EFECTOS DE LA UREMIA Y LA CONCENTRACIÓN DE BICARBONATO EN LA CALCIFICACION DE LAS CÉLULAS DE

MÚSCULO LISO VASCULAR

Alain J. de Solís, Francisco R. González-Pacheco, Juan J.P. Deudero, Mª Angeles Castilla, Fernando Neria, Silvia Peñate, Ruth Fernández-Sánchez,

Carlos Caramelo. Laboratorio de Nefrología e Hipertensión.

Fundación Jiménez Díaz - Capio. Universidad Autónoma de Madrid.

CALCIFICACIÓN VASCULARProceso regulado, caracterizado por la deposición de cristales minerales en el tejido vascular, especialmente sobre arterias y válvulas cardiacas.

Tipos de calcificación vascularAsociada a CE y macrófagos. Relacionada con procesos inflamatorios y oxidativosasociados a ateroesclerosis.

Localizada sobre la lámina elástica de CMLV.Similar a la esclerosis de Mönckeberg.

Capa intima

Capa media

Células endoteliales (CE)Células de músculo liso vascular (CMLV)Macrófagos, Fibroblastos

Tipos celulares

Moléculas Anticalcificantes: MGP, OPG, Fetuina–AProcalcificantes: ALP, Cbfa-1, Osteocalcina

La calcificación de la media arterial es un factor de riesgo cardiovascular particularmente significativo en los pacientes urémicos.

Es un proceso activo, con transformación de las CMLV hacia un fenotipo osteoblástico.

La administración de bicarbonato para corregir la acidosis metabólica aumenta el pH sanguíneo. In vitro, el pH alcalino favorece la precipitación de los fosfatos cálcicos.

Factores de riesgo

•Ateroesclerosis•Diabetes•Hiperfosfatemia y/o hipercalcemia, con elevación del producto Ca X P•Factores desconocidos

Daño celularPerdida inhibidoresApoptosisHiperfosfatemiaHipercalcemia

Vesículas de matriz

CMLVFenotipo osteoblástico

Pi

Cbfa-1ALPColágeno I

Ca X P

ARTERIOPATIA URÉMICA CONCALCIFICACIÓN DE LA MEDIA

CMLVFenotipo normal

Calcificación de la lamina elástica de las CMLV

Raggi P., ASN Renal Week 2004

Modelo del cambio fenotípico de CMLV (Shanahan, Giachelli)

HIPÓTESIS

•Analizar el papel del suero urémico como potenciador de la calcificación vascular en un modelo in vitro

•Estudiar el efecto de la variación de pH extracelular y de las concentraciones de bicarbonato sobre la calcificación

OBJETIVOS

•La alcalinización extracelular favorece la acumulación de calcio en el tejido vascular

•Este efecto es más intenso en el suero urémico

MATERIALES Y MÉTODOSCultivo primario de células de músculo liso vascular de aorta bovina.Inducción de calcificación mediante -glicerofosfato 10 mM.

Análisis del proceso de calcificación mediante:

•Pool de sueros de pacientes urémicos en hemodiálisis, sin medicación con posibles efectos sobre la calcificación. •Pool de sueros de individuos sanos, ajustados en edad y sexo a los pacientes urémicos.•Consentimiento informado por escrito

Variaciones en la concentración de bicarbonato y en el pH extracelular.

•Visualización de la calcificación con tinción Von Kossa•Medida de la incorporación de 45Ca•Medida de la expresión de marcadores de transformación osteoblástica•EIPA (n-ethylisopropylamiloride): inhibidor del intercambiador Na+/H+

•PFA (Acido Fosforofórmico/Foscarnet): inhibidor del transportador P/Na+

•Levamisole: inhibidor de ALP

S. UREMFBS S. NO UREMTinción de Von Kossa. Día 12

El suero urémico indujo un incremento significativo de la captación de 45Ca y de la deposición de fosfatos cálcicos.

Curva de incorporación de 45Ca con 10% del suero indicado ( * p<0,01).

*

*

EFECTO DEL SUERO URÉMICO

DEPENDENCIA DE LA CALCIFICACIÓN DE LA HIPERFOSFATEMIA

Medida de la incorporación de 45Ca. Efecto de PFA 1 mM (inhibidor del transportador P/Na+) y de Levamisole 1 mM (inhibidor de la ALP) * p<0,05 **p<0,001.

El proceso de calcificación in vitro inducido por -glicerofosfato es dependiente de hiperfosfatemia.

***

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE BICARBONATO

El aumento de la concentración de bicarbonato en el medio de calcificación favorece la incorporación de 45Ca. Este efecto es significativamente mayor con el suero urémico.

FBS

S. NO URÉMICO S. URÉMICO

Medida de la incorporación de 45Ca en medios con diferentes concentraciones de bicarbonato y medida del pH resultante

EFECTO DEL pH DEL MEDIO EXTRACELULAR

La alcalinización del medio extracelular provoca un incremento de la incorporación de 45Ca (*p<0,01)

La acidificación del medio extracelular provoca un descenso de laincorporación de 45Ca (*p<0,01)

*

*

pH medio de calcificación

Medida de la incorporación de 45Ca

EFECTO DEL EIPA SOBRE LA INCORPORACIÓN DE 45Ca

El bloqueante del transportador Na+/H+, EIPA, provoca aumento en incorporación de 45Ca por el sistema. Esto coincide con un incremento del pH extracelular y de la expresión de los marcadores de transformación osteoblástica Cbfa-1 y ALP.

Curva de incorporación de 45Ca

Western blot de marcadores de transformación osteoblastica

Día

Cbfa-1

ALP

0CONTROL EIPA 10 M

4 8 12 4 8 12

7,42 ± 0,04

7,53 ± 0,03EIPA 10 M

CONTROL *pH EXTRACELULAR

( p<0,05)*

EFECTO DE LA ALDOSTERONA SOBRE LA INCORPORACIÓN DE 45Ca

La aldosterona provoca incremento de captación de 45Ca de forma dosis dependiente (p<0.05 respecto al basal).

*

Medida de la incorporación de 45Ca en presencia de diferentes concentraciones de aldosterona.

CONCLUSIONES

El suero urémico incrementa la calcificación de CMLV en cultivo. Esta calcificación es extracelular y depende de la presencia de hiperfosfatemia.

El aumento de la concentración de bicarbonato y el pH del medio extracelular incrementan la incorporación de 45Ca por las CMLV. Este efecto es potenciado por el suero urémico.

El bloqueo del transportador Na+/H+ por el EIPA y la exposición a aldosterona favorecen el proceso de calcificación vascular.

Los hallazgos referidos son de importancia potencial para el manejo ácido-base y el eje renina-angiotensina-aldosterona en pacientes urémicos con tendencia a la calcificación.