PRÁCTICA 10: AISLAMIENTO DE SALMONELLA Epidemiológicamente unos pocos serotipos de Salmonella tienen huésped específico siendo la mayoría inespecíficos, en cuanto a especie animal que potencialmente pueden afectar. Las fuentes de contaminación son muy amplias y las especificaciones en Microbiología de Alimentos exigen ausencia de cualquier serotipo de Salmonella en 25 o 50 g de muestra. El aislamiento de Salmonella a partir de alimentos se hace difícil por dos factores: La población de Salmonella frente a la flora competitiva es muy baja y porque muchos alimentos han sido sometidos a procesos que destruyen parte de la flora microbiana, quedando los que sobreviven muy debilitados. La metodología para el aislamiento e identificación de Salmonella comprende 5 pasos: Preenriquecimiento en medio no selectivo Enriquecimiento selectivo Siembra en medios selectivos Pruebas bioquímicas Pruebas serológicas Materiales þ Recipiente estériles, boca ancha, de 500 ml con 225 ml de Caldo BHI o Caldo Tripticase Soya

þ Incubadora a 35°C 1 °C þ Baño de agua a 45°C þ Pipetas estériles de 1 ml þ Asa bacteriológica þ Tubos serológicos 10 x 75 mm þ Portaobjetos þ Tubos con 10 ml de Caldo Tetrationato o Caldo Rappaport þ Tubos con 10 ml de Caldo Selenite Cistina þ Cajas con Agar Bilis Verde Brillante þ Cajas con Agar Bismuto Sulfito þ Cajas con Agar Hektoen þ Cajas con Agar XLD þ Tubos con Agar Hierro tres azúcares þ Tubos con Agar Lisina hierro þ Tubos con Caldo o Agar Urea þ Solución salina fisiológica þ Agar Tripticase Soya inclinado þ Antisuero polivalente Procedimiento Pre enriquecimiento no selectivo:

Pesar asépticamente 25 g ó ml de la muestra

Agregar la muestra a 225 ml de Caldo Cerebro Corazón en un recipiente de 500 mL

Incubar a 35 - 37°C durante 2 - 6 horas

Enriquecimiento:

A partir del medio de enriquecimiento

Pipetear 1 mL y sembrar en Caldo Selenite Cistina (incubar a 35°C por 24 h)

Pipetear 1 mL y sembrar en Caldo Tetrationato (blanco lechoso) o Caldo Rappaport (incubar a 43°C por 24 h)

3. Siembra en Medios Selectivos: De cada uno de los medios de enriquecimiento selectivo sembrar con asa en:

Agar Bismuto Sulfito

Agar Bilis Verde Brillante

Agar Hektoen o Agar XLD

Incubar las cajas a 35°C por 24 horas. Si en Agar Bismuto Sulfito no aparecen colonias sospechosas, reincubar por 24 horas más

Interpretación de las colonias: Agar Bismuto Sulfito Colonias Microorganismos Centro negro, precipitado negro y con Salmonella (Excepto S. paratyphi y con brillo metálico S. pullorum) Pequeñas con color verde a pardo Coliformes, Proteus (Solo presentes ocasionalmente) Agar XLD Colonias Microorganismos Amarillas, opacas halo de precipitado E. coli, Enterobacter, Aeromonas Amarillas, mucosas, halo de precipitado Klebsiella Amarillas opacas, a veces con centro negro Citrobacter Amarillas con halo amarillo Serratia, Hafnia Amarillas, transparentes con centro negro Proteus Rojizas a veces con centro negro Salmonella Anaranjadas opacas Salmonella typhi Rojizas transparentes Shigella, Providencia

Agar Hektoen Colonias Microorganismos Verde húmeda, plana transparente Shigella, Providencia Azul verdosa con centro negro Salmonella Azul verdosa sin centro negro Proteus Azulada plana borde irregular Pseudomonas Color salmón, con halo de precipitación Coliformes Agar Bilis Verde Brillante Colonias Microorganismos Rojas con halo rojo Salmonella Proteus Amarillas con halo amarillo E. coli, Enterobacter, Citrobacter,

Klebsiella

Pruebas Bioquímicas:

Seleccionar 2 o más colonias sospechosas de cada uno de los medios selectivos

Inocular cada colonia en tubos con Agar hierro tres azúcares y Agar Lisina hierro y Agar Urea, en el fondo y en la superficie. Después de sembrar el primer tubo inocular el segundo sin flamear el asa

Incubar los tubos de 35°C durante 24 horas. Los cultivos sospechosos de en Agar hierro tres azúcares muestran el fondo amarillo (formación de ácido) y la superficie inclinada rojo. Con o sin producción de H2S (ennegrecimiento del medio). En Agar Lisina hierro muestran una reacción alcalina (púrpura) del medio resultante de la descarboxilación de la lisina con o sin H2S. En Agar Urea no se produce cambio de color en el medio.

Si es necesario realizar las pruebas bioquímicas que se indican en la tabla. Pruebas Serológicas: Prueba para antígeno somático, polivalente O

Diluir y chequear el antisuero con cultivos conocidos

Marcar 2 secciones de 1 x 2 cm en un portaobjetos

Colocar una asada de cultivo de 24 horas de Agar Nutritivo o Agar Hierro tres azúcares en la sección marcada

Agregar una gota de solución salina fisiológica a cada sección

Mezclar con asa limpia

Agregar una gota de antisuero polivalente o a una sección y mezclar

Agitar el portaobjetos por 1 minuto

Observar sobre fondo oscuro Interpretar:

Positivo: Cuando se presenta aglutinación en la mezcla cultivo salina suero y no aglutinación en la mezcla cultivo salina. Negativo: Cuando no hay aglutinación en la mezcla cultivo salina suero. Estos cultivos deben probarse con el antisuero polivalente H Inespecífico: Cuando las dos mezclas aglutinan. En este caso se requieren pruebas adicionales Interpretación: Las cepas que muestran pruebas bioquímicas típicas y dan reacciones serológicas positivas se

consideran como Salmonella especies.

1. Las cepas que muestran pruebas bioquímicas típicas pero no dan reacciones serológicas y las cepas que no muestran reacciones bioquímicas típicas pero dan reacciones serológicas positivas pueden ser Salmonella

2. Las cepas que no muestran reacciones bioquímicas típicas ni dan reacciones serológicas

positivas no se consideran Salmonella. Las cepas aisladas en los casos 1 y 2 deben ser enviadas en Agar Cerebro Corazón inclinado en tubo de tapa rosca a un Centro de referencia, adjuntando la información pertinente. Expresión de resultados: Si no se aisló Salmonella en los medios de enriquecimiento y selectivos reportar:

No se aisló Salmonella en 25 g o 50 g de la muestra examinada.

Si se encuentra Salmonella a partir de uno o los 2 caldos de enriquecimiento selectivo reportar: Se aisló Salmonella en 25 g de la muestra examinada.

Reacción Porcentaje de Serotipos que producen la Reacción

Agar Hierro tres azúcares: glucosa, con formación de ácido glucosa, con formación de gas lactosa sacarosa H2S

+ + -* - +

100 91.9 99.2 99.5 91.6

Urea - 100

Lisina + 94.6

galactosidasa -* 98.5

Indol - 98.9

* Salmonella: subgénero III (Arizona) puede presentar reacciones positivas.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA SALMONELLA

PRUEBA

MEDIOS DE CULTIVO Y/O REACTIVOS

SIEMBRA

INTERPRETACION

Oxidasa A. Nutritivo + Discos de Oxidasa

Colocar 1 colonia sobre la zona reactiva de la tira

A los 20-60 segundos comparar con escala de colores Positivo: Azul o violeta

Indol Agua de Triptona +Reactivo de Kovacs

Siembra ligera Incubar 18-24 horas

Agregar 0.3-0.5 mL de Reac. de Kovac Positivo: coloración rosada

Rojo de Metilo Caldo MR VP + Sol Rojo de Metilo

Siembra ligera Incubar 48 horas

Agregar 4-6 gotas de rojo de metilo Positivo: color rojo

Voges Proskauer Caldo MR VP +

naftol y KOH

Separa 1 mL del cultivo en caldo MRVP antes de hacer la prueba

Agregar 0.6 mL de naftol y 0.2 mL de KOH. Agitar y dejar reposar hasta 2 horas Positivo: Coloración rojiza

Citrato Agar Citrato de Simonns Sembrar en estrías Incubar 24 horas

Positivo: Crecimiento en la superficie y cambio de color a azul

Malonato Caldo malonato

Incubar 24-48 horas Positivo: cambio de color a azul

Fenilalanina Fenilalanina Incubar 24-48 horas Agregar HCl 0.1N hasta amarillo. Agregar 3-4 gotas de Cloruro férrico al 10% Positivo: verde en 2-3 minutos

Galactosidasa 0.25 mL de Solución salina fisiológica

Siembra densa + 1 gota de tolueno Incubar 2-5 minutos a 37°C

Agregar 0.25 mL de Reactivo de ONPG Positivo: coloración amarilla a los 20 minutos en baño Esperar hasta 3 horas reacción lenta

Fuente: Gaviria, Blanca C., Manual de Prácticas de Microbiología de Alimentos, 1997, Bogotá, Colombia, Carrera de Bacteriología PUJ.