en sangre periférica
• Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5
• Medida de fosfatidilserina con Anexina V-FITC
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
Medida de la expresión de superficie procoagulante:
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias:• Objetivos:• Detección y cuantificación de fragmentos circulantes de
membrana plaquetaria que expresan fosfatidilserina
• Diferenciar micropartículas activadas y no activadas
• Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación
Aspectos metodológicos:
• El análisis se efectúa en sangre periférica
• Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5
• Medida de fosfatidilserina con Annexina V-FITC
• Método normalizado en Biocytex
BASAL
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
A23187 67mM
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
A23187 67mM
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
BASAL
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias:
Number of Pathological Samples : n = 22
Test A Test B
CD61/CD41 Annexin V/CD41
Mean 7745 1362
SD 3474 570
Range 1839 - 13620 400 - 2280
Results expressed in number of events / µl whole blood
Micropartículas activadas
Micropartículas plaquetarias
A B C
D E
F
G
RBC
Plaquetas
ADP
Basal
ADPADP
A23187A23187 Basal
ADPBasal
EJEMPLO DE ANALISIS CITOMETRICO INTEGRADO DE LA FUNCION PLAQUETARIA