ESCUELA NORMAL MIXTA PCIA. DE SAN LUÍS

FORMACIÓN PROFESIONAL PARA AYUDANTES DE LABORATORIO

NOMBRE: COMISIÓN:

TEÓRICO-PRÁCTICO Nº 5: MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE

MICROORGANISMOS

INTRODUCCIÓN

Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros, a partir

de los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos.

Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder

obtenerlo es necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento.

SIEMBRA

Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a

las exigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicación, si

se incuba en condiciones adecuadas.

Para ello una pequeña porción de cultivo o muestra, que se denomina inóculo se

transfiere al medio con precauciones especiales de asepsia a fin de evitar la introducción

de otros microorganismos ajenos al inóculo.

El conjunto de pasos a efectuar para lograr una siembra correcta, se conoce como

técnica aséptica.

La toma del inóculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente:

La siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire (cerrar bien

puertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin brusquedad y sin

hablar.

Coloque frente a usted el mechero y la preparación o muestra que contiene los

microorganismos, así como el resto del material necesario (portaobjetos, tubos, placas).

Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos.

Se debe trabajar a una distancia no mayor de 15 cm. de la llama de un mechero.

El ansa de siembra se esteriliza por flameado directo (flaméelo hasta que alcance

un color rojo incandescente) y antes de retirar el inóculo debe facilitarse su enfriamiento,

a fin de evitar la muerte de los microorganismos a sembrar (enfríelo en la proximidad de

la llama unos 10 a 15 segundos).

Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el ansa a la llama del

mechero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo.

Introducción a la Microbiología

Nunca debe depositarse un tapón sobre la mesada o gradilla, pues estos

elementos están cargados de microorganismos.

Cuando esté destapado, mantener el tubo en la forma más horizontal posible para

evitar que los microorganismos del ambiente, en su caída, tengan acceso al interior.

Las bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde

serán transferidos, deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente antes de

que el ansa sea introducida. También se debe flamear la boca del tubo antes de taparlo.

Este procedimiento fija al vidrio los microorganismos que pueden estar en dicha boca y

tiende a crear corrientes hacia afuera (el aire tiende a salir), disminuyendo así el riesgo

de contaminación.

Para retirar el inóculo o sembrar medios de cultivos en placas de Petri, coloque la

placa invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que contiene el medio de

cultivo con los microorganismos. Llévela a la proximidad de la llama del mechero y tome

el inóculo con el ansa de siembra. Otro método permitido consiste en retirar el inóculo o

sembrar, levantando la tapa solo lo suficiente para permitir la introducción del ansa, para

evitar que los microorganismos ambientales se depositen en la superficie del medio.

Si la siembra se realiza con pipeta, ésta debe estar convenientemente preparada

y esterilizada hasta el momento de su empleo. Una vez utilizada se descarta

introduciéndola en una solución antiséptica (hipoclorito de sodio al 5%).

Transfiera el inóculo a otro medio de cultivo estéril, tomando las mismas

precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad de la

llama, etc.).

La finalidad de una siembra puede ser la de realizar una transferencia o un

aislamiento. La primera se efectúa con cultivos puros (una sola especie bacteriana), ya

sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie, o bien para

conocer alguna de sus propiedades culturales o bioquímicas. El aislamiento, en cambio,

se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su

objeto es separarlas para obtener cultivos puros.

TOMA DEL INÓCULO

Si la muestra proviene de un medio líquido, el inóculo se toma agitando

suavemente el ansa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión

superficial en el extremo del filamento del ansa de siembra.

Si el medio es sólido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (placa de

Petri), tome una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con el ansa de

siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de

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Introducción a la Microbiología

flauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de la

misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colóquelo en el soporte necesario.

TRANSFERENCIA

La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del

tipo de recipiente que los contiene. Para trasladar los microorganismos de un medio de

cultivo a otro, utilizamos el ansa de siembra. Esta ansa consta de un filamento de platino,

que puede ser recto o terminado en anillo. Para facilitar el manejo, este filamento está

sujeto a un mango aislante.

Antes de poner en contacto el ansa de siembra con los microorganismos tenemos

que esterilizarla a la llama del mechero hasta que todo el filamento quede incandescente.

Dejamos enfriar cerca de la llama y luego podemos introducirla en el recipiente que

contenga el cultivo o la muestra que queremos trasladar.

Se pueden presentar los siguientes casos:

Siembra en tubos sobre medios sólidos

a) Siembra en picadura o punción

Se introduce el ansa en punta con el inóculo en un tubo conteniendo agar en

columna, sin tocar las paredes del tubo y en forma paralela asegurándose que el inóculo

quede distribuido a lo largo de toda la punción.

Esta técnica nos permite conocer el comportamiento de los microorganismos

frente al oxígeno y su movilidad.

b) Siembra en estrías

Se toma el material con ansa recta o en anillo y se siembra en estrías en un tubo

que contiene agar pico de flauta o agar inclinado.

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a) ansa en anillo

b) ansa en punta

a)

b)

Introducción a la Microbiología

Siembra en superficie sobre medios sólidos

a) Siembra en agotamiento por estrías

Con el ansa cargada de material hacemos una serie de estrías paralelas no

superpuestas sobre una tercera parte de la superficie de la placa de medio de cultivo.

Esterilizamos el ansa y hacemos una serie de estrías en dirección perpendicular a la

anterior, comenzamos donde esta termina. Este procedimiento se repite varias veces.

El flameado del ansa disminuye la cantidad de microorganismos que extendemos

en la misma, de forma que una vez inoculadas las placas en estufa durante 24 – 48 hs a

la temperatura adecuada, obtendremos colonias aisladas en las últimas estrías,

separadas unas de otras, permitiendo a partir de las mismas la obtención de cultivos

puros mediante resiembra.

b) Siembra con espátula de Drigalsky

Se pipetea un volumen de inóculo y se deposita sobre la superficie de la placa de

Petri que contiene el medio de cultivo solidificado. Con una espátula de Drigalsky estéril

(previamente embebida en alcohol, flameada y enfriada) se disemina la muestra por toda

la superficie, efectuando movimientos de rotación hasta su completa absorción.

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Introducción a la Microbiología

Esta técnica permite sembrar inóculos sobre superficies grandes, para obtener un

crecimiento confluente que nos permite estudiar en efecto de antimicrobianos y el

recuento de colonias.

c) Siembra con hisopo

Se embebe un hisopo de algodón estéril en un tubo que contiene un cultivo líquido

previamente homogeneizado. Se elimina el exceso de inóculo presionando el hisopo

contra las paredes internas del tubo. Se disemina el inóculo por toda la superficie de la

placa con el medio sólido; para ello se estría toda la placa en una dirección (teniendo la

precaución de alcanzar bien los bordes de la placa) partiendo de los bordes hacia el

centro, luego se gira 90º y se estría nuevamente toda la superficie, finalmente se gira 45º

y se vuelve a estriar.

Esta técnica permite sembrar inóculos abundantes sobre superficies grandes a los

fines de obtener un crecimiento confluente que nos permita estudiar el efecto de los

antimicrobianos.

d) Siembra en placa vertida

Se lleva un volumen de inóculo a un tubo que contiene agar fundido y templado

(45ºC), se homogeiniza y se vierte el contenido en una placa de Petri estéril, se agita la

placa efectuando movimientos rotatorios en ambas direcciones para distribuir sus

contenidos y se deja solidificar.

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Introducción a la Microbiología

Una vez incubada a temperatura adecuada, observamos colonias en profundidad

(inmersas en el medio) y en la superficie.

Descripción de las colonias

Si se toma un ansa cargada con una muestra que contenga bacterias y se van

haciendo estrías de ésta sobre una placa de agar nutritivo de tal manera que el material

se vaya “diluyendo” sobre la superficie llegará un momento en que las bacterias

depositadas en la estría estén bien separadas unas de otras, reproduciéndose cada una

en progresión geométrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, etc.).

Dependiendo del tiempo de generación, que varía según la especie bacteriana,

después de cierto tiempo, cada una se habrá multiplicado muchas veces, formando sobre

la superficie del medio un pequeño promontorio constituido por células bacterianas

llamado Colonia, que se obtiene generalmente en unas 24-48 horas.

Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamaño, color,

consistencia, etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases.

Cada colonia aislada está constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se

supone que es la descendencia de una sola célula y por tanto, un cultivo puro.

Para estudiar las características físicas, químicas, fisiológicas, etc., de una

bacteria, se necesita que ésta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en placa de

Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de una porción de

una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su pureza después de la

incubación apropiada, mediante observación al microscopio.

La morfología de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debe

familiarizarse el alumno con ella. La terminología mencionada a continuación sobre

algunas de las características más constantes de una colonia bacteriana es muy útil:

FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc.

TAMAÑO: Estimar el diámetro en mm.

SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concéntricos, etc.

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Introducción a la Microbiología

ELEVACIÓN: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umbilicada, etc.

BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc.

COLOR: Según sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser

de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.

OPACIDAD: Transparente, opaca, etc.

CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el ansa

bacteriológica para determinar la consistencia.

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Introducción a la Microbiología

NOMBRE: COMISIÓN:PARTE PRÁCTICA: MÉTODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO SE MICROORGANISMOS

Objetivos

Ejecutar las técnicas básicas para la manipulación de cultivos microbianos en forma

aséptica.

Adquirir conocimientos básicos, teóricos y prácticos, de la siembra y aislamiento de

bacterias.

Adquisición de criterio en la elección de los distintos medios de cultivo.

Actividades a desarrollar

(I) Ejercitación de las diversas técnicas de siembra de los microorganismos.

Se utilizarán los siguientes medios de cultivo

Agar Nutritivo

Agar Chapman

Agar Levine EMB

1) Siembra de placas de Petri por agotamiento por estrías en diferentes medios de

cultivo: se toma el material con el ansa estéril y se siembra por diseminación en estrías

por agotamiento con la finalidad de aislar microorganismos.

Técnica

a. Con el marcador dividir la placa de Petri en 3 sectores, de tal manera que al

destaparla para proceder a la inoculación, se tenga como se indica en la figura:

b. Destapar el tubo que contiene el cultivo y flamear su punta. No dejar que la tapa

se contamine colocándola sobre el mesón. Con el ansa en anillo previamente

esterilizada tomar una ansada de cultivo bacteriano.

c. Flamear nuevamente la boca del tubo que contiene el cultivo, tapar y colocar en la

gradilla.

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Introducción a la Microbiología

d. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y

descargar el material en el sector 1, trazando una serie de zig-zags muy cerrados

a todo lo ancho del sector. Cerrar la placa.

e. Esterilizar el ansa flameándola y mientras que se enfría, girar la placa 90° hasta

que el sector 1 quede a la izquierda y el 2 hacia arriba a la derecha.

f. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 2 invadiendo el sector 1 para llevar un poco de

material al sector 2 y las siguientes estrías no deben tocar el sector 1. De esta

forma se diluye el material quedando unas bacterias separadas de las otras.

g. Esterilizar de nuevo el ansa, girar la caja 90° y ahora el sector 2 estará a la

izquierda y el 3 a la derecha.

h. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 3 invadiendo el sector 2 y el resto sin tocar el

sector 2, como se muestra en el dibujo:

i. Incubar a 37°C por 24-48 horas.

j. Observar si hubo o no, aislamiento de colonias. (nota: En el sector 1

generalmente no se obtienen colonias aisladas, pero en 2 y 3 sí).

k. Anotar las características de las colonias aisladas.

l. Preparar un frotis, teñir con la técnica de Gram y observar al microscopio con

objetivo de inmersión para confirmar su pureza.

2) Siembra en placa de Petri con espátula de Drigalsky : con pipeta estéril colocar 0,1 ml

de cultivo en medio líquido sobre el medio sólido, diseminar inmediatamente con

espátula.

3) Siembra en placa de Petri con hisopo estéril : se embebe el hisopo sumergiéndolo en

un medio líquido y se disemina en estrías.

4) Siembra en placa por método de placa vertida : se coloca 1 ml de cultivo en medio

líquido sobre una placa de Petri vacía estéril e inmediatamente se vierte agar fundido y

templado a 45ºC, se agita la placa efectuando movimientos rotatorios en ambas

direcciones para distribuir sus contenidos y se deja solidificar.

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Introducción a la Microbiología

5) Siembra en agar inclinado : se toma el material con ansa recta o en anillo y se siembra

en estrías.

a. Agitar el cultivo líquido para resuspender los microorganismos en el medio. Evitar

mojar la tapa del tubo con el cultivo.

b. Esterilizar el ansa a la llama.

c. Destapar el tubo que contiene el cultivo y flamear su punta. No dejar que la tapa

se contamine colocándola sobre el mesón.

d. Insertar el ansa estéril en el cultivo y tomar una ansada llena para transferirla al

otro tubo que contiene el medio de cultivo sólido estéril.

e. Flamear nuevamente la boca del tubo que contiene el cultivo líquido, tapar y

colocar en la gradilla.

f. Destapar el tubo que contiene agar nutritivo estéril y flamear su punta. No dejar

que la tapa se contamine colocándola sobre el mesón.

g. Para inocular el medio sólido estéril introducir el ansa que contiene el cultivo en el

tubo de agar nutritivo estéril hasta el fondo del tubo donde comienza el bisel y

diseminar el inóculo sobre la superficie del mismo moviendo de lado a lado y

hacia arriba hasta llegar a la punta del bisel.

h. Flamear nuevamente la punta del tubo y tapar.

i. Esterilizar nuevamente el ansa.

j. Colocar los tubos en su gradilla e incubarlos a 37°C por 24 horas.

6) Siembra en agar en columna : por picadura con ansa en punta.

7) Siembra en agar pico de flauta : se toma el material con ansa recta o en anillo y se

siembra por picadura y en estrías.

(II) Observar y registrar las características de desarrollo en cada uno de los medios.

(III) Observar y registrar las características morfológicas de las colonias de los distintos

microorganismos.

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