Obtención de molécula de ADN recombinante La clonación del DNA puede definirse como la recombinación in vitro de un fragmento de DNA con un DNA vector con capacidad de replicación autónoma. El fragmento de DNA se replicará junto con el DNA vector en la célula hospedadora y así será posible obtenerlo en un número elevado de copias. Las etapas básicas son:

Utilización de las enzimas de restricción

1) Extracción y fragmentación específica del DNA del organismo que nos interesa.

GENOTECAS Una librería de DNA es una colección de los fragmentos derivados del genoma de un organismoIr a 1

2) Unión de los fragmentos de ADN a nuestro vector. Ya tenemos DNA aislado, hemos fragmentado el DNA de nuestro vector y queremos insertar en él nuestro gen, con el objetivo de clonarlo.

A.-Vectores de clonación.Un vector es una molécula de DNA con un origen de replicación autónomo y que posee zonas donde pueden introducirse fragmentos de DNA exógeno. Así, el DNA exógeno se replica como parte del vector en la célula receptora y hospedadora. Los vectores más usados son :

1.-Plásmidos.Moléculas de DNA bicatenario circular extracromosómico.Suelen conferir a la célula que hospedan alguna característica como la resistencia a antibióticos.Para ser utilizados como vectores los plásmidos deben cumplir unas características: -pequeño tamaño (mejor manipulación y aislamiento)-capacidad de replicación independiente de la célula hospedadora (permite obtener el DNA clonado en grandes cantidades)

2.-Virus y bacteriófagos.Ventajas frente a plásmidos:-Su introducción en las células hospedadoras es más eficaz que la que sucede con los plásmidos.-Admiten y replican fragmentos de ADN mayores que los plásmidos. -La infección viral permite que cada célula hospedadora contenga muchas copias del gen exógeno y que éste se exprese abundantemente bajo el control de los virus que son muy activos.Inconvenientes:-Su manipulación es más compleja.

El bacteriófago más conocido es el λ de E.coli

B.-Fusión del vector con el segmento de interés:

Para unir los fragmentos de DNA al vector utilizamos las DNA ligasas.Para ello hay que tener en cuenta los extremos que se nos han originado a partir de la acción de los enzimas de restricción.Ir a 2

3) Introducción en las células receptoras del DNA recombinante.

Las más usada es E. coli .Ir a 3

4) Selección de colonias que porten las moléculas de ADN recombinante.

Seleccionar aquellas colonias bacterianas que expresen nuestro DNA recombinante.En el caso de los plásmidos, lo podemos hacer utilizando la característica de resistencia a antibióticos. Sembramos las colonias de bacterias en una placa con antibiótico y sólo aquellas en las que se haya introducido el plásmido sobrevivirán(porque son las que resisten a los antibióticos)Ir a 4

5) Multiplicación del organismo transgénico

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