Aislamiento de cepas de Rhizobium spp., asociados a dos leguminosas forrajeras. Artículo Original

51 Revista Colombiana de Microbiología Tropical. Vol. 2 N° 2. Enero – Junio 2012.

Aislamiento de cepas de Rhizobium spp., asociados a dos leguminosas forrajeras en el Centro Biotecnológico del Caribe

Isolation of Rhizobium spp., associated two forage leguminous in the Caribbean Biotechnological Center

Jorge L. Hernández1, Juan G. Cubillos-Hinojosa2*, Pablo E. Milian3

RESUMEN El propósito de esta investigación fue aislar cepas nativas de Rhizobium spp., a partir de nódulos de las plantas leguminosas forrajeras, Leucaena (Leucaena leucocephala) y Matarratón (Gliricidia sepium) en cultivos establecidos en el Centro Biotecnológico del Caribe, ubicado en el valle del Cesar, Colombia. Los nódulos obtenidos se llevaron al laboratorio y se sembraron en Levadura Manitol Agar (YMA). Se realizaron pruebas de identificación fisiológica en YMA + Azul de Bromotimol (AB), YMA + Rojo Congo, Peptona Glucosa Agar (PGA) + Purpura de Bromocresol, prueba de cetolactasa en Levadura Lactosa Agar (LLA), tinción de Gram, y pruebas de crecimiento en agar XLD y Hektoen. Se aislaron 22 cepas nativas de Rhizobium spp., 11 a partir de L. leucocephala y 11 a partir G. sepium. Las cepas seleccionadas se sometieron a pruebas de tolerancia como pH, temperatura, concentración de NaCl y antibióticos. Se observaron bacilos cortos móviles gram negativos, con reacción acida en el medio YMA + AB. Algunas cepas, no toleraron las sales biliares presentes en agar XLD y en agar Hektoen. Las pruebas de tolerancia a factores abióticos demostraron mejor crecimiento en pH entre 9.0 y 11, entre 30 y 37°C, y crecimiento moderado en concentraciones de NaCl 1% y 2%, todas las cepas presentaron resistencia al cloranfenicol. Estos resultados afianzan la posibilidad de establecer estudios que permitan evaluar en una etapa de invernadero y campo el potencial de fijación de nitrógeno y promoción de crecimiento en plantas leguminosas utilizadas como forraje para ganado bovino. Palabras clave: cepas nativas, Leucaena leucocephala, Gliricidia sepium, nódulos, Rhizobium spp.

ABSTRACT

The purpose of this research was to isolate native strains of Rhizobium spp. from nodules of

leguminous forage leucaena (Leucaena leucocephala) and matarratón (Gliricidia sepium) in

1. Microbiólogo Agroindustrial. Universidad Popular del César, Balneario Hurtado vía a Patillal. Valledupar, Colombia. 2. Microbiólogo Agroindustrial. Instructor SENA Distrito Capital. Carrera 30 No. 14- 53, Complejo Paloquemao, Bogotá. Colombia. <jcubillosh@misena.edu.co> 3. Microbiólogo Agroindustrial. Proambiente S.A.S. Carrera 60 No. 70 – 31. Barranquilla, Colombia.

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crops grown in the Caribbean Biotechnology Center, located in the valley of Cesar, Colombia.

The nodules obtained were taken to the lab and grown in Yeast Mannitol Agar (YMA).

Identification tests were conducted physiological YMA + bromthymol blue (AB), YMA + Congo

Red, Glucose Peptone Agar (GPA) + bromocresol purple, evidence in Yeast Lactose Agar

cetolactasa (ALL), Gram staining and tests XLD agar growth and Hektoen. We isolated 22

native strains of Rhizobium spp., 11 from L. leucocephala and 11 from G. sepium. The selected

strains were tested for tolerance as pH, temperature, concentration of NaCl and antibiotics.

There were gram-negative bacilli mobile short, with acid reaction in YMA + AB. Some strains,

did not tolerate the bile salts present in XLD agar and Hektoen agar. Evidence of tolerance to

abiotic factors showed better growth at pH between 9.0 and 11 at temperatures between 30

and 37 ° C, and moderate growth in NaCl concentrations of 1% and 2%, all strains were

resistant to chloramphenicol. These results entrench the possibility of studies to evaluate in a

greenhouse and field phase of the potential for nitrogen fixation and growth promotion of

leguminous plants used as fodder for cattle.

Keywords: native strains, Leucaena leucocephala, Gliricidia sepium, nodules, Rhizobium sp.

1. INTRODUCCIÓN El género Rhizobium sp., hace parte del reino de las Proteobacteria, pertenece al orden Rhizobiaceae, y a la subdivisión α-Proteobacterias, los cuales se caracterizan por fijar nitrógeno atmosférico, se asocia simbióticamente con las plantas, específicamente aquellas perteneciente al grupo de las leguminosas; dentro de este orden también se ubica el género Agrobacterium, una eubacteria gram negativa aerobia, que se diferencia del género Rhizobium en que no estimula la formación de nódulos de la raíz ni la fijación de nitrógeno (Atlas & Bartha, 2005; Kuykendall et al., 2005). Las bacterias pertenecientes al género Rhizobium son bacilos móviles gram negativo miden de 0.5 a 0.9 por 1.2 a 3.0 µm, y a menudo contiene gránulos de β-hidroxibutirato y son pleomorfos en situaciones adversas. Es considerado un habitante prominente de la rizosfera. (Kuykendall et al., 2005; Ferrera y Alarcón,

2007). Rhizobium sp infecta y forma nódulos en huéspedes específicos, porque la bacteria contiene un plásmido grande que codifica la información que no se utiliza cuando crece en el suelo como organismo de vida libre, pero por otra parte es vital para infectar a la planta huésped susceptible (Rincón et al., 2000; Atlas & Bartha, 2005). Es por esto que en la simbiosis Rhizobium-leguminosa, resulta una interacción muy específica entre la bacteria y la planta. La formación del nódulo es un proceso inducido por un intercambio de señales entre los dos participantes de la interacción; sustancias con efecto mitógeno (factores de nodulación) son sintetizados por los genes de nodulación del microsimbionte (genes nod), en respuestas a la excreción por la planta de sustancias de tipo flavonoide. Los genes codificados por plásmidos influyen también en la variedad de plantas huéspedes en las que Rhizobium sp., puede formar nódulos (Atlas & Bartha, 2005; Marco et al., 2009). Algunas de las leguminosas capaces de asociarse con Rhizobium sp son por ejemplo, judías, tréboles, alfalfa, guisantes, entre otras. Estas plantas poseen en sus raíces pequeños

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engrosamientos llamados nódulos que contienen internamente bacteroides o rizobios, conocidos también como organismos infectivos de raíces. Durante esta simbiosis, la planta suministra nutrientes y protección a los rizobios a cambio de nitrógeno atmosférico fijado (Atlas & Bartha, 2005). Las leguminosas revisten especial importancia en la agricultura, debido que contribuyen a aumentar la fertilidad de los suelos a través de la fijación de nitrógeno; se estima que la simbiosis Rhizobium-leguminosa puede fijar de 24 hasta más de 584 kg de nitrógeno/ha y abastecer en algunos casos hasta 90% de las necesidades de las plantas (Ferrera y Alarcón, 2007; Mayz et al., 2010; Lindström et al., 2010). Para lograr un aislamiento efectivo de cepas nativas de Rhizobium spp., se recomienda realizar extracción directa de los nódulos de las plantas en estudio, ya que se puede obtener un aislado de altas proporciones. Para ello, es necesaria la utilización de medios de cultivos específicos que faciliten la diferenciación bioquímica de las especies de acuerdo con sus componentes. Entre los más conocidos y utilizados se encuentran: Levadura Manitol Agar (YMA), agar XLD y Hektoen, específicos para determinar crecimiento de bacterias Gram negativas YMA con Rojo Congo, permite diferenciar de Agrobacterium sp., que absorbe el colorante, comportamiento que no es evidenciado por Rhizobium sp., también, evaluación de crecimiento en LLA, con producción de cetolactosa (; Kuykendall, 2005; Küçük, Ç. Y M. Kivanç, 2008; Pérez et al., 2008). De acuerdo con lo anterior el propósito de esta investigación consistió en el aislar cepas nativas de Rhizobium spp., a partir de nódulos de Leucaena (Leucaena leucocephala) y Matarratón (Gliricidia sepium), con potencial biopromotor de leguminosas forrajeras utilizadas para la alimentación bovina.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo de nódulos El muestreo se realizó en el Centro Biotecnológico del Caribe ubicado en el valle del Cesar, en el Km 7 vía la Paz, Valledupar Colombia, que cuenta con un área aproximada de 1’005.000 m2, equivalente a 100,5 ha, de las cuales existen 3.584 m2, es decir, aproximadamente 0,4 ha plantadas con G. sepium, distribuidos en tres lotes de la siguiente manera: el primero es de 392 m2; el segundo de 1.596 m2, y el tercero de 1.596 m2. Las plantas de L. leucocephala actualmente se encuentran distribuidas en todo el área del centro; es decir, no existe un cultivo establecido. Prospección de nódulos. Se recolectaron nódulos a partir de Matarratón (G. sepium) y Leucaena (L. leucocephala), durante periodo de lluvia comprendido entre los meses de septiembre y octubre del año 2009. Esto facilitó la extracción del sistema radicular sin ocasionar daños mecánicos, obteniendo de esta manera una muestra representativa de nódulos. Para el muestreo de G. sepium, se seleccionaron plantas jóvenes y vigorosas, para lo cual se realizó un muestreo aleatorio simple en X, en cada lote cultivado. Se tomaron 3 plantas por cada punto, para un total de 15 plantas por lote. Para L. leucocephala se seleccionaron plantas jóvenes en estado de floración. El muestreo se realizó en forma estratificada. Se dividió la población en 5 puntos; se realizo un muestreo aleatorio simple en Zig-zag, tomando, 8 plantas/punto. Para un total de 40 plantas de L. leucocephala y 45 de G. sepium. Se realizó el conteo de nódulos y se evaluó la nodulación según la estructura, la abundancia, el tamaño, el color interno y la nodulación en la raíz principal (Salazar et al., 2001; López, 2005; Martínez, 2005; Westermeyer, 2006). Los nódulos

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seleccionados se empacaron en bolsas de polietileno con cierre hermético y se transportaron a temperatura ambiente (Jiménez, 2007; Peña & Reyes, 2007) hasta el Laboratorio de Microbiología del CBC. Procesamiento de los nódulos. Los nódulos se desinfectaron por inmersión sucesiva en alcohol al 70% por un minuto e hipoclorito de sodio al 2,5% durante cuatro minutos y posterior enjuague con agua destilada estéril (Matos et al., 2007). Se midió la viabilidad del bacteroide en el nódulo, tomando nódulos al azar, que luego se seccionaron, y posteriormente se realizó un extendido en fresco sobre placas porta objeto a las cuales se les aplicó tinción de Gram Matos & Zúñiga, 2002; Ferrera & Alarcón, 2007). Aislamiento primario de Rhizobium spp., a

partir de nódulos de Leucaena y

Matarratón. Los nódulos se seccionaron con

un bisturí estéril, luego transferidos a placas

con Levadura Manitol Agar con Azul de

Bromotimol como indicador (YMA + AB), y se

incubaron a 30ºC, por 7 días hasta observar

crecimiento abundante alrededor de los

nódulos (Mora, 1995; Bécquer et al., 2000;

Rincón et al., 2000; Salazar et al., 2001; Matos

y Zúñiga, 2002; Jiménez, 2007; Pérez et al.,

2008). Para el recuento de las colonias

crecidas y para determinar el porcentaje de

nódulos obtenidos para cada especie de

leguminosa se propuso la siguiente fórmula:

100

Donde: %R = porcentaje de recuperación NNC = número de nódulos con crecimiento TNS = total de nódulos sembrados Aislamiento secundario. Se realizó mediante siembra por agotamiento en cajas estériles con YMA + AB a partir de las

colonias obtenidas en el aislamiento primario. Las cajas fueron incubadas a 30°C por 7 días, se observó el crecimiento, la morfología de las colonias, y de las células por tinción de Gram (Bécquer et al., 2000). Se realizaron observaciones cada dos días repicando las colonias típicas de Rhizobium spp., (Matos et al., 2007). Las cepas que presentaron crecimiento en el segundo aislamiento se codificaron para hacer posible la diferenciación. Identificación de las cepas de Rhizobium sp. Se tomaron las colonias obtenidas en el aislamiento secundario. El criterio para la selección se basó en las características planteadas por Martínez et al., 2005; colonias con reacción ácida en el medio de cultivo YMA + AB y morfología bacilar Gram negativa; luego se realizó siembra por agotamiento en cajas con agar YMA sin Azul de Bromotimol y se incubaron a 30°C durante 7 días. Durante este tiempo se estudió las características de las colonias como forma, tamaño, color, textura y la tasa de crecimiento (Pérez et al., 2008). Este último se realizó midiendo el diámetro de 10 colonias/placa y calculando las medias correspondientes (Bécquer et al., 2000). Para la evaluación se seleccionaron los inóculos acuerdo a las características planteadas por Pérez et al., 2008 y Rojas, 2009. Se evaluó el crecimiento de las cepas en diferentes medios para lograr la caracterización de las cepas (Pérez et al., 2008). Se tomaron inóculos a partir de cada cepa y se realizó siembra por agotamiento en cajas con PGA + PB (Peptona Glucosa Agar + Purpura de Bromocresol), luego se incubaron a temperatura de 30ºC. Los resultados se valoraron acuerdo al crecimiento, como (+) o (-), (Bécquer et al., 2000). La cepas también fueron evaluadas según la metodología planteada por Küçük & Kıvanç, 2008; Rojas et al., 2009, tomando inóculos y realizando siembra por agotamiento en medio YMA + RC (Levadura Manitol Agar + Rojo Congo), la colonias se evaluaron en base a la absorción

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del rojo congo. (Kuykendall et al., 2005; Matos et al., 2007). Por otra parte las cepas se sembraron en cajas con LLA (Levadura Lactosa Agar) y se incubaron a 30ºC durante 3 días; luego se realizaron extendidos y se adicionó reactivo de Benedict; los resultados se valoraron de acuerdo a la producción de cetolactosa, como (+) o (-). (Martínez et al., 2005; Kuykendall et al., 2005; Matos et al., 2007). Evaluación del crecimiento de las cepas en Agar XLD y Hektoen. Se tomaron inóculos, realizando siembra por agotamiento en placas con agar XLD (Xilosa Lactosa Desoxicolato) y Hektoen, para lograr determinar la especificidad de crecimiento de bacterias Gram negativas y posteriormente se realizaron pruebas de motilidad. Tolerancia de las cepas a factores abióticos. Las cepas seleccionadas se evaluaron con respecto a la habilidad para crecer bajo diferentes niveles de pH (4.5; 6.8; 9.0 y 11), concentración de NaCl (0.01%; 1% y 2%) y diferentes temperaturas (4.5°C, 30°C, 37 y 44°C) (Bécquer et al., 2000; Küçük & Kıvanç, 2008; Mouraud et al., 2009). Para la prueba de pH, se ajustó el medio YMA, con NaOH y HCl 1N. Para las concentraciones de NaCl, se prepararon tubos con caldo Levadura-Manitol, incubando a 30ºC por 3 días en ambos casos. Para la prueba de tolerancia a diferentes temperaturas, se realizó siembra por agotamiento en cajas con YMA. Luego fueron incubadas a diferentes temperaturas. Resistencia de las cepas a antibióticos. Las cepas seleccionadas se sometieron a pruebas de resistencia a los antibióticos Tetraciclina (5,0 µg/ml) y Cloranfenicol (10,0 µg/ml) (Küçük & Kıvanç, 2008). Los antibióticos se obtuvieron comercialmente y las soluciones se prepararon con agua destilada estéril. Posteriormente, se adicionó el vial al medio de cultivo YMA y se realizó siembra por

agotamiento. Las placas fueron incubadas a 30°C durante 7 días, se evaluó la formación de colonias; tomando el criterio resistente (+), o no resistente (-) (Bécquer et al., 2000). Conservación de las cepas de Rhizobium sp. Se cultivaron en medio YMA + AB en plano inclinado y en caldo Levadura Manitol. Se incubaron a 30°C por 5 días; luego se llevaron a una nevera a temperatura entre 4 y 5°C (Matos et al., 2007). La prueba de viabilidad se realizó cada 30 días durante 6 meses mediante siembra por agotamiento en placas con YMA.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se obtuvieron 21 plantas noduladas para G. sepium correspondiente al 46.7% del total muestreado. Con respecto a la prospección de nódulos se encontró un total de 599, distribuidos en cada lote: en el primero se tomaron 39; en el segundo, 81; y, en el tercero, 479. Entre tanto para L. leucocephala se obtuvieron 9 plantas noduladas, el 22.5% de las plantas evaluadas. En los puntos uno y dos no se encontraron plantas con nódulos. La prospección de nódulos fue muy escasa en comparación a G. sepium; encontrando sólo 110 nódulos distribuidos en todos los puntos de muestreo. La prospección de nódulos fue mejor en G. sepium, destacándose en los lotes 2 y 3 el mayor número de plantas noduladas. Las raíces mostraron poca nodulación en la raíz principal pero alta en las raíces secundarias, los nódulos presentaron coloración rojiza en su interior; estos últimos resultados también se presentaron en L. leucocephala (Tabla 1). En el caso de L. leucocephala, la explicación a la escasa nodulación en algunos puntos de muestreo puede deberse a que no existe un cultivo constante que permita establecer especies de rizobios específicos que la nodulen. Según lo propuesto por Rincón et al,

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2000; Ferrera & Alarcón, 2007, ésta planta presenta alta especificidad en sus requerimientos de rizobios, ya que no todas las cepas que la nodulan pueden producir una eficiente fijación del nitrógeno atmosférico, esto es un factor limitante para su establecimiento. Prueba de viabilidad del bacteroide en el nódulo. Con la tinción de Gram se constató la viabilidad de los nódulos y además permitió continuar con el proceso de aislamiento (Fig. 1). Ferrera & Alarcón, 2007 afirman que algunos factores ambientales como la temperatura, pH, estrés salinos y la presencia de compuestos fenólicos en extractos de raíces, pueden causar la muerte de los rizobios establecidos en los nódulos de L. leucocephala. Aislamiento primario de rizobios. Los porcentajes de recuperación fueron relativamente satisfactorios para cada especie leguminosa obteniendo 86% en G. sepium, y en L. leucocephala 94 % (Tabla 1). En este primer aislamiento se obtuvo un crecimiento ligeramente moderado de cepas con características fermentativas en el medio de cultivo YMA + AB (Fig. 2). A partir de aquí se seleccionaron las cepas que presentaron reacción ácida en el medio. Aislamiento secundario de rizobios. Las cepas seleccionadas presentaron características propias de rizobios. Las colonias observadas fueron convexas con bordes regulares, de color lechoso y consistencia gelatinosa, algunas de ellas con abundante goma. (Bécquer et al, 2000). Así mismo se observó mediante la tinción de Gram, bacilos Gram negativos, finos no esporulados. (Salazar et al., 2001). Se observó en general, crecimiento lento, encontrando crecimiento a los 3 días de incubación con colonias de menos de 2mm de diámetro, con producción de ácido (Fig. 3). Por ello se agruparon en grupos correspondientes a cada leguminosa.

Test fisiológico y bioquímico. Para la selección de las colonias, un elemento esencial fue la falta de absorción del colorante rojo congo en el medio YMA + RC. Por lo general, las colonias de Rhizobium sp se observan blancas o rosadas, debido a que no absorben el colorante; sin embargo Rojas et al., 2009, señala que toman color rojo intenso luego de 8 días de incubación; evento que se registró al realizar las caracterizaciones bioquímicas. La absorción de rojo congo es característico del género Agrobacterium sp., a diferencia de Rhizobium sp., que no absorbe (Kuykendall et al., 2005). Como resultado se aislaron 22 cepas en total: 11 procedentes de G. sepium, y 11 de L. leucocephala. De todas las cepas sembradas en el medio mínimo PGA + PB se descartaron cuatro aisladas a partir de G. sepium, y dos de L. leucocephala; debido a que presentaron un elevado crecimiento y poca producción de acido (Tabla 2). De acuerdo a lo planteado por Matos et al, 2007, la fermentación de la glucosa en un medio mínimo carente de minerales no es típica para el género Rhizobium sp, por lo que no se tuvieron en cuenta. La reacción a la tinción de Gram permitió observar bacilos Gram negativos; sin embargo, al realizar los ensayos de crecimiento en agar XLD y Hektoen, algunas cepas no crecieron; este comportamiento se debe a que algunas especies de Rhizobium no toleran la presencia de sales biliares, Rincón et al., 2000. Las pruebas de tolerancias a factores abióticos como el pH demostraron que la totalidad de las cepas de G. sepium y L. leucocephala crecieron en pH 9.0 y 10, lo que puede estar vinculado a las exigencias del microorganismo al adaptarse a condiciones adversas de su microhábitad. Resultados similares fueron reportados por Bécquer et al., 2000. Se encontró que las cepas presentaron mejor crecimiento a 30 y 37°C;

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presentaron mejor crecimiento a temperaturas extremas, 5 y 44°C, no se observó crecimiento. La tolerancia a NaCl al 1% y 2% fue un criterio adicional que permitió diferenciar cepas de Rhizobium sp., de cepas pertenecientes Bradyrhizobium sp. En la tolerancia al pH se evidenció crecimiento abundante en los rangos 9.0 y 11.0 para todas las cepas seleccionadas tanto G. sepium como L. leucocephala (Tabla No 3). La totalidad de las cepas evaluadas presentaron resistencia al cloranfenicol (Tabla 2).

4. CONCLUSIONES Las cepas nativas de Rhizobium spp., se observaron como bacilos cortos móviles Gram negativos, que presentaron reacción ácida en el medio YMA + AB. Algunas cepas de Rhizobium spp., nativas no toleraron la presencia de sales biliares presentes en el medio XLD y Hecktoen. Las cepas nativas de Rhizobium spp., no degradaron la cetolactasa en el medio LLA. Las pruebas de tolerancia a factores abióticos demostraron mejor

crecimiento en los pH entre 9,0 y 11, a temperaturas de entre 30 y 37°C, crecimiento moderado en concentraciones de NaCl de 1% y 2%. Se aislaron 22 cepas de Rhizobium spp, nativas: de la cuales 11 fueron específicas para Matarratón (Gliricidia sepium) y 11 para Leucaena (Leucaena leucocephala), las cuales presentaron mejor resistencia al cloranfenicol. Se pretendió con este estudio obtener cepas de Rhizobium sp, para facilitar una segunda etapa orientada a la evaluación de invernadero y en campo en donde se evalúe el efecto de las cepas nativas de Rhizobium spp., sobre la promoción de crecimiento en plantas leguminosas utilizadas como forraje para la alimentación de ganado bovino.

5. AGRADECIMIENTOS Los autores de este trabajo expresan sus agradecimientos al Centro Biotecnológico del Caribe, SENA Regional Cesar donde se desarrolló esta investigación y al Semillero de Investigación Agroecológico por el apoyo.

6. BIBLIOGRAFIA Atlas, R. y R. Bartha. 2005. Ecología microbiana y microbiología ambiental. Cuarta edición. Pearson educación,

S.A., Madrid. 97-114p. Bécquer, J., D. Prévost y A. Prieto. 2000. Caracterización fisiológica bioquímica de cepas de rizobios, aislados en

leguminosas forrajeras. Biologia 14: 123. Centro Internacional De Agricultura Tropical-CIAT. 2007. Informe anual de la CIAT. Ferrera, R. & A. Alarcón. 2007. Microbiología agrícola. Primera edición. Editorial Trillas, México D.F. 225-236 p. Jiménez, J. 2007. Caracterización molecular de cepas nativas de Azotobacter ssp mediante análisis de restricción

del DNA ribosomal 16S. Tesis Microbiología Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. En: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis14.pdf. Pp. 3-28; consulta: agosto de 2009

Kuykendall, D., J. Young, E. Martínez, A. Kerr, y H. Sawada. 2005. Rhizobium. Frank 1889, 338. Bergey`s Manual of

Systematic Bacteriology. Editorial Springer US. 325-340p.

58

Küçük, Ç. & M. Kivanç. 2008. Preliminary characterization of Rhizobium strains isolated from chickpea nodules. African Journal of Biotechnology. 7 (6), 772-775.

Lindström, K., M. Murwira, A. Willems & N. Altier. 2010. The biodiversity of beneficial microbe-host mutualism:

the case of rhizobia. Research in Microbiology 161 (6) 453-463. López, M. 2005. Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas. Centro de Investigación sobre Fijación

de Nitrógeno, Universidad Nacional Autónoma de México.En:http://www.microbiologia.org.mx/microbiosenlinea/CAPITULO_11/Capitulo11.pdf. 11 p.; consulta: mayo de 2010.

Marco, D., J. Carvajal, S. Cannas, R. Pérez, A. Hidalgo, J. Olivares, J. Ruiz & J. Sanjuán. 2009. An experimental and

modelling exploration of the host-sanction hypothesis in legume–rhizobia mutualism. Journal of Theoretical Biology. 259 (3) 423-433.

Martínez, M., H. Castañeda, J. Martínez, M. Ruiz & C. Álvarez. 2005. Aislamiento e identificación de Rhizobium en

Lupinus silvestres por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Revista Scientia CUCBA. 7(2), 175-181.

Matos, G., E. Ormeño & D. Zúñiga. 2007. Diversidad de los rizobios que nodulan el cultivo de pallar (Phaseolus

lunatus L.) En la costa central del Perú. En: http://www.lamolina.edu.pe/ciencias/ecologia/revista5.htm. 42-46p; consulta: 26 de mayo de 2010.

Matos, G. & D. Zúñiga. 2002. Comportamiento de cepas nativas de Rhizobium aisladas de la costa del Perú en

dos cultivares del pallar (Phaseolus lunatus l.). Ecología Aplicada. 1(001), 19-24. Mayz, J., A. Lárez & N. Alcorcés. 2010. Efectividad de cepas rizobianas nativas de sabana en Vigna unguiculata

(L.) Walp. cv. C4A-3. Revista Colombiana Biotecnológica. 12(2), 194-202. Mora, F. 1995. Selección de cepas nativas de Rhizobium leguminosarum bv phaseoli Eficientes en fijación

biológica de nitrógeno en suelos de Costa Rica. Agronomía Mesoamericana. 6, 68-74. Mourad, K., K. Fadhila, M. Chahinez, R. Meriem, D. Philippe, B. Abdelkader. 2009. Antimicrobial activities of

Rhizobium sp. strains against Pseudomonas savastanoi, the agent responsible for the olive knot disease in Algeria. Grasas y Aceites. 60(2), 139-146.

Peña, H., I. Reyes. 2007. Aislamiento y evaluación de bacterias fijadoras de nitrógeno y disolventes de fosfatos

en la promoción del crecimiento de la lechuga (Lactuca sativa L.). Interciencia. 32(8), 560-565. Pérez, G., G. Gómez, M. Nápoles, B. Morales. 2008. Aislamiento y caracterización de cepas de rizobios aisladas de

diferentes leguminosas en la región de Cascajal, Villa Clara. Pastos y Forrajes. 31(2), 151-159. Rincón, J., T. Clavero, R. Razz, S. Pietrosemoli, F. Mendez, N. Noguera. 2000. Efecto de la inoculación con cepas

nativas e introducidas de Rhizobium sobre la fijación de nitrógeno en Leucaena (Leucaena leucocephala (Lam) de Wit). Revista Facultad Agronomía. 17, 342-357.

Rojas, D., M. Garrido, R. Bonilla. 2009. Estandarización de un medio de cultivo complejo para la multiplicación

de la cepa C50 de Rhizobium sp. Corpoica-Ciencia y Tecnología Agropecuaria. 10 (1), 70-80. Salazar, M., F. Londoñ, H. Toro. 2001. Caracterización de la bacteria nitrificante del suribio (Pithecelobium

lanceolatum BENTH). Universidad de Caldas Facultad de Ciencias Agropecuarias departamento de

59

Fitotecnia. En: http://acad.ucaldas.edu.co/jcg/fitotecnia/boletin/48/48.html. 6p.; consulta: agosto de 2009.

Westermeyer, M. 2006. Efecto de Rhizobium leguminosarum BV. trifolii (Frank) y una CPCV (Cepa Promotora del

Crecimiento Vegetal) inoculadas a la rizósfera de Trifolium pratense L. Tesis de pregrado. Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Austral de Chile.

60

Figura 1. Prueba de viabilidad del bacteroide en el nódulo a través de la tinción de Gram,

obsérvese la presencia de rizobios viables Gram negativos (A) Nódulos de Gliricidia sepium.

(B) Nódulos de Leucaena leucocephala

Foto: Hernández J, 2009.

Figura 2. Aislamiento primario de rizobios en YMA + AB, obsérvese la reacción ácida (A/A)

Foto: Hernández J, 2009.

Figura 3. Crecimiento en YMA + AB, reacción ácida (A/A) y alcalina (K/K). (A): colonias

observadas después de 3 días de incubación. (B): colonias observadas después de 7 días de

incubación.

Foto: Hernández J, 2009.

A B

B A

61

Tabla 1. Recuento de nódulos con crecimiento y porcentaje de recuperación para G. sepium y

L. leucocephala

Leguminosa

Lote/punto

Nódulos aislados

o sembrados

Nódulos con crecimiento

Porcentaje de recuperación

G. sepium Lote 1 25 19 76 Lote 2 56 42 75 Lote 3 153 140 92

Total 234 201 86* L. leucocephala Punto 2 18 18 100

Punto 3 25 22 88 Punto 4 5 5 100 Total 48 45 94*

*Porcentaje de recuperación con respecto al total de nódulos con crecimiento en cada

leguminosa

Tabla No 2. Caracterización bioquímica y fisiológica de cepas Rhizobium sp, aisladas a partir

de G. sepium y L. leucocephala.

Gliri

cid

ia s

ep

ium

Nº Cepa

Crecimiento en: Rx. YMA + Ab

YMA + Rc Rx

Benedict

Resist. Antib

PGA + Pb

LLA YMA +

Rc XLD Hektoen Tetra. Clor.

1 G-21* (-) (+) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (+) (+)

2 G-22 (+) (+) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (-) (-)

3 G-24 (+) (+) (+) (+) (+) (+/-) Traslucidas (-) (+) (+)

4 G-26 (+) (+) (+) (+) (+) (+/-) Rosadas (-) (-) (+/-)

5 G-32* (-) (+) (+) (+) (+) (-) Traslucidas (-) (-) (+)

6 G-34* (-) (+) (+) (+) (+) (-) Traslucidas (-) (-) (+)

7 G-35* (+/-) (+) (+) (+) (+) (-) Traslucidas (-) (-) (+)

8 G-36* (+/-) (+) (+) (+) (+) (-) Traslucida (-) (-) (+)

9 G-38* (-) (+) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (-) (+)

10 G-39 (-) (+) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (-) (+)

11 G-310 (+) (+) (+) (+) (+) (+/-) Traslucidas (-) (-) (+)

Leu

caen

a leu

co

cep

hala

1 L-01 (+) (+) (+) (-) (-) (+/-) Rojizas (-) (-) (+)

2 L-24 (-) (+) (+) (-) (-) (-) Rojizas (-) (-) (+)

3 L-27 (1)* (-) (+) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (-) (+)

4 L-27 (2) (-) (+) (+) (-) (-) (-) Rojizas (-) (-) (+)

5 L-32* (-) (-) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (-) (-)

6 L-34* (-) (+) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (-) (+)

7 L-35* (-) (+) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (-) (+)

8 L-36* (-) (+) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (-) (+)

62

9 L-38 (2)* (-) (+) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (-) (+)

10 L-38 (3) (+) (+) (+) (-) (-) (-) Rosadas (-) (-) (+)

11 L-47 (-) (+) (+) (-) (-) (+/-) Rojizas (-) (-) (+)

CC 1 aCC (+/-) (+) (+) (+) (+) (-) Rosadas (-) (-) (+)

PGA: Peptona-glucosa Agar; Pb: Púrpura de bromocresol; Ab: Azul de bromotimol; LLA: Levadura-Lactosa-Agar; YMA: Levadura-Manitol-Agar; Rc: Rojo congo; Rx: Reacción; Tetra: Tetraciclina; Clor: Clorafenicol; (+/-): Débilmente. * Cepa nativa de Rhizobium spp., seleccionadas. a Cepa comercial.

Tabla 3. Tolerancia a factores abióticos para G. sepium y L. leucocephala.

Tolerancia a factores abióticos

Gliri

cid

ia s

ep

ium

Código cepa

[ ] de NaCl Niveles de pH Niveles de temperatura

0,01% 1% 2% 4,5 6,8 9,0 11,0

5ºC 30ºC 37ºC 44ºC

G-21 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-)

G-32 (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

G-34 (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

G-35 (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

G-36 (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+)

G-38 (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

Leu

caen

a

leu

co

cep

hala

L-27 (1) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

L-32 (+) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

L-34 (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

L-35 (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

L-36 (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

L-38 (2) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

Cepa comercial

C-ICA J-01 (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)

(+) Crecimiento positivo, (-) Crecimiento negativo; [ ] Concentración.