J José Lu ia Luna Calvo

4'?$ i%ioiogía

JBiologfa Experimental

86-P

30 h/s

Departamento de Farmacologfa y Toxicologfa de l Centro de Investigación y de Estudios Avanzados d e l in- t i tuto Pol i t6cnico Nacional.

Julio 7 de 1986

'Enero 5) de 1 9 8 3

Dr. J o s é Luis: Reyes Sdnchez Profesor T i t u l a r y Coordinador Académico d e l Departamento de Farniacologfa y Toxicologfa de l Centro de investigación y de Ertudios avanzado^ de l ins t i tu to Pol i t6cnico Nacional. Con l a asesorfa técnica de l a C.P.B. El-a I. Sdnchez Montes de Oca adscrita a l dsmo depart-ento.

J

I / "Estudio comparativo de dos t ipos de maceración en l a obtención de Cau'boxilesterasas/amidasa. de var ios drganos y t e j idos de rata'?

1. T i tu lo d e l Proyecto I n i c i a .

"EstUdio comnarativo de d w t i aos de maceracidn en

l a obtenci6n de Carboxiler~terasas/amidasas de var ios

drganos y t e j i dos de rata".

.^

.<_.

,. ...

. .

~

..

..-

2. Just i f i cac ión y naturaleza de l Proyecto.

E l estudio de las Oarboxilesterasas/amidasas (CE/A)

microsomales requiere de que se disponga de e l l a s con l a

mayor aure+za y cantidad posibles. Los diverso8 métodos de

puri f icaci6n (1-3) invariablemente abaten l a actividad

eniimática obtenida. EF p o r l o tanto, conveniente que

durante el proceso de aislamiento, especialmente durante

l a maceración se lopre i a máxima ruptura celular.

aumentar e l nfamero de cé l iAas i isadas se espera que

la frciccidn microsomai y l a actividad enzimática unida

e l l a también se incrementc.

Combente se ha empleado un homogenizador de l

t iuo Potter-Elvejhem (1,4--6) unido a un motor Sorvall t

a

Omni Mixer (Dupont Instruments). Sin embargo, en algunas

ocasiones l a actividad ensimdtica obtenida a p a r t i r de l

material macerado no es suf ic iente para las cuantif icaciones

requeridas. Es posible que e l macerador denominado Polytron

(Brlnkmann Instruments) r ea l i c e una homogenizacidn m&

e f i c i en t e ya que e l maceramiento con es te aparato s e l l e v a

a cabo mediante cuchil las rotator ias, mientra? que e l

PottefiElvejhem act& mediante f r icc idn. La probable

eievscidn de l a actividad enzimática proporcionaría los

I .

requerimientos necesarios y permit ir ia e l ahorro de

material bioldgico.

E l presente proyecto, de naturaleza básica, se

desarrol lará para establecer l a comparacibn de l a

ac6ividad enzimática entre l o s productos de l a maceracibn

lograda con dos t ipos diP.tintos de homogenizadores. E l

conocimiento de l a s caracter ís t icas d e l Polytron como

macerador en l a obtención de las CE/A y su contraste

respecto a l PottemElvejhnm permitirá establecer l a

conveniencia d e l uso de cualquiera de e l l o s en e l estudio

de estas enzimas. -

3. Introduccibn.

A p a r t i r de 1953 empieza a establecerse l a

di ferenciacibn entre l a s esterasas especí f icas (Acet i l -

coi inesterasas) y las esterasas inespecif icas, en ese

momento denominadas Dseudocolinesterasas, mediante e l

empleo de comnuestos organofosforados ( 7 ) . Ei uso de

estos comnuec tos también permitió l a discriminacibn de las esterearn ineRpecfficas entre s i . 1.)i comportamiento de

estas enximas f rente a lor! orgemofosforadoP permiti6 l a

deducci6n de su primera ci.asif icatribn. Se establecieron

los t ipos A+B y C dependianño de sf l a s e'terasas:

( A ) son capaces de h idro l i zar organofosforados; (B) son

inhibidas nor e l l o s o ( C ) no se nresenta ninguna de l a s

situaciones anteriores (8,9,iO). Lac esterasas

inespecff icas han recibido diversos nombres (Ari lesterasas, - Alquiiesterasas, etc. ) aquí se l e s denominará

c arboxi ies terasas/amidasas t érmino ampi io capaz de

subst i tuir a l o s &em& nomibres. Los problemas que se han

presentado en l a nomenclatura y l a determinacidn de l &digo

eneim(ttico fueron revisados por Walker y lacknees (11).

La administracidn tie insecticidas organofosforados

en l a alimentaaidn de lacs ratee disminuye significativa-

mente l a actividad de algunas CE/A (tipo B) reepeoto de

iaa coiinesterasas en higado, riñdn y suero sanguine0 (12). Sin embargo, l a actividad de las C W A microsomales de hfgaao

de rata (eoterasacs de l tiipo A) sobre insecticidas organo-

fosforedos y piretroides como e l maiatidn, peraoxdn y

fenvalerato parece confirmar e l papel de estas emimas

como una v i a de destoxificacidn (4) . Se ha logrado

identi f icar una CE/A hepática especif i c a de l paraoxdn

(paraoxonasa) localizada fundamentalmente en i a fraccidn

microsomal, constituida en forma de un complejo

calcio-protefna, con un rango de pH óptimo de 7.2-7.8 (13).

Por eiectrofóresis se han identificado un gran número

de eneimas hidrol ft icaa en l a fraccidn microsomdl de

hepatocitos. Cinco de las principalee CE/A aaf como una

aminopeptidasa fueron altmente purificades; l a

diferenciacidn pudo establecerse mediante sus diversos

puntos iaoeléctricos (PI= 6 , PI= 5.6, PI= 5.2, pi= 6.2 y .-

Q I m 6.4). Todas las CE/A presentaron subunidades de peso

molecular similar, en contraste, l a aminopeptidaea presentó

una subunidad de peso moiecuiar mayor. Lacs CE/A hidrolizaron

considerablemente algunos mono gl icér id os y f u(9m 1 inhibidas

por compuestos organofosforados por e l l o se designaron cono

eeterasa? de l t i po B. La similitud precentada en cuanto a su

peso molecular, e l que todas mostrar& un bajo contenido de

, be,xosas así como su afinidad similar hacia algunos sustratos,

eugir ieron l a posibilidfui de que se trataFje de l a misma

pro t e h a sometida a mod if i c ac iones transcripc ionales . Pero,

aigunos estudios de car& ter inmunoi6gico indicaron que

~ 6 1 0 dos de las CE/A (PI= 6.4 y PI= 6.2) est& relacionadas

- __ íntimamente (14). En especial l a CE/A de PI= 5.2 pudo ser -

resue l ta en otras dos enzimas que hidrol izaron

predominantemente t a t o &teres de l a carnit ina como

d ig l i ckr idos . Ea posible iiue una de eptas dos enzimas

resuelta3 en combinación Ron l a aci l tran-ferasa, es te

implicada en e l transporte de l a carnit ina fuera de l a s

cé lulas hepaticas. Igualmente se planted para ambas enzimas

l a funcibn como ageentee hidrol izantes de m i l ca rn i t inas de

cadena larga, compuestos (mpliamente conocidos por su

capacidad de l i sar membrana- (15).

I..

. .

. ."

Las CE/A participan activamente en e l metabolismo

de diversos fdrmacos que poseen enlaces &ter y amida (16).

Se ha probed6 suficientemente l a capacidad de estas enzimas

en l a h id rd l i s i s de anesthsicos y carcinógenos en diversos

órganos de ra ta (17). Ent:re estos órganos, e l hígado

presentó l a rzcti-idad enzimática m& alta, dos CE/A

-= microsomales h e ~ d t i c a s fueron aioladae y se establec ió su

part ic ipación en l a hidró ' l ie is de algunoR deteres de l a

hidrocortisona, en wosible que también actúen en l a

degradación de algunas otras drogas esteroides (6). La

h id rd l i s i s de un f h n a c o ampliamente conocido como e l

h i d o a c e t i l s a l i c f l i c o (aFpirina) fue descr i ta en varios

6rganos y t e j i dos como e l hígado, e l riñon, l a mucosa

g th t r i ca y l a mucosa inteatinal. Tambi6n se ha descr i to l a

h i d r ó l i s i s de este fármaco en e l plasma y en los er i t roc i to6

de algunos vertebrados (18-20, 22). Aparentemente do8 CE/A

d e l t i p o B son las principales enzima8 responsables del

catabolism0 de i a aspirina (21).

Cabe señalar que 1 , ~ mucosa intest ina l part ic ipa

activamente en la hldrd l ia i s de algunos f h a c o s con

enlace? d e l t i p o &ter , erspecialmente durante e l proceso de

absorción. La actividad h i a r o l f t i c a de ePte t e j ido , propor-

cionada por i a ~ CE/A microsomales, d i f i e r e ampliamente

entre la9 diversas especies (1). Se ha logrado demostrar

que i a actividad enzimática ?e l o c a l i z a predominantemente

en iaa c6iuia.i mdv super f ic ia iee de l a mucosa, eFto es,

en l ae célula? de l a s va1:toeidade~ (27). De l a mucosa fue

ais lada una CE/A con un pcmo molecular de aproximadamente

55 000. Esta enzima uurificada fue capaz de h idro l i zar

aspir ina,c lor f ibrato y proc-.frn (73).

.

%a degradación de fármaco~ de l t i no & t e r aor las CE/A puede disminuir su actividad terapéutica. Sin embargo

l a h id rd l i s i s no siempre representa una desventaja. Puede

w a r s e e*-te hecho para e l empleo de drogas biorreversibles,

como se ha p1.anbeeBo para algunos conpuestos con

actividad ant i t urnoral ( 24 ,, 25 ) .

, .

. ..

4. Antecedentes

E l proceso de maceración se ha l levedo a cabo con

instrumentos eenc i l los como e l mortero y actueilmente se

r e a l i z a con maceradores mechicos m á a compie jos y e f ic ientes.

En ocasiones al proceso de maceracidn l e eiguen otro t i po de

tratamientos como l a adición de detergentea o e l empleo de

ultrasonido. Todo e l l o para t ratar d e l ograr l a maxima

l i s i s celular.

Como ya ve ha mencionado anteriormente, e l macerador

PotteF-Elvejhem es muy empleado para el proceso de homo-

genización. La frecucincia de .u uso ha permitido conocer

cuales son l a s comliciones óptimas para su emaieo, no

sucede igual respecto a l Polytron. E l dlseño estructural

de l Poiytron l e permite no s610 e l maceramiento de materiai

b io lóg ico (ob je t ivo para e1 que fue construido), también l e

permite e l fraccionamiento de materiales de consistencia

inucho m& dura. Es especialmente con este &timo t ipo de

materiales con l o s que ha sido usado m á s frecuentemente. La

razón anterior es por l a cual no se ha podido establecer en

qué condiciones y con qué t ipo de material b io lógico puede

ser usado confiablemente.

Durante e l deearrol lo de l presente proyecto e l

Potter-Elvejhem y e1 Polgtron per& u ~ a d o e como maaeradoref - -

- de dos órganos (hígado y riñón) y de dos t e j idos (mucosa _ _ g4str ica y mucosa in tes t ina l ) de l a ra ta macho. En l o s que

ee sabe poseen una a l t a actividad enzimática, especialmente

local izada en l a f raación microsomal. La actividad h i d r o l í t i c a de l a s CE/A microsomales es posible de ser

valorada mediante e l empleo de t res sustratos. E l acetato

de pn i t r o f eno l quien debido a su a l t a inespecif ic idab - ._ iermite medir aproximadamente l a actividad t o t a l de estas -

enzimas. LOR otros dos sustratos, e l &ido a c e t i l s a i i c f l i c o

y l a acetani l ida son mds eppecfficon por l o que proporcionan

parhetrou de comoaracidn mds exactos. Tonto el acetato de

p-nitrofenoi como e l ácido a c e t i i u a i c í i i c o poeeen enlaces

érter, l a acetani l ida porse un enlace d e l t i p o mida.

Los productor; de 113 hidr6lisi.c enziniática de ertop

sustrato3 (p-nitrofenoi , &ido o a i i c i i i c o y anil ina), a r i

como l a cantidad de prote:[na emwleada en l a s reacciones

enzimáticap pueden Fer cutmtif icados espectrofotomdtrica-

mente.

5. Objetivo.

E l ob je t i vo de l presente proyecto ep:

Establecer sf e l UUO de l maceredor Polytron (Brinkmann

Instruments) permite l a r od i z a c i 6n de una maceracidn más

e f e c t i v a que l a obtenida con e l homogenizador Potter-Elve jhem , .

(Dupont Inetrumsnts). La comparaci6n'ds ambos maceradores

l l e v a r 4 a 'cabo mediante la'determinacibn de l a actividad

enzim6.tica . de . l n e . 'C~boxi l .e~ter&~ah/ . - ida : .e r ! microsomales

. . :

I 1

presentss en hígado, riñón, mucoea gáetr ica y mucoua intest i -

nal de ra ta ;VinFtar macho. Para r e a l i z a r esta comparaci6n se

emplearán como sustratoe e l acetato de p n i t r o f e n o i , e l

ácido a c e t i l s a l i c f l i c o y l a acetanilida.

He t odologf a de trabajo . 1. Obtencidn de drganos y te j idos.

Se u t i l i z an ratas Winstar macho, mantenidas con l i b r e

acceso a comida y agua. Se pacri f ican por disiocacidn

eerv ica i y se l e s pract ica una laparatomía. según sea e i

caso se tratan l o s drgsinocs y t e j idos de l a siguiente manera:

a) E l hígado se perfunde con solucidn sa l ina ieotdnica (SSI)

-

f r í a , a través de l a vena suprahepática durante varios

minutos hasta que l a coioracibn d e l drgano demuestre que

l a sangre ha -al ido cas i totaimente. Entonces e l 6rgano

se extrae y @e pepa.

b) Los riñoneir Fe someten a un proceso s imi lar al indicado en

e l inciso anterior. S610 que l a aerfusidn ce r e a l i z a a

través de l a a r t e r i a renal.

c ) Para obtener l a mucosa Rdetrica se extrae e l estdmago y se

abre a l o l a rgo de l a curvatura mayor. Se lava con S S I

para eliminar e l contenido g b t r i c o y se raspa con una

e s d t u l a con un poco de buf fer de f os fa tos 1 0 W .

d ) La mucosa intest ina l st) obtiene de un fragmento del t e r c i o

superior d e l yeyuno. El. intestino seccionado se abre

iongitudinaimente y se lava con ssi f r í a . La mucosa se

raspa con un poco de buf fer de f os fa tos 100 mM.

2- iüaceracibn y Obtención de micro soma^.

Los drganos y te j idoF obtenidos se dividen en dos

porciones iguales. Una de la6 porciones se homogeniza en

un macersdor d e l t i p o Potter-Elvejhem y l a o tra en un maceredor d e l t i p o Polytran. Ambas maceraciones serea l i zan

. ..

a l 20-2591, (P/V) (V/V) en buf fer de f os fa tos 100 mM. E l

material macerado Fe t ranr f i e re a tuboe de l a c e n t r i f w a

refr igerada ".Orval1 (:nodelo RC-5) y ?e centri fuga a 10 O00

revolucione. por minuto(rpm) durante 30 min. de l eobrena- ._

dante (sobrenadante poRtmxtocondriel), se obtiene @l volumen

y r e aeepa caCi2 0.8

de 8 mM. La mezcla se ag i t a esporadicamente durante 5 min. manteniendola en hielo. Se vuelve a centri fugar a 1 5 000 rpm

durante 1.5 .nin. Las pa~ t i l . l a s obtenidas se resuspenden en

y Fe l l e v a a concentracibn f i n a l

amortiguador de fos fatos 1.00mBn en e l mismo volumen y se -

centri fuga nuevamente a 15 O00 rpm nor 10 min.

La resuspencidn f i r i a i .=e hace en l a mitad d e l volumen

de l arimer sobrenadante con amortiguador de fos fatos 50 iiiM.

3. Determinacidn de p-nitrofenol como producto de l a hidrblisir-.

de acetato de p-nitrofenol..

fii-te método est4 bafado en e l reportado por Heymann y

Wentlein en Methods i n knsymology, 1981 (26).

".e ca l i b ra e l espectrofotdmetro (Beckman mod. 96 )

usando agua bidest i lada y se wa f i c a l a l i nea baaai por 30 seg.

(1 pula) con l a s siguienttts condiciones:x= 400nm, SPAN= 0.1 y

VC= 7 od.g/min.

Se g ra f i ca l a basal. de agua contra Tris-HC1 50 mM,

OH= 8, duran6e e l mismo tiempo y en las mismas condiciones

anteriores.

La actividad enzimatica, a s í como l a no enrimática se

obtienen praficando e l incremento de absorbancia de lap

nieeclaa preparadas como sigue:

T r i s - H C 1 Hp-NP (@I (Pl)

Activ. no enzi- mática. 500 5

mducoRa g tk t r i ca 500 5 Mucopa Intest i - nal 500 5

R ifión 5 O0 5 H %gad o 500 5

Las reaccione? no eiizim4ticas

Alicuota d e l t e j i do (pl)

10

20 ( 1 : l O )

20 (1:10)

y enzim4ticar de dejan

correr durante 30 reg. (1 uuig,. Cada una de l a s reacciones

se hace nor dunlicado. La- cmdicionep de ?. y Vc (velocidad

de c w t a d e l graf icodor r(? mantienen ,?in variar.

4. l~eterminacidn de ácido F a l i c í l i c o como oroducto de l a hidrd

1 i p i s d e l &ido ace t i l ca l i c f l i co .

EFte método e? tá barado en e i renortado por Spenney

en Anal. Biochern., 1977 (?7).

C m a determinación consh te de ?or l o menos 4 tubos.

La comaosicidn de cada uno de 108 tubos * a l a siguiente:

1 Opl 5 n i n 5 min

AAS , 2OOmM - incubaci6n 37- 3 8 O C -- -- A'TCA 10 % 30Opl 3GOpi. 3 o v 3 0 0 u

I 191

P84 = Amortiguador de f o s f a t os H = hígado

AAS = &id7 aceti lsal icf1:Lco R = riñón

ATCA = ácido t r i c l o roacdt i co M(r = nucoaa gáFtrica - NI = mucoFa inteet ina l

E l tubo A e@ e l control de lec tura d e l amnTtiguador solo.

El tubo B ea e l control no ennimático ( h i d r b i i s i s espontánea)

dsl AAS

E l tubo C es e l control de lec tura d e l te j ido .

E l tubo D es e l tubo en que Fe rnide l a actividad enzimática

d e l t e j i d o sobre e l AAS.

Despude de agregar e l ATCA (para detener l a reacción), l o s

tubos C y D se centr i fuga l a 3 300 rpm por 5 rnin.

De l o s tubos A y B r e toman l a s lecturas de Densidad üptica

(D.O.) a 300 nm directamente. En l o s tubos C y D se mide

l a D.O. a l a misma , pero d e l sobrenadante obtenido después

de c e n t r i f u g e .

En e l caso de l o s t e j i do? , cuando se usa hígado o riñbn

l a a l ícuota es de 50yl . Cuando es rnucoRa in tes t ina l o

gástr ica l a a l ícuota en do low. La cantidad de buf fer de

f oa fa tos $e ajusta a l a cantidad de t e j i d o como s0

muestra en l a tabla. Ya que e l volumen de reacción siempre

será de 0.5 ml.

4. Determinación de ani l ina como producto de l a h id ró l i s i s

de acetanilida.

Cada determinaci6n consiste de dos lecturas. La

primera ( A ) es e1 control de l a lec tura de l amortiguador

y l a segunda (B ) e. l a que cuent i f i ca l a actividad

enzimática de cualquiera tie l o s t e j i dos ciobre l a

acetanilida. La composicidn de cada una de l a s mezclas

de reacción s e describen B continuacidn:

k B - iilgado Rifión Mucosa Mucosa

G &u tr i c a In t e? t ina l

T r ie-HC1

Tej ido (fl) -- 10~0 100 390 390

Acetanilids -- 1 0 10 10 10 C.2M Cy11 ATCA 10% (a) 200 400 400 400 400

-- -- 5Omld,nH=8 (yl) 300 3 90 390

La reaccidn enzimática se incuba a 37-38OC durante

20 min y Fe Ruspende con e l &ido t r ic loroacdt ico ATCA al

io$. La mezcla se centri fupa a 2 500 rom por 5 m i n . y se

400 p d e l sobrenadante. Se l e añaden 200 Jil de

NaNO.;> - 0.756 y se incuban a temperatura ambiente por 1 5 min.

Se añaden 300 yl de Sulfamato de amonio al 2.5% y se mezcla

bien. Se incuba a temoerature ambiente wor 1 min. Se afladen 200 p i de acetato de sodio 3M. Se apeean 700pl de

N-Naftiletilendiamina a l 0.1%. Fe incuba a temperatura

ambiente 5 min y derwd- re añaden 'O0 p l de Ha1 4N. Por último se l e e l a DenPidad Optica a 557 run.

5. neterminaci6n de proteína<-

La determinacidn de proteínaF ?e l l e va rá a, pabn

ue&n e l mdtodo de Lowry, RoPebrough, Parr y Randall en

J . Biol. Chem., 1951,(28).

Tartrato de sodio 0.02%) con 1 m l d e l Reactivo B(CuS04 0.5%).

Formando e l react ivo de coloración. Se hacen l a s diluciones

apropiadae de l a s muestrais (nota a l f i n a l ) con a@a

bidest i lo-a para obtener concentracionee aproximadas de

trabajo de 1 a 5 m d m l . Mezclar nérfectamente. A 10 fl de l a d i luc ión de l a mueetra o a loa reFoectivoe p l d, - - curva emthdar, se &aden 1 m l de react ivo de coloraci6n.

Se mezclan 50 m l d e l Reactivo A (NaCO3 ¿$, NaOH 0.1N,

Se mezcla bien y -e de ja reporar 10 min a teinnerntura

ambiente. Pa-ado ece tiemno, ?e apegan 100 pi de react ivo

de Fo l in 1 N, R B mezcla inmediatamente y Fe de ja reposar

30 min a temperatura ambiente. Se l e e en e l esnectro-

fotdmetro a 750 nm.

Nota: Diluciones aoroximadas.

Tejidos @ ~ i l u c i d n Hígado 10 1: 2

Riñón 10 1: 2

Inte- t ina l 15 -.-

G& t r i c a ?O -.-

Mucoea

Mucosa

"-

R. Li tera tura Citada

L) bi. Inoue, hi. Morikawa, M. Tsuboi y,M. Sugiura,

JEnan J . Pharmacol. an 9 (1979) .

2 ) t?.J. !:weet, L.C. Mattheue y T. Richardfion,

Arch. Biochem. BioDhys,. u, 1 4 4 (1984) .

3 ) R. Ment2ein, S . Héilanit y E. Heymann, Arch. Biochem. Bioohys.. E, 547 (1984) .

4 ) L.R. Kao, N. Motoyama y 'V1.C. Dauterman,

P e s t i c . Biochem. PhyRiol. 3, 66 (1985) .

5 ) B. f i i i y ' s . Kaur,

J. Pharmac. exp. 'l'her. a, 589 (1973) .

6 ) B. A l i , S . K a u r , E.C. James y S.S. Parmar,

Biochem. Pharmac. 2, 1881 (1985) .

7 ) W . N . Aldridqe, Biochem. J . a, 67 (1953a) .

8 ) W . N . Alar idee , Biochem,. J . a, 110 (1953b).

9 ) t i . N . Aldridge, Biwhem., J . 2, 117 ( 1 9 5 3 ~ ) .

10) P. Bermgman, R. Segal :r S. Rimon,

Riochem. J . - 6 7 , 481 (1:?57).

11) C.H. Nalker y M.I. fiaclcness,

Biochem. Pharmac. 2, :I765 (1983) .

1 2 ) M. Su, P.F.. Kinoshi ta y J.P. Frawley,

Tox. i lppl . Pharmacol. ?O, 2 4 1 ( 1 9 7 1 ) .

1 3 ) J .E. NlcIvain, J. Ti;nm:cyk y T. Nakatsugawa,

P e - t i c . Biochem. P h y s i o l . 21, 16:' (1984) .

1 4 ) W . Mentle in , M. Schurnaiin y L. Heymann,

Arch. Hiuchen. Biophys,,. 214, 6 1 2 (1964) .

Arch. k c h e m . Biopiiys.. x, 801 (1985).

. .

15) ii. fdeiitlein, G. Aeuter y d. Heyiiiann,

. ..

1 6 ) E. Heymann: en i ce tabol i c Bar i? of Detoxica t ion .

-- (eoP. vv.6. Jakoby, J . R e Bend y J . Cadwell) p. 2 2 9 ,

Academic P r e s s , New Y0i.k (19%’).

1 7 ) B. A l l , E.C. James, S. Kaur, S . J . Brumleve y S . $ , Parmar,

r r o c . iieFt. Pharrnac. Soc. 3, 359 (19843.

1 8 ) H . 3 . ityiance y R. Wallnce,

Br. J . c l i n . Phemac. 2.2, 437 ( 1 9 8 1 ) .

1 9 ) L. Horton y K. Hendstrom,

Acta Pharmac. Tox. 3, 1 5 5 (1971) .

20) K.N. White y B.D. Hope,, Biochem. J

2 1 ) B. A l i y S. Kaur,

J . Pharrnacol. erp. Thei-. 376, 589 . . .

2 2 ) J .H. Dawson y J .H. B r i d g e s ,

Biochem. Pharmac. lo, :?415 ( 1 9 8 1 ) .

iy7, 771 (1381) .

1Y83).

2 3 ) M. Inoue, M. Morikawa, M. Tsuboi, T. Yaroada y Ni. Sugiura ,

Japan 3 . Pharmacol. a,, 17 ( i Y 7 9 ) .

2 4 ) A.A. :inkula y S.H. Yal.kowsky,

J . Pharm. S c i . 9, 1 8 1 (1975) .

2 5 ) T. Kamaguchi y fU. S a i t o , (;hem. Pharmac. Bull. 2, 1 6 5 2 ( 1 9 8 5 ) .

26) E. Heymann y E. Ment1ej.n: en Methods i n Enzymology.

( e d s . :!.B. j u o b y ) P. 1\35, vol. 7 7 , 1icadeuiic Press,

New Y o r k (1981).

-

27) J . G . Spenney, Anal. Biochem. - 80, 578 ( 1 9 7 7 )

2 8 ) O.H. Lowry, N . J . aosebrough, A . J j . Parr, y H.J. Randall ,

J . B i o l . Chem. u, 365 (1351)

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JOSE LUIS LUNA CALVO I.

80222886

86-S-167

B i o l o g í a

B i o l o g í a Exper imenta l

87-1

20 h/s

Departamento de F a r m a c o l o g í a y T o x i c o l o g í a de l Centro de I n v e s t i g a c i d n y de E s t u d i o s Avanzados del

I n s t i t u t o P o l i t 6 c n i c o N a c i o n a l .

J u l i o 7 de 1986

Marzo 5 de 1987

Dr. José Luis Reyes Sánchez, Profesor Ti tular y Dr. Francisco A . Posadas del Rio, Profesor Adjunto del Departamento de Farmacolo- gia y Toxicologfa del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Inst i tuto Politécnico Nacional. Con l a asesoría de l a Q.F.B. Elsa I . Sánchez Montes de Oca, ayudante de Investi- gación del mismo Departamento.

" E s t u d i o c o m p a r a t i v o de dos t i p o s de m a c e r a c i ó n en l a a c t i v i d a d de l a s Carboxiiesterasas/Amidasas de v a r i o s Órganos y t e j i d o s de r a t a s a d u l t a s machos" .

A. Título del Informe Final.

"ESTUDIO COMPARATIVO DE DOS TIPOS DE MACERACION EN LA ACTIVIDAD DE LAS CARBOXILESTERASAS/AMIDASAS DE VARIOS ORGANOS Y TEJIDOS DE RATAS ADULTAS PACHOS".

B. Introducción.

La caracterizacion de cualquier enzima requiere que se dis- pongada la mayor cantidad y pureza de la mism. es conveniente que al inicio del proceso de purificación, espe- cialmente durante la maceración, se logre la ruptura máxima de las células que se pretende estudiar. Al aumentar el número de células lisadas se esperaría que aumente la cantidad de la frac- ción subcelular que contiene la enzima y por lo mismo, la acti- vidad total.

Por lo tanto

La mayoría de los investigadores que han estudiado las Carboxilesterasas/Amidasas (CE/A) de varios órganos de la rata, utilizan el macerador tipo Potter-Elvejhem acoplado a un motor (1-5). las células entre un recipiente de vidrio y un émbolo, que puede ser de teflón. llas rotatorias pudiera ser más eficiente que el método antes mencionado.

Este macerador efectúa la ruptura por friccibn, al forzar

Es posible que la mceracián realizada con cuchi-

El estudio presente, de naturaleza básica, se desarrolló para establecer la comparación de la actividad enzimática lograda con dos tipos distintos de maceradores. El conocimiento de las características del Polytron como mcerador, en la obtención de las CE/A y su contraste respecto al Potter-Elvehjem, permitió establecer la conveniencia de su uti1 ización en el estudio de es- tas enzimas.

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Las Carboxilesterasas/Amidasas son proteínas que ctltal izan la hidrdlisis de xenobióticos que contienen grupos carboxiléster, tioéster y arilamida en su molécula (6) .

cuentran amp1 iamente distribuidas en tejidos de vertebrados, in- sectos, plantas, micobacterias y hongos. (7).

Estas enzimas se en-

El tipo de CE/A mejor definido y al parecer el mds relevante en las reacciones de biotransformacidn corresponde a las llamadas Esterasas B o Hidrolasas de serina. Estas enzimas se han encon- trado en la mayoría de los drganos (eT hígado, los riñones, el estómago, el intestino delgado, los pulmones y el cerebro), de los mamfferos estudiados. El higado contiene la mhs alta activi- dad esterákica hacia sustratos aromáticos y al ifáticos simples. La actividad enzimática de las CE/A hepáticas, renales y cerebra- les se local iza predominantemente en el sistema reticuloendoplás- mico liso (fracción microsámica) de estas células (6,7).

Las CE/A purificadas del hígado de ratas hidrolizan ésteres alifáticos y aromdticos (Butirato de Metilo, Acetato de 4-Nitro- fenol y Acido Acetilsalicilico), amidas (Acetanilida, y Fenacetina) y tioésteres (Acetato de tiofenol). Sin embargo, las amidas son generalmente mhs resistentes a la hidrólisis enzimática que los ésteres de estructura similar mientras los tioésteres son hidro- 1 izados con mayor rapidez que los ésteres correspondientes (8,9).

En las ultimas pub1 icaciones mencionadas también se demostró que las esterasas tienen actividades altas y constantes de Michaelis y knten pequeñas con lípidos naturales. punto isoeléctrico (PI), 6.4 y 6.2 hidrolizan una gran variedad de lípidos COM palmitoil-COA J: monogiicéridos que contienen ácidos grasos con más de 10 carbonos (Hidrolasas de Palmitol-COA). esterasa de PI 6.0 tiene actividad preferencial hacia ésteres de ácidos grasos de longitud intermedia (Hidrolasa de Octanoilo). Por Último, las esterasas de pl 5.6 y 5.2 actüan sobre palmitoil

Así, las esterasas de

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carnitina y lisofosfolipidos (Hidrolasas de Palmitoil Carnitina). Estos resultados sugieren que las Hidrolasas parecen participar en la protección de las membranas celulares a través de la inacti- vación de algunos detergentes naturaTes como palmitoil carnitina y monogl icéridos (10).

C.- Objetivo.

El objetivo del estudio presente pretendió establecer si el uso del macerador Polytron (Brinkmann Instruments) permite la realización de una naceración celular más efectiva que el homoge- neizador Potter-El vejhem (Dupont Instruments). La comparación se llevó a cabo mediante la determinacidn de la actividad enzimbtica de las Carboxilesterasas/Amidasas microsómicas del hígado, los riñones, la mucosa gdstrica y la mucosa intestinal de ratas machos adultas, uti1 izando tres sustratos: a) El Acetato de p-Nitrofenol, que debido a su baja especificidad, proporcionó información sobre la actividad total de estas enzimas y b) El Acido Acetilsalicílico y la Acetanilida, cuya especificidad permitió la comparación de pardmetros d s relevantes.

O.- Material y Métodos.

1 . Obtenci6n de órganos y tejidos.

Se utilizaron ratas Wistar adultas machos, que se mantuvieron con libre acceso a comida y agua antes de los experimentos. Las ratas se sacrificaron por dislocación cervical y se les practicó lauparotomía. El hígado se perfundió con solución salina isotó- nica ( S S I ) fría, a través de la vena suprahepdtica, durante varios minutos. La perfusidn se suspendió cuando la coloración del órgano demostró la eliminación completa de la sangre. Entonces, el órgano fué extraído y pesado. Los riñones se sometieron a un manejo simi- lar pero perfundiéndolos a través de la arteria renal. Una porción de 30 a 50 cms. de largo del intestino delgado, correspondiente al

t e r c i o superior del yeyuno, fue extraida, cortada longitudi- nalmente y lavada profusamente con SSI f r i a . El estdmago se ex t ra jo , se abr i6 a l o largo de l a curvatura mayor y se lavó profusamente con SSI f r í a . test inal se obtuvieron por raspado con espátula.

Tanto mucosa gástr ica como l a in-

2. Maceration y obtención de l a fracción micros6mica.

Los 6rganos y te j idos se dividen en dos porciones iguales y se maceran con el Potter-Elvejhem y el Polytron. La macera- ci6n se real izó en una soluci6n amortiguada con fosfato de potasio (0.1M) a pH 7.5. Los macerados se t ransf ir ieron a tubos de policarbonato y se centrifugaron a 10,000 r.p.m. (12,000 g) en una centrífuga refrigerada Sorvall (modelo RC-56), durante 15 minutos; l o s precipitados fueron desechados. Los sobrena- dantes se colocaron en u n vaso de precipitados, se l e s agreg6 una cantidad suf ic iente de CaC12 para l l evar los a una concen- traci6n f ina l de 8 mM, se agitaron durante 5 minutos, se trans- f i r ie ron a tubos apropiados y se centrifuqaron a 15,000 r.p.m. J27,OOO g ) durante 10 minutos. Los sobrenadantes fueron dese- chados y l o s precipitados se resuspendieron en la soluci6n amortiguada de fosfatos de potasio (O.lM, pH 7.5) . Esta suspen- si6n se centrifug6 nuevamente a 15,000 r.p.m., repitiendose es te paso una vez mas. en 50 mM del amortiguador de fos fa tos , pH 7.5. Todo el procedi- miento se reaiizd entre O y 4OC. modificaci6n del método descrito por Kamath y col . (ll), para l a obtention rápida y senc i l la de l a fracci6n micros6mica.

Finalmente, los precipitados se resuspendieron

Este procedimiento es una

3 . Oeterminaci6n de l a Actividad Enzimftica.

La actividad h idro l í t i ca de l a s CE/A microsdmicas se deter- mind en u n espectrofotómetro Beckman (Modelo 26), utilizando el Acetato de 4-Nitrofenol, e l Acido A c e t i l s a l i c í l i c o y l a Acetani- l ida como sustratos , por medio de l a s técnicas a n a l í t i c a s siguientes:

S U S T R A T O S

+ H3C- COOH HlDROLlSlS

ACETATO D E

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+ H3C-COOH HID ROL lS IS

ACE TAN IL IDA ANILINA ACIUO ACETICO

La hidrólisis del Acetato de 4-Nitrofenol en 50 mM Tris-HC1 ,

La hidrólisis del Acido Acetilsalicílico en 50 mM DH 8.0 y temperatura ambiente, por la producción de 4-Nitrofenol a 405 nm (12) .

MES, pH 5.5 y 37"C, determinando la producción del Acido Salicí- lico a 300 nm (13). La producción de Anilina a 550 nm (14), por hidrólisis de la Acetanilida en 50 mM Tris-HC1, pH 8.0 y 37°C. Estas reacciones se presentan en el esquema correspondiente, en donde la flecha indica el sitio de hidrólisis de cada sustrato. Los controles de la hidrólisis espontánea de cada sustrato fueron determinados en las mismas condiciones.

La concentración total de proteínas se cuantificó con el reactivo de Fol in (15), uti1 izando albúmina sérica bovina como referencia.

E. Resultados

Los valore de la Actividad Enzimátic Específica (AEE) de la fracción microsómica proveniente de la maceración del hígado; los riñones, la mucosa gástrica y la mucosa intestinal de ratas adultas machos, efectuada con el Potter-Elvejhem y el Polytron, se presenta en la Tabla I. Esta actividad se expresa como el pro- medio en n moles de producto por minuto por miligram de proteína, más o menos el Error Tipo del Promedio (E.T.P.) para cada sustrato.

El hígado contiene la actividad hidrolitica más alta hacia los tres sustratos, con ambos procedimientos de maceración. Sin embargo, el promedio de la actividad esterásica del higado y los riñones, hacia el Acetato de p-Nitrofenol (ApNF), es dos veces mayor con el Polytron (P) que con el Potter-Elvejhem (PE). Ade- más, se puede observar que con el ApNF, la actividad enzimática de los riñones, la mucosa intestinal y la mucosa gástrica, mace- rados con el PE, es respectivamente el 7%, 6% y 0.3%, de la acti- vidad hepática mientras que con el P, esta relación es de 7%, 3% y 0.1%. En el caso del Acido Acetilsalicilico (AAS), los riñones

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contienen el 75%, la mucosa intestinal el 18% y la rrmcosa gástrica el 14%, de la actividad hepática. Asimismo, la actividad amidásica renal e intestinal hacia la Acetanilida (AN), corresponde al 30%

de la actividad hepática con el PE y al 20 % con el P.

En la misma tabla se observa que la capacidad hidrolítica de la fracción micros6mica hepática, renal e intestinal (obtenida por maceración con el PE), hacia el ApNF es 15, 1.5 y 5.2 veces mayor que hacia el AAS y ésta, 125, 340 y 70 veces mayor que con la AN, mientras que la actividad hidrolítica de los mismos árganos mace- rados con el P, hacia el ApNF es 39, 3.8 y 4.7 veces más alta que con el AAS y ésta, 72, 223 y 100 veces mayor que hacia la Aceta- nilida.

Para la mucosa gástrica los resultados son completamente opuestos, pues la capacidad para hidrolizar el AAS es 2.75 y 5.4 veces más alta que hacia el ApNF, con los maceradores del PE y del P, respectivamente. Por otra parte, es conveniente considerar las concentraciones diferentes de los sustratos estudiados.

Con el propásito de comparar rds rigurosamente estos resulta- dos, se empleó ?a prueba t de Student, para una probabilidad mayor del 95%, que permitiera valorar la aleatoridad de las diferencias de la Actividad Específica obtenidas con los dos tipos de macera- dores. los resultados de la actividad de cada árgano con los sustratos respectivos.

Ademas, se consider6 ilustrativo presentar en forma gráfica,

1. CE/A Hepáticas.

Los valores de la Actividad Especifica de las CE/A microsámi- cas del higado macerado con el Potter-Elvejhem (PE) y el Polytron (P), hacia el Acetato de p-Nitrofenol (Ap-NF), el Acido Acetilsali- cilico (AAS) y la Acetanilida (AN), se ilustran gráficamente en la

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Figura 1. hepáticas, es el doble con el macerador P que con el PE. Esta diferencia es estadfsticamente significativa, con una p mayor del 95%. En forma similar, la actividad amidásica hacia la AN, es más alta con el P que con el PE mientras la actividad esterá- sica hacia el AAS, tiene una tendencia opuesta. estas diferencias no son significativas.

Con el Ap-NF, la Actividad Específica de las CE/A

Sin embargo,

2. CE/A Renales. El patrán de la actividad hidrolítica de estas enzimas es

semejante al de las hepáticas, con los tres sustratos, en el sen- tido que la Actividad Especifica es mayor al maee~m con el Polytron, cuando se usan el Ap-NF y la AN como sustratos, obser- vándose lo contrario con el ABS (Figura 2). En contraposicián, las CE/A renales no presentan diferencias estadísticamente siqni- ficativas con los tres sustratos, a pesar de que la Actividad Específica promedio es dos veces mayor con el P que con el PE, para el Ap-NF.

3. CE/A Intestinales.

de las CE/A intestinales. En esta figura se observa que la acti- vidad hidrolítica es mayor hacia los tres sustratos, cuando la maceracián se realiza con el PE pero nuevamente, no existen dife- rencias significativas entre estas actividades.

La Figura 3 representa el gráfico de la Actividad Específica

4. CE/A Gástricas. Finalmente, la actividad esterásica de las CE/A gdstricas hacia

el Ap-NF, es relativamente más alta con el PE mientras que con el P es mayor hacia el AAS (Figura 4). Sin embargo, estas diferencias no son estadísticamente significativas.

F. Discusián. Los resultados obtenidos demuestran que la fraccidn microsá-

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mica del higado de ra tas adultas machos, contiene l a actividad hidrol í t ica más elevada de los 6rganos estudiados, hacia los t r e s sustratos , con los dos tipos de maceradores empleados. l o s valores de l a Actividad Específica de l o s diferentes órganos macerados con e l Potter-Elvejhem, son semejantes a l o s descritos por otros investigadores ( 3 , 4 , 8 ) .

Además,

Un de ta l le interesante que vale l a pena mencionar, es e l hecho que l a s CE/A gástr icas hidrol izan eT Acido Acetil sal i c í l ico con mayor rapidez que e l Acetato de p-Nitrofenol , a diferencia de l o que sucede con l a s CE/A hepáticas, renales e intest inales cuya ac- tividad esterás ica hacia e l ApNF, es siempre varias veces mayor que hacia e l AAS. Este hallazgo parecería indicar que l a concentracidn de l a s isoenzimas de l a mucosa gástrica e s drásticamente diferente que en los otros 6rganos mencionados.

Por otro lado, es importante enfatizar que aunque el hígado contiene l a actividad enzimática mayor, l a participacidn de otros órganos también puede s e r relevante en la biotransformación hidro- 1 í t i c a de fármacos como el AAS y la Acetanil ida , en e l organismo completo .

En términos generales, e l a n a l i s i s comparativo de l a s Activi- dades Especificas de l a s CE/A de cada 6rgan0, con l a prueba t de Student, revel6 que l a s enzimas hepáticas, renales, y gastr icas obtenidas con l o s dos t ipos de maceradores, no pre- sentan diferencias estadísticamente s igni f i ca t ivas de l a actividad h idro l í t i ca hacia l o s t r e s sustratos. La Actividad Específica de l a s CE/A hepáticas hacia el ApNF, significativamente mayor cuando l a maceraci6n se real iza con el Polytron, fue u n resultado excep- cional y puede considerarse poco relevante debido a l a baja espe- c i f i c idad de e s t e sustrato.

intest inales

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Los resultados demuestran que ambos tipos de maceradores son igualmente eficientes para la obtención de las Carboxil- esterasas/Amidasas microsámicas de los órganos investigados. Sin embargo, el tiempo requerido para macerar cantidades equi- valentes de los diferentes órganos, fué aproximadamente tres veces menor con el Polytron que con el Potter-Elvejhem. Esta ventaja adquiere importancia especial para el estudio de enzimas particularmente inestables así como para la purificación de enzimas, que requiere inicialmente el procesamiento de cantida- des considerables de material biológico.

G . Conclusiones.

1 . La hidrólisis del Acetato de p-Nitrofenol, el Acido Acetilsalicílico y la Acetanilida, catalizada por las Carboxil- esterasas/Amidasas microsomicas de varios órganos ae las ratas adultas machos y representada como Actividad Especifica, es comparativamenre d s rápida en el hígado que en los riñones, la mucosa intestinal y la rrmcosa gástrica, prácticamente en forma independiente de que la maceración se lleve a cabo con el Potter- Elvejhem o con el Polytron.

2. La actividad esterásica de las Carboxilesterasas/Amidasas gástricas es mayor hacia el Acido Acetilsalicílico que hacia el Acetato de p-Nitrofenol, contrariamente a lo observado con las enzimas hepáticas, renales e intestinales.

3. La eficiencia es esencialmente equivalente con ambos tipos de maceradores para la obtención de las Carboxilesterasas/ Amidasas microsámicas de los órganos investigados.

4. La maceracián del hfgado, los riñones, la mucosa intes- tinal y la mucosa gástrica requiere tres veces menos tiempo con el Polytron que con el Potter-Elvejhem.

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H. Resumen.

El macerador Potter-Elvejhem ha sido usado con frecuencia para causar l a ruptura de l a membrana citoplásmica de l a s célu- l a s de la mayoría de los órganos y te j idos de l o s mamíferos, que se ut i l izan como animales experimentales, con el propósito de investigar l a actividad de l a s enzimas celulares. se ha empleado comúnmente en l a investigación de l a s Carboxil- esterasas/Amidasas (CE/A), que cata1 izan l a hidról i s i s de é s t e r e s , t ioés teres y amidas. Estas enzimas se localizan principalmente en e l sistema reticuloendoplásmico l i s o de l a s cé lulas (fracción microsómica), de l o s órganos de todas l a s especies de mamíferos estudiadas. El objet ivo del t raba jo experimental fué establecer la e f i c ienc ia de l a maceración con cuchi l las rotator ias que l l eva a cabo e l Polytron, comparativamente con el Potter-Elvejhem que macera por f r i c c i ó n . La actividad enzimática de l a s CE/A micro- sómicas del hígado, l o s riñones, l a mucosa intest inal y l a mucosa gástrica de l a s ratas adultas machos, fué e l parámetro de compa- ración. La fracción microsómica de estos órganos se preparó con el método de centrifugaci6n diferencial y precipitación con c lo- ruro de ca lc io . La h idró l i s i s del Acetato de p-Nitrofenol (ApNF), a temperatura ambiente y del Acido A c e t i l s a l i c í l i c o (AAS) y l a Acetanilida (AN), a 3 7 O C , se determinó por cuantif icación espec- trofotométrica de los productos respectivos, mediante técnicas a n a l í t i c a s establecidas. El orden de mayor a menor Actividad Específica hacia l o s t r e s sustratos se observó de l a fracción microsómica hepática, rena l , i n t e s t i n a l , a l a g á s t r i c a , con ambas formas de maceraci6n. Asimismo, el ApNF fue hidrolizado más rápidamente que el AAS y é s t e con mayor velocidad que l a AN, por l a s CE/A hepáticas, renales e intest inales . é s t o , e l AAS que con e l ApNF. La prueba t de Student no reveló di fe- rencias generales en l a actividad enzimática de l a s CE/A obtenidas

Este macerador

En contraste con l a actividad esterás ica de l a s CE/A gástr icas es mayor con

de l o s órganos con l a s dos c lases de maceradores. Estos resul- tados demostraron que e l Polytron es igualmente efect ivo que el Potter-Elvejhem, para l a obtención de l a s CE/A micros6micas de los órganos investigados, aunque l a maceración con el Polytron t iene l a ventaja de requerir menor tiempo, que es u n fac tor importante en el procesamiento de cantidades relativamente grandes de cualquier órgano.

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.~ ~.

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. _.

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.."

. ~.

.-

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" ..

1 -

1. Amn, V . R . und Quintenz, M . (1972). Isolierung und chara k ter i sierung e i nes Propanidi d-Spa1 tenden Enzyms a$s Rattenleber. Arzneim.-Forsch., 2: 977-82.

2. Inoue, M., Morikawa, M . , Tsuboi, M. and Sugiura, M. (1979). Species difference and characterization o f intest ina 1 es terases on the hydrolyzing a c t i v i t y o f ester-type drugs. Jap. J . Pharmacol., - 29: 9-16.

3. Sanchez Montes de Oca, E.I. y Posadas del Rio, F. (1984). La actividad h idro l í t i ca hacia ésteres y amidas, de l o s microsomas de varios órganos de l a rata . Comunicaciones del VI11 Congreso Nacional de Farmacologfa. Monterrey, N . L . , p . 128.

Resumen de l a s

4. Nousiainen, U. and Torronen, R. (1984). Differentiation o f microsomal and cytosol i c carboxylesterases in the r a t 1 iver by in vivo and in v i t r o inhibit ion. Gen. Pharmacol., - 15: 223-27.

5. Kao, L . R . , Montoyama, N . and Dauterman, W.C. (1985). Multiple forms o f esterases in mouse and rabbit l i v e r and t h e i r role i n hydrolysis o f organophosphorus and pyrethroid insect ic ides . Pest ic . Biochem. Physiol., - 23: 66-73.

6 . Heymann, E. (1980). Carboxylesterases and Amidases. En "Enzymatic Basis o f Detoxication". (W.B. Jacoby, ed.) Vol. 11, p . 291-323, Academic Press, N.Y.

7. Junge, W. and Krisch, K. (1975). The CarboxylesteraseslAmida- ses o f m a m i i a n l i v e r and t h e i r possible signif icance. Crit. Rev. Toxicol . , - 3: 371-434.

,"..

1 ~.

8. Mentlein, R., Heiland, S. and Heymann. E. (1980). Simul- taneous purification and comparative characterization of six serine hydrolases from rat liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys., 200: 547-559. -

9. Mentlein, R., Suttorp, F., and Heymann, E. (1984). Speci- ficity of purified monoacylglycerol lipase, palmitoyl-COA hydrolase and nonspecific carboxylesterase from rat liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys., 228: 230-246.

10. Mentlein, R., Reuter, G . , and Heymann, E. (1985). Specifi- city of two different purified acylcarnitine hydrolases from rat liver, their identity with other carboxylesterases, and their possible functuion. Arch. Biochem. Biophys., 240: 801-810.

11. Kamath, S.A., Kimnerow, F.A. and Narayan, K.A. (1971). A simple procedure for the isolation of rat liver microsomes. FEBS Let., - 17 : 90-92.

12. Heymann, E. and Mentlein, R. (1981). Carboxylesterases-Amida- ses. Methods in Enzymol ., - 77: 333-344.

13. Spenney, J.G. (1977). An ultraviolet absorbance method for determining acetylsal icy1 ic hydrolase activity. Anal. Biochem. - 80: 579-584.

14. Pesez, M. and Bartos, J. (1974). Aromatic amines. En "Colori- metric and Flurometric Analysis of Organic Compounds and Drugs. Clinical and Biochemical Analysis". Vol. 1, p. 210 Marcel Dekker, Inc., N.Y.

15. Lowry, O.H. Rosenbrough, N.H., Farr, A.L. and Randall, R.J. (1951). J. Biol. Chem., - 193: 265-275.

Protein measurements with the Folin Dhenol reagent.