Bioqumica II e Inmunologa

Mdulo 4

Sesin prctica 3

Determinacin cuantitativa de alanina

aminotransferasa ALT (GPT) y aspartato

aminotransferasa AST (GOT) en suero humano

El aumento plasmtico de estas enzimas proporciona

informacin sobre la alteracin del tejido de procedencia

Los enzimas especficos no plasmticos son importantes en

el diagnstico de las enfermedades de tejidos y rganos

Un proceso patolgico puede provocar:

cambios en la permeabilidad de la membrana celular incremento de la muerte celular

la liberacin de las enzimas

intracelulares en el plasma

depende de:

la irrigacin del tejido el tamao de la enzima gradiente de concentracin citoslica o mitocondrial cantidad de tejido daado

Enzimologa clnica

ALGUNAS DE LAS PRINCIPALES ENZIMAS DE INTERS CLNICO

PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA CLINICA Y PATOLOGIA MOLECULAR. ALVARO GONZALEZ-HERNANDEZ

GlutamatoCetoglutarato CetocidoL-Glutamato

L-Aminocido

a-Cetoglutarato

a-Cetocido

Aminotransferasas

E-PMP + a-cetocido2 L-aa2 + E-PLP (a-cetoglutarato) (Glutamato)

L-aa1 + E-PLP a-cetocido1 + E-PMP

Transaminacin: eliminacin del

grupo -amino de los aminocidos

Aminotransferasas: AST y ALT

Aminotransferasas o transaminasas: catalizan la transferencia reversible

de un grupo amino desde un aminocido hasta un a-cetocido

Las aminotransferasas de mayor inters clnico:

GPT o ALT (glutamato piruvato transaminasa o alanina aminotransferasa)

alanina+ a-cetoglutarato piruvato + glutamatoALT

GOT o AST (glutamato oxalacetato transaminasa o aspartato aminotransferasa)

aspartato+ a-cetoglutarato oxalacetato + glutamatoAST

Sus actividades aumentan en el suero por la liberacin del

contenido celular de clulas lesionadas o necrosadas

ALT:

Hgado: actividad 3.000 veces superior a la del suero

Aminotransferasa ms especfica del hgado. Vida media 45h

Se expresa en menor cantidad en otros tejidos, como el rin

Diagnstico de enfermedades hepticas, musculares y traumatismos

AST:

Hgado: actividad 7.100 veces superior a la del suero

En hgado, msculo cardiaco, msculo esqueltico y otros tejidos

2 isoenzimas:

- mitocondrial: vida media: 87h; aparece si la lesin hstica es intensa

- citoslica (90% de la actividad srica en personas sanas): vida

media: 17h. Abundante en corazn, musculo esqueltico y rin

Se emplea en el control post-infarto y de pacientes con desrdenes

del msculo esqueltico.

Junto con ALT y ALP, se utiliza para el diagnstico diferencial de

enfermedades hepticas. Varios frmacos elevan sus niveles.

Determinacin de la actividad ALT

El descenso de la absorbancia de NADH es directamente

proporcional a la concentracin de aminotransferasa

alanina+ a-cetoglutarato glutamato + piruvatoALT

piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+lactato deshidrogenasa

LDHabsorbancia a 340nm

Tampn R1 TRIS pH 7,8

Lactato deshidrogenasa (LDH)

L-Alanina

100 mmol/L

1200 U/L

500 mmol/L

Sustrato R2 NADH

a-Cetoglutarato

0,18 mmol/L

15 mmol/L

La hemolisis incrementa ligeramente la actividad de las aminotransferasas

Esta se mantiene estable hasta 3 das a RT o 3 semanas a 4C

La descongelacin afecta negativamente la actividad ALT

1. Conectar el espectrofotmetro y ajustar l a 340 nm.

2. Ajustar el espectrofotmetro a cero con agua destilada o aire.

3. Pipetear en una cubeta: 1 ml RT y 100 ml de suero

4. Mezclar por inversin. Incubar 1 minuto

5. Leer la absorbancia inicial de la muestra y cada minuto durante 3

minutos

6. Calcular el promedio de la DA/min (media de tres valores)

A/min x 1750 = U/L de ALT

Determinacin de la actividad ALT

Preparar el reactivo RT: mezclar 4 volmenes del tampn R1 con un

volumen de sustrato R2. Diluir la solucin resultante 1:2 (preparado

con antelacin)

Determinacin de la actividad AST

El descenso de la absorbancia de NADH es directamente

proporcional a la concentracin de aminotransferasa

aspartato+ a-cetoglutarato glutamato + oxalacetatoAST

oxalacetato + NADH + H+ malato + NAD+Malato deshidrogenasa

MDHabsorbancia a 340nm

Tampn R1 TRIS pH 7,8

Lactato deshidrogenasa (LDH)

Malato deshidrogenasa (MDH)

L-Aspartato

80 mmol/L

800 U/L

600 U/L

200 mmol/L

Sustrato NADH

a-Cetoglutarato

0,18 mmol/L

12 mmol/L

Preparar el reactivo RT: mezclar 4 volmenes del tampn R1 con un

volumen de sustrato R2. Diluir la solucin resutante 1:2 (preparado

con antelacin)

1. Conectar el espectrofotmetro y ajustar l a 340 nm.

2. Ajustar el espectrofotmetro a cero con agua destilada o aire.

3. Pipetear en una cubeta: 1 ml RT y 100 ml de suero

4. Mezclar por inversin. Incubar 1 minuto

5. Leer la absorbancia inicial de la muestra y cada minuto durante 3

minutos

6. Calcular el promedio de la DA/min (media de tres valores)

A/min x 1750 = U/L de AST

Determinacin de la actividad AST

GRUPO ALT (U/L) AST (U/L)

1

2

3

4

5

6

Valores obtenidos (37C)

H (40 U/L)

M (32 U/L)

H (38 U/L)

M (31 U/L)

Cuestiones

Explicar brevemente en qu rutas metablicas desempean su

funcin las enzimas AST y ALT.

Cul es el fundamento de la determinacin de la actividad ALT en

muestras sanguneas?

Cul es el fundamento de la determinacin de la actividad AST en

muestras sanguneas? Por qu se emplea lactato deshidrogenasa

en la determinacin?

Calcular los valores de ALT y AST en U/L a 37C en las muestras

analizadas. Anotar los valores del resto de los grupos y compararlos

con los valores de referencia que se indican en el guin. Indican

los valores obtenidos la posible existencia de alguna patologa?