89591777 Transaminacion Informe Final
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TRANSAMINACIÓN
Baltazar González Chávez (1025715), Kimberly Navarro Vélez (1025088), Jezir
Valencia Gómez (1023851)
Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad del
Valle, Cali – Colombia - 2011
RESUMEN
La transaminación es una de las reacciones más importantes del catabolismo y de la
biosíntesis de los aminoácidos, en donde el grupo amino de un aminoácido es
transferido a la enzima, produciendo el correspondiente a-ceto ácido y la enzima aminada
y finalmente el grupo amino es transferido al a-ceto ácido aceptor (ej. Alfa-cetoglutarato)
formando el producto aminoácido (ej. Glutamato) y regenerando la enzima. En la práctica
se quiso colocar en prueba la reacción de transaminacion, usando como sustratos
alanina-α-cetoglutarato y a partir de la preparación de un extracto enzimático de corazón
de res, la formación de los productos piruvato y glutamato; para lograr la máxima
eficacia de la actividad enzimática, se le brindo a la enzima todas las condiciones
necesarias para que funcionara y diera los productos esperados comprobando por medio
de cromatografía de papel que la enzima era la alanina aminotransferasa por el
desplazamiento de los aminoácidos al ser revelado con ninhidrina. Se observó una
transaminación efectiva por parte de la alanina aminotransferasa presente en el extracto
enzimático, esto se evidencia con la cromatografía de papel. Concluyendo a partir de los
resultados que la enzima efectivamente convierte un a-cetoácido en un aminoácido en
presencia de otro (a.g. Alanina- a-cetoglutarato Piruvato – Glutamato).
Palabras Claves: Transaminación, Alanina Aminotransferasa, Fosfato de piridoxal,
Cromatografía, Metabolismo.
INTRODUCCIÓN:
El catabolismo de los aminoácidos ocurre de manera diferente en plantas y animales.
En las plantas, la capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico hace posible la síntesis de
aminoácidos, y ante una alta concentración de estos, el almacenaje en proteínas de
reserva, que de acuerdo a las necesidades metabólicas de la planta se usaran o
acumularan más; sin embargo, en los animales tales macromoléculas de reserva no
existen, de modo que continuamente se deben sintetizar o ingerir a través de la dieta en
forma de proteínas (Peretó et al, 2007). Cuando los aminoácidos obtenidos ya han
cumplido su objetivo en el organismo, y hay un exceso de estos, son degradados.
La degradación requiere inicialmente la eliminación del grupo α-amino; pero esta no es
una reacción fortuita, por tanto, debe realizarse mediante moléculas intermediarias
como las transaminasas, que transfieren el grupo amino al α-cetoglutarato para formar
glutamato que en la mayoría de animales, será posteriormente desaminado mediante la
enzima glutamato deshidrogenasa que utilizando NAD+ o NADP+ como agentes
oxidantes libera amonio (NH4+), que a través del ciclo de la urea se eliminará del
organismo (Berg et al, 2004); al extraer el grupo amino solo queda la estructura
carbonada del aminoácido inicial que consecutivamente será transformada en glucosa o
en acetylCoA, que intervendrán en reacciones glucogénicas o cetogénicas
respectivamente (Peretó et al, 2007).
Las transaminasas, también denominadas amino-transferasas o enzimas anapleróticas
son las encargadas de las reacciones de transaminación (anapleróticas) que fueron
descritas por primera vez por Braunstein & Kritzmann en 1938 que a su vez
determinaron su carácter reversible. Todas las aminotransferasas contienen una
coenzima de gran versatilidad, denominada fosfato de piridoxal (PLP por sus siglas en
ingles); esta coenzima se enlaza a la enzima y al sustrato formando una base de Schiff.
Este enlace es posible gracias al grupo aldehído que presenta, el cual acepta el grupo
α-amino de los aminoácidos y se convierte en fosfato de piridoxamina (PMP) que
transferirá el grupo amino a un 2-oxoácido y con esto se regenerará el PLP y se
producirá un nuevo aminoácido (Nelson & Cox, 2005).
Esta práctica de laboratorio tuvo como principal finalidad la demostración cualitativa de
la transaminación entre alanina (Ala, A) y glutamato (GLU, Q) así como la identificación
del ácido acético como inhibidor de la reacción y la comprensión de la importancia
metabólica de este proceso.
METODOLOGÍA
Se siguió el procedimiento mencionado en la guía de laboratorio de Biología Celular y
Bioquímica II. Observada en el anexo 1.
RESULTADOS
El corazón de res del cual se dispuso fue licuado y posteriormente llevado a
centrifugación. El líquido resultante tenía una textura espesa y de color rojizo salmón.
(a) (b)
Figura 1.Observacion del licuado y trasvaso de la preparación enzimática cruda. (a)Se
observa la coloración rojo-salmón del preparado mientras se trasvasa en un tubo de
centrifuga de 50 mL, (b) Medición del peso del tubo para centrifugación.
Luego de haber pesado los tubos de centrífuga con su respectivo licuado de corazón de
res se procedió a centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 15 minutos. Pasado este
tiempo, la sustancia de los tubos se estratificó en dos fases lo cual se puede observar
en la Figura 2, una fase superior acuosa (sobrenadante) que contenía el extracto
enzimático crudo y una inferior (precipitado). El extracto enzimático fue decantado en
un tubo de ensayo y los sedimentos desechados.
.
Figura 2. Resultado obtenido luego de centrifugar el licuado de corazón. Se observa las
dos fases resultantes de la centrifugación del licuado de corazón de res, arriba la fase
líquida que corresponde al extracto enzimático crudo, y abajo el sobrante que fue
desechado.
Al realizar el punto 2 de los métodos, los tubos 1 y 2 presentaron unas particulas de
color café claro flotando, a diferencia del tubo 3 que se mostró hialino (ver figura 3). A
continuación se muestra el sobrenadante y el resultado de los tubos 1, 2 y 3, del punto
2 de la guÍa.
(a) (b)
Figura 3. (a) Aspecto del tubo 1 luego del baño en ebullición, antes de la filtración, que
muestra sedimentos café claro (b) Apariencia del tubo 2 (izquierda) que presenta
partículas de coloración café claro, el tubo 3 (derecha) es incoloro y sin partículas
suspendidas.
Al haber terminado los puntos 1 y 2 de la guía de métodos se procedió a realizar la
cromatografía que duró 41:54 (min) los resultados obtenidos se pueden apreciar en la
Figura 4, donde en la primera columna (izquierda a derecha), correspondiente al
filtrado libre de proteínas del tubo 1, se observó una mancha oscura superior y otra muy
leve por debajo de la primera, en la columna 2 (filtrado libre de proteínas del tubo 2) se
observan dos manchas oscuras, en la columna 3 (Blanco) se observa una única
mancha superior y por último, en la columna 4 (sustancia patrón) se observan dos
manchas.
Figura 4. Cromatografía de los tubos 1, 2 y 3 con un patrón para comparación. Se
observa las manchas correspondientes a la cromatografía, 1, 2, 3 y P corresponden a
tubo 1, tubo 2, tubo 3 y Patrón respectivamente.
Posterior a esto se realizaron los cálculos del Rf (Formula I) de las manchas de los tubos 2 y
Patrón para comparar, la Tabla 1 ilustra los datos recogidos.
Formula I
Tabla 1. Valores de los Rf obtenidos a partir de la cromatografía. La distancia recorrida
por el solvente fue de 8.1 cm.
# Tubo Distancia
Recorrida Ala (cm)
Distancia Recorrida Glu (cm)
Rf Ala Rf Glu
Tubo 2 3,3 1,1 0,407 0,135
Patrón 2,4 1,5 0,419 0,185
DISCUSIÓN
Para la práctica de transaminación, se preparó un extracto enzimático a partir de
corazón de res. Inicialmente el corazón fue partido en pequeños trozos y se procedió a
realizar el licuado agregando amortiguador de fosfatos que es de gran importancia ya
que mantiene un pH estable para las proteínas globulares que son muy sensibles a los
cambios brucos de pH. Posteriormente la mezcla homogenizada se centrifugó durante
15 minutos para obtener el extracto enzimático crudo (sobrenadante) y se descartaron
los sedimentos celulares. Se prepararon 3 tubos de acuerdo a la metodología (anexo
1). En el tubo 1 se quiso inhibir la función enzimática de modo que se evitase la
formación de piruvato y glutamato, para ello antes de agregar el extracto enzimático, se
colocó el tubo en un baño de agua en ebullición durante 3 minutos, donde la
temperatura modificó la estructura tridimensional de la enzima y junto con la adición de
ácido acético que modifica el pH de la solución, y cambia la estructura de la proteína al
desprotonar el grupo R de la cadena lateral, se logra una desnaturalización de la
enzima y al ocurrirle esto, no se puede llevar a cabo la catálisis enzimática. (Badui
1999). Para el tubo No.2, se quería hacer que el extracto enzimático que contenía la
enzima especifica de transaminacion, funcionara correctamente; para ello se le brindó
los sustratos (alanina-α-cetoglutarato) y temperatura adecuada (37ºC) sabiendo que las
enzimas son extremadamente selectivas y solo funcionaría la que cataliza la producción
de piruvato y glutamato, conocida como alanina aminotransferasa o transaminasa
glutamicopirúvica (GPT) (Bergmeyer & Horder, 1980). Después de 30 minutos de
posible acción enzimática durante la incubación a 37ᵒC, al igual que en el tubo 1 se
inhibe la acción enzimática mediante la adición de acido acético y la exposición a un
baño en ebullición durante 3 minutos. Esto hace que las proteínas precipiten y puedan
ser filtradas quedando solo una solución libre de proteínas y posibles productos por la
acción de la enzima.
Por otra parte el tubo No. 3 fue tomado como blanco; pues éste fue sometido a las
mismas condiciones que el tubo No. 2, pero sin contener el extracto enzimático, y en
vez de este 1 mL de agua destilada, y aunque tenía los mismos sustratos que los otros
dos tubos y también se obtuvo una solución libre de proteínas, el comportamiento fue
diferente.
Posteriormente se realizó una cromatografía como método para determinar
cualitativamente la presencia de Acido Glutámico (Glu, E) como producto de la reacción
entre el ácido α-cetoglutarato y la Alanina. Específicamente, se realizó una
cromatografía de reparto en capa fina (TLC “Thin-Layer chromatography”) la cual
consiste a groso modo en la distribución de los solutos (aminoácidos) sobre la fase
estática de acuerdo a la afinidad con la fase móvil (Smith & Feinberg, 1966); para esta
práctica, la fase estática fue papel Whatman que está hecho a base de celulosa; y
como fase móvil se usó etanol, agua y amoniaco (80:10:10 respectivamente); también
se utilizaron las sustancias citadas en la metodología (Anexo 1), realizando tres
aplicaciones por cada punto para tener una concentración de aminoácidos adecuada, y
se realizó el revelado con ninhidrina al 0,2% en acetona; que debido a su fuerte poder
oxidante decarboxila y desamina al aminoácido, esta ninhidrina reducida reacciona con
otra molécula de ninhidrina no reducida y con el amoniaco resultante de la
desaminación formando un complejo violeta (Teijón,2005). En la Figura 4, las manchas
correspondientes a la sustancia patrón indican la presencia de dos aminoácidos
diferentes. La Alanina, un aminoácido no polar (hidrofóbico), esta característica le
confiere una muy poca afinidad por el solvente de la cromatografía, lo que provoca un
largo recorrido en el cromatograma (Smith & Feinberg, 1966); de modo que, la marca
superior corresponde a este aminoácido. Por deducción, la marca inferior
correspondería al Ácido Glutámico, sin embargo esta afirmación se apoya en el hecho
de que este aminoácido es polar y debido a su gran afinidad con el solvente, recorrerá
poca distancia y tendrá un Rf menor que el de la alanina, estos valores se confirman en
la Tabla 1. En todas las columnas del cromatograma se pudo observar una mancha
superior a la misma altura de la mancha de Alanina de la columna 4(P), de modo que
las manchas de las columnas 1, 2 y 3 corresponden a la porción de Alanina que no fue
transaminada. La columna 1 que contenía el filtrado libre de proteínas con control a
tiempo 0, presentó una ligera mancha inferior que demuestra la formación de una leve
transaminación; aunque se intento detener a tiempo 0 la reacción mediante la adición
de ácido acético, se llevó a cabo; lo que nos dice que esta reacción tiende a suceder de
manera espontánea; pues es una de las reacciones más comunes de un organismo
vivo. En la columna 2 que corresponde al filtrado libre de proteínas sin inhibición
inmediata, se observó una mancha inferior de coloración púrpura oscura que tiene un
Rf cercano al del Ácido Glutámico obtenido en la columna 4(P) (Tabla 1); por tanto, se
puede afirmar que hubo una transaminación entre la Alanina y el Ác. Α-cetoglutárico,
por medio de la alanina aminotransferasa, cuyo producto observado fue el Ácido
Glutámico. En la columna 3 se aplicó una preparación sin extracto enzimático, lo cual
claramente se comprueba al observar en la Figura 4 la ausencia de una mancha
púrpura inferior y por ende la no realización de una transaminación.
La reacción de Alanina + Ácido α-cetoglutárico no solo tiene como producto el Ácido
Glutámico, sino también, Piruvato (Anexo 2). Este último no tuvo comprobación en la
práctica de laboratorio, sin embargo, para detectar el Ácido Pirúvico existen varias
pruebas; las más utilizadas son la prueba del Nitroprusiato de Sodio y la prueba del 2,4
Dinitrofenilhidracina, que dan positivo al reaccionar con el carbonilo 7 etonico del
piruvato mostrando un anillo verde o azul y una coloración café-rojiza oscura
respectivamente. Estas pruebas requieren que la preparación se encuentre a un pH
ligeramente alcalino de 7.4, pues a este pH se inactiva la enzima piruvato
descarboxilasa (Lozano & Campos, 2007) y se evita la formación oxalacetato, un
intermediario implicado en la gluconeogenesis.
El proceso de la transaminación es un proceso llevado a cabo por el metabolismo, más
específicamente por el catabolismo del nitrógeno (de los aminoácidos).Este se da en el
citosol de algunas células en algunas regiones de los animales, es llevado acabo para
la síntesis de aminoácidos a partir de otros aminoácidos o de proteínas. Se basa en el
transporte del grupo amino de un aminoácido a un α-cetoácido, así el aminoácido de
partida se transforma en un α-cetoácido y el α-cetoácido de partida en un aminoácido.
Esto se puede demostrar mediante la aparición de Glutamato a partir del α-
cetoglutarato presente en el sustrato ofrecido a la enzima transaminasa, para este caso
la alanina aminotransferasa, que transporta mediante el piridoxal fosfato (derivado de la
vitamina B6) que se encuentra en el sitio activo de la enzima (Muñoz y García. 1997), el
grupo amino de la alanina a el α-cetoglutarato. Esta enzima es abundante en el hígado,
corazón y músculo (Fuentes, 2003) por esto se utilizó el corazón de res. En algunas
enfermedades a estos órganos, los procesos patológicos crean injuria tisular y
liberación de estas enzimas al plasma, aumentando la concentración de las mismas,
siendo utilizado esta medición de concentración de la enzima como indicador para
diagnóstico y pronostico.
Además de que la transaminación se da para la obtención de distintos aminoácidos,
con unas excepciones como lo son lisina, prolina, hidrixiprolina y treonina, ocurre
también como participante en los procesos de la obtención de energía, el ciclo de
Krebs. Un ejemplo de esto es la valina, la cual al ser metabolizada da α-
cetoisovalerato, este a continuación es rápidamente convertido en succinil-CoA y
utilizado en el ciclo de Krebs, sin posibilidad de volver a transaminarse.
En conclusión, la transaminación es una de las reacciones celulares más importantes y
comúnmente realizadas en organismos animales, ya que a través de ella se pueden
originar aminoácidos de los cuales haya deficiencia en el organismo y sean requeridos
en alguna ruta metabólica; sin embargo, para que haya un proceso de transaminación
efectivo, es necesario que el medio cumpla con la temperatura y acidez apropiadas a la
enzima catalizadora. Además, como se observó en la práctica, la cromatografía es un
excelente método para detectar una transaminación positiva.
BIBLIOGRAFIA
Badui S. 1999. Quimica de los Alimentos. 3 ed. 5 reimpresión. Editorial
Alhambra Mexicana. México.
Berg J., Tymoczko J., Stryer L. Biochemistry. Sexta edición. Estados Unidos. W.
H. Freeman and Company. 2004. Páginas: 656 – 661
Bergmeyer, H.U., and Horder, M. IFCC Methods for the Measurement of Catalytic Concentration of Enzymes, Part 3 IFCC Method For Alanine Aminotransferase, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 18, 521
Fuentes X. 2003. Codex de Ciencias de Laboratorio Clínico. Elsevier España. pp 740
Lozano A., Campos A., Guía No5: Reconocimiento de aldehídos y cetonas. Guía
de Laboratorio de Química Orgánica. Bogotá, Colombia. Universidad Jorge
Tadeo Lozano. 2007. Páginas : 3-6
Nelson D. and Cox M., Lehninger Principles of biochemistry Quinta edición.
Madrid. W.H and Co, 2005. Páginas:
Peretó J., Sendra R., Pamblanco M., Bañó, C. Fundamentos de Bioquímica.
Primera edición. España. Universidad de Valencia, 2007. Paginas: 249, 296-297
Teijón J.M., Garrido A. Fundamentos de bioquímica structural. Primera edición.
Argentina. Grupo editor Alfaomega, 2005. Páginas 67-68
Smith I., Feinberg J. Paper and thin layer chromatography and electrophoresis.
En Journal of Chromatography. [En línea], 1966, Volumen 23, Pagina 185.
[Citado Octubre 1 de 2011]. En línea: http://www.sciencedirect.com.
bd.univalle.edu.co/science/article/pii/S0021967301986728
Anexos
Anexo 1: Guía de laboratorio de biología celular y bioquímica II, práctica número
2, transaminación
Anexo 2. Reacción de la Alanina transaminasa como catalizador de la reacción entre
alanina y ácido α-cetoglutárico produciendo Piruvato y Acido glutámico.
Alanina