FRACCIONAMIENTO Y PRUEBAS DE TOXICIDAD

DE ACEITES ESENCIALES DE ESPECIES VEGETALES

1) INTRODUCCION y JUSTIFICACION

La palabra “tóxico” deriva directamente del término griego (Toelkòv), que quiere decir “arco”, refiriéndose al uso de algunas hierbas para envenenar las flechas, con las cuales se mataba con rapidez al enemigo. Las propiedades tóxicas y alucinógenas son parte de las tradiciones y la cultura de muchos pueblos a lo largo del planeta.

Las plantas presentan algunas sustancias activas o propiedades activas que son tóxicas y dañinas a los animales que pueden ser alcaloides, fitotoxinas, resinoides y oxalato de calcio

Los aceites esenciales pueden aplicase sobre las partes del cuerpo o inhalar por la nariz para tratar y aliviar las infecciones virales, enfermedades de la piel, dolor muscular y diversas enfermedades crónicas. También calma el estado mental de una persona, promueve la regeneración celular y alivia el estrés, la ansiedad y el dolor físico, psicológico y emocional.

Algunos aceites esenciales están muy concentrados y son tóxicos para el cuerpo humano cuando se ingieren o utilizan en la terapia de masaje tambien pueden producir reacciones alérgicas y peligrosas, dando lugar a enfermedades mortales.

Debido a la gran aplicación que tiene los aceites esenciales ya sea en campo de la medicina, industria y perfumería y por la gran diversidad de especies vegetales que se encuentran en zona del trópico Valle de Sacta, se decidió realizar un estudio sobre la toxicidad de los aceites esenciales con Artemia Salina para ver si presentan actividad toxicológica.

3) OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL.- Realizar el fraccionamiento y las pruebas de toxicidad de aceites esenciales de especies vegetales

3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO.-

- Realizar el pre tratamiento de las muestra vegetal (pesado, triturado)

- Extraer el aceite esencial de una especie vegetal con destilación por arrastre con vapor de agua.

- Cromatografía en capa fina del aceite esencial usando diferentes solventes para realizar el fraccionamiento

- Fraccionamiento del aceite esencial en Cromatotron con diferente polaridad de solventes.

- Fraccionamiento del aceite esencial en columna liquida con diferente polaridad de solventes

- Realizar la siembra de la Artemia Salina y realizar el conteo - Realizar pruebas de toxicidad con la Artemia Salina- Calcular el DL50 con los resultados obtenidos.

4) FUNDAMENTO TEORICO

4.1 ACEITES ESENCIALES

Los aceites esenciales son mezclas de varias sustancias químicas biosintetizadas por las plantas, que dan el aroma característico a algunas flores, árboles, frutos, hierbas, especias, semillas y a ciertos extractos de origen animal. Se trata de productos químicos intensamente aromáticos, no grasos, por lo que no se enrancian, volátiles por naturaleza y poco densos. Son insolubles en agua, levemente solubles en vinagre, y solubles en alcohol, grasas, ceras y aceites vegetales. Se oxidan por exposición al aire. Se han extraído más de 150 tipos, cada uno con su aroma propio y virtudes curativas únicas. Proceden de plantas tan comunes como el perejil y tan exquisitas como el jazmín. Para que den lo mejor de sí, deben proceder de ingredientes naturales brutos y quedar lo más puro posible.

Las plantas elaboran los aceites esenciales con el fin de protegerse de las enfermedades, ahuyentar insectos depredadores o atraer insectos benéficos que contribuyen a la polinización.Los aceites esenciales son característicos de los magnoliales, los laurales, los austrobaileyales, y los piperales, y también de algunas familias no emparentadas con estos órdenes, como Myrtaceae, Rutaceae, las familias de apiales, Lamiaceae, Verbenaceae y Asteraceae.

Están presentes en distintas partes de la planta: en las flores en el caso de la lavanda, el jazmín y la rosa, en todo el árbol como sucede con el eucaliptus ,en las hojas como la citronela ,en la madera como el sándalo, en la raíz es el caso del vetiver, en la resina que exhudan el incienso, la mirra y el benjuí y en la cáscara de los frutos como el limón, la naranja y la bergamota.Dentro de los tejidos vegetativos, se encuentran en células esféricas o diferentes cavidades o canales en el parénquima, y cuando dan el olor a las flores, se encuentran en las glándulas odoríferas, desde donde son liberados.

El clima también influye: en el más cálido o húmedo se evaporan con más facilidad las notas altas, por lo que se acentúan las de fondo, motivo por el cual las fragancias nos parecen más intensas en verano

Estructura Química

El isopreno es la unidad química de los terpenoides, compuesto principal de los aceites esenciales.Están formados principalmente por terpenoides volátiles, formados por unidades de isopreno unidas en estructuras de 10 carbonos (monoterpenoides) y 15 carbonos (sesquiterpenoides). Cada aceite lo integran por lo menos 100 compuestos químicos diferentes, clasificados como aldehídos, fenoles, óxidos, ésteres, cetonas, alcoholes, terpenos y muchos compuestos aún por identificar.

Propiedades y Aplicación

Todos los aceites esenciales son antisépticos, pero cada uno tiene sus virtudes específicas, por ejemplo pueden ser analgésicos, fungicidas, diuréticos o expectorantes. La reunión de componentes de cada aceite también actúa conjuntamente para dar al aceite una característica dominante como el de manzanilla, refrescante como el de pomelo, estimulante como el aromático de romero o calmante como el clavo.

En el organismo, los aceites esenciales pueden actuar de modo farmacológico, fisiológico y psicológico. Habitualmente producen efectos sobre diversos órganos (especialmente los órganos de los sentidos) y sobre diversas funciones del sistema nervioso..

El uso principal de los aceites esenciales es en perfumería, actúan como mensajeros químicos se mezclan con los pigmentos naturales de la piel por el cual le confiere un aroma o perfume particular y diferente a cada piel.

También se usa como conservadores en alimentos especialmente cárnicos por sus propiedades insecticidas y acaricidas que poseen algunos aceites, se los emplea con fines de controlar algunas plagas de manera ecológica.

Los aceites esenciales se utilizan en la industria para dar sabor y aroma al café, al té, los vinos y las bebidas alcohólicas, de la misma se utiliza en jabones, desinfectantes y productos similares y en la medicina por su efecto calmante en el dolor y su valor fisiológico.

Otro uso es en la terapia alternativa denominada aromaterapia. Por ejemplo, el aceite de lavanda se usa para las heridas y quemaduras, y el aceite de jazmín se utiliza como relajante.

Precauciones y Conservación.

Es importante señalar que la mayor parte de los aceites esenciales no pueden aplicarse en su estado puro directamente sobre la piel, ya que son altamente concentrados y pueden quemar la piel. Antes de aplicarlos es necesario diluirlos en otros aceites conocidos como aceites bases o en agua.

Preferentemente los aceites esenciales no deben de ser ingeridos. No deben entrar en contacto con los ojos. En caso de hacerlo deben de lavarse los ojos con abundante

agua, evitando tallarse con las manos. Los aceites sintéticos son calidad es muy inferior a los aceites esenciales naturales y si son aplicados en

la piel causan quemaduras y alergias.

Los aceites esenciales siempre deben de estar protegido de la luz y mantenerse en botellas de vidrio de preferencia botellas de color azul, ya que este color es específico para los aceites esenciales.

4.2 METODOS DE EXTRACCION DE ACEITES ESENCIALES

Los aceites esenciales son muy inestables, volátiles, frágiles, alterables con la luz y presentan una concentración elevada, por lo que sólo se necesitan miligramos para lograr el efecto deseado También se pueden sintetizar en forma artificial, que es la manera más habitual de obtenerlos, debido a que la gran demanda de estos productos no llega a ser abastecida por las fuentes naturales.

4.2.1 DESTILACIÓN CON AGUA (HIDRODESTILACIÓN).

El principio de la destilación en agua es llevar a estado de ebullición una suspensión acuosa de un material vegetal aromático, de tal manera que los vapores generados puedan ser condensados y colectados. El aceite, que es inmiscible en agua, es posteriormente separado.

Este sistema de extracción es particularmente empleado en zonas rurales que no cuentan con instalaciones auxiliares para la generación de vapor.

En la destilación con agua el material vegetal siempre debe encontrarse en contacto con el agua. Un factor de especial importancia a considerar es el de que, si el calentamiento del extractor es con fuego directo, el agua

presente dentro del extractor deberá ser suficiente y permanente para llevar a cabo toda la destilación a fin de evitar el sobrecalentamiento o carbonización del material vegetal, dado que este hecho provocaría la formación de olores desagradables en el producto final.

El material vegetal en el extractor se aconseja mantenerlo en constante agitación a fin de evitar aglomeración es o sedimentación del mismo en el fondo del recipiente, lo cual puede provocar su degradación térmica.

Algunas especies vegetales tienden a formar suspensiónes mucilaginosas al someterse a calentamiento en medios acuosos, lo cual dificulta severamente la extracción del aceite esencial y la consecución del proceso como ejemplo la destilación de las semillas de cardamomo. Por ello es importante realizar pruebas preliminares a nivel de laboratorio antes de efectuar destilaciones a gran escala. El equipo recomendado para realizar estas pruebas preliminares es el sistema Clevenger modificado.

El tiempo total de destilación es función de los componentes presentes en el aceite esencial. Si el aceite contiene compuestos de alto punto de ebullición, el tiempo de destilación deberá ser mayor, dado que generalmente no es posible colocar suficiente agua para soportar todo el ciclo de destilación, se han diseñado equipos que presentan un tubo de cohobación lateral que permite el retorno de agua hacia la olla. Un ejemplo de este tipo de cohobación a escala de producción puede ser visto en la Figura 3, el cual es un esquema representativo del equipo tipo Cisirill desarrollado en el Instituto de Investigación Científica e Industrial de Sri Lanka.

Fig. 3 Representación esquemática del Equipo tipo CISIRILL. (Tuley de Silva, 1995).

Los aceites esenciales obtenidos mediante destilación en agua normalmente presentan notas más fuertes y un color más oscuro con respecto a los producidos por otros métodos. Es posible decir, en general, que los aceites producidos por destilación en agua son de menor calidad que los producidos por otros métodos por las siguientes razones:

• Algunos componentes como los ésteres son sensibles a la hidrolisis, mientras que otros componentes tales como los hidrocarburos monoterpénicos acíclicos o los aldehídos, son susceptibles de polimerización. (El pH del agua frecuentemente es bajo, hecho que facilita la realización de reacciones hidrolíticas o conversiones (Koedam y col., 1980).

• Los compuestos oxigenados, tales como los fenoles, tienden a ser parcialmente solubles en el agua de destilación, hecho por el cual es imposible la remoción completa de estos compuestos.

• Los tiempos requeridos de destilación son demasiado largos, lo cual se asocia a un detrimento de la calidad del aceite obtenido.

Por otra parte, este sistema presenta la desventaja de presentar un a menor eficiencia en energética con respecto a la destilación con vapor o vapor/ agua, además de que, al ser realizada como un arte, normalmente no se opera bajo condiciones óptimas de tiempo y temperaturas tomando como punto de control la calidad del aceite obtenido.

Sin embargo, este método es útil cuando el material vegetal tiende a aglomerarse cuando el vapor pasa a través de él. Una ventaja adición al es que el costo involucrado para la fabricación del equipo es de los más bajos comparativamente entre los métodos en unciados, además de que su operación no requiere de servicios de energía eléctrica, vapor, aire u otros.

La duración de la destilación son largas en estos equipos a causa de la concepción del sistema de calentamiento y de enfriamiento, que limitan los rendimientos en esencia. El tiempo de destilación es en realidad muy variable, y debe definirse en función de la calidad de producto que se quiere obtener. En algunos casos, como por ejemplo en la esencia de eucalipto tipo eucaliptol, se pueden lograr productos muy distintos según se destile poco tiempo o mucho: en el primer caso se consigue una esencia muy rica en eucaliptol, y con un bajo costo, pero carente de productos más pesados, que resultan fundamentales para su uso como sabor. Para determinar estos tiempos conviene saber que en una hidrodestilación o destilación por arrastre con vapor, los primeros componentes volátiles que se extraen son los más solubles en agua. De esta manera durante la extracción se realiza una suerte de destilación fraccionada de la esencia contenida en la planta.

4.2.2 DESTILACIÓN POR ARRASTRE CON VAPOR DE AGUA (HIDRODIFUSION)

La extracción por arrastre con vapor de agua, puede considerarse el más sencillo, seguro e inclusive, el más antiguo, ya que se menciona en textos tan antiguos como la Biblia. Está basado en que la mayor parte de las partes olorosas que se encuentran en una materia vegetal pueden ser arrastradas por el vapor de agua.

La destilación por arrastre con vapor que se emplea para extraer la mayoría de los aceites esenciales es una destilación de mezcla de dos líquidos inmiscibles y consiste, en resumen , en una vaporización a temperaturas inferiores a las de ebullición de cada uno de los componentes volátiles por efecto de una corriente directa de vapor de agua, el cual ejerce la doble función de calentar la mezcla hasta su punto de ebullición y disminuir la temperatura de ebullición por adicionar la tensión de vapor del vapor que se inyecta, a la de los componentes volátiles de los aceite esenciales. Los vapores que salen del cuello de cisne se enfrían en un condensador donde regresan a la fase líquida, los dos productos inmiscibles, agua y aceite esencial y finalmente se separan en un decantador o vaso florentino.

La destilación por arrastre con vapor de agua, no ha podido ser sustituida por la extracción con solventes orgánicos o con calentamiento directo por la gran cantidad de ventajas que tiene en relación a estos dos últimos sistemas y que pueden resumirse en:

• El vapor de agua es muy económico en comparación al costo de los disolventes orgánicos. • Asegura que no se recaliente el aceite esencial. • No requiere el uso de equipos sofisticados.

El cálculo de la cantidad de vapor necesaria para separar una determinada cantidad de aceite esencial en función de la temperatura y la presión a la que se realiza la destilación se efectúa usan do las ecuaciones clásicas empleadas en la destilación de líquidos inmiscibles.

En el momento del arrastre con vapor, la suma de la presiones parciales PA y P H2O (aceite esencial y agua) es igual a la presión total existente en el extractor, que en este caso es la atmosférica. La ecuación fundamental del arrastre con vapor se deduce de la ley de los gases perfectos, según las cuales las presiones de vapor de los componentes de una mezcla gaseosa son proporcionales al número de moléculas presentes.

dQ PH2O (1)

dA PA

Siendo Q la cantidad total de agua en moles, necesaria para realizar el arrastre y A el número de moles del aceite esencial volátil existen te en el extractor.

Para integrar la ecuación anterior es necesario conocer la relación entre PH2Oy PAy e l resto de las variables existentes. La presión de vapor del aceite depende de la concentración de aceite en la carga y puede calcularse en función de A y de C (siendo C los moles de los componentes no volátiles en la carga) y de la tensión de vapor del componente puro (aceite esencial), con base en la ley de Raoult. Hay que tomar en cuenta la vaporización del aceite esencial que se efectúa durante el inmediato paso del vapor de agua a través de la carga (hojas, semillas, parte aérea, raíces, tubérculos) y en consecuencia la presión de vapor de A en fase gaseosa será menor que la correspondiente de equilibrio a esa temperatura.

Para resolver esta desviación se corrige la ley de Raoult con un coeficiente de eficiencia E, que siempre será inferior a la unidad y será función de las condiciones reinantes dentro del extractor de destilación. Siendo ρA la tensión de vapor del aceite esencial, obtendremos:

Pa = E * ρA A ( 2 )

A + 1

La presión de vapor del agua, que es constante cuando se han establecido las condiciones de operación y existe condensación , es igual a la tensión de vapor del agua a la temperatura de la misma dentro del extractor y que se expresa en todo momento, como la diferencia entre la presión total (la atmosférica) y la del componen te volátil.

A

P H 2 O = P tot - P a = P tot - E .ρA

A + 1 (3)

Relacionando las tres ecuaciones anteriores (1), (2) y (3) podemos deducir la ecuación correspondiente al proceso de arrastre con vapor de agua:

Q P H2O

A E.ρA

(4) Si se multiplica a ambos miembros por los Pesos Moleculares respectivos del agua y del aceite esencial nos queda:

W agua Q. PM agua P agua PM agua

WA A. PMA E.ρA.PM A

Siendo agua la relación en peso de la cantidad de vapor de agua necesaria para obtener una determinada cantidad de aceite esencial mediante arrastre con vapor. Como es imposible de- terminar el peso molecular de un aceite esencial, lo que se hace en la práctica es utilizar un pro- medio ponderado de los pesos moleculares de los componentes mayoritarios presentes en el aceite esencial. Además de esto es necesario disponer de un a curva donde se relación de la tensión de vapor del aceite esencial a distintas temperaturas. Si no se dispone de estos datos, se calcula la relación por separado para cada uno de los componentes principales.

La determinación del coeficiente de eficiencia en los arrastres con vapor tratándose de líquidos fue estudiado por Carey, quien dedujo que era función del espesor de la capa líquida l, del diámetro medio de la burbuja d y de una constante K característica de la sustancia destilada, que está relacionada con la difusividad de la misma en estado gaseoso. La relación exponencial propuesta fue:

- K 1 /d

E = 1 - e (5)

Para cálculos prácticos y tratándose de líquidos, E oscila entre 0,5 y 0,7.

Cabe señalar que cuan do se efectúa el arrastre con vapor de agua de un aceite esencial en - cerrado en una pared vegetal de una planta , los coeficientes dependerán no sólo de lo compacta- do del material, sino también de factores tales como la permeabilidad del material celulósico para permitir el paso del aceite volátil.

Para dar un ejemplo de cómo se calcula la relación entre el gasto de vapor necesario y la cantidad de esencia obtenida, se analizará el caso de la esencia de trementina. Sus componentes principales son el α y β pineno (53 y 35% respectivamente), por lo que el peso molecular a utilizar será 136 (correspondiente a los dos isómeros del pineno) y 18 para el agua. Tomando el dato de la bibliografía (Badger y McCabe, 1936), a 95.5ºC la tensión de vapor (ρ) de la esencia trementina es de 114 mm de Hg, y la del agua es de 646 mm de Hg. Teniendo en cuenta un valor de eficiencia de 0,6 queda:

W agua 646 mm Hg. 18 1,25

WA 0,6. 114 mm Hg. 136

En la Figura 4 se muestra un esquema de un equipo de extracción por arrastre con vaporde agua a nivel piloto desarrollado en el CIATEJ.

Figura 4.- Equipo piloto de extracción de aceites esenciales tipo CIATEJ.

En los diseños más modernos de destiladores de este tipo, el vapor se genera dentro de una camisa en el cuerpo del extractor, lo que significa un importan te ahorro de energía, pues el calor que irradia esta camisa hacia adentro sirve para precalentar el material vegetal en el interior del extractor, reduciendo la cantidad de vapor necesaria para llegar a la temperatura de destilación de la esencia.

La destilación de plan tas aromática y medicinal, se efectúa, a menudo, con vapor directo, en extractores con capacidades que varían de 50 litros para los de nivel de laboratorio, a los de 1.000 a 6.000 litros para las instalaciones de gran envergadura. Varios recipientes pueden ser colocados en una misma planta, según la importancia de la producción y el ritmo de la destilación. La mayoría de los equipos está compuesto de dos recipientes de capacidad de 1.500 litros, los cuales pueden ser ocupados alternativamente: mientras una unidad está en proceso de extracción, la otra está en operación de carga o descarga de material vegetal, esto redunda en un ahorro de tiempo importante para los costos de producción.

La destilación de plantas aromáticas se efectúa generalmente con bajas presiones, con el fin de no deteriorar los constituyentes del aceite esencial por efecto de una temperatura muy elevada. Sin embargo, es necesario para cierto tipo de esencias como es el caso del vetiver (Vetiveria zizanoides) o clavo de olor (Eugenia caryophyllata) de operar con presión es de 1 a 2 bar. Se logra reducir el tiempo de destilación y conducir a un mejor rendimiento, sin perjudicar la calidad de la esencias.

Formación de emulsiones en el proceso de arrastre con vapor

Es necesario mencionar que cuando se realizan destilaciones hetero-azeotrópicas de plantas aromáticas utilizando unidades de extracción con vapor, una vez efectuada la condensación de dos líquidos no miscibles, se obtienen generalmente en el recipiente de decantación emulsiones de tipo directa, es decir aceite en agua y emulsiones inversas de agua en aceite, que son muy estables y difíciles de separar. Estas emulsiones, llamadas “térmicas”, de aspecto lechoso, tienen diámetro de gotas de algunos micrones.

Durante la destilación de una planta aromática se presenta un fenómeno de separación de fases que ni la simple decantación o la cohobación permiten la recuperación de los aceites esenciales. Además, es pertinente indicar que las emulsiones que se forman representan un doble interés para que sean tratadas. Por un lado es deseable recuperar la esencia que se podría perder, sobre todo cuan do son de alto costo. Y por otro lado se contribuye al mantenimiento del ecosistema mediante un tratamiento que permite la descontaminación del agua de condensación. En las empresas destiladoras de aceites esenciales efectúan la separación en un recipiente denomina- do “vaso florentino”.

La mayor parte de las técnicas de separación de fases de una emulsión se basan sobre la ecuación de Stokes, que expresa la relación que existe entre la velocidad ascencional o de sedimentación de una microgota de la fase dispersa en el seno de una fase continua.

∆ρ. g . dE2 W =

18. A. µ .c

En la ley de Stokes se encuentran expresadas el conjunto de técnicas de separación aceleradas que pueden ser aplicadas para separar emulsiones de tipo secundario. Para acelerar la velocidad ascencional o de sedimentación de la fase dispersa, se puede influir directamente o indirectamente sobre los 4 parámetros que condicionan esta última.

1. Si se influye sobre la viscosidad (µc) de la fase continua se disminuye su valor por la elevación de la temperatura. A esta técnica se le conoce como tratamiento térmico.

2. Para el caso de querer influir sobre la diferencia de densidad entre fases (∆ρ) s e puede aumentar en ciertos casos de manera artificial por la técnica de flotación con aire. También se puede provocar esto, saturando la fase acuosa con una sal (agregando un exceso de sal de mesa por ejemplo). Esto provoca la separación de cualquier elemento que permanezca en la fase acuosa en un equilibrio metaestable.

3. Cuando se desea influir sobre la aceleración de la gravedad (g) se sustituye por un aceleración centrifuga. En estos casos se emplea la centrifugación median te el uso de hidrociclones. 4. Influir sobre el diámetro (dE2) de las microgotas de la emulsión que se desea separar. Podemos notar que en este caso se trata del parámetro de acción más sensible ya que se encuentra elevado al cuadrado. En este caso se provoca una aglomeración de microgotas de fase dispersa, para obtener macrogotas que sean fáciles de separar. Dos técnicas de principios muy diferentes pueden asegurar la coalescencia de microgotas:

a) La electrocoalescencia, aplicable sólo cuando la fase continúa es no conductora de la electricidad.

b) La coalescencia sobre lechos fibrosos o granulares aplicables en todos los casos, sobre todo en la separación de aceites esenciales emulsionados en agua.

4.2.3 DESTILACIÓN CON AGUA - VAPOR.

En este caso el vapor puede ser generado median te una fuente externa o dentro del propio cuerpo del extractor, aunque separado del material vegetal. La diferencia radical existen te entre estos sistemas y el anteriormente mencionado es que el material vegetal se encuentra suspendido sobre un tramado (falso fon do) que impide el contacto del material vegetal con el medio líquido en ebullición . Este sistema reduce la capacidad neta de carga de materia prima dentro del extractor pero mejora la calidad del aceite obtenido. En la Figura 5 se muestra un equipo tradicional de un proceso de destilación vapor - agua:

Figura 5.- Equipo tradicional de destilación vapor - agua.

Si la cantidad de agua contenida en el extractor no es suficiente para sostener el proceso de destilación, es conveniente utilizar un sistema de cohobación a través del cual, el agua ya condensada es retornada al cuerpo del extractor para volver a ser calentada.

A continuación se describe algunos aspectos importantes a considerar referentes al mecanismo de cohobación.

Aplicación de la cohobación La cohobación es un procedimiento que solamente puede ser utilizado para la destilación de vapor y destilación agua-vapor. Como ya se ha mencionado, el sistema de cohobación involucra el retorno del condensado de agua (una vez separado el aceite esencial) al cuerpo del extractor.

Este hecho permite minimizar las pérdidas de componentes oxigenados, particularmente los fenoles que presentan una gran solubilidad en agua. El reuso del agua condensada permitirá que ésta llegue a saturarse con los constituyentes disueltos de tal manera que no será capaz de disolver mayor número de componentes.

Para la mayoría de los aceites, las pérdidas reportadas utilizando este sistema no rebasa, más que para aceites ricos en fenoles, el 0,2%.

La destilación con agua-vapor de plantas aromáticas se efectúa, desde hace muchos años, en equipos artesanales de pequeñas capacidades que trabajan a “fuego directo”, los cuales no están muy difundidos aún en el caso de países en vías de desarrollo.

4.2.4 DESTILACIÓN PREVIA MACERACIÓN

En algunos casos la plantas aromáticas requieren ser sometidas a un proceso de maceración en agua caliente para favorecer la separación de su aceite esencial ya que sus componentes volátiles están ligados a otras sustancias, formando componentes glicosidados. El método se aplica para extraer el aceite de semilla de almendras amargas, bulbos de cebolla, bulbos de ajo, semillas de mostaza, hojas de gaulteria y hojas y corteza de abedul.

En el Cuadro 3 se muestran las reacciones enzimáticas previas reportadas (Guenther, 1952; Block, 1985) para estos materiales vegetales

PLANTA PRECURSOR ENZIMA PRODUCTOAROMATICO

Gaulteria gaulterina (ormootropiside)

primaverosidasa salicilato de metilo + primaverosa

Almendra amarga amigdalina (mandelonitrilo gentiobiósido)

emulsina benzaldehido + glucosa + HCN

Mostaza negra sinigrina (mirosinato de potasio)

mirosinasa isotiocianato de alilo + glucosa + KHSO4

Cebolla cebolla alilos mezcla de sulfóxido de S-alquil cisteína

alilasa disulfuro de dipropilo + propionaldehido (mayor)

Ajo ajo alilos sulfóxido de S-alil cisteína

alilasa disulfuro de dialilo (mayor)

Cuadro 3.- Ejemplos de aceites esenciales producidos por reacciones enzimáticas

4.2.5 DESTILACIÓN SOMETIDA A UNA DEGRADACIÓN TÉRMICA

Es utilizado por ejemplo para producir la brea del abedul y para obtener el aceite de enebro, en un proceso en el cual sucede una degradación térmica. Según Guenther (1952) , para el caso de la producción del aceite de enebro, la madera del tronco, las ramas y las raíces de la especie Juniperus oxycedrus L. son fragmentadas en pedazos que se amontonan sobre una plancha cóncava que posee en el centro un tubo conductor con orientación hacia abajo del colector. En otro recipiente de hierro se coloca carbón, el cual se quema hasta alcanzar un color rojo intenso, el resultado del calor extremo que genera esta combustión se transmite hacia los fragmentos de madera, ésta sufre una descomposición térmica que permite la liberación

del aceite esencial. Una vez “extraída” esta esencia se mezcla con las sustancias piroleñosas de la madera carbonizada dan- do como producto un líquido viscoso homogéneo de color pardo oscuro con un fuerte olor a humo.

En la Figura 7 se representa en forma esquemática.

En forma reciente Chalchat y col. (1990) demostraron que muchos hidrocarburos sesquiterpénicos soportan estas condiciones drásticas de destilación. Como resultado, la cantidad de aceite que se descompone no es tan grande, sin embargo para ciertos hidrocarburos sesquiterpénicos ocurren ciertos reacomodamientos. Finalmente, es de interés mencionar que el enebro francés se produce por esta técnica con la especie Juniperus oxycedrus L., de la misma manera que el aceite de enebro español a partir de las especies Juniperus phoenicea L. o Juniperus sabina L.

4.2.6 PROCESOS DE EXPRESIÓN APLICADOS A LOS CÍTRICOS

Estos procesos son generalmente aplicados a los frutos de los agrios y su aplicación se conocen desde el año 1776. Rodano clasificó en varias etapas los fenómenos que ocurren durante la extracción del aceite siendo éstas las siguientes:

a) Laceración de la epidermis y de las celdas que contienen la esencia. b) Creación en la cáscara de áreas con presión mayor que sus circundantes a través de las cuales el aceite fluye al exterior. c) Abrasión de la cáscara, con la formación de pequeñas partículas de la raspadura. La extracción del aceite se realiza sobre la fruta entera o sobre la cáscara, y en ambos procesos se puede realizar con un proceso manual o mecánico.

En el Cuadro 4 se da una clasificación de estos tipos de procesos

PRODUCTO PROCESADO

Sistema PROCESO

Fruto

Manual

ESCUDILLASISTEMA DE CUCHARARALLADOR CIRCULAR

MecánicoPOR “STRIADURA”

“PELADORAS”ESPECIALES

Cascara

Manual ESPONJA

Mecánico

POR “AFUMATURA”POR PRESIÓN

ESPECIALES

Cuadro 4.- Procesos extractivos aplicados para la extracción de aceites esenciales de cítricos (Haro Guzmán, 1969).

Todos los métodos anteriormente mencionados se basan en la ruptura de las glándulas secretoras de aceite y en recolectar en forma inmediata la esencia, para evitar ser absorbida por la corteza esponjosa que resulta después de este tipo de procesos. Por esta razón todas las máquinas que procesan los cítricos cuentan con un sistema de aspersión de agua que moja constantemente la superficie del fruto.

Cabe señalar que para efectuar una buena selección del proceso a aplicar, es necesario considerar la disponibilidad y los volúmenes de materia prima a procesar. Además, cada uno de estos procesos puede ten er un a influencia considerable en lo que respecta a la calidad del aceite esencial.

La Figura 8 representa un diagrama de una máquina de extracción de aceite esencial de cítricos por sistema peladura

4.2.7 EXTRACCIÓN POR MICROONDAS.

Es una técnica patentada originalmente en Canadá (Paré y col., 1989). Consiste en aprovechar el mismo proceso de los hornos a microondas caseros, es decir en calentar el agua contenida en el material vegetal, que a su vez está inmerso en un disolvente “transparente” a las microondas, como pueden ser el Cl4C, el hexano o el tolueno. Al aumentar la temperatura del medio, se rompen las estructuras celulares que contienen a la esencia por efecto de su presión de vapor. La esencia es así liberada y disuelta en el disolvente presen te en el medio. La principal ventaja de esta técnica es su velocidad, pues pueden lograrse extracciones en minutos, cuando comparativa- mente una técnica tradicional como la hidrodifusión necesita varias horas4

La implementación del sistema de microondas a escala industrial, si bien es factible tecno- lógicamente, implica una fuerte inversión económica. Además, deben tenerse en cuenta que, como en cualquier cambio de las tecnologías tradicionales, los productos obtenidos suelen diferir en calidad de los normalmente ofrecidos en el mercado internacional, y pueden por lo tanto significar un problema para competir con el producto comercialmente consagrado

4.2.8 EXTRACCIÓN CON FLUIDOS EN ESTADO SUPERCRÍTICO.

Introducción

En un diagrama temperatura-presión que muestre los dominios de los tres estados físicos, sólido, líquido y gaseoso, se puede observar una interrupción de la curva que delimita los estados líquido y gaseoso (Figura 10); la abscisa correspondiente a dicha interrupción corresponde a la temperatura crítica, más allá de este punto se vuelve imposible la licuefacción del gas independientemente de la presión aplicada. La temperatura crítica está asociada a un a presión crítica; ambos valores fijan los valores mínimos del dominio, denominado como estado supercrítico (T>Tcrit; P >P crit).

Figura 10.- Diagrama de fases presión-temperatura para una sustancia pura.

Bajo condiciones supercríticas, las propiedades de transporte del solvente se modifican; por ejemplo, un fluido en estado supercrítico posee una densidad similar a la de los líquidos, una alta compresibilidad, muy baja viscosidad y alta difusividad. A medida que un fluido supercrítico intensifica su poder disolvente con una alta densidad, una baja viscosidad y una menor tensión superficial, se logran mejores penetraciones y difusión en el material de extracción.

La extracción con fluidos en estado supercrítico presenta algunas ventajas sobre los métodos extractivos tradicionales, algunas de estas ventajas dependen directamente del disolvente. Algunos de los efectos a considerar deberán ser:

1) El disolvente debe mostrar afinidad por los compuestos a extraer para poder solubilizarlo. 2) El disolvente debe ser inerte con respecto a los materiales con los que está en contacto bajo las condiciones de extracción. 3) El disolvente deberá tener valores de temperatura y presión críticas relativamente moderados. 4) El disolvente debe ser barato, no tóxico, de preferencia no inflamable y fácil de conseguir en altos grados de pureza. El dióxido de carbono es el disolvente de mayor utilización en el procesamiento de alimentos en los últimos años, debido a que reúne la mayor parte de las características mencionadas. Una comparación de las condiciones críticas del dióxido de carbono con las condiciones de otros disolventes puede ser vista en el Cuadro 5.

Fundamentos

El principio básico para la extracción con fluidos en estado supercrítico se basa en el cambio de propiedades de transporte y de solubilidad que presenta un solvente en este estado. Para el caso del dióxido de carbono como fluido en estado supercrítico dos factores compiten en la influencia de la solubilidad de los solutos. Al incrementar la temperatura se incrementa la presión de vapor del soluto y por lo tanto su solubilidad. Sin embargo, simultáneamente a un incremento en la temperatura se disminuye la densidad del CO2, con lo cual tiende a decrecer la solubilidad del soluto. Conforme la presión se incrementa por encima del punto crítico del dióxido de carbono (7.38 mPa), la densidad del fluido se vuelve menos dependiente de la temperatura y la presión de vapor del soluto se vuelve dominante, de manera que la solubilidad del soluto se incrementa con la temperatura. Un máximo de solubilidad puede ocurrir, pero la solubilidad de un soluto siempre se incrementa cuando aumenta la densidad del fluido supercrítico.

Aplicaciones

Si bien las aplicaciones industriales de la extracción con fluidos en estado supercrítico son limitadas, sus aplicaciones potenciales son numerosas y son actualmente el objeto de trabajos de investigación. Entre las aplicaciones “positivas” para las cuales el extracto constituye la fase noble, citemos la preparación de extractos de lúpulo, de sustancias aromáticas extraídas de especias, de café, de ciertas frutas, la separación de sustancias aromáticas a partir de biomasa. Las aplicaciones “negativas” tendientes a eliminar las sustancias indeseables como la cafeína del café o del té han suscitado un interés creciente ligado a la moda de alimentos “ligeros”: empobrecimiento calórico por eliminación de grasas, eliminación del colesterol de la mantequilla y de productos del huevo, desalcoholización de cerveza y vino, etc. A nivel industrial, se encuentran por ejemplo algunas fábricas de extracción de lúpulo y de descafeinización en Alemania. En Francia, existe una plata- forma de ensayo en Pierrelatte (CEA) y una fábrica productora de un cierto número de extractos en Grasse.

A pesar de estos pocos ejemplos de aplicación industrial, existen aún varias complicaciones que limitan el uso de la tecnología de extracción con fluidos en estado supercrítico: existen conocimientos limitados de ciertas propiedades de los fluidos supercríticos (intercambio de calor), el consumo energético y el reciclado del solvente no ha sido optimizado, existen riesgos de trabajo debido a las altas presiones, y la inversión en equipamiento es muy superior a las instalaciones de extracción con solventes clásicos. De tal manera que la extracción con fluidos supercríticos se justifica únicamente en productos de alto valor agregado y fabricado en cantidades suficientes para que las instalaciones se amorticen en un periodo razonable y para

aquellos productos que se obtengan con una calidad superior respecto a otras calidades obtenidas por técnicas menos costosas

4.2.9 ENFLEURAGE

Método tradicionalmente utilizado para extraer aceite esencial de flores delicadas como el jazmín y la rosa. Para esto se utilizan grasas naturales con puntos de ablandamiento alrededor de 40 ºC, normalmente manteca de cerdo RBD (Refinada, Blanqueada, Desodorizada). Se extiende en bandejas en profundidad no mayor a 0.5 cm y sobre ella se colocan los pétalos de flores ó el material vegetal, desde donde se van a extraer los principios odoríficos, el contacto puede durar de 3 a 5 días. Luego el material vegetal es removido y reemplazado por material fresco, esta operación se repite buscando la saturación de la grasa. Posteriormente la grasa impregnada del principio activo, se lava con alcohol libre de congéneres (alcohol de perfumería), relación 1/1 dos veces consecutivas. El alcohol se filtra y se destila a vacío ( 21 in Hg, T 30 ºC) hasta recuperar un 80 % del volumen de alcohol, como mínimo, en el fondo queda un residuo llamado “absolute”.

Este método también puede seguirse de forma fácil en casa, para preparar aceites aromáticos (sustituyendo la grasa por un aceite) o bien seguir hasta la extracción alcohólica.

4.2.10 EXTRACCIÓN CON DISOLVENTES

El término oleorresina se utiliza para designar a los exudados naturales ricos en aceites esenciales; sin embargo, es también utilizado para nombrar los extractos obtenidos mediante utilización de disolventes orgánicos en especies aromáticas, una vez que el disolvente ha sido removido completamente. Las oleorresinas de especies herbáceas contienen, además de los aceites esenciales, los aceites vegetales fijos, pigmentos, y algunos otros principios activos. La composición final es función del disolvente utilizado.

El proceso de obtención de oleorresinas en una simple etapa se muestra en la Figura 12:

MATERIA MOLIDO EXTRACCIÓN PRIMA CON DISOLVENTE

ESTANDARIZACIÓN REMOCIÓN

DE OLEORRESINA DE DISOLVENTE FILTRACION

ADITIVOS RECUPERACIÓN TRATAMIENTO DE D E DISOLVENTE DESECHOS

Figura 12.- Diagrama del proceso de obtención de oleorresinas en una simple etapa.

En primera instancia, la hierba o especia se muele para que la penetración del disolvente sea más rápida y completa. El tamaño de partícula y el tipo de equipo a utilizar son datos de especial importancia que requieren ser determinados experimentalmente.

Cualquier etapa de molienda previa provoca la pérdida de componentes volátiles. Es por ello que es conveniente evitar al máximo este detrimento de calidad. El uso de molinos criogénicos es recomendado para asegurar la menor pérdida de volátiles en la muestra. Algunas sustancias criogénicas utilizadas son: el nitrógeno líquido y el CO2líquido.

Los procesos de extracción pueden ser de una sola etapa o de dos etapas. El proceso de extracción en dos etapas requiere del uso de un destilador con arrastre con vapor a fin de separar el aceite esencial antes de la extracción.

Los disolventes posibles de utilizar y la cantidad de disolvente residual permitido están regulados por las leyes de cada país, exigiéndose en general valores menores a las partes por millón. En los Estados Un idos de América, los disolventes permitidos a utilizar son: acetona, cloruro de metileno, hexano, alcohol isopropilico, alcohol metílico. Sin embargo, los solventes clorados cada vez tienen mayores restricciones para su uso.

En la extracción en una sola etapa, la oleorresina se extrae a partir de la especie utilizando el disolvente seleccionado. La mezcla se separa y el disolvente es cuidadosamente removido llevando consigo a la oleorresina. Sin embargo, en la extracción con doble etapa, la especie es inicialmente sometida a un proceso de destilación por arrastre con vapor a fin de extraer el aceite esencial contenido. Posteriormente, la materia residual se seca y se somete a una extracción semejan te a la de una sola etapa. Una vez removido el disolvente (operación que requiere menor cuidado con respecto al de una sola etapa debido a que la muestra ya no contiene los volátiles), la porción no volátil de la oleorresina se combina con la porción volátil con el fin de formar un producto de características estandarizadas.

En ambos procesos, la extracción de la oleorresina sigue el mismo diagrama de flujo: La planta se coloca dentro de una canasta, molida hasta un tamaño de partícula que no permita la pérdida del material vegetal y la canasta se coloca en un vaso reactor con camisa de calentamiento. Se adiciona una cantidad conocida de disolvente que permita el lavado de los componentes vegetales y se permite la interacción de la materia prima con el disolvente durante cierto tiempo a una temperatura constante controlada. El proceso antes descrito puede ser llevado a cabo en sistema batch o en sistema continuo. La etapa de remoción del disolvente normalmente es llevada a cabo mediante destilación fraccionada a vacío. En un inicio, la evaporación es muy sencilla de realizar, sin embargo, a medida que el disolvente llega a una concentración cercan a al 1% en la muestra, la presión de vacío debe incrementarse a fin de evitar el incremento de temperatura de ebullición. Así mismo, es conveniente bajar la velocidad de flujo de evaporación para incrementar la eficiencia de la destilación fraccionada. Normalmente, es imposible evitar la pérdida de volátiles junto con el disolvente removido, por lo cual es recomendable incorporar un segundo sistema de destilación fraccionada aplicable a ciertas fracciones a fin de separar compuestos volátiles de interés. La fracción ligera así recuperada deberá incorporarse nuevamente a la oleorresina obtenida. La estandarización, que involucra ya sea la incorporación de algún aceite esencial o incluso de algún aceite vegetal, es una etapa necesaria a realizar a fin de restaurar el perfil aromático original de la materia prima en la oleorresina. Cualquier adición de otros aditivos deberá ser declarada en la etiqueta del producto. Debido a que las oleorresinas son líquidos muy viscosos, la adición de estos aditivos tiene el fin de bajar la viscosidad. El mezclado normalmente se efectúa mediante la utilización de un molino coloidal, un agitador con alto esfuerzo de corte o un homogeneizador.

4.3 CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia y la física. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un

sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separándose, pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de compuesto.

Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente).

Medir la proporción de los componentes de la mezcla En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.

4.3.1 CROMATOGRAFIA PLANA

En la cromatografía plana la fase estacionaria esta sujeta por una placa plana o en los poros de un papel. En este caso la fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por acción capilar o por la influencia de la gravedad

CROMATOGRAFÍA CAPA FINA (TLC)

La cromatografía en capa fina, que comenzó a usarse hacia 1950, es muy simple, barata, sensible y eficiente. Es especialmente útil cuando se quiere determinar el número de componentes de una mezcla o identificar los compuestos existentes en una mezcla.En la cromatografía de capa fina, un adsorbente está depositado formando una delgada capa sobre una placa de vidrio, papel de aluminio u otros materiales, por la que ascienden, arrastradas por un disolvente (eluyente), una o más sustancias que se pretenden separar o identificar.Con la ayuda de un capilar de vidrio, una pequeña cantidad de muestra se deposita sobre el adsorbente, muy cerca del extremo inferior de la placa. Una vez depositada la muestra, se introduce la placa en una cubeta de cromatografía, que contiene en el interior el disolvente con el que va a desarrollarse el cromatograma. La altura del disolvente en dicho frasco o cubeta debe ser tal, que éste no toque la zona donde se encuentra la pequeña mancha de producto depositado. La placa se coloca en posición vertical, ligeramente inclinada.

El disolvente asciende entonces por capilaridad a lo largo de la placa, arrastrando a los compuestos a diferentes velocidades, según el grado de adsorción de éstos produciéndose así su separación. Transcurridos unos minutos, cuando el frente del disolvente se encuentra próximo al extremo de la placa, se saca ésta de la cubeta, se deja secar y se examina. Los diversos compuestos se localizan directamente si son coloreados, o con la ayuda de un indicador o luz ultravioleta, si son incoloros.Los compuestos que avanzan a lo largo de la placa se ven atraídos por fuerzas electrostáticas sobre la superficie del adsorbente, interaccionando el disolvente con ambos. Esta interacción competitiva establece las velocidades relativas con que ascienden por la capa de adsorbente, el frente de disolvente y un determinado compuesto. Cuanto mayor es la polaridad de los compuestos, más intensamente se ven éstos atraídos por el adsorbente. Se puede establecer el orden aproximado de polaridad: ácidos carboxílicos<aminas <alcoholes y tioles <aldehídos, cetonas y ésteres <halogenuros de alquilo y arilo <hidrocarburos no saturados <hidrocarburos saturados

La actividad del adsorbente también influye en el grado de emigración del soluto, de manera análoga a la ya considerada anteriormente. Los adsorbentes más utilizados en cromatografía en capa fina, son la gel de sílice y la alúmina activada dependiendo su grado de adsorción del contenido en agua. La polaridad del disolvente influye asimismo en la velocidad de ascensión del soluto a lo largo de la capa de adsorbente. A mayor polaridad del disolvente, mayor grado de ascensión del soluto por la placa, pudiéndose establecer un orden orientativo de polaridad creciente de los disolventes: éter de petróleo <tetracloruro de carbono <ciclohexano <éter etílico <acetona <benceno <acetato de etilo <cloroformo <etanol <metanol <agua <piridina <ácido acético

Bajo unas determinadas condiciones experimentales, un compuesto dado puede recorrer una cierta distancia a lo largo de la placa. Se denomina RF a la relación existente entre la distancia recorrida por el compuesto y la recorrida por el disolvente en el mismo tiempo, es decir:RF= (distancia recorrida por el compuesto) / (distancia recorrida por el disolvente)

Naturalmente, los valores de RF para un determinado compuesto varían ampliamente con los cambios de disolvente.El valor de RF para un compuesto dado depende de su estructura y es una constante física de éste, lo mismo que lo es su punto de fusión.Puede calcularse el valor de RF para cada compuesto en cualquier cromatograma, bajo unas determinadas condiciones experimentales. La importante influencia de las condiciones experimentales hace imposible la elaboración de tablas con valores de RF.

Los datos más importantes que deben registrarse cuando se estudia un cromatograma, son:1) Adsorbente utilizado.2) Espesor y grado de activación de éste.3) Disolvente utilizado para el desarrollo del cromatograma.4) Cantidad de muestra depositada en la placa.5) Método utilizado para detectar los compuestos.6) Valor de RF para cada sustancia.

Para calcular el valor de RF. de un compuesto dado, se miden la distancia recorrida por este desde donde se depositó en la placa y la distancia recorrida por el disolvente. La medida se realiza desde el centro de la mancha. Los mejores datos se obtienen cuando las manchas no superan los 5 mm de diámetro.

4.3.2 CROMATOGRAFIA COLUMNA ( CC )

4.3.2.1 CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)

La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interactúa con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna.

a) La cromatografía gas-sólido (GSC)

En la GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorción. Precisamente este proceso de adsorción, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación limitada, ya que la retención del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. Su única aplicación es la separación de especies gaseosas de bajo peso molecular.

b) La cromatografía gas-líquido (GLC) o (GC)

La GLC utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte. La GC se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases. Éste consta de diversos componentes como el gas portador, el sistema de inyección de muestra, la columna (generalmente dentro de un horno), y el detector.

Diagrama de un cromatógrafo de gases

Gas portador

El gas portador cumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones:- Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria)- Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa- Fácilmente disponible y puro- Económico- Adecuado al detector a utilizar

El gas portador debe ser un gas inerte, para prevenir su reacción con el analito o la columna. Generalmente se emplean gases como el helio, argón, nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono, y la elección de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado. El almacenaje del gas puede ser en balas normales o empleando un generador, especialmente en el caso del nitrógeno y del hidrógeno. Luego tenemos un sistema de manómetros y reguladores de flujo para garantizar un flujo estable y un sistema de deshidratación del gas, como puede ser un tamiz molecular.

Generalmente la regulación de la presión se hace a dos niveles: un primer manómetro se sitúa a la salida de la bala o generador del gas y el otro a la entrada del cromatógrafo, donde se regula el flujo. Las presiones de entrada varían entre 10 y 25 psi, lo que da lugar a caudales de 25 a 150 mL/min en columnas de relleno y de 1 a 25 mL/min en columnas capilares. Para comprobar el caudal se puede utilizar un rotámetro o un simple medidor de pompas de jabón, el cual da una medida muy exacta del caudal volumétrico que entra a la columna.

La pureza de los gases es sumamente importante, se requieren niveles 4.5 o mayores es de 99.995 % de pureza. Sin embargo, debido al cuidado que se debe tener con la fase activa de la columna, se hace completamente necesario la instalación de trampas a la entrada del Gas carrier, estas trampas obviamente tienen una capacidad limitada, pero son importantísimas al momento de usar el Cromatografo. Estas trampas evitan el ingreso de Hidrocarburos, agua, CO entre otros.

Sistema de inyección de muestra

La inyección de muestra es un apartado crítico, ya que se debe inyectar una cantidad adecuada, y debe introducirse de tal forma (como un "tapón de vapor") que sea rápida para evitar el ensanchamiento de las bandas de salida; este efecto se da con cantidades elevadas de analito. El método más utilizado emplea una microjeringa (de capacidades de varios microlitros) para introducir el analito en una cámara de vaporización instantánea. Esta cámara está a 50 °C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil, y está sellada por una junta de goma de silicona septa o septum.

Inyector de muestra para un GC

Si es necesaria una reproducibilidad del tamaño de muestra inyectado se puede usar una válvula de seis vías o válvula de inyección, donde la cantidad a inyectar es constante y determinada por el tamaño del bucle de dicha válvula.

Si la columna empleada es rellena, el volumen a inyectar será de unos 20 μL, y en el caso de las columnas capilares dicha cantidad es menor, de 1 μL, y dependiendo del tipo de columna capilar es que si se utiliza todo el volumen de muestra inyectado. Para obtener menor cantidad de volumen, se utiliza un divisor de flujo (la inyección se conoce como modo "Split") a la entrada de la columna que desecha parte del analito introducido. Si se utiliza todo el volumen de muestra la inyección es de tipo "Splitless". El modo Splitless, se empleó más para determinar pequeñas cantidades o trazas (determinaciones ambientales).

Si se inyecta 1 microlitro de solvente, por ejemplo agua al pasar a la fase vapor su volumen se multiplicará por mil. Es decir, un microlitro de agua pasaría a ser 1 mL de agua en gas, como el volumen del puerto de inyección es limitado, se emplean split pulsado u otras configuraciones para garantizar el ingreso adecuado de las muestras.

En caso de muestras sólidas, simplemente se introducen en forma de disolución, ya que en la cámara de vaporización instantánea el disolvente se pierde en la corriente de purga y no interfiere en la elución.

Según las curvas de Van Demter (HEPT vs. Velocidad Lineal), el mejor gas a usar en la columna cromatográfica como portador de los analitos es el hidrógeno, sin embargo dada su peligrosidad, es más usado como gas de encendido en el detector FID, junto con el aire. Luego vienen, respectivamente, helio y nitrógeno. El gas hidrógeno es el mejor carrier, pero los flujos que manejan los cromatógrafos no son peligrosos, además a la salida de ellos existen restrictores de llama que evitan la propagación de un posible incendio. Por eso siempre se recomienda el uso de hidrógeno, primero por su bajo precio respecto a los otros gases y por la resolución de los picos que se muestran en los cromatogramas. Los riesgos de peligrosidad son mínimos si se CONOCE que la relación para la ignición entre aire e hidrógeno es 10 a uno (por cada 10 mL de H2, 1 de Aire), y se tiene que estar en presencia de una chispa o zona de calentamiento alta.

Columnas y sistemas de control de temperatura

En GC se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno y las tubulares abiertas o capilares.. La longitud de estas columnas es variable, de 2 a 60 metros, y están construidas en acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón. Debido a su longitud y a la necesidad de ser introducidas en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma helicolidal con longitudes de 10 a 30 cm, dependiendo del tamaño del horno.

La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separación de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisión de décimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de ebullición del analito o analitos, como también la máxima temperatura de funcionamiento de la columna (fase estacionaria), y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente superior a él. Para estos valores, el tiempo

de elución va a oscilar entre 2 y 30-40 minutos. Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullición, se ajusta la llamada rampa de temperatura con lo cual ésta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la elución ya que aunque a mayor temperatura la elución es más rápida, se corre el riesgo de descomponer el analito.

Detectores

El detector es la parte del cromatógrafo que se encarga de determinar cuándo ha salido el analito por el final de la columna. Las características de un detector ideal son:

Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisión cuándo sale analito y cuando sale sólo el gas portador. Tienen sensibilidades entre 10-8 y 10-15 g/s de analito.

Respuesta lineal al analito con un rango de varios órdenes de magnitud. Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal de salida. Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por ejemplo desde temperatura ambiente hasta unos 350-

400 °C, temperaturas típicas trabajo. Estabilidad y reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales de analito debe dar salidas de señal

iguales. Alta fiabilidad y manejo sencillo, o a prueba de operadores inexpertos. Respuesta semejante para todos los analitos, o Respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido número de analitos.

Algunos tipos de detectores:

Detector de ionización de llama (FID, Flame Ionization Detector). Detector de conductividad térmica (TCD, Thermical Conductivity Detector). Detector termoiónico (TID, ThermoIonic Detector). Detector de captura de electrones (ECD, Electrón-Capture Detector). Detector de emisión atómica (AED, Atomic Emission Detector).

Otros detectores minoritarios son el detector fotométrico de llama (PFD), empleado en compuestos como pesticidas e hidrocarburos que contengan fósforo o azufre. En este detector se hace pasar el gas eluido por una llama hidrógeno/oxígeno donde parte del fósforo se convierte en una especie HPO, la cual emite a λ = 510 y 526 nm, y simultáneamente el azufre se convierte en S2, con emisión a λ = 394 nm. Dicha radiación emitida se detecta con un fotómetro adecuado. Se han podido detectar otros elementos, como algunos halógenos, nitrógeno, estaño, germanio y otros.

En el detector de fotoionización (PID), el gas eluido al final de la columna se somete a una radiación ultravioleta con energías entre 8,3 y 11,7 eV, correspondiente a una λ = 106-149 nm. Mediante la aplicación de un potencial a la celda de ionización se genera una corriente de iones, la cual es amplificada y registrada.

Columnas y tipos de fases estacionarias

Columnas de relleno

Las columnas de relleno o empacadas consisten en unos tubos de vidrio, metal (inerte a ser posible como el acero inoxidable, Niquel, Cobre o Aluminio) o teflón, de longitud de 2 a 3 metros y un diámetro interno de unos pocos milímetros, típicamente de 2 a 4. El interior se rellena con un material sólido, finamente dividido para tener una máxima superficie de interacción y recubierto con una capa de espesores entre 50 nm y 1 μm. Para que puedan introducirse en el horno, se enrollan convenientemente.

El material de relleno ideal consiste en pequeñas partículas, esféricas y uniformes, con una buena resistencia mecánica, para tener una máxima superficie donde interaccionar la fase estacionaria y el analito. La superficie específica mínima ha de ser de 1 m²/g. Como todos los componentes de columnas para GC, debe ser inerte a altas temperaturas (~400 °C) y humectarse uniformemente con la fase líquida estacionaria durante el proceso de fabricación. El material preferido actualmente es la tierra de diatomeas natural, debido a su tamaño de poro

natural. Estas especies, ya extinguidas, utilizaban un sistema de difusión molecular para tomar nutrientes del medio y expulsar sus residuos. Por tanto, debido a que el sistema de absorción superficial del analito y la fase estacionaria es parecido, son materiales especialmente útiles.

El tamaño es crítico a la hora de darse el proceso de interacción del analito, y a menores tamaños la eficacia de la columna es mejor. Pero existe el problema de la presión necesaria para hacer circular un caudal estable de gas portador por la columna, ya que dicha presión es inversamente proporcional al cuadrado del diámetro de dichas partículas. Así, el tamaño mínimo para usar presiones máximas de 50 psi es de 250 a 149 μm.

Columnas capilares

Las columnas capilares son de dos tipos básicos: las de pared recubierta (WCOT) y las de soporte recubierto (SCOT). Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finísima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material absorbente como el empleado en las columnas de relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta última, ya que en su fabricación se emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en primer lugar están las WCOT, luego las SCOT y por último las columnas de relleno.

Las columnas WCOT se fabrican a partir de sílice fundida, conocidas como columnas tubulares abiertas de sílice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de sílice especialmente pura, sin apenas contenido de óxidos metálicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo proceso de obtención del tubo se recubre con una capa de poliimida, de esta forma la columna puede enrollarse con un diámetro de unos pocos centímetros. Estas columnas, con propiedades como baja reactividad, resistencia física y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clásicas.

Las columnas FSOT tienen diámetros internos variables, entre 250 y 320 μm (para columnas normales) y 150-200 μm para columnas de alta resolución. Estas últimas requieren menor cantidad de analito y un detector más sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con diámetros de hasta 530 μm, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores prestaciones.

En estas columnas existe un problema debido a la absorción del analito sobre la superficie de la sílice fundida, adsorción debida a la presencia de grupos silanol (Si-OH), los cuales interaccionan fuertemente con moléculas polares orgánicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por sililación con dimetilclorosilano (DMCS). La absorción debida a los óxidos metálicos se ve paliada en gran parte por la elevada pureza de la sílice empleada.

La fase estacionaria

Las propiedades necesarias para una fase estacionaria líquida inmovilizada son:

1. Características de reparto (factor de capacidad κ' y factor de selectividad α) adecuados al analito.2. Baja volatilidad, el punto de ebullición de la fase estacionaria debe ser al menos 100 °C mayor que la

máxima temperatura alcanzada en el horno.3. Baja reactividad.4. Estabilidad térmica, para evitar su descomposición durante la elución.

Existen como mucho una docena de disolventes con estas características. Para elegir uno, debe tenerse en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor polaridad del analito, mayor polaridad deberá tener la fase estacionaria. Algunas fases estacionarias utilizadas actualmente son:

Polidimetilsiloxano, fase no polar de uso general para hidrocarburos, aromáticos, polinucleares, drogas, esteroides y PCB.

Poli(fenilmetildifenil)siloxano (10% fenilo), para ésteres metílicos de ácidos grasos, alcaloides, drogas y compuestos halogenados.

Poli(fenilmetil)siloxano (50% fenilo), para drogas, esteroides, pesticidas y glicoles. Poli(trifluoropropildimetil)siloxano, para aromáticos clorados, nitroaromáticos, bencenos alquilsustituidos.

Polietilenglicol, sirve para compuestos polares, también para compuestos como glicoles, alcoholes, éteres, aceites esenciales.

Poli(dicianoalildimetil)siloxano, para ácidos grasos poliinsaturados, ácidos libres y alcoholes.

Generalmente, en columnas comerciales, la fase estacionaria se presenta enlazada y entrecruzada para impedir su pérdida durante las operaciones de elución o lavado. De esta forma se obtiene una monocapa adherida químicamente a la superficie de la columna. La reacción implicada suele ser la adición de un peróxido al líquido a fijar, iniciándose una reacción por radicales libres que tiene como resultado la formación de un enlace carbono-carbono que además incrementa su estabilidad térmica. Otra forma es la irradiación con rayos gamma.

Otro tipo de fase estacionaria son las quirales, lo cual permite resolver mezclas enantioméricas. Este tipo de fases suelen ser aminoácidos quirales o algún derivado adaptado al trabajo en columna.

El grosor de la película varía entre 0,1 y 5 μm; el grosor depende de la volatilidad del analito. Así, un analito muy volátil requerirá una capa gruesa para aumentar el tiempo de interacción y separar más efectivamente los diferentes componentes de la mezcla. Para columnas típicas (diámetros internos de 0,25 o 0,32 mm) se emplean grosores de 0,25 μm, y en las columnas macrocapilares el grosor sube hasta 1 μm. El grosor máximo suele ser de 8 μm

Aplicaciones

La GC tiene dos importantes campos de aplicación. Por una parte su capacidad para separar mezclas orgánicas complejas, compuestos organometálicos y sistemas bioquímicos. Su otra aplicación es como método para determinar cuantitativa y cualitativamente los componentes de la muestra. Para el análisis cualitativo se suele emplear el tiempo de retención, que es único para cada compuesto dadas unas determinadas condiciones (mismo gas portador, rampa de temperatura y flujo), o el volumen de retención. En aplicaciones cuantitativas, integrando las áreas de cada compuesto o midiendo su altura, con los calibrados adecuados, se obtiene la concentración o cantidad presente de cada analito.

4.3.2.2 CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS

Sólo aproximadamente 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por cromatografía de gases, ya sea porque no son suficientemente volátiles y no pasan a través de la columna, o porque son térmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de separación.

La cromatografía de líquidos de alto rendimiento o resolución (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.

La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.

La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria. Tales interacciones esencialmente no existen en la fase móvil para la cromatografía de gases. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación. El recobro de la muestra es fácil en la HPLC. Las fracciones separadas se recolectan en forma sencilla, colocando un recipiente abierto al final de la columna. El recobro es usualmente cuantitativo (exceptuando la adsorción irreversible en la columna) y los componentes separados son fácilmente aislados del disolvente de la fase móvil. Adicionalmente al tipo usual de compuestos orgánicos, la cromatografía líquida en columna puede manejar separaciones de compuestos iónicos, productos lábiles de origen natural, materiales poliméricos y compuestos polifuncionales de alto peso molecular.

a) Cromatografía de partición de alta resolución (Líquido- líquido)

La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquido y la cromatografía unida químicamente. Estas técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. En el segundo caso, como su nombre lo indica, la fase estacionaria se une químicamente a la

superficie del soporte. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la cromatografía líquido-líquido necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil.En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes.Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares.Esta técnica puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, bebidas refrescantes entre otras.

b) Cromatografía de adsorción de alta resolución (Líquido-sólido)

La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC.Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la primera la preferida.Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen.En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En este tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas.

c) Cromatografía de intercambio iónico de alta resolución

La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aniónicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto.Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad.Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios donde intervienen moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas muy cargadas, como las proteínas, se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos.En resumen la gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia.Todas estas técnicas tienen en común la existencia de una fase estacionaria a través de la cual fluye una fase móvil, así como la presencia de un mecanismo de inyección de la muestra y un mecanismo de detección de los diferentes componentes separados.La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el químico sueco Arne Tiselius, merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en esta esfera.La electroforesis es una técnica analítica de separación de fundamento cinético basada en el movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en un determinado medio (solución tampón de electroforesis), a través de una matriz o soporte reticulado como resultado de la acción de un campo eléctrico. El comportamiento de la molécula viene dado por su movilidad electroforética y ésta por la carga, tamaño y forma de la misma. Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra un ión en el seno del campo eléctrico.Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromoléculas de interés en la industria biotecnológica y química. Ha sido un método muy útil para la separación de proteínas (enzimas, hormonas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolución.

d) Cromatografía de exclusión por tamaño de alta resolución

También llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel, se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. El tiempo de elución es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una técnica reproducible, escalable y rápida.La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volumen poroso y son las últimas que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. En resumen los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del poro, el tamaño de la partícula y el flujo de elución.Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables, mecánica y químicamente, tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna.Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta.

e) Cromatografía por afinidad de alta resolución

Para esta cromatografía se requiere enlace covalente de un reactivo, llamado ligando por afinidad, con un soporte solido Los ligandos por afinidad característicos son anticuerpos, inhibidores de enzimas u otras moléculas que en forma reversible y selectiva se enlazan a las moléculas del analito en la muestra

Cuando esta pasa por la columna solo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad. Las moléculas que no se unen atraviesan la columna con la fase móvil, después que se eliminan las moléculas indeseables, los analitos retenidos pueden ser arrastrados cambiando las condiciones de la fase móvil.

4.3.2.3CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS (CFS)

La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una técnica híbrida entre la cromatografía de gases (GC) y la HPLC, que combina lo mejor de ambas técnicas. Esta técnica es importante porque permite la separación de mezclas en las que no es adecuada la aplicación de la GC ni de la HPLC. En concreto, se aplica a compuestos no volátiles o térmicamente inestables que no pueden ser separados mediante GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su detección en HPLC.

Instrumentación

Debida a las características de la fase móvil (alta presión y temperatura) se emplean equipos parecidos a los de HPLC, con varias diferencias:

El empleo de un horno termostático para poder controlar con precisión la temperatura de la fase móvil. El uso de un restrictor, empleado para poder mantener por una parte la presión en el interior de la

columna y por otra parte permitir la bajada de la presión a la salida para que el fluido supercrítico (SF en adelante) pase al estado gaseoso y pueda ser detectado adecuadamente el analito.

Básicamente, un restrictor es un tubo capilar de unos 2 a 10 cm de longitud y un diámetro interno menor al de la columna (típicamente 1/10 del diámetro), donde a la salida el SF expande y pasa al estado gaseoso y se puede mantener simultáneamente la presión en el interior de la columna.

A diferencia de la cromatografía de gases, en la SFC no se aumenta la velocidad de elución modificando la temperatura, sino la presión del SF. El aumento de presión, al aumentar la densidad, permite una mayor interacción analito-fase móvil y disminuye los tiempos de elución. Se suele emplear en las eluciones una primera etapa isobárica para luego aumentar la presión lineal o asintóticamente hasta el final de la elución.

Fases estacionarias

Se pueden emplear, al igual que en la GC, las columnas capilares o de relleno, prefiriéndose las primeras. Las dimensiones son parecidas en longitud, de 10 a 20 m, y el diámetro interno es bastante menor, de 0,05 a 0,10 mm. La película interna es de siloxano entrelazado y polimerizado. Si se emplean columnas de relleno, su diámetro interno varía entre 0,5 y 4,6 mm, y el grosor de la partícula de relleno es de 3 a 10 μm. En este caso, el recubrimiento es parecido al empleando en HPLC de reparto.

Fases móviles

La fase móvil estrella en la SFC es el dióxido de carbono, por sus excelentes propiedades:

Apolar, disuelve una gran variedad de moléculas orgánicas. Transparente a la radiación ultravioleta Inodoro No tóxico Fácil de obtener Barato No inflamable

El CO2 tiene la ventaja de que se puede obtener fácilmente como fluido supercrítico. Su temperatura crítica es de 31ºC y la presión crítica de 72,9 atm, condiciones realmente asequibles y por debajo del rango de condiciones usuales en la HPLC.

Otras fases móviles también probadas y empleadas son el etano, pentano, dietiléter, amoníaco, tetrahidrofurano, diclorofluorometano y óxido nitroso.

Detectores

Se puede emplear el detector de ionización de llama (también usado en GC), por sus características de universalidad (permite detectar casi cualquier compuesto orgánico), alta sensibilidad y bajo mantenimiento. El espectrómetro de masas también tiene utilidad, al tener una salida en fase gas, y detectores espectrofotométricos como el de infrarrojos, ultravioleta, el de emisión por fluorescencia, el termoiónico y el fotométrico de llama.

Aplicaciones

La SFC se aplica a una gran variedad de compuestos, entre los que podemos citar drogas, alimentos, herbicidas, tensioactivos, polímeros, explosivos, polímeros y aditivos para éstos, impelentes, explosivos o combustibles fósiles.

4.4 ARTEMIA SALINA

Artemia salina es una especie de crustáceo branquiópodo del orden Anostraca propia de aguas salobres continentales, de distribución cosmopolita.

Criptobiosis

Los huevos pueden permanecer metabólicamente inactivos durante largos períodos (incluso de 10 años) en condiciones de total ausencia de agua y oxígeno, y a temperaturas por debajo del punto de congelación. Esta característica inusual es llamada criptobiosis o diapausa; una vez el entorno es adecuado, la eclosión puede comenzar transcurridas las primeras ocho horas.

El adulto alcanza un centímetro de largo en promedio, y su vida media es de un año. Este rápido desarrollo, y la habilidad de sus huevos para soportar largos períodos en condiciones desfavorables, la hacen un modelo invaluable en investigaciones biológicas, algunas incluso desarrolladas en el espacio exterior. Un conocido y repetido experimento escolar consiste en estudiar la variación de las condiciones de salinidad del ambiente en el desarrollo de las larvas de Artemia.

Alimentación Artemia spp. son camarones minúsculos de cuerpo blando, de color carmelita y transparentes a la luz;pertenecen al Phylum Arthropoda, clase Crustaceae, subclase Branchiopoda. Se conocen comúnmente porel nombre de artemia .El género Artemia está compuesto por varias especies, de las cuales se han identificado al menos cinco especies bisexualesy varias poblaciones partenogenéticas, entre ellas Artemia salina Leach, Artemia persimilis Piccinelli yProsdocimi, Artemia franciscana Kellogg (bisexuales) y Artemia partenogenetica Bowen y Sterling

Al eclosionar, las larvas nauplio tienen menos de 500 micras (5x10-4 m). Se alimentan de fitoplancton, en especial algas de los géneros Chlamydomonas, Tetrahedron y Dunaliella. En laboratorios y acuarios se les suele suministrar harinas de pescado, maíz o soya, y también se suele utilizar la clara de huevo.

Estas especies se encuentran distribuidas en todo el mundo en aguas de elevada salinidad, pueden crecera temperaturas entre 6 y 35ºC. Se alimentan de algas y bacterias y son fuente de alimento para peces, pájaros y varios invertebrados. Las hembras producen huevos que, en condiciones externas favorables,eclosionan produciendo larvas de un tamaño aproximado de 1 mm. Los huevos también puedenformar quistes y permanecer en esta forma por un año o más. Las artemias se convierten en adultostranscurridas 6 a 8 semanas, alcanzando un tamaño promedio de 7mm.

5) METODOLOGIA

CL50.-Es un parámetro toxicológico que mide la concentración en el aire de una sustancia que mata al 50% de una población de la muestra después de exposición a la misma

PARA EXTRACTOS:

Realizar la colecta, Picar el material vegetal y lavar con agua corriente e inmediatamente se utilizaron para la extracción.

Para la extracción se utilizaron 300 g de material vegetal. Luego se procedió a la destilación por arrastre de vapor durante 2 horas

Evaluación de la toxicidad del extracto mediante el ensayo de letalidad con Artemia salina

Valorar la actividad tóxica in vitro del extracto mediante el ensayo de letalidad con Artemia salina evaluar 2 concentraciones del extracto: en un vaso de precipitado, con un volumen total de 10 mL de agua de mar artificial, colocar 10 larvas de A. salina y el extracto a concentración final de 1 000, 100 y 10 µg/mL. Después de 24 h de contacto, contar las larvas que sobrevivieron. La toxicidad se expresa en porcentaje de mortalidad e interpretar: 0-10 % no tóxico, 11-50 % moderadamente tóxico, 51-90 % altamente tóxico y 100 % extremadamente tóxico. Los ensayos se realizarlo por triplicado. Los porcentajes de mortalidad llevar a gráficos en función de la concentración utilizada y la línea de tendencia potencial. A partir de la ecuación de la gráfica se calcular la concentración que es letal para 50 % de la población expuesta (CL50).

PARA ACEITES ESENCIALES

Moler la corteza y luego se obtener el aceite esencial empleando la técnica de hidrodestilación. Preparar 30 µL del aceite esencial en 1 mL de diclorometano e inyectar 1 µL de esta solución en el cromatógrafo de gases. Realizar los experimentos por triplicado, para la identificación de los compuestos se usar algunos terpenos estándar, analizados bajo las mismas condiciones instrumentales, espectros de masas experimentales e índices de retención de Kovàts (Davies, 1990; Adams, 1995) Para la evaluación de la CL50 del aceite esencial sobre Artemia salina, realizar ensayos preliminares con el fin de establecer el rango de concentración que permitió la determinación de la CL 50 por el método de análisis Probit (Finney, 1971) .Para realizar los bioensayos de letalidad preparar soluciones de 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40 ug/mL, utilizando agua de mar. Por cada bioensayo preparar tres réplicas por concentración y en cada vial colocar 10 larvas en 10 mL de las soluciones a evaluar. La cantidad de DMSO escogido tomar en cuenta para preparar el control negativo con agua de mar artificial. El conteo de organismos muertos realizar a las 24 y 48 horas después de colocar las larvas en las diferentes soluciones sobre bioensayos efectuados por duplicado