TEMA 3: ENZIMAS 1 Enzimas......... y mucho ms.... Son proteinas, con excepcin de molculas catalticas de ARN Se requiere su conformacin nativa e integridad para funcionar Tienen pesos entre 6,000 y 1 x 106 Da Algunas requieren componentes qumicos adicionales: Cofactores, iones inorgnicos (Fe 2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+) y Coenzima (complejos orgnicos). 2 Enzimas......... y mucho ms.... Cualquier grupo que se una fuertemente a la enzima se denomina grupo prosttico (Holoenzima), denominndose la porcin protica apoenzima. Las coenzimas son transportadores transientes de grupos funcionales especficos y derivan de las vitaminas, en su mayora. Algunas enzimas son modificadas covalentemente por procesos de fosforilacin, glicosilacin y otros: REGULACION 3 Clasificacin Internacional de las Enzimas 4 1Oxidoreductasas Transferencia de electrones (iones hidruro o tomos) 2Transferasas Reacciones de transferencia de grupos 3Hidrolasas Transferencia de grupos funcionales al agua 4Liasas Adicin de grupos a dobles enlaces, o remocin de dobles enlaces por remocin de grupos 5Isomerasas Transferencia de grupos dentro de las molculas para rendir formas isomricas 6Ligasas Formacin de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N por reacciones de condensacin acopladas a ruptura del ATP 5 oxidoreductasa TransferasaLiasasHidrolasasIsomerasasLigasasClasificacin de las enzimas (IUBM) 6 Oxidoreductasas Dehidrogenasas, Oxigenasa Peroxidasas, Reductasas Catalasa, Hidroxilasas Transferasas Transaldolasa Fosfomutasa Quinasas Hidrolasas Esterasas, peptidasas Fosfatasas, Fosfolipasas Glicosidasas, Deaminasas Liasas Descarboxilasa, Aldolasa Hidratasas, Dehidratasas Sintasas, Liasas Isomerasas Racemasas, Epimerasas Isomerasas, Mutasas Ligasas Sintetazas Carboxilasa 7 Cu2+ Cytochromo oxidasa Fe2+ Fe3+ Cytochromo oxidasa, catalasa, peroxidasa K+ Pyruvato kinasa Mg2+ Hexoquinasa, G-6-fosfatasa, pyruvato kinasa Mn2+ Arginasa, ribonucletido reductasa MoDinitrogenasa Ni2+ Ureasa SeGlutathione peroxidasa Zn2+ Anhydrasa carbnica, alcohol dehidrogenasa, carboxipeptidasa A y B Algunos elementos inorgnicos cofactores de enzimas 8 Experimentos cinticos revelan propiedades de las enzimas 1. Mediciones cinticas: eficiencia como catalizadores 2. Alteracin de V al variar [S] y [E] 3. Orden Cintico -Nmero de molculas reaccionantes -Orden Cero -Primer Orden -Segundo Orden -Pseudo Primer Orden 9 10 S P A [ P ] At = V = k [S] k = constante de velocidad Rapidez o eficiencia de una reaccinConstante de proporcionalidad que refleja la probabilidad de una reaccin bajo un set decondiciones dadas 11 EL ORDEN CINTICO GENERAL DE UNA REACCIN ES LA SUMA DE LOS EXPONENTES EN LA ECUACIN DE VELOCIDAD Y NOS DICE CUNTASMOLCULAS ESTN REACCIONANDO EN LA ETAPA MS LENTA DE LA REACCIN. Cuando la concentracin de uno de los reactantes es tan alta que permanece casi constante durante la reaccin, se dice que es de orden cero con respecto a ese compuesto, y por ende el trmino de ese reactante puede eliminarse de la ecuacin. 12 | | | | | |10211S k S S k V = =Una reaccin de primer orden es aquella que depende de la presencia de un solo sustrato 13 | | S k V =Las ecuaciones de velocidad en la prctica corriente usan ms de dos reactantes y esto las hace demasiado complicadas, pero se escogen condiciones a voluntad de modo que se efecten en varias etapas y que cada etapa sea de primer orden 14 | | | |1211S S k V =S1+S2 P1+P2 Variables cinticas para una reaccin enzimtica sencilla K1 y K-1 gobiernan la V de asociacin y disociacin de E con S, respectivamente Kcat, mide la actividad cataltica de una enzima Velocidades iniciales: curvas de progreso A|P|/ At, pendientes del origen 15 P E ES S E + +K1 K-1 Kcat Estudia la V de una reaccin y como cambia en respuesta a cambios en los parmetros experimentales Ecuacin de Michaelis-Menten 16 | || | S KmS VV+=max017 E saturada con S, velocidad Independiente de [S] [S] ++ reaccin de primer orden con respecto a S De segundo orden: [E]1[S]1

[S] intermedias, orden con respecto a S es fraccionado, decrece de 1ero a orden 0 x baxy+=| || | S KmS VVo+=maxHiprbola rectangular | || | S EKmKcatVo =| || |0S E Kcat Vo =Qu postularon Michaelis-Menten? La E se combina primero con S forma ES en un proceso relativamente rpido y es reversible ES luego se rompe en un paso lento y d E (libre) y el P de la reaccin En cualquier momento de la reaccin la enzima existe en dos formas: E (libre) o combinada ES. 18 K1 K-1 K2 K-2 ES S E +P E ES + Al comienzo V depende de [S] y el equilibrio ir a la derecha La Vmax se alcanza cuando E est como ES: saturacin La reaccin luego alcanza el estado ESTACIONARIO, [ES] y otros intermediarios permanecen constantes en el tiempo 19 Qu es Vmax ? Ecuacin de V para la regin de pseudoprimer orden de la curva: Vo (saturacin) = Vmax = K [E][S]0 = K [E]total = Kcat [ES] En la Saturacin casi todas las molculas de E existen como ES y aqu opera Kcat: constante de V para la conversin de ES a E (libre) y producto Kcat = Vmax/ [E]total, la cual es la medida de V con la cual una enzima puede catalizar una reaccin 20 Qu es Km ? Km es la [S] a media saturacin de E Tiene unidades de concentracin Puede ser la constante de disociacin para el complejo ES, cuando Kcat es despreciable: -A menor Km, ms firmemente se fija el S a E -Se usa para estimar la [S] dentro de una clula 21 22 23 24 Indica la eficiencia cataltica de las enzimas: -Km: estabilidad del complejo [Elibre][S] / [ES] -Kcat: mide la actividad cataltica de una enzima y de cuantas reacciones por segundo puede catalizar una molcula enzimtica. -Kcat tiene valores ~ 103 s-1 -Kcat / Km tiene valores ~ 108 a 109 M-1 s-1

25 26 27 28 La mayor velocidad a la cual dos solutos sin carga pueden aproximarse entre si por difusin Cmo trabajan las enzimas? Sitio activo Sustrato Afectan las velocidades de reaccin, no el equilibrio 29 Alineacin de grupos reactivos Formacin de intermediarios inestables cargados Rearreglo de enlaces Otras transformaciones La energa de activacin AG++ seala la diferencia de energa entre el estado de transicin y el basal Porqu existen las barreras de activacin? Son cruciales para la vida La estabilidad de una molcula aumenta con su barrera Si no fuera as, macromolculas complejas revertiran espontneamente a formas moleculares ms simples y el orden elevado de estructura y los procesos metablicos complejos de las clulas no existiran 30 31 32 INHIBICIN REVERSIBLE El inhibidor se une con fuerza no-covalente a la Enzima Al unirse a E interfiere con su actividad y evita la formacin de ES y posteriormente E + P Se usan para investigar los mecanismos enzimticos y descifrar las vas metablicas Ayuda a estudiar la especificidad de una enzima 33 Arquitectura fsica y qumica del sitio activo Se puede eliminar con dilisis o filtracin en gel Se clasifican en:Inhibidores Competitivos Inhibidores Acompetitivos Inhibidores No-competitivos | || | | | EI I E Ki / =34 Inhibicin Competitiva EscomnqueSseunanenelmismositio activo,peroalgunosinhibidoresseunena sitiosdiferentesaldelSysiguesiendo competitiva LacapacidadparaformarESdependedela cantidaddeSeIpresentesydesus afinidades relativas 35 La formacin de EI se puede revertir aumentando [S] Mientras ms potente el inhibidorse necesita ms [S] para tener la media saturacin o Km = Km (aparente) Vmax no se afecta con la presencia de este Inhibidor 36 Inhibidores competitivos Los Inhibidores son por lo general anlogos no metabolizables del sustrato Derivado del sustrato Sustrato alterno de la enzima El producto de la reaccin 37 38 Inhibicin Competitiva | | ES kp v =| || || || || | EI ES EES kpEtvt+ +=| || || | EKsSES =| || || | EKIEIi=P E ES S E + +I + EI Ki KsKp | || || || || || || || |||.|

\|+ +||.|

\|=EKIEKSEEKSE kvi sst p| || | | |i ssKIKSKSVv+ +=1max| || || | SKIKSVvis+||.|

\|+=1max39 | || || | SKIKSVvis+||.|

\|+=1max40 Inhibicin Acompetitiva Se une reversiblemente al complejo ES y no a E, generando ESI inactivo Es comn en los sistemas de mltiples reactantes, en los cualesse enlaza solamente al complejo ES 41 Vmax ser menor Km aparente decrece, debido a la utilizacin de ES por el I 42 43 Inhibicin Acompetitiva P E ES S E + ++ I ESI | | ES kp v =| || || | EKsSES = | || || | IKESESIi=Ki KsKp | || || || | ESI ES EES kpEvt+ +=| || || || || || | | || || ||.|

\|+ +=Ks KiE I SKsS EEKsS EE kpvt.| || || ||.|

\| + +=KiIS KsSVv1max| || | S KmS Vvo +=max| || | SKmSVv+=oomax44 | || | SKmSVv+=oomax45 Inhibicin No-Competitiva Se unen tanto a E como a ES, de modo que se pueden formar complejos EI y ESI, ambos inactivos Por lo general, I no es semejante a S Se comporta como un removedor de E de la solucin, por tanto decrece la Vmax pero no cambia Km. Esta inhibicin no se supera al aumentar [S] 46 No-competitiva pura: Cuando el I se fija a E y ES con igual afinidad No-competitiva mixta: cuando las afinidades de unin del I a E y ES son diferentes La inhibicin puede ser revertida por dilisis exhaustiva de la enzima inhibida, siempre y cuando la reaccin entre E e I no sea covalente. 47 48 Inhibicin No-competitiva | || || | | || || |Ki KsS I EKsS EIESI.= =| || || |KiI EEI =| || || || | | | | || | | | EKi KsI SKiIKsSKsS EE kpvt|.|

\|+ + +=.1| || || || ||.|

\| + +|.|

\| +=KiISKiIKsSVv1 1max| || | S KmSVvo o +=max| || | S KsSVv+=omax49 | || | S KsSVv+=omax50 Inhibicin Irreversible Se enlazan de forma covalente y estable a la E, se combinan y destruyen un grupo funcional que es esencial para la catlisis No es revertida por dilisis a menos que el enlace sea lbil qumicamente como un ester o un tioester 51 Para que se usan? Permiten identificar aa del sitio activo por sustitucin especfica de sus cadenas laterales Ejemplo: el grupo thiol del sitio activo de la gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa reacciona con -cloromercuribenzoato, el cual no revierte con dilisis ni adicin de S. 52 Drogas como inhibidores enzimticos: antimetabolitos -Sulfa (sulfanilamida), agente antibacterial, compite con el cido -aminobenzico (PABA) Dihidropteroatesynthetasa cido flico 53 Methotrexato, evita la biosntesis de purinas y pirimidinas, es anlogo del dihidrofolato,compitiendo con este por la dihidrofolatoreductasa