Casa abisrta al fmmoo

UN~ERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA V6NISION DE ClENClAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

SERVICIO SOCIAL

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que el (la): ’ k’k%a t del Departamento de: BIOTECNOLOG¡A de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

DR. FRANCISCO CRUZ SOSA*

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/TITULO: ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO DE CELULAS EN SUSPENSI~N A PARTIR DE CALLO DE COTILEDONES Prosopis laevigafa (mezquite)

’ ALUMNO: MANUEL4 L ó P E VlLLAVlCENClO

/LICENCIATURA: BlOLOG¡A

/PERIODO: 17 DE OCTUBRE DE 1995 - 31 DE OCTUBRE DE 1 9 3

.! Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a los diecinueve días del mes de Noviembre de mil novecientos noventa y seis.

Atentamente, “Casa Abierta al Tiempo”

r t Dr. Tomás Morato Cartagena Secretario Académico Div. CBS

UNIDAD l7TAPALAPA Av. Michoadn y La Purísima Iztapalapa 09340 México, D.F. A.P. 55-535 Fax: (5) 612-80-83 Tels. 724-46-81 y 85

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ESTABLECIMIENTO DE UW CULTIVO DE CÉLULAS EN SUSPENSIbN

A PARTW DE UN CALLO DE COTDLEDONES DE

Prosopis l a m i g a (maquite).

INTRBDU,TCI~N Y ANTECEDENTES:

El mezquite es un planta originaria de México distribuida en las regiones

áridas y semiáridas de Norte, Centro y Sudamérica. En México es abundante en los estados

del. norte y centro del país, asi como en las planicies costeras, en donde se establecen en

condiciones áridas y semiáridas (Maldonado, 1990).

Hoy en día en México, esta planta que pertenece a la familia de las leguminosas, es

considerada como maleza indeseable y es combatida en algunas regiones debido a que se le

atribuye una gran agresividad jr competencia con especies forrajeras. Sin embargo el

mezquite es una planta que desde la antiguedad constituyó una fuente de obtención de

diversos productos para los pobladores de las zonas áridas de México y Norte América.

Actualmente se sigue utilizündo este recurso pero a escala reducida, con la nadera pueden

fabricarc:: Fortss, durmirntes, herramientric, muebles, etc. (Meyer y Felker, 1989). La

corteza de la raíz se ha utilizado en cocción para curar heridas y como vomitivo y purgante.

El jugo de las hojas es también medicinal y se utiliza en padecimientos oculares. (Anónimo,

1976)

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Del tronco del mezquite se puede obtener una resina exudada con caractensticas

similares a la goma arábiga empleada para obtener mucílago y para la fabricación de dulces.

Sus flores son frecuentadas por una gran cantidad de abejas y avispas productoras de miel de

alta calidad, las semillas constituyen un alimento importante para la fauna local como aves y

ínicromamiferos. El fruto jugó un importante papel en la alimentación de algunos pueblos

indígenas donde era utilizado para la preparación de harinas y atoles (Anónimo, 1976).

El mezquite tiene una enorme importancia en e! equilibrio de los ecosistemas

desérticos de nuestro ?Us, las raíces profundas de esta planta ayudan a la conservación de

10s nive!es de agua del subsuelo además de que aporta componentes nitrogenados io que

eleva la calidad de la tierra y de los cuittvos alternativos,

A p a r de fa evidente importancia del mezquite. Este está siendo sometido a !a ids

indiscriminada de los bosques para su utilización como carbón o para uso agícola del suelo,

por lo que PS aecesario desarrollar un plan de reforestación basado en los métodos

tradiciodes de cultivo y en el empleo de !a biotzcnoiogia para la propagación de individuos

sobrepductores de goma o de rápido crecimiento.

El término de cultivo de tejidos vegetales se refiere al cultivo in vitro de

todas las partes de la planta (células aisladas, tejidos y órganos) b2jo condiciones asépticas y

cvntroiadas. E1 :u!tivo di rcjidcs vz;%ilec se utiliza a menudo como un sistema inodrlo

para el estudio de aspectos fisiológicos, bioquímicos, ge-giicos y estmcturales de las

plantas. Estas técnicas of?ecen también un gran potencial como vías de propagación

vegetativa de cultivos económicamente importantes (Torres, 1989).

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Estas técnicas, como puede verse, otorgan diversas ventajas de las cuales destacan en

primer término, el gran número de plántulas que pueden ser obtenidas a partir de un solo

explante, además de que a partir de esta técnica pueden ser obtenidas plantas con un

incremento en su productividad o bien resistentes a enfermedades, plagas, herbicidas y en

general a diferentes condiciones de estrés medioambiental. La micropropagación permite

también el trabajo con una especie durante todo el año e independientemente de las

condiciones medioambientales, si se cuenta con un número adecuado de plantas madre

(Evans y Flick, 1981) (Gautheret, 1985) (Robert y Loyola, 1985) (Ochoa, 1985).

Ei éxito en los cuitivos vegetales está determinado por la composición quimica de los

medios de cultivo utilizados, estos pueden estar constituidos por los siguientes

componentes:

- Sales inorgánicas (macro y micronutrientes)

- Vitaminas

- Reguladores del crecimiento vegetal

- Aminoácidos

- Carbohidratos

- Agua

- Agentes solidificantes

- Suplementos no definidos

(López, 1985)

Los cultivos vegetales pueden, a su vez, subdividirse en términos más específicos

para diferenciarlos:

* Cultivo de la planta: Se refiere a el cultivo de germinados o de plantas mayores

* Cultivo de embriones: Es el cultivo de embriones maduros o inmaduros aislados

* Cultivo de órganos: Cultivo de órganos de la planta de forma aislada

* Cultivo de callo. Cultivos de tejidos obtenidos por explantes de órganos

* Cultivo en suspensión y de células: Se refiere al cultivo de algunas células aisladas o

pequeñas agrupaciones celulares en un medio líquido

* Cultivo de protoplastos

:@ Cultivo de células hapioides. Aquí entran cé!ulas maduras o inmaduras como los granos de

polen.

(Torres, 1989)

E l h e r o de etapas en las que puede dividirse en general la micropropagación son

las siguientes:

- Fase 0. Selección de la planta madre

- Fme 1: Establecimiento del cultivo aséptico

- Fase 2: Multiplicación de brotes

- Fase 3: Enraizamiento (in vitro, in vivo)

- Fase 4: Transferencia a suelo y aclimatación (invernadero o Vivero)

(Debergh y Maene, 1981)

Estas son las fases que idealmente debería presentar un traba-io de micropropagación,

sin embargo cada UM de estas etapas presenta diversos problemas tales como la

contaminación, oxidación vitrificación entre otros, que limitan su aplicación a escala

comercial, de manera que para solucionarse deben de buscarse formas de trabajo que

aborden los mismos de forma integral.

JUSTIFICACI~N:

- El empleo de diferentes técnicas de cultivo de tejidos vegetales para la propagación

masiva de diferentes especies con interés comercial. biotecnológico y ecológico, toma cada

día más fuerza debido a las ventajas que okecen estas metodologías con respecto a :as

convencionales. Algunas de las razones que nos llevan a querer implementar estas técnicas

en un árbol como P. h ~ i g a t a con las siguientes:

a) Todas las partes constituyentes de los árboles de mezquite (madera, flores, semillas,

raíces, etc.) tienen un uso generalizado, esto lo convierte en un recurso natural muy

importante (medicinal, combustible, artesanal, alimenticio, etc ).

b) 2 e los idcales de xezquite se obtkne una resina o exudado muy semejante a !a goma

arábig% de ahí que sea factible su utilización en la industria alimentaria como un sustituto de

menor costo

c) El mezquite juega también, un importante papel ecológico en los desiertos mexicanos; sus

raíces profundas contribuyen en la conservación dei suelo y del agua, además que por ser

una leguminosa contribuye a nitrogenar el suelo. El cultivo de tejidos vegetales podria

considerarse como una alternativa de reforestación que contrarrestre la tala indiscriminada

de este recurso.

d) El cultivo de tejidos vegetales hace posible disponer de sistemas experimentales

reproducibles y cuantificables, lo que simplifica la experimentación en todas las áreas de la

fisiología vegetal.

METODOLOG&:

- Etapa 1. Obtención de las s e d a s en el campo (San Luis Potosí) y de material colectado.

- Etapa 2. Limpieza de las semillas (extracción de la vaina, desinfección y desidestación).

- Etapa 3. Siembra in vitro de las semillas en medio sólido (agar 8 g&) sin reguladores del

crecimiento vegetal.

- Etapa 4. Inducción de cdlo en medio B5 suplementado con 3% de sacarosa, 1.6 gk de

glutamha, 100 m g L de ácido ascórbico, 50 m& de ácido cítrico y de acuerdo con las

siguientes combinaciones de auxinas: icido naftalenacético (ANA), ácido indolacético

(AIA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido indolbutírico (AB) y citocinina:

benciiaminopurina (Bhp), utilizando como explantes cotiledón de Prosopzs laevzgata (tabla

1).

Tabla 1. Combinaciones de auxinas y BAP para la obtención de callo:

ANA A M 2,4-D AIB (1.0mgíL) ( l.Omg/L) ( 1.0rngLL) ( 1 .O m a )

BAP A1.22.4.5 Bi,2.3,4,5 c1.2,3,4,5 D1.2,3,4,5

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~ .. En total serian 4 tratamientos (A, B, C, D) a 5 diferentes periodos de tiempo ( I , 2, 3,

4, 5 días) lo que nos da un total de 20 experimentos. Cada tratamiento se hará por duplicado

en series de IO fiascos por tratamiento. Posteriomente se resembrarán los callos generados

(subcultivos cada 15 días) para de esta manera obtener UM cantidad considerable de

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i~iomasa para dar inicio a .diferentes cultivos en suspensión, en el tratamiento que más *__

-. convenga para este fin. ._ .

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AC'FADADES REALIZADAS:

Se realizó todo el proceso de cultivo de tejidos a partir de cotiledones de xzquite,

lo que implicó desde la recolección de las semillas en el campo, su limpieza y desinfección

hasta la resiembra del callo producido a partir de los cotiledones. Durante la época en que

no habían semillas disponibles de esta planta, se trabajó con tres plantas alternativas: plátano,

violetas africanas y orquídeas. En estos tres casos no fue necesario cultivar la planta a partir

de semillas ya que se tenían plántulas bien Zesarrolladas in vitro, de manen que sólo se

replantaron porciones de las plantas madres, para 10 cual se prepararon medios diferentes de

acuerdo al tipo de cultivo del que se tratara, para las violetas africanas y el platanu, el medio

fue muy similar al utilizado para el cultivo de cotiledones de mezquite (medio 35, vet

metodología) auncpe en este caso no se agrzgó glutaminn ni .mtioxidantes (ácido ascórbico

y ácido cítrico). En el caso de las orquídeas se utilizó un medio especial para este tipo de

plantas, medio Knudson, el cual lleva además extracto se60 de plátano. Las plántulas de

plátano, una vez que hubieron alcanzado un tamaño importante, transferidas a condiciones

de invernadero (suelo).

-Lugar de Realización:

Todo este proyecto se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal y

Fitoquímica (S- 153). Departamento de Biotecnología UAM Iztapahpa.

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS:

Los objetivos de este trabajo contemplaban originalmente sólo la utilización

de una planta, el mezquite; sin embargo y como resultado de la falta de material, se tuvo que

recurrir a otras plantas, lo que permitió conocer algunas de las diferencias en el proceso de

cultivo de tejidos vegetales, se :ealizaron diferentes medios de cultivo y se siguieron

diferentes procedimientos de siembra, ye que los objetivos eran diferentes; en el caso del

mezquite, se buscaba obtener callo o proliferación celular, mientras que para los tres tipos de

?!antes restantes, la intención era propagarlas vegetativamente a partir de una planta madre y

ilevarlas de un medio de cuitivo a suelo.

RESULTADQS Y CQNCLUSIONES:

En el caso del mezquite los resultados fueron los siguientes:

- No se cncontraron diferenciic si&ca:ivas on !as combinaciones de a?cUnas y BAP (ver

tabla ij, 2s decir la cantidad de callo obtenida ?ara los 5 tipos de medio (4 combinaciones y

un testigo) fue muy similar.

- 5 n la última repetición realizada que consistía en 10 frascos para cada combinación y para

el testigo (50 frascos totales), el porcentaje de contaminación fue muy bajo, sin embargo no

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fue posible obtener callo de ninguno de los frascos ya que en todos se presentó una

oxidación del tejido.

- El porcentaje de germinación aumentó considerablemente en las Últimas etapas. pasó de un

50% aprox. a casi un go%, esto como resultado de hacer pequeños cortes sobre la cubierta

de la semilla para facilitar la entrada de agua a la misma.

- El grado de contaminación fue mucho mayor cuando ia siembra se realizó en frasco, a

diferencia de la siembra en tubo de ensayo.

- La cantidad de cailo producida resultó considerablemente mayor cuando la siembra de

cotiledones se daba en tubo en lugar de en frasco.

Los resultados del trabajo de las tres plantas restantes heron los siguientes:

- El porcentaje de contaminación fue mínimo, aproximadamente un lo%, el cud en la

mayoría de ios casos se registró como una contaminación aislada que no interfena con el

crecimiento normal de la planta.

- El :CO% de las plantas creció de manera normal, formó raíces y no presentó problemas de

oxidación.

- En ei caso concreto de la planta de plátano que se repiantó directamente en suelo, en un

principio creció con fuerza y sanamente, sin embargo después de aproximadamente un mes

en estas condiciones sufrió una plaga que destruyó al 90?6 de las plántulas.

Las conclusiones de este trabajo nos muestran que aunque aparentemente no existe

diferencia en ninguno de los reguladores del crecimiento vegetal en relación con el

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favorecimiento de la formación de callo, no podemos decir que esto sea absoluto. Las

concentraciones utilizadas fueron muy bajas (1.0 mgL), y aunque las células vegetales

responden a concentraciones de órdenes muy pequeños, probablemente para encontrar

resultados que sean significativos deban utilizarse concentraciones mayores. El crecimiento

de las células, aunque también obedece en gran medida de la presencia de reguladores, no

depende exclusivamente de esto, muchos otros factores como son la humedad, luz o

temperatura inciden sobre la división celular, por lo que estos factores deben estar muy bien

controlados para que los resultados sean válidos. Aunque las cantidades de antioxidantes

que se agregaron al medio de cultivo estuvieron de acuerdo a lo dictado por la literatura, es

evidente que hay contradicciones, ese fue uno de los mayores problemas de los cultivos de

mezquite, un buen número de muestras se oxidaban, por lo que si a esto se le suma la

contaminación natural que existe cuando se trabaja en este campo, quedan muy pocas

mestras en buen estado para hacer comparaciones; tanto la contaminación como la

oxidación deben de reducirse al m b o , como la contaminación muchas veces está fuera de

nuestras manos, 2s imprescindible que se reconsideren nuevamente las cantidades, tipo y uso

de los antioxidantes.

En el caso concreto de las plántulas de plátano, todo el desarrollo que precedió a la

siembra en suelo fue rápido y normal, el problema se tuvo cuando se hizo el transplante a

tierra (aunque también en un principio esto no presentó problemas), en este caso,

probablemente las plántulas aunque ya estaban bastante crecidas, no se encontraban lo

suficientemente fuertes como para desarrollarse correctamente en condiciones ambientales,

por lo que fueron poco capaces de defenderse ante agentes dañinos.

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RECDME"ES:

- Como ya se dijo, resulta mejor la siembra en tubo de ensayo que en frasco, no solo porque

la contaminación es menor y el desarrollo de callo más evidente, si no porque además las

cantidades de material utilizadas para los tubos son mucho menores en comparación a los

Zascos, además de que el manrjo de los mismos iesulta más fácil.

- Las s e d a s germinaron mucho mejor cuando se realizó un pequeño corte que tan sólo

levante la testa y permita la entrada de agua y la hidratación; este corte debe hacerse en el

extremo opuesto a la región donde se encuentra el embrión pzra evitar dañarlo

- La germinación puede hacerse en medio de cultivo, sin embargo se vieron mejores

resultados si este proceso se llevaba a cabo directamente en agua o sobre algún sustrato

húmedo como algodón o gasa, lo además reduce los costos del proceso.

- Otro de los grandes problemas que se tuvieron, fue el referente a las semillas. Como estas

no están disponibles durante todo el año, era preciso recolectar grandes cantidades y

almacenarlas para ir tomando las necesarias, sin embargo durante el tiempo en que el

material se encontraba almacenado, d a la mayor infestsrción por insectos que se

reproducían rápidamente y acabando en poco tiempo con !a mayor parte del material, para

evitar esto es necemio que una vez que se han recolectado las semillas y antes de que se

almacenen sean tratadas con productos insecticidas para eliminar tanto a los insectcs

existentes como a las larvas y huevos de los mismos.

- En cuanto a los tratamientos resulta mucho mejor hacerlos por partes, es decir se deben

preparar como mucho dos tipos de medios con diferentes reguladores, el tratar de hacer

.- pocas cantidades de los 5 tipos de tratamientos (A. B, C, D y testigo) (ver tabla I), complica

enormemente las cosas porque se trabaja con mucho material diferente, lo que puede llevar a

grandes confusiones. El único problema en trabajar cada medio por separado es el referente

a la edad de los cotiiedones, ya que esto debe ser considerado y en cada uno de los

tratamientos sembrar cotiiedones de la misma edad para no obtener resultados erróneos

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